Izolacja i charakterystyka neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej

Anjali S. Yennemadi; Joseph Keane; Gina Leisching

doi:10.3791/67805

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i charakterystyka neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67805

⸱

7 lutego 2025

Anjali S. Yennemadi¹ , Joseph Keane¹ , Gina Leisching¹

¹TB Immunology Group, Department of Clinical Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, St James's Hospital, Trinity College Dublin, The University of Dublin

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj oferujemy niezawodne podejście do izolacji neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej za pomocą izolacji magnetycznej (selekcja negatywna) i podłoża o nieciągłym gradinie gęstości. Zapewnia nietkniętą izolację komórek o wysokiej czystości (≥93%), ułatwiając dokładną analizę subpopulacji neutrofili, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w zdrowiu i chorobie.

Streszczenie

Pojawiające się badania pokazują, że populacja krążących neutrofili u ludzi składa się z różnych podtypów i nie powinna być badana jako pojedyncza populacja, jak to miało miejsce w przeszłości. W szczególności wykazano, że neutrofile o niskiej i normalnej gęstości (LDN, NDN) mają funkcjonalnie i metabolicznie odrębne profile, co należy wziąć pod uwagę przy publikowaniu badań nad neutrofilami. W tym miejscu przedstawiamy zmodyfikowaną metodę nietkniętej izolacji i separacji LDN i NDN od krwi pełnej.

Medium o gradiencie gęstości (1,135 g/ml) jest łączone o 9:10 z 10x PBS. Specyficzne gradienty gęstości 55%, 70% i 81% są następnie wytwarzane przez połączenie pożywki o gradinie gęstości 100% z 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Neutrofile wyizolowane z 12 ml obwodowej krwi pełnej uzyskanej od dawców, którzy wyrazili zgodę przy użyciu zestawu do izolacji magnetycznej opartej na selekcji negatywnej, są ponownie zawieszane we frakcji 55%. Objętość 3 ml frakcji 81% i 70% umieszcza się warstwami w probówce o pojemności 15 ml, a następnie frakcję 55% zawierającą całkowitą liczbę neutrofili. Gradienty gęstości są następnie odwirowywane przy 720 x g przez 30 minut. Dwa odrębne pasma są uzyskiwane na granicy faz 55%/70% (LDN) i 70%/81% (NDN). Komórki są ostrożnie pipetowane do oddzielnych probówek i przemywane za pomocą PBS. Czystość wyizolowanych frakcji określa się za pomocą cytometrii przepływowej. Zarówno LDN, jak i NDN zdefiniowano jako CD14lo CD15+ SSChi za pomocą cytometrii przepływowej. Czystość izolacji obliczono na ≥93% komórek żywotnych dla obu typów.

Ta metoda zapewnia niezawodne i skuteczne podejście do oddzielania LDN i NDN od krwi obwodowej, zapewniając wysoką czystość i żywotność izolowanych komórek. Zwiększenie precyzji izolacji neutrofili ułatwia dokładniejsze dalsze analizy tych odrębnych subpopulacji neutrofili. Mają one kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat heterogeniczności neutrofili i jej implikacji w różnych kontekstach fizjologicznych i patologicznych.

Wprowadzenie

Neutrofile to ziarniste komórki odpornościowe i najliczniejsza leukocyty we krwi obwodowej, stanowiące średnio około 50%-70% leukocytów. Rozwijają się one w szpiku kostnym z prekursorów granulocytów-monocytów (GMP), które z kolei rozwijają się z hematopoetycznych komórek progenitorowych (HPC) w obecności czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF). W homeostazie mają długość życia ~24 godziny, ale badania wykazały, że ich żywotność może być przedłużona w określonych warunkach fizjologicznych i związanych z nimi mikrośrodowiskach, takich jak przewlekła aktywacja immunologiczna¹, zapalenie¹, a nawet pobyt....