Artykuł metodologiczny

Izolacja i charakterystyka neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej

DOI:

10.3791/67805

⸱

7 lutego 2025

 ,  , 
1TB Immunology Group, Department of Clinical Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, St James's Hospital, Trinity College Dublin, The University of Dublin

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj oferujemy niezawodne podejście do izolacji neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej za pomocą izolacji magnetycznej (selekcja negatywna) i podłoża o nieciągłym gradinie gęstości. Zapewnia nietkniętą izolację komórek o wysokiej czystości (≥93%), ułatwiając dokładną analizę subpopulacji neutrofili, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w zdrowiu i chorobie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojawiające się badania pokazują, że populacja krążących neutrofili u ludzi składa się z różnych podtypów i nie powinna być badana jako pojedyncza populacja, jak to miało miejsce w przeszłości. W szczególności wykazano, że neutrofile o niskiej i normalnej gęstości (LDN, NDN) mają funkcjonalnie i metabolicznie odrębne profile, co należy wziąć pod uwagę przy publikowaniu badań nad neutrofilami. W tym miejscu przedstawiamy zmodyfikowaną metodę nietkniętej izolacji i separacji LDN i NDN od krwi pełnej.

Medium o gradiencie gęstości (1,135 g/ml) jest łączone o 9:10 z 10x PBS. Specyficzne gradienty gęstości 55%, 70% i 81% są następnie wytwarzane przez połączenie pożywki o gradinie gęstości 100% z 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Neutrofile wyizolowane z 12 ml obwodowej krwi pełnej uzyskanej od dawców, którzy wyrazili zgodę przy użyciu zestawu do izolacji magnetycznej opartej na selekcji negatywnej, są ponownie zawieszane we frakcji 55%. Objętość 3 ml frakcji 81% i 70% umieszcza się warstwami w probówce o pojemności 15 ml, a następnie frakcję 55% zawierającą całkowitą liczbę neutrofili. Gradienty gęstości są następnie odwirowywane przy 720 x g przez 30 minut. Dwa odrębne pasma są uzyskiwane na granicy faz 55%/70% (LDN) i 70%/81% (NDN). Komórki są ostrożnie pipetowane do oddzielnych probówek i przemywane za pomocą PBS. Czystość wyizolowanych frakcji określa się za pomocą cytometrii przepływowej. Zarówno LDN, jak i NDN zdefiniowano jako CD14lo CD15+ SSChi za pomocą cytometrii przepływowej. Czystość izolacji obliczono na ≥93% komórek żywotnych dla obu typów.

Ta metoda zapewnia niezawodne i skuteczne podejście do oddzielania LDN i NDN od krwi obwodowej, zapewniając wysoką czystość i żywotność izolowanych komórek. Zwiększenie precyzji izolacji neutrofili ułatwia dokładniejsze dalsze analizy tych odrębnych subpopulacji neutrofili. Mają one kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat heterogeniczności neutrofili i jej implikacji w różnych kontekstach fizjologicznych i patologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile to ziarniste komórki odpornościowe i najliczniejsza leukocyty we krwi obwodowej, stanowiące średnio około 50%-70% leukocytów. Rozwijają się one w szpiku kostnym z prekursorów granulocytów-monocytów (GMP), które z kolei rozwijają się z hematopoetycznych komórek progenitorowych (HPC) w obecności czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF). W homeostazie mają długość życia ~24 godziny, ale badania wykazały, że ich żywotność może być przedłużona w określonych warunkach fizjologicznych i związanych z nimi mikrośrodowiskach, takich jak przewlekła aktywacja immunologiczna1, zapalenie1, a nawet pobyt tkankowy w stanie stacjonarnym2. Neutrofile od dawna uważane są za pierwszą linię obrony przed patogenami i wywołują ich działanie przeciwdrobnoustrojowe poprzez 3 główne funkcje efektorowe - degranulację, fagocytozę oraz aktywację i uwalnianie pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET) (NETosis).

Większość badań nad funkcją neutrofili i biologią analizuje wyniki dla całej populacji neutrofili. Jednak od badań nad nowotworami określających podtypy N1 (przeciwnowotworowe) / N2 (pronowotworowe) do klasyfikacji neutrofili na podstawie dojrzałości, choroby i stanu fizjologicznego, a nawet gęstości komórkowej (neutrofile o niskiej gęstości i normalnej gęstości), staje się coraz bardziej oczywiste, że ludzka populacja neutrofili stanowi fenotypowo zróżnicowane podtypy. Niezależnie od tego, czy istnienie tych podtypów neutrofili można przypisać całkowicie odrębnym typom komórek, czy też złożonej naturze plastyczności, istnieje coraz więcej literatury na temat atypowych neutrofili i stanowi ona fascynującą okazję do badania neutrofili o niskiej gęstości oddzielnie od neutrofili o normalnej gęstości3.

Opisany po raz pierwszy u pacjentów z TRU jako podzbiór prozapalnych neutrofili4, LDN zostały zidentyfikowane w chorobach przewlekłych, ciąży, a nawet w zdrowym krążeniu, zarówno w zdolnościach prozapalnych, jak i supresyjnych5,6,7,8. LDN znajdują się jednocześnie z komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC), gdy krew pełna jest odwirowywana na pożywkach o gradiencie gęstości. Ich gęstość właściwa odpowiada około 1,077 g/ml, w porównaniu do NDN o stężeniu 1,083 g/ml9. Chociaż wciąż toczy się poważna debata na ten temat, istnieją spekulacje, że LDN przypominają bardziej niedojrzały fenotyp granulocytów (podobny do promielocytów i mielocytów, o gęstości poniżej 1,080 g / ml)9,10. Inni nadal spekulują, że istnieją zarówno dojrzałe, jak i niedojrzałe fenotypy LDN w zależności od obecności lub braku choroby11,12,13. Niemniej jednak LDN wykryto również u osób zdrowych; Jednak ich włączenie do niektórych badań jest ograniczone ze względu na trudności w wyizolowaniu ich w wystarczającej liczbie5.

To badanie miało na celu wyizolowanie tych dwóch populacji w ilościach, które pozwoliłyby nam na przeprowadzenie dalszych eksperymentów metabolicznych in situ (minimum 0,5 × 106 komórek/ml). W ten sposób istniejący protokół5 został zoptymalizowany za pomocą powszechnie zgłaszanych markerów fenotypowych13,14, które zapewniają najlepszy wynik dla izolacji i charakterystyki LDN i NDN z krwi pełnej (Rysunek 1A).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki krwi zostały pobrane za świadomą zgodą zdrowych uczestników. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki Badań zarówno Szpitala św. Jakuba, jak i Szpitala Uniwersyteckiego w Tallaght.

1. Przygotowanie podłoża o gradiencie gęstości, frakcji izotonicznych roztworów roboczych i buforu do separacji komórek

  1. Przygotowanie izotonicznych roztworów roboczych z ośrodka o gradiencie gęstości
    1. Przygotowanie 100% roztworu roboczego Isotonic (~1,123 g/mL)
      1. Aby przygotować izotoniczny 100% roztwór roboczy, połącz 27 ml pożywki o gradiencie gęstości z 3 ml 10x PBS. W ten sposób powstaje roztwór izotoniczny nadający się do dalszych rozcieńczeń.
    2. Przygotowanie izotonicznego roztworu roboczego 81% (~1,0996 g/mL)
      1. Przygotować izotoniczny 81% roztwór roboczy, mieszając 8,1 ml izotonicznego 100% roztworu roboczego (przygotowanego w kroku 1.1.1) z 1,9 ml 1x PBS. Dokładnie wymieszaj, aby zapewnić jednorodność.
    3. Przygotowanie izotonicznego 70% roztworu roboczego (~1,0861 g/ml)
      1. Aby przygotować izotoniczny 70% roztwór roboczy, połącz 7 ml izotonicznego 100% roztworu roboczego z 3 ml 1x PBS. Upewnij się, że roztwór jest dobrze wymieszany.
    4. Przygotowanie izotonicznego 55% roztworu roboczego (1,0676 g/ml)
      1. Przygotuj izotoniczny 55% roztwór roboczy, mieszając 5,5 ml izotonicznego 100% roztworu roboczego z 4,5 ml 1x PBS. Dokładnie wymieszaj.
  2. Nakładanie warstw frakcji gradientowych
    1. Nakładanie warstw frakcji gradientowej
      1. Używając stożkowej probówki o pojemności 15 ml, ostrożnie nałóż na dno 3 ml izotonicznego 81% roztworu roboczego. Następnie powoli i delikatnie nałóż 3 ml izotonicznego 70% roztworu roboczego na wierzch, unikając mieszania warstw. Ten gradient zostanie wykorzystany do separacji komórek.
  3. Przygotowanie buforu do separacji komórek
    1. Przygotowanie 500 ml buforu do separacji komórek
      1. Aby przygotować bufor do separacji komórek, połącz 2% płodową surowicę bydlęcą (FBS) i 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) z 1x PBS do całkowitej objętości 500 ml. Użyj tego bufora do mycia i ponownego zawieszania komórek podczas procesu izolacji.
        UWAGA: Upewnij się, że warstwy są dobrze oddzielone i nienaruszone. W tym protokole izotoniczne roztwory robocze są określane jako "100%", "81%", "70%" i "55%" w oparciu o metodę przygotowania, zgodną z wcześniejszymi badaniami5. Należy jednak wyjaśnić, że etykiety te nie reprezentują rzeczywistych końcowych stężeń roztworów roboczych. Na przykład pożywkę o gradiencie gęstości "100%" przygotowuje się przez zmieszanie 27 ml pożywki o gradientze o czystej gęstości z 3 ml 10x PBS, co daje końcowe stężenie 90% izotonicznego roztworu roboczego. Kolejne rozcieńczenia (np. "81%", "70%" i "55%") podobnie odzwierciedlają proporcje preparatu, a nie rzeczywiste stężenia procentowe. Nomenklatura ta została zachowana w celu zachowania spójności z terminologią używaną we wcześniejszej literaturze przedmiotu.

2. Izolacja neutrofili z krwi pełnej za pomocą selekcji negatywnej

  1. Przygotowanie koralików magnetycznych
    1. Dokładnie obracaj kulki magnetyczne przez 30 sekund, aby upewnić się, że są całkowicie zawieszone przed użyciem.
  2. Przygotowanie krwi
    1. Dla każdego dawcy podajcie 4 ml krwi pełnej do trzech oddzielnych probówek okrągłodennych o pojemności 14 ml.
  3. Dodanie koktajlu izolującego neutrofile i kulek magnetycznych
    1. Do każdej probówki dodać 50 μl koktajlu izolującego neutrofile i 50 μl kulek magnetycznych na ml krwi. Na 4 ml krwi dodaj 200 μl każdego odczynnika.
    2. Mieszaninę należy dobrze zawiesić, delikatnie pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut, aby odczynniki mogły związać się z niepożądanymi komórkami.
  4. Mycie i separacja magnetyczna - pierwsza runda
    1. Uzupełnij każdą probówkę do 12 ml za pomocą buforu do separacji komórek i dokładnie wymieszaj.
    2. Umieść probówki bez pokrywek na magnesie i pozwól im inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić przyciągnięcie kulek magnetycznych związanych z niechcianymi komórkami do ścianki probówki.
  5. Zbiór niepowiązanych komórek
    1. Ostrożnie przenieść przezroczystą zawiesinę komórek zawierających neutrofile z każdej probówki do nowej, czystej probówki za pomocą pipety do przenoszenia. Wyjmij oryginalną rurkę z magnesu.
  6. Ponowna aplikacja i inkubacja kulek magnetycznych - druga runda
    1. Ponownie wiruj kulki magnetyczne przez 30 sekund. Dodaj taką samą objętość kulek magnetycznych do nowo przeniesionej zawiesiny komórek, jak w kroku 2.3. Dokładnie zawiesić i inkubować w temperaturze pokojowej przez kolejne 5 minut.
  7. Końcowa separacja magnetyczna i zbieranie
    1. Umieść probówki z powrotem na magnesie bez pokrywek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez kolejne 10 minut.
    2. Ostrożnie przenieść zawiesinę przezroczystych komórek do nowej probówki. Ta końcowa zawiesina reprezentuje izolowaną całkowitą populację neutrofili.

3. Oddzielenie neutrofili o niskiej gęstości (LDN) i neutrofili o normalnej gęstości (NDN) od całkowitej populacji neutrofili

  1. Gromadzenie i przygotowanie zawiesin komórek
    1. Dla każdego dawcy należy połączyć izolowane zawiesiny neutrofili w probówkach o pojemności 50 ml. Uzupełnij każdą probówkę do całkowitej objętości 50 ml za pomocą buforu do separacji komórek.
  2. Wirowania
    1. Odwirować probówki o stężeniu 400 x g przez 5 minut przy temperaturze pokojowej przy włączonym hamulcu.
  3. Ponowne zawieszenie i zliczanie komórek
    1. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad neutrofili w 1 ml buforu do separacji komórek. Wykonaj zliczanie komórek, aby określić całkowitą liczbę neutrofili.
  4. Przygotowanie podłoża o gradiencie gęstości
    1. Ponownie odwirować probówki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej z włączonym hamulcem. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad neutrofili w 3 ml pożywki o gradiencie gęstości 55%. Aby uzyskać optymalną rozdzielczość, użyj 3 ml pożywki o gradiencie gęstości 55% na 5-6 × 106 całkowitych neutrofili.
    2. W razie potrzeby podziel zawieszone komórki na wiele wstępnie przygotowanych probówek gradientu gęstości, upewniając się, że 3 ml zawiesiny komórek jest ułożone warstwami w każdej probówce.
  5. Nakładanie warstw na rurki gradientu gęstości
    1. Zawiesinę komórkową o objętości 3 ml zawierającą pożywkę o gradiencie gęstości 55% należy powoli nakładać na gotowe probówki z gradientem gęstości (przygotowane zgodnie z opisem w sekcji 1). Zapewnij staranne nakładanie warstw, aby nie zakłócać gradientu.
  6. Wirowanie w gradiacji gęstości
    1. Wirować probówki o masie 720 x g przez 30 minut bez użycia hamulca. Po odwirowaniu należy ostrożnie obchodzić się z probówkami, aby nie naruszyć warstw.
  7. Izolacja frakcji neutrofili
    1. Po odwirowaniu obserwuj, jak neutrofile rozdzielają się na dwie odrębne warstwy:
      Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) będą zlokalizowane na granicy faz 55%/70%, tworząc górne pasmo na poziomie około 3 ml, a neutrofile o normalnej gęstości (NDN) będą znajdować się na granicy faz 70%/81%, pojawiając się jako dolne pasmo wokół znaku 6 ml.
    2. Za pomocą pipety transferowej ostrożnie odizoluj każdą warstwę i przenieś je do oddzielnych probówek o pojemności 15 ml.
  8. Mycie wydzielonych frakcji
    1. Aby zmyć wszelkie resztki pożywki o gradiencie gęstości, dodaj 1x PBS do każdej probówki o pojemności 15 ml do oznaczenia 15 ml.
    2. Wirować przy 400 × g przez 5 minut przy suchej temperaturze rynkowej z włączonym hamulcem. Jeśli komórki nie tworzą twardego osadu, a zamiast tego pozostają zawieszone, powtórzyć ten etap płukania, wskazując na obecność pozostałego podłoża o gradiencie gęstości.
  9. Zliczanie komórek i dalsze aplikacje
    1. Policz komórki w każdej frakcji i przystąp do dalszych zastosowań, takich jak eksperymenty metaboliczne, barwienie cytometrią przepływową, ekstrakcja RNA lub liza białek w razie potrzeby.
      UWAGA: Po wysianiu ogniw zaleca się obracanie płytki z prędkością 210 × g przez 1 minutę (hamulec wyłączony).

4. Fenotypowanie izolowanych LDN i NDN

  1. Wyizoluj ~ 0,5-1 × 106 LDN i NDN. Wykonaj 2x skoncentrowany mastermix przeciwciał przy użyciu bloku CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, Fc i barwienia żywotności.
  2. Wyizolowane populacje LDN i NDN wybarwić równoważną objętością mastermixu przeciwciał tak, aby końcowe rozcieńczenie przeciwciał barwiących komórki wynosiło odpowiednio 1:100 (CD14, CD86, CD15, CD16, CD10, blok Fc) i 1:50 (barwienie żywotności).
  3. Inkubować komórki przez 10 minut w ciemności w temperaturze RT.
    UWAGA: Upewnij się, że komórki są dokładnie wymieszane z mieszanką główną przeciwciał i blokiem Fc.
  4. Umyć komórki raz PBS, a następnie odwirować przy 400 × g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant.
  5. Utrwal komórki w 1% paraformaldehydzie (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  6. Ponownie przemyć komórki PBS, odwirować przy 400 × g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
  7. Zawiesić komórki w 200 μl PBS lub w razie potrzeby i jak najszybciej pobrać komórki na cytometrze przepływowym.
    UWAGA: Barwione i utrwalone komórki mogą być przechowywane przez krótki czas w temperaturze 4 ◦C w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu fluoroforów. Jednak najlepiej byłoby, gdyby procedura fenotypowania została przeprowadzona natychmiast po barwieniu i utrwaleniu, aby zapewnić optymalną żywotność komórek i dokładne wyniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udane nawarstwianie całkowitej liczby neutrofili na ośrodku gradientu gęstości można zaobserwować w Rysunek 1B. Należy uzyskać dwa odrębne pasma. Jeśli dojdzie do wymieszania gradientów lub całkowita liczba neutrofili ułożonych warstwowo w probówce jest wysoka (większa niż około 5-6 × 106), pasma będą wyglądały na rozproszone (Rysunek 1C), a ryzyko zmieszania się dwóch podtypów neutrofili znacznie wzrośnie. Aby uniknąć tego ostatniego, zalecamy nałożenie warstw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę podziału całkowitej populacji neutrofili na neutrofile o niskiej i normalnej gęstości, wraz z charakterystyką fenotypową każdego typu komórek za pomocą cytometrii przepływowej dostosowanej do poprzednich metod5.

Protokół ten opiera się na izolacji LDN i NDN z krwi pełnej. Kluczowym krokiem jest wyizolowanie całkowitej liczby neutrofili za pomocą metod selekcji negatywnej. Metody selekcji pozytywnej polegają na zastosowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Health Research Board EIA-2024-002 oraz Royal City of Dublin Hospital Trust. Chcielibyśmy podziękować dr Lorraine Thong i dr Kevinowi Brownowi za ich pomoc w pobraniu próbek od zdrowych dawców do tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
14 ml polipropylenowa probówka z okrągłym dnem (17 x 100 mm)Corning Science352059
APC anty-ludzki CD14 (63D3)BioLegend367118
Brilliant Violet 421 anty-ludzki CD10 (25 testów)BioLegend312217
Dulbecco's Saline buforowany fosforanemSigmaD8537-1L
MagnesEasySep EasyEightsStemCell Technologies#18103
EasySep Buffer (bufor do separacji komórek)StemCell Technologies#20144
EasySep Bezpośredni zestaw do izolacji ludzkich neutrofiliStemCell Technologies#19666
Odczynnik blokujący FcR, ludzkiMiltenyi Biotec130-059-901
FITC anty-ludzki CD16 (3G8)BioLegend302005
Kulki kompensacyjne OneComp eBeadseBioscience Inc.01-1111-42
PE/Cy7 anty-ludzki CD86 (BU63)BioLegend374209
PE/Dazzle 594 anty-ludzki CD15 (SSEA-1)BioLegend323037
Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanami Gibco18912-014
Zestaw do naprawy Zombie NIR BioLegend423105

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tracchi, I., et al. Increased neutrophil lifespan in patients with congestive heart failure. Eur J Heart Fail. 11 (4), 378-385 (2009).
  2. Ballesteros, I., et al. Co-option of neutrophil fates by tissue environments. Cell. 183 (5), 1282-1297.e18 (2020).
  3. Mckenna, E., et al. Neutrophils: Need for standardized nomenclature. Front Immunol. 12, 602963(2021).
  4. Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis Rheumatol. 29 (11), 1334-1342 (1986).
  5. Hardisty, G. R., et al. High purity isolation of low density neutrophils casts doubt on their exceptionality in health and disease. Front Immunol. 12, 625922(2021).
  6. Scapini, P., Marini, O., Tecchio, C., Cassatella, M. A. Human neutrophils in the saga of cellular heterogeneity: Insights and open questions. Immunol Rev. 273 (1), 48-60 (2016).
  7. Ssemaganda, A., et al. Characterization of neutrophil subsets in healthy human pregnancies. PLoS One. 9 (2), e85696(2014).
  8. Tay, S. H., Celhar, T., Fairhurst, A. M. Low-density neutrophils in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheumatol. 72 (10), 1587-1595 (2020).
  9. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. J Leukoc Biol. 107 (5), 809-818 (2020).
  10. Cowland, J. B., Borregaard, N. Isolation of neutrophil precursors from bone marrow for biochemical and transcriptional analysis. J Immunol Methods. 232 (1-2), 191-200 (1999).
  11. Blanco-Camarillo, C., Aleman, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Front Immunol. 12, 672520(2021).
  12. Park, J., et al. Low-density granulocytes display immature cells with enhanced NET formation in people living with HIV. Sci Rep. 13 (1), 13282(2023).
  13. Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  14. Ui Mhaonaigh, A., et al. Low density granulocytes in anca vasculitis are heterogenous and hypo-responsive to anti-myeloperoxidase antibodies. Front Immunol. 10, 2603(2019).
  15. Mosca, T., Forte, W. C. Comparative efficiency and impact on the activity of blood neutrophils isolated by Percoll, Ficoll and spontaneous sedimentation methods. Immunol Invest. 45 (1), 29-37 (2016).
  16. Ren, Y., et al. Increased apoptotic neutrophils and macrophages and impaired macrophage phagocytic clearance of apoptotic neutrophils in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 48 (10), 2888-2897 (2003).
  17. Connelly, A. N., et al. Optimization of methods for the accurate characterization of whole blood neutrophils. Sci Rep. 12 (1), 3667(2022).
  18. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes in systemic autoimmunity and autoinflammation. Immunol Rev. 314 (1), 313-325 (2023).
  19. Yennemadi, A. S., Keane, J., Leisching, G. Mitochondrial bioenergetic changes in systemic lupus erythematosus immune cell subsets: Contributions to pathogenesis and clinical applications. Lupus. 32 (5), 603-611 (2023).
  20. Futoh, Y., et al. Peripheral low-density granulocytes after colorectal cancer surgery in predicting recurrence. BJS Open. 7 (1), zrac154(2023).
  21. Dwivedi, A., et al. Emergence of dysfunctional neutrophils with a defect in arginase-1 release in severe COVID-19. JCI Insight. 9 (17), e171659(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

neutrofile o niskiej g sto cipodtypy neutrofiliseparacja w gradiencie g sto ciizolacja neutrofilicytometria przep ywowaizolacja za pomoc kulek magnetycznychkrew obwodowabufor do separacji kom rekheterogenno neutrofili

Powiązane artykuły