Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Podsumowanie

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Streszczenie

RASopatie to zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją ERK, prowadzące do chorób wieloorodowych, które mogą również prowadzić do predyspozycji do nowotworów. Pomimo szerokiej heterogeniczności genetycznej, mutacje przyrostu funkcji linii zarodczej w kluczowych regulatorach szlaku RAS-MAPK stanowią podstawę większości przypadków, a dzięki zaawansowanym technikom sekwencjonowania potencjalnie patogenne warianty wpływające na szlak RAS-MAPK są nadal identyfikowane. Funkcjonalna walidacja patogenności tych wariantów, niezbędna do dokładnej diagnozy, wymaga szybkich i wiarygodnych protokołów, najlepiej in vivo. Biorąc pod uwagę niedobór skutecznych terapii we wczesnym dzieciństwie, takie protokoły, zwłaszcza jeśli są skalowalne w opłacalnych modelach zwierzęcych, mogą być kluczowe dla stworzenia przedklinicznych podstaw do przestawiania i ponownego wykorzystania leków.

Tutaj szczegółowo opisujemy krok po kroku protokół szybkiego generowania przejściowych modeli RASopatii w embrionach danio młodego oraz bezpośrednią inspekcję zmian aktywności ERK związanych z chorobą zachodzących już podczas gastrulacji za pomocą wielospektralnego obrazowania Förstera rezonansowego transferu energii (FRET) w czasie rzeczywistym. Protokół wykorzystuje transgeniczny raporter ERK, niedawno zainstalowany i zintegrowany ze sprzętem mikroskopów komercyjnych. Przedstawiamy przykładowe zastosowanie modeli danio nosaczonych (NS) uzyskanych przez ekspresję Shp2^D61G. Opisujemy prostą metodę, która umożliwia rejestrację zmiany sygnału ERK w modelu ryb NS przed i po modulacji sygnału farmakologicznej za pomocą dostępnych inhibitorów MEK w niskiej dawce. Szczegółowo opisujemy, jak generować, odzyskiwać i oceniać ratiometryczne sygnały FRET z wielospektralnych akwizycji przed i po leczeniu oraz jak weryfikować wyniki poprzez klasyczną immunofluorescencję na całych zarodkach we wczesnych stadiach. Następnie opisujemy, jak poprzez analizę standardowych parametrów morfometrycznych można zapytać o późne zmiany kształtu zarodka, wskazujące na wynikające z tego zaburzenie gastrulacji, u tych samych embrionów, których aktywność ERK jest oceniana za pomocą żywego FRET 6 godzin po zapłodnieniu.

Wprowadzenie

RASopatie to zespoły genetyczne, które zahamują prawidłowy rozwój i wpływają na różne narządy oraz tkanki. Schorzenia te często są spowodowane mutacjami linii zarodkowej (GoF) w kluczowych genach i uczestnikach sygnalizacji RAS/MAK, co skutkuje hiperaktywacją (zwiększoną fosforylacją) kinazy sterowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK). ERK reguluje niektóre podstawowe procesy ważne podczas rozwoju – wzrost tkanek – poprzez translokację do jądra ^1,2. Mutacje somatyczne w genach zaangażowanych w szlak RAS-MAPK są najczęstszymi zdarzeniami prowadzącymi do raka³. Nic dziwnego więc, że predyspozycje do nowotworów obserwuje się także w RASopatiach. Zespół Noonana (NS), charakteryzujący się opóźnieniem rozwojowym, niskim wzrostem, deficytami poznawczymi o zmiennym nasileniu oraz kardiomiopatią, jest najczęstszą formą RASopatii². W większości przypadków choroba jest wywoływana przez mutacje GoF w PTPN11, pierwszym genie RASopatii odkrytym na początku 2000 roku, 4 kodującym białko tyrozynową fosfatazę SHP2, która pełni funkcję dodatniego regulatora szlaku.

Od tego czasu, dzięki wykładniczemu zastosowaniu metod sekwencjonowania egzomu u niezdiagnozowanych pacjentów, potencjalnie patogenne warianty wpływające na czynniki związane z RAS-MAPK, prawdopodobnie powiązane z różnymi formami RASopatii, są nadal odkrywane i czekają na funkcjonalną charakterystykę dla efektywnej stratyfikacji pacjentów². Aby osiągnąć ten cel, wymagane są protokoły eksperymentalne gwarantujące szybkie i informacyjne prawidłowe walidację funkcjonalną na poziomie organizmu. Wykorzystanie klasycznych i standaryzowanych modeli ssaków do testowania wariantów o nieznanym znaczeniu byłoby kosztowne, bardzo czasochłonne i wymagałoby inwazyjnych metod u nieprzezroczystych dużych zwierząt. Taka strategia wyraźnie nie jest zgodna z wymogiem szybkich testów, biorąc pod uwagę obciążenie społeczne związane z ubogimi lub niezdiagnozowanymi pacjentami z RASopatią, obecnie bez leczenia i leczenia. Protokoły ilościowej oceny kluczowych cech fenotypowych i molekularnych korelatów w całych organizmach służyłyby również przyspieszeniu możliwej translacji klinicznej leków dostępnych dla pacjentów z RASopatią poprzez ponowne wykorzystanie i przepozycjonowanie.

Danio pręgowany jest idealnym modelem kręgowców do badania chorób wpływających na wczesny rozwój. Na początek, danio pręgowane dzieli wysoki poziom genetycznej homologii z ludźmi. Wysoka płodność dorosłych ryb skutkuje dużą produkcją małych zarodków, które rozwijają się szybko. Zarodki są przezroczyste na wczesnym etapie, dzięki czemu główne procesy rozwojowe – epibolia, gastrulacja, osie i kształtowanie się ciała – można łatwo zobrazować za pomocą standardowej mikroskopii. Ponadto dostępność linii transgenicznych, które mogą być wykorzystywane do śledzenia specyficznego zachowania komórkowego i dynamicznych zdarzeń molekularnych w przestrzeni i czasie podczas rozwoju, w połączeniu z zaawansowanymi technikami generowania modeli genetycznych, jest nie do pobicia. Ponadto odczyty fenotypowe można oceniać na wielu poziomach u danio pręgowanego (od defektów organizmowych po komórkowe), a dedykowane testy są już opracowane dla kilku chorób, w tym RASopathies⁵. Ponadto stosunkowo proste metody zanurzenia w kąpieli do podawania leków we wczesnych stadiach, przynajmniej dla związków rozpuszczalnych w wodzie, pozwalają na wysokoprzepustowe badania leków in vivo w formacie 96-dołkow.

Z molekularnego punktu widzenia badania wykorzystujące standardowe podejścia, takie jak immunohistochemia i immunoblot, wyraźnie wykazują korelację między aktywacją ERK a wadami rozwojowymi związanymi z RASopatią w zarodkach ryb ^6,7. Niedawno opracowany biosensor FRET typu EKAR u danio (Tg[ef1a:ERK biosensor-nes], Teen) stanowi niezawodne narzędzie in vivo do rejestrowania aktywacji ERK podczas embrigenezy w sposób rozdzielony czasowo-przestrzennie. Dlatego może być cenny do lepszej oceny dynamicznych zmian ERK i modulacji farmakologicznych w modelach ryb RASopathy.

W czujniku Teen specyficzny substrat ERK w reporterze jest fosforylowany podczas aktywacji ERK, wywołując zmianę konformacyjną, która w bliskim sąsiedztwie sprowadza do obecności dawcy fluorescencyjnego CFP (D) oraz akceptora fluorescencyjnego Ypet (ulepszony YFP) (A). Jeśli widmo emisji D znacznie pokrywa się ze spektrum absorpcji A, może wystąpić FRET (absorpcja energii z D do A). Jest to proporcjonalne do odległości między D a A, a więc w Teen, do statusu aktywacji ERK. Różne protokoły obrazowania można skonfigurować zarówno przy użyciu standardowych, jak i zaawansowanych modułów obrazowania standardowych lub konfokalnych mikroskopów zarówno w próbkach żywych, jak i stałych. Po wzbudzeniu D, pozyskanie wielospektralnych skanów wzdłuż określonego spektrum emisji (λ) od CFP do YFP, a następnie algorytmów spektralnego "rozmieszania", jest jedną z najbardziej wiarygodnych metod rejestracji i ilościowego określenia danych FRET⁸. Może być również stosowany do żywych okazów danio pręgowanego w celu rejestrowania dynamiki tkanek in vivo .

Na podstawie wcześniejszych raportów ^6,9 oraz naszej najnowszej aplikacji⁷, tutaj szczegółowo opisujemy krok po kroku workflow z użyciem młodych ryb do oceny aktywacji ERK w komórkach na marginesie zwierzęcego bieguna modeli NS na początku gastrulacji oraz korelujemy go z charakterystycznymi defektami osi ciała widocznymi dopiero później w rozwoju. Pokazujemy, jak uzyskać i przeanalizować ilościowe dane FRET z żywych gastruli NS przed i po leczeniu dostępnym MEKi oraz jak weryfikować wyniki za pomocą standardowej immunohistochemii względem fosforylowanego (aktywnego) ERK lub przeprowadzić korelacyjną morfometryczną analizę defektów wydłużania zarodków.

Workflow ten mógłby być stosowany do zwiększenia funkcjonalnych testów nowych wariantów i genów chorób domniemanych z RASopatiami oraz uzyskania wglądu w korelację dynamiki aktywacji ERK przestrzennie i czasowo podczas rozwoju kręgowców oraz defektów morfologicznych w embrionach. Pokazujemy, że protokół ten może być również używany do testowania skuteczności leków kandydatów na modulację aktywacji ERK.

Protokół

Wszystkie eksperymentalne procedury dotyczące hodowli i hodowli zwierząt były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi ARRIVE dotyczącymi stosowania danio danio w badaniach na zwierzętach i zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (Direzione Generale della Sanità Animale e dei Farmaci veterinari - DGSAF). Wszystkie reakcje DNA/RNA oraz sesje obrazowe mogą być skalowane lub skalowane według uznania, w zależności od wymaganego materiału końcowego lub liczby testowanych genów i wariantów.

1. Generowanie i leczenie farmakologiczne przejściowych modeli rasopatii danio pręgowanej

UWAGA: Do monitorowania ekspresji wariantów związanych z RASopatią można użyć konkretnych konstrukcji zawierających pożądaną sekwencję kodującą (cds) interesującego białka w ramce z cdami małych niefluorescencyjnych tagów (takich jak myc lub podobne). W ten sposób poziomy ekspresji zmutowanego białka można ocenić za pomocą standardowego western blota na tle tagu. Jeśli dostępne są przeciwciała przeciwko konkretnemu interesującemu się białku, można unikać tagów. Immunofluorescencja może być również wykorzystywana do oceny ekspresji białek w tkance zarodka, zgodnie ze standardowymi protokołami. Tego typu eksperyment kontrolny może być przydatny do korelacji ekspresji białek mutantów z indukowanymi poziomami aktywacji ERK. Stosowanie znaczników fluorescencyjnych nie jest zalecane w połączeniu z obrazowaniem FRET, ze względu na możliwe zakłócenia emisji fluorescencji podczas mikroskopii.

1. Liniaryzacja plazmidów (dni 1-2) (Rysunek 1A)
   UWAGA: Przy generowaniu przejściowego modelu choroby danio (tutaj RAsopath) spowodowanego mutacją GoF dotyczącą konkretnego genu, szybkie podejście polega na przygotowaniu mRNA kodującego dziki typ (WT) oraz interesujące białko mutanta, które następnie należy wstrzyknąć zarodkom danio pręgowanego według poniższych kroków. Plazmid użyty jako szablon do transkrypcji mRNA powinien zawierać pożądaną pełną długość CDS (sekwencję kodującą) dla interesującego genu sklonowanego dalej niż promotor polimerazy T7, Sp6 lub T3 oraz sygnał poliadenylacji (poliA) przed nim. Jeśli nie jest dostępny, pierwszym krokiem jest jego wyprodukowanie przez sklonowanie dano dano danowanego lub pożądanego przez człowieka CDS w odpowiednim wektorze¹⁰ i weryfikację za pomocą sekwencjonowania SANGER. Do klonowania warto rozważyć dodatkowy czas (średnio tydzień, wliczając klonowanie, przesiewanie kolonii oraz izolację i rozbudowę odpowiednich klonów).
   1. Liniaryzuj plazmid odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, przecinając sygnał polyA (tutaj KpnI) tylko raz za nim. Aby osiągnąć efektywną linearyzację plazmidów, wymieszaj 3 γ (μg/μL) DNA plazmidowego, 2 μL enzymu restrykcyjnego (20 000 Unit/mL) oraz 10 μL buforu reakcji 10x w końcowej objętości 100 μL w wodzie wolnej od nukleazy. Dokładnie wymieszaj składniki, pipetując kilka razy i inkubuj mieszankę reakcji w 37 °C przez 2-4 godziny.
   2. Sprawdź efekt linearyzacji przez elektroforezę na żelu agarozowym o pojemności 1,5%.
      1. Rozcieńcz 10x roztwór bazowy TBE (48,5 g Tris, 11,4 mL kwasu octowego lodowca, 20 ml 0,5 M EDTA [pH 8,0]) wodą wolną od nukleazy.
      2. Przygotuj żel agarozy, rozpuszczając w mikrofalówce 1,5 g agarozy w ostatecznej objętości 100 mL roztworu 1x TBE. Następnie dodaj 3,5 μL barwnika żelu.
      3. Żel należy wylać, wlewając roztwór agarozy do komór o odpowiedniej wielkości, w zależności od liczby warunków i plazmidów. Ustaw grzebienie i odczekaj około 1 godziny, aż żel się zastygnie; Następnie usuń grzebienie i umieść zpolimeryzowany żel w odpowiedniej tacce żelowej do elektroforezy.
      4. Wymieszaj kilka μL strawionego plazmidu ("cut") i 1,5 μL buforu 6x obciążenia (zawierającego barwnik do monitorowania elektroforezy) w końcowej objętości 10 μL wody wolnej od nukleazy. Przygotuj w ten sam sposób osobną próbkę kontrolną z niestrawionym plazmidem ("nieprzeciętym"). Załaduj próbki na agarozowych torach, a na pierwszym torze załaduj drabinę DNA o masie 1 Kb. Wykonaj elektroforezę DNA przy napięciu 100 V przez 30 minut.
      5. Wizualizuj i dokumentuj pasma DNA powstałe w wyniku pracy na standardowym transiluminatorze UV. Sprawdź efektywność linearyzacji plazmidów, badając wzór pasm DNA porównując "cięcie" i "nieobrzezane".
         UWAGA: Plazmidy wystarczająco zlinearyzowane powinny działać szybciej jako jeden ostry pas. Upewnij się, że rozszczepienie DNA jest kompletne, ponieważ rozpoczęcie reakcji transkrypcyjnej jest kluczowym krokiem ograniczającym i może być utrudnione przez obecność okrężnych form plazmidów, co skutkuje słabą wydajnością mRNA.
   3. Przystąpić do oczyszczenia zlinizowanego plazmidu za pomocą dostępnych komercyjnie zestawów do oczyszczania DNA opartych na kolumnie spinowej i przechowywać oczyszczone preparaty DNA w temperaturze -20 °C do czasu potrzeby.
      UWAGA: Zamiast linearyzacji możliwe jest wykorzystanie produktu PCR jako wzorca do transkrypcji mRNA, pod warunkiem, że obejmuje on sekwencję promotora polimerazy umieszczoną przed nią oraz sekwencję sygnału poliA poniżej kodonu stopowego. Produkty PCR powinny być również oczyszczane i sprawdzane na żelu agarozowym przed rozpoczęciem leczenia.
2. Transkrypcja, oczyszczanie i kontrola jakości in vitro mRNA (dni 2-3) (Rysunek 1A)
   UWAGA: dokładnie czyść obszar roboczy i pipety roztworami dekontaminującymi RNAzy. Używaj materiałów i odczynników wolnych od nukleazy; Noś rękawiczki. To zminimalizuje skażenie RNaz i pozwoli na lepszy wyciąg pełnowymiarowego mRNA.
   MRNA z kapsułką i poliadenylowanymi transkrybują, kodujące białka WT i mutantów z zliniaryzowanych plazmidów, wykorzystujące standardowe zestawy do transkrypcji in vitro mRNA i zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. Wiruj oczyszczony zlinearyzowany plazmid przez kilka sekund przy 17 949 × g , aby upewnić się, że zanieczyszczenia zostaną zebrane na dnie probówki i nie zostaną przeniesione do reakcji transkrypcji.
   2. Wszystkie składniki rozmrażamy w temperaturze pokojowej (RT) z wyjątkiem mieszaniny analogów NTP i CAP, które są przechowywane na lodzie. Utrzymuj polimerazę w temperaturze -20 °C do użycia.
   3. Przed użyciem krótko wiruj wszystkie odczynniki w 17 949 × g , aby zapobiec utracie lub przypadkowemu zanieczyszczeniu, a następnie krótko wiruj bufor reakcji 10x oraz gotową do użycia mieszankę analogową NTP/CAP, aż będą całkowicie roztworzone. Zachowaj 10x bufor reakcji na RT.
   4. Przygotowanie reakcji transkrypcyjnej w RT, dodając 600-800 ng zlinearyzowanego i oczyszczonego plazmidu do roztworu zawierającego 10 μL mieszaniny analogowej 2x NTP/CAP, 2 μL buforu reakcji 10x, 2 μL enzymu SP6, T7 lub T3 (w zależności od konkretnego promotora znajdującego się przed CDS w plazmidzie) w końcowej objętości 20 μL uzupełnionej wodą wolną od nukleazy. Dokładnie wymieszaj, pipetując kilka razy w górę i w dół.
   5. Inkubuj reakcję transkrypcyjną w temperaturze 37 °C w termocyklerze. Pamiętaj też, aby ustawić temperaturę pokrywki na 37 °C i prowadzić reakcję przez 2 godziny.
   6. Aby usunąć resztki plazmidów, które nie zostały przepisane podczas reakcji, należy dodać 1 μL standardowego roztworu DNA (2 jednostki/μL). Dokładnie wymieszaj reakcję, pipetując kilka razy i inkubuj w 37 °C przez dodatkowe 30 minut.
   7. Przed rozpoczęciem sprawdź jakość i integralność mRNA syntetyzowanego in vitro za pomocą elektroforezy TBE/formamid agarozy. Rozpuść 1,0 g agarozy w 50 mL roztworu 1x TBE, dodać 5,5 mL 37% formamidu i 3,5 μl barwnika żelu, wymieszać i odlewać żel zgodnie z powyższym wyjaśnieniem.
      UWAGA: Podczas obsługi formamidu należy nosić środki ochrony osobistej (PPE) i używać kaptura chemicznego.
   8. Wymieszaj 1 μL transkrybowanego mRNA z 2,5 μL 2x buforu załadunku barwnika formamidowego w wodzie wolnej od nukleazy o łącznej objętości 5 μL. Dokładnie wymieszaj składniki, pipetując kilkukrotnie i ładując próbki do torów żelowych. Uruchom żel na 100 mV przez 10-15 minut w schłodzonym buforze 1x TBE. Zrób też 1 kb DNA i/lub RNA Ladder.
   9. Opcjonalnie: Denaturacja drabiny i mRNA w 70 °C przez 10 minut.
   10. Wizualizuj i dokumentuj powstałe pasma mRNA na standardowym transiluminatorze UV.
       UWAGA: Długie okresy i wysokie temperatury zwiększają prawdopodobieństwo degradacji RNA.
   11. Jeśli integralność i rozmiar syntetyzowanego RNA z kapsułką są optymalne, należy przystąpić do poliadenylacji C-terminalu, dodając do reakcji: 36 μL wody wolnej od nukleazy, 20 μL buforu obciążenia 5x denaturującego, 10 μL 25 mM MnCl₂, 10 μL 10 mM ATP oraz 4 μL enzymu poliadenylacyjnego (np. oczyszczonego E. coli Poli(A)polimeraza). Dokładnie wymieszaj reakcję, pipetując kilka razy i inkubuj 100 μL końcowej reakcji w 37 °C przez kolejne 1 godzinę.
       UWAGA: Nie zaleca się sprawdzania jakości RNA za pomocą elektroforezy żelowej po reakcji poliA, ponieważ RNA będzie wyglądać na rozmazane z powodu ogonów poliA.
   12. Wytrącają i odzyskują syntetyzowane, zakapowane i poliadenylowane mRNA przy użyciu odpowiednich soli, takich jak LiCl. Krótko mówiąc, wymieszaj równe ilości wody wolnej od nukleazy i standardowego roztworu LiCl 2,5 M (30 μL) i inkubuj przez >30 minut w temperaturze -20 °C.
       UWAGA: Efektywne wytrącanie można uzyskać po 2 godzinach, ale inkubacja nocna zazwyczaj zwiększa końcową wydajność mRNA.
   13. Aby wypuścić oczyszczone mRNA, odwiruj reakcję przez 30 minut w temperaturze 4 °C przy 17 949 × g i usuń supernatant. Następnie przemyj pellet ~1 mL etanolu 70% (EtOH) i wiruj przez 15 minut w temperaturze 4 °C przy 17 949 × g , aby usunąć zanieczyszczenia i pozostałe nukleotydy z reakcji.
   14. Susz granulat na powietrzu, a następnie ponownie zawiesij go w 20 μL wody wolnej od nukleazy. Dobrze rozpuszczaj RNA, delikatnie i wielokrotnie pipetując w RT i inkubuj po 10 minutach.
       UWAGA: Sprawdzaj granulki co 5 minut, aby upewnić się, że EtOH odparowuje. Podczas ponownego zawieszania, ze względu na lepkość RNA, pipetuj je aż do prawidłowego rozpuszczenia w wodzie.
   15. Ocenić stężenie i czystość przygotowanego mRNA, mierząc absorpcję na poziomie 260 nm i 280 nm (stosunek 260/280) w spektrofotometrze. Mierz różne skalarne rozcieńczenia przygotowania RNA, aby zapewnić prawidłowe estymowanie stężenia.
       UWAGA: Zazwyczaj stężenie syntetyzowanego RNA wynosi od 1 do 2 μg/mL, jednak ostateczna ilość może się różnić w zależności od długości CDS i ilości materiału wyjściowego.
   16. Podczas oceny jakości utrzymuj zapas mRNA w lodzie, następnie przedzielaj je na 5 μL alikwoty i przechowywaj w temperaturze -80 °C do czasu potrzeby wstrzyknięcia.
3. Przygotowanie standardowych roztworów i materiałów do zastrzyków zarodków oraz leczenia farmakologicznego (dni 2-3, rysunek 1B)
   1. Pobieranie igieł do mikroiniekcji dla zarodków danio dano majgowanego za pomocą sterylnych naczyń włosowatych (standardowe wymiary kapilary: 1,0 OD x 0,58 średnica x 100 L mm). Użyj komercyjnie dostępnego urządzenia do wyciągania i zastosuj pożądane ustawienia w zakresie napięcia wyjściowego, trybu ciągnięcia (jeden lub dwa kroki) oraz siły ciągnięcia, aby uzyskać zmienną długość, średnicę i kształt igły. O najczęściej używanych cechach igieł dla danio dano można znaleźć w Abdelrahman i współpracownikach¹¹.
      UWAGA: Optymalne warunki mogą się różnić w zależności od laboratoriów, ponieważ warunki środowiskowe (takie jak wilgotność czy temperatura pokojowa) mogą wpływać na wyniki wyciągania igły. Ustawienia powinny być regularnie testowane i kalibrowane. Igły wyciągane można przechowywać w RT w czystych pojemnikach przez kilka miesięcy.
   2. Przygotuj 30x roztwór "Danieau" o pH 7,6, rozpuszczając 101,7 g NaCl, 1,56 g KCl, 2,96 g MgSO₄ x 7H_2O, 4,25 g Ca(NO₃)₂ oraz 35,75 g HEPES w 1 L wody podwójnie destylowanej (DD) do przygotowania roztworu mikroiniekcji. Przygotuj także roztwór zapasowy Phenol Red w stężeniu 5% w wodzie DD, który zostanie użyty jako widoczny ślad mieszanki do wstrzykiwania.
   3. Przygotuj roztwór podłoża E3 do wzrostu zarodka, rozcieńczając 4 mL NaCl (5 M), 680 μL KCl (1 M), 1,32 mL CaCl₂ x 2H₂O (1 M) oraz 1,32 mL MgSO₄ (1 M) w końcowej objętości 4 L wody z odwróconej osmozy.
   4. Przygotuj roztwory zapasowe pożądanych leków (w tym przykładzie: inhibitor MEK [MEKi] PD032590) jako roztwory zapasowe zgodnie z kartą katalogową produktu i rozpuszczalnością (10 mM wybranego MEKi poprzez rozpuszczenie 5 mg w 1,036 mL DMSO). Dokładnie wymieszaj i wygeneruj małe aliquoty, które można przechowywać w temperaturze -80 °C do użycia.
      UWAGA: DMSO to powszechny rozpuszczalnik stosowany do rozpuszczania zarówno związków polarnych, jak i niepolarnych, wykazując rozpuszczalność w szerokim zakresie rozpuszczalników organicznych oraz w wodzie.
   5. Przygotuj żywą zawiesinę krewetek solanych, pozwalając wykluć się torbielom Artemia salina w roztworze wykluwowym (2 g/L cyst Artemia salina w 30 g/l soli oceanicznej wcześniej rozpuszczonej w wodzie odwróconej osmozy) w temperaturze 28-30 °C przez co najmniej 18 godzin, zapewniając stałą napowietrzanie.
      UWAGA: Warunki hodowli i czas wylęgu mogą być zależne od warunków środowiskowych i torbieli i należy je regularnie testować i w razie potrzeby ponownie ustawiać.
4. Przygotowanie par lęgowych dla ryb Tg[ef1α:ERK biosensor-nes] (nastolatki) (dzień 3)
   1. W dniu godu regularnie karmij dorosłe pary zgodnie z zatwierdzonym protokołem placówki zwierzęcej.
      1. Oczyść hodowlę zawierającą wyklute krewetki solankowe, filtrując niewyklute lub puste cysty za pomocą dwóch sitek o różnych rozmiarach filtrów (krok I: 180 μm, krok II: 112 μm).
      2. Zbierz i przemyj przefiltrowane krewetki solankowe w 200 mL wody z odwróconą osmozą, aby nakarmić 10-15 dorosłych ryb około 5-10 ml roztworu krewetek solowych.
         UWAGA: Sprawdź jakość roztworu z wyklutych krewetek solowych, obserwując ich żywotność, ruchliwość, rozmiar i kolor oraz upewnij się, że usuwasz niewyklute lub puste torbiele, które są niestrawne dla ryb i mogą szkodzić przewodowi pokarmowemu ryb. W przypadku par lęgowych zaleca się podawanie ostatniego posiłku dnia co najmniej 3 godziny przed izolacją par w zbiorniku hodowlanym, aby umożliwić trawienie pokarmu i utrzymać wysoką jakość wody.
   2. Wybieraj pary ryb, które nie były parowane do kopulacji przez (co najmniej) ostatnie 2 tygodnie, aby zminimalizować stres i umożliwić rozwój gamet. Zaaklimatyzuj wybrane dorosłe pary młodych ryb (zwykle o takim składzie: 1 ♂ : 2 ♀) w odpowiednich zbiornikach lęgowych. Oddziel samice od samców, używając przegrody do akwarium do następnego ranka. Zapewnij standardowy cykl światła/ciemności 14/10 godzin.
      UWAGA: Można również organizować krzyże grupowe. Jednak w tym przypadku tarło może odbywać się w różnych momentach, a selekcja zarodków na tym samym etapie z mięgów mieszanych staje się trudniejsza. Przejście z ciemności do jasnej jest kluczowe dla udanego kopulacji.
5. Pobieranie zarodków i mikrowstrzykiwanie WT oraz mutowanych mRNA (dzień 4)
   1. Gdy tylko światło zostanie włączone w obiekcie, usuń dzielnik oddzielający samce i samice, a jeśli to konieczne, wymień około 20% wody z akwarium na świeżą z systemu recyrkulacyjnego akwakultury, aby utrzymać wysoką jakość wody bez nadmiernego rozcieńczania hormonów uwalnianych przez ryby.
   2. Nie ruszaj ryby i regularnie sprawdzaj, czy nie składają jaj (zwykle w pierwszych 30 minutach do godziny światła dziennego). Jaja (2-3 mm) są składane i opadają na dno akwarium, oddzielone siatką, tak że dorosłe nie mogą ich zjeść. Odizoluj dorosłe osobniki, które skutecznie się rozmnażały, i przecedź wodę z jajami w akwarium przez standardowe sitko (np. sitko do herbaty), aby zatrzymać jaja.
      UWAGA: Możliwe jest umieszczenie tej samej ryby z powrotem w zbiorniku hodowlanym na kolejną rundę godową lub odesłanie do pierwotnych zbiorników kryjowych, rejestrując parę godową, datę i osiągi.
   3. Przemyj zebrane zarodki świeżym medium E3 i usuń niezapłodnione, zdegenerowane komórki jajowe, kał i inne zanieczyszczenia z par za pomocą pipety Pasteura.
      UWAGA: Zbieraj ~n = 100 zapłodnionych jaj nastolatków w szalce Petriego o średnicy 90 mm, aby uniknąć przeludnienia zarodków.
   4. Ułóż i ułóż zapłodnione jajeczka nastolatków na niestandardowej mikroiniekcji, uzyskanej przez formowanie 2% agarozy w medium E3, aby uzyskać odpowiednie tory, które muszą zatrzymać i ograniczyć komórki jajowe podczas mikroiniekcji.
      UWAGA: W tym celu można używać form wykonanych na zamówienie lub komercyjnych.
   5. Przygotuj świeżą mieszankę mikroiniekcji do generowania mutantów w następujący sposób: 30-60 pg zakapowanego i poliadenylowanego mRNA (tutaj shp2) rozpuszczonego w 0,3x roztworze Danieau (rozcieńczonego z roztworu zapasowego) dla końcowej objętości 20 μL. Dodaj 0,2 μl (0,05%) roztworu Phenol Red jako mikroiniekcyjne znaczniki.
   6. Dodaj do igły 2 μL materiału do wtrysku za pomocą pipety mikroładowającej. Wstrzyknij roztwór do stadium jednokomórkowego zarodków młodych danio danio za pomocą komercyjnie dostępnego mikroiniektu ciśnieniowego, ręcznie regulując ciśnienie i czas, aby skalibrować każdy zastrzyk w zależności od jakości igły i zarodka. Należy odwołać się do standardowych protokołów mikroiniekcji danio danio dostępnych w literaturze^11,12.
   7. Mikrowstrzyknięte zarodki nastolatków w warunkach kontrolowanego hodowli (temperatura: 28 °C, wilgotność: 70%, cykl światła/ciemności: 14/10 h) dla optymalnego rozwoju i usuń wszelkie jajeczka wyglądające na mętne lub zdegenerowane w ciągu następnych 3 godzin po złożeniu.
   8. Po ~4 godzinach po zapłodnieniu (HPF) przesiewaj zarodki pod kątem fluorescencji (ekspresja reporterowa) za pomocą standardowego stereomikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednimi ustawieniami lampy i filtra (465-500 nm). Do obrazowania FRET używaj ryby z pozytywnym wynikiem nastolatków oraz rodzeństwo negatywne do ocen immunohistochemicznych (IHC) (patrz poniżej).
      UWAGA: Biorąc pod uwagę znaną zmienność ekspresji transgenów opartych na Tol2¹³, zarodki mogą wykazywać różne poziomy fluorescencji nastolatków . Zaleca się badanie rodzeństwa nieiniekowanego w celu kontroli zmienności fluorescencji między osobami w danej partii, a biorąc pod uwagę niski zakres dynamiczny obrazowania FRET, odrzucenie zarodków o bardzo niskim poziomie fluorescencji podstawowej.
6. Leczenie zarodków danio dano za pomocą inhibitora MEK (MEKi) (dzień 4)
   1. Przygotuj roztwór pośredni MEKi PD0325901 (1 mM), rozcieńczając 1 μL roztworu 10 mM z 9 μL w medium E3. Użyj roztworu pośredniego, aby uzyskać ostateczne roztwory w niskiej dawce. Przygotuj niską dawkę (0,25 μM) PD0325901 MEKi o łącznej objętości 3 mL, mieszając 0,75 μL roztworu pośredniego o pojemności 1 mM z 2,25 μL medium E3. Rozcieńcz 0,75 μL 10% DMSO z 2,25 mL medium E3, aby uzyskać roztwór kontrolny (Ctrl).
   2. Umieść baseny zarodków o równej liczbie w różnych dołkach na 6-dołkowej płytce i rozpocznij leczenie zanurzeniem w kąpieli: dla każdego dołku zamień podłoże E3 na podłoże zawierające nośnik E3 (0,0025% DMSO) lub rozcieńczone leki w pożądanym stężeniu (0,25 μM, 0,0025% DMSO), jak wspomniano wcześniej. Użyj 3 mL roztworu leku na dołek.
      UWAGA: Aby wyeliminować wszelkie skutki spowodowane zmiennym stężeniem nośnika (DMSO), ważne jest, aby zarówno roztwory kontrolne, jak i lecznicze miały takie samo końcowe stężenie DMSO.
   3. Utrzymuj obtraktowane zarodki w temperaturze 28 °C przed pobraniem aż do pożądanego etapu rozwoju do testów kontrolnych (tutaj: analiza morfometryczna i walidacja IHC).

2. Obrazowanie na żywo wielospektralne FRET modeli danio RASopathy w stadium gastruli oraz analiza danych

1. Montaż gastruli do obrazowania na żywo (dzień 4) (Rysunek 2A)
   1. Przygotuj podłoże mocujące żywe zarodki, rozpuszczając 1,5 g niskotopniącej agarozy (LMA) w 1x PBS, aby uzyskać 1,5% LMA/E3.
      UWAGA: Wybierz stężenie agarozy od 0,8 do 1,5% w zależności od etapu rozwoju i specyficznej potrzeby powstrzymania ryby. Rozprowadz świeżo przygotowany roztwór LMA w aliquotach o pożądanym formacie i przechowuj LMA w stanie polimeryzowanym w RT (stabilny przez kilka miesięcy). Minimalizuje to zanieczyszczenie bakteryjne i grzybiczne, ale regularnie sprawdzaj jakość aliquotu LMA przed użyciem.
   2. Przed montażem próbki stopić 1,5% LMA aliquot w termomieszarce lub sterylnej kąpieli wodnej w temperaturze 50 °C. Po rozpuszczeniu temperatura termomieszacza należy obniżyć do około 30 °C.
   3. Umieść pojedynczy wstrzyknięty zarodek Teen⁺ (tutaj żołądkę ekspresyjną Shp^D61G) w centrum szklanej podstawy o średnicy 35 mm do obrazowania na żywo i ukierunkuj go za pomocą cienkiego włosa. Usuń nadmiar podłoża E3 i unieruchom zarodek, narzucając na niego kroplę LMA i pozostawiając go do polimeryzacji w RT.
      UWAGA: Na początku procesu polimeryzacji rybę można ustawić w pożądanej pozycji. Zaleca się stosowanie LMA w temperaturze nie wyższej niż 35 °C, aby uniknąć uszkodzeń tkanek.
2. Ustawianie parametrów mikroskopii i wykonanie wielospektralnego obrazowania żołądkowego (dzień 4) (Rysunek 2B)
   UWAGA: Protokół dotyczy korzystania z każdej platformy mikroskopii konfokalnej wyposażonej we cały niezbędny sprzęt i oprogramowanie do wykonywania obrazowania FRET. Zastosowaliśmy tam mikroskop konfokalny wyposażony w laser argonowo-jonowy o liniach długości fali 458-476-488-496-514 nm, programowalny rozdzielacz wiązki akustowo-optycznej (AOBS) oddzielający światło wzbudzone i emisyjne, dwa spektralne detektory hybrydowe (HyD) oraz inkubator stopniowy do utrzymania stabilnych warunków temperatury (28 °C) i wilgotności podczas obrazowania na żywo próbek.
   Opisany protokół obrazowania na żywo wielospektralnego obrazowania FRET może być stosowany do zarodków na różnych etapach rozwojowych poza wczesnymi gastrulami, co wykazali Fasano i ^in.7. Większy stos z-powinien być rozważony na późniejsze etapy rozwoju (np. 24 hpf) oraz odpowiednie ustawienia interwałów z i t, aby umożliwić wielospektralne kroki detekcji podczas akwizycji obrazów spektralnych FRET.
   1. Włącz kontroler inkubatora co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem akwizycji i ustaw temperaturę na 28 °C, aby utrzymać zarodki danio pręgowanego w zdrowym stanie. Gdy temperatura inkubatora się ustabilizuje, umieść talerz obrazujący z zarodkiem na pojemniku próbki i użyj obiektywu 10x/suchy (apertura numeryczna 0,4), aby szybko zwizualizować próbkę.
   2. W konfiguracji laserowej wspomnianego oprogramowania włącz laser argonowo-jonowy i użyj suwaka, aby ustawić moc lasera do 50%. W ustawieniach sprzętowych wybierz 8-bitową rozdzielczość głębi, przy której obrazy będą pobierane.
   3. Wybierz tryb skanowania wykrywania widmowego XYλZ w panelu akwizycji i ustaw następujące parametry akwizycji: format obrazu: 512 x 512 px; prędkość skanowania 400 Hz; zoom optyczny 0,75.
   4. Aktywuj linię laserową 458 nm lasera argonowo-jonowego i ustaw jej wartość intensywności, zwykle <10% (tutaj 8,5%).
   5. Wybierz detektor HyD i dostosuj czułość detektora (wzmocnienie), wpisując pożądaną wartość ( tutaj 500).
      UWAGA: Dla żywych, słabo fluorescencjowych próbek oraz mniejszej ilości szumu tła zaleca się stosowanie detektorów hybrydowych zamiast lamp fotopowielaczowych (PMT).
      W cytowanym oprogramowaniu wyświetlanie widma emisji barwnika wymaga aktywacji detektora.
   6. Aby zacząć, aktywuj pierwszy detektor (HyD) i wybierz białko fluorescencji cyjanu (CFP), aby wyświetlić jego krzywą emisji. Otwórz rozwijane menu paska detektora w oprogramowaniu, aby otworzyć listę wyboru dla krzywej emisji CFP. Teraz aktywuj drugi detektor, aby wyświetlić krzywą emisji drugiego białka fluorescencji żółtej barwnika (YFP). Aby wyświetlić również krzywą emisji Ypeta , aktywuj drugi detektor, a następnie wybierz krzywą emisji YFP , która pojawi się na obrazie widma po wyłączeniu drugiego detektora.
      UWAGA: Po zakończeniu tego etapu drugi detektor powinien zostać dezaktywowany, ponieważ w trybie akwizycji widmowej wykorzystywany jest tylko jeden detektor.
   7. Aby rozpocząć akwizycję na żywo, ustaw kursor detekcji w zakresie najintensywniejszej emisji sygnału (w tym przypadku YFP), aby zwizualizować próbkę, zdecydować i ustawić pozycję początkową i końcową grubości próbki w oknie z-stack LAS X.
   8. Dla właściwości zasięgu λ ustaw następujące parametry: początek (460 nm) i koniec (570 nm) zakresu detekcji; Szerokość pasma detekcji: 5 nm; λ-skan Rozmiar kroku: 5 nm. Rozpocznij akwizycję z-stack.
      UWAGA: Wskazane parametry pozwalają użytkownikom uzyskać stosunkowo szybkie obrazowanie o akceptowalnej rozdzielczości, ale można stosować różne ustawienia. W ustawieniach Fluorifier Disc można odłączyć automatycznie wkładany filtr NOTCH, aby uniknąć pojedynczej utraty intensywności.
   9. Aby ocenić zmiany sygnału w czasie rzeczywistym po ekspozycji na MEKi, umieść pojedynczy mutantowy embrion (tutaj Shp2^D61G) w szklanej misce i obraz przed i po leczeniu farmakologicznym. W przypadku tych eksperymentów na żywo należy bezpośrednio przeprowadzić leczenie lekiem przez zanurzenie w kąpieli podczas sesji obrazowania, maksymalnie 2 mL roztworu zawierającego rozpuszczony lek.
3. Obróbka obrazów i wielospektralna separacja barwników w celu uzyskania proporcjonalnych obrazów FRET (Dzień 5) (Rysunek 2C)
   1. Aby oddzielić emisję dawcy (CFP) i akceptora (Ypet), należy wyeliminować wkład emisji fluorescencyjnej obu cząsteczek w kanale FRET, zwanym przeciekiem spektralnym (SBT).
      1. Do wyświetlania i pobierania pliku .cvs względem standardowego widma emisji CFP (widma wzbudzania i emisji) należy zapoznać się z publicznie dostępnymi bazami danych barwników/fluorescencjowych białek.
      2. W panelu danych pliku .cvs wybierz opcję Tekst do kolumn i podziel dane na kolumny, używając przecinka jako separatora. Powstały plik będzie zawierał dodatkowe informacje (np. wzbudzenie CFP, CFP 2P), które powinny zostać usunięte. Zachowuj tylko dane kolumnowe względem długości fali i emisji.
      3. W kolumnie emisji CFP usuń wszystkie dane intensywności od 501 nm wzwyż.
      4. Zapisz dostosowany plik emisyjnego CFP z zakresu 460 do 500 nm w formacie .xls (zwanym "eCFP modified" na Rysunku 2C).
      5. Powtarzaj tę samą procedurę, aby pobrać i przetworzyć widmo emisji białek YFP i zachować jedynie dane kolumny względem długości fali i emisji. Usuń wszystkie wartości emisji do 524 nm. Zapisz dostosowany plik widma emisji YFP z formatu in.xls 525 do 650 nm (nazywany "Ypet from 525 nm" na Rysunku 2C).
      6. Aby umożliwić wyłączenie przenikania widma (SBT) w bazie barwników dostępnej w oknie konfiguracji oprogramowania, wstaw i zapisz dwa dostosowane referencyjne spektra emisji dla CFP i YFP.
   2. Wybierz powstały plik obrazu spektralnego z sesji obrazowania, otwórz okno Proces i wybierz Spektralną separację barwników w narzędziu Separacja barwników. Konfiguruj ustawienia separacji barwników następująco: w rozwijanych listach po lewej stronie dialogu wybierz nowe widmo emisji CFP (eCFP zmodyfikowane) w pierwszej pozycji oraz nowe widmo emisji YFP (Ypet z 525 nm) z bazy danych widma.
   3. W sekcji Rescale wybierz Per Channel (Per Channel dla skalowania kanałów indywidualnie), a następnie w λ-skanowaniu obrazów wybierz ten o największej natężeniu sygnału (odpowiadający krokowi 14 skanowania spektralnego na poziomie szczytu emisji kanału FRET, oznaczonym białą strzałką na panelu pokazującym kroki detekcji po prawej stronie Rysunku 2B). Następnie przesuwamy się wzdłuż skanu Z próbki i wybieramy sekcję optyczną, która podkreśla obszar zainteresowania w strefie marginesu.
   4. Użyj trybu wyboru ROI w strefie marginesowej bieguna zwierzęcego, aby zdefiniować obszar o najlepszym widmie. Kliknij na ROICrosshair wskazany na górze w oknie wyświetlacza, aby wywołać celownik i dostosować rozmiar referencyjnego ROI, wpisując wartość 40 wokseli w obszarze pomiarów. Dokładnie zdefiniuj obszar zainteresowania ROICrosshair. Na diagramie obrazu wybierz normalizację danych, a następnie kliknij Zastosowaj , aby wykonać separację barwnika z ustawionymi ustawieniami.
   5. Otwórz ten nowo wygenerowany plik uzyskany z dwoma kanałami rozdzielonymi i wytwórz dwuwymiarowy obraz projekcji z trójwymiarowej serii obrazów (projekcja maksymalnej intensywności) do wizualizacji danych.
   6. W oknie Process wybierz Przycięcie , aby rozdzielić kanały na dwa oddzielne pliki: kanały CH1 i CH2 (lub FRET).
   7. W oknie Proces wybierz Combine Images, wybierz plik CH2 i wstaw go w pierwszej opcji, a następnie wybierz plik CH1 i wstaw go w drugiej opcji. Ustaw przeskalowanie z czynnikiem 5 i wybierz operację Ratio. Następnie kliknij Apply , aby wygenerować nowy plik zawierający obraz ratiometryczny (YFP/CFP). Zapisz plik do dalszej analizy danych.
4. Analiza ilościowa sygnałów FRET i renderowanie obrazu (dni 5-6) (Rysunek 2D)
   1. Dla ilościowych pomiarów sygnałów FRET z obrazów stosunkowych FRET/CFP należy przeprowadzić eksperyment na embrionach N>2 (replikacjach), w zależności od a priori oceny statystycznej opartej na oczekiwanym efekcie. Stosuj pakiet do przetwarzania obrazów, taki jak otwartoźródłowe oprogramowanie Fiji. Importuj pliki obrazów uzyskane z obrazowania spektralnego i separacji barwników do pakietu do analizy obrazów, takiego jak open source Fiji.
   2. Przed rozpoczęciem wyboru ROI na obrazach gastrul, ustaw parametry jako pomiary odczytu za pomocą funkcji Analyze | Zestaw wymiarów | wybierz interesujące parametry, takie jak powierzchnia, gęstość zintegrowana oraz średnia wartość szarości.
   3. Wybierz obszar zainteresowania (w tym konkretnym badaniu: margines gastruli) za pomocą narzędzia do wyboru wielokątów z paska narzędzi. Zapisz zwrot z inwestycji w specyfikację x,y klikając Analizuj | Narzędzia | Kierownik ROI.
   4. Aby wykonać pomiary w wybranym ROI, kliknij Analizuj | Zmierz. Powtarzaj te kroki dla każdego zwrotu z inwestycji oraz obrazu/warunku.
      UWAGA: Jeśli zajdzie taka potrzeba, zapisz obraz jako . Format TIFF. Możliwe jest zapisanie wszystkich pomiarów ROI pochodzących z wielu obrazów jako jednego pliku ROI. Zmień każdą miarę z listy menedżerów ROI poprawną nazwą względem każdej próbki/obrazu.
   5. Dla każdego warunku (mutant i mutant + leczenie tutaj) wyodrębn wszystkie wartości stosunku FRET/CFP dla każdego wybranego ROI i uporządkuj je w arkuszu, organizując na przykład grupy eksperymentalne w kolumnach, a każdą wartość surową w wierszach.
   6. Używaj odpowiedniego oprogramowania do oceny statystycznych różnic sygnałów FRET pomiędzy różnymi warunkami eksperymentalnymi oraz do generowania wykresów i wizualizacji danych.
      UWAGA: Dostępne są oprogramowanie open-source i licencjonowane do analizy danych i rozwiązań graficznych.
   7. Zorganizuj konkretny projekt oceny statystycznej, uwzględniając wszystkie surowe pomiary oraz liczbę powtórzeń dla każdego warunku eksperymentalnego. Do analizy statystycznej pojedynczej replikacji biologicznej stwórz tabelę kolumnową z jedną zmienną grupującą, z każdą grupą zdefiniowaną przez kolumnę. Do analizy statystycznej więcej niż jednej replikacji biologicznej stwórz tabele grupujące co najmniej dwie zmienne grupujące, jedną zdefiniowaną przez kolumny (np. warunki eksperymentalne), a drugą zdefiniowaną przez wiersze (np. średnie wartości replikatów).
   8. Po odpowiednim uporządkowaniu grup eksperymentalnych w arkuszu pracy oceń rozkład danych (test normalności, np. D'Agostino-Pearson, Anderson-Darling) i na podstawie wyniku wybierz najbardziej odpowiedni test statystyczny.
      1. Wykonaj jednokierunkową ANOVA dla danych parametrycznych (według rozkładu Gaussa) oraz test Kruskala-Wallisa dla danych nieparametrycznych. Jeśli obecnych jest więcej czynników (stężenia genetyczne i lekowe), rozważ dwukierunkową ANOVA. Porównaj średnią wartość FRET dla każdego warunku ze sobą (wielokrotne porównania) i skoryguj dla wielu porównań za pomocą testu post hoc (np. test Tukeya i Dunna dla danych parametrycznych i nieparametrycznych, odpowiednio).

3. Walidacja wyników FRET przez IHC oraz korelacjacyjna analiza morfometryczna defektów gastrulacyjnych

1. Przygotowanie roztworów oraz utrwalanie i montaż zarodków do IHC na tle tERK i pERK (Dzień 7) (Rysunek 3A)
   1. Przygotuj rozwiązania robocze wymagane dla IHC.
      1. Przygotuj roztwór zapasowy 10x PBS, rozpuszczając 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na₂HPO₄ oraz 2,4 g KH₂PO₄ w 1 L wody DD. Autoklaw roztwór, żeby utrzymać sterylność.
      2. Przygotuj roztwór PBS-Triton o stężeniu 0,8% (PBSTr), rozpuszczając 8 ml 10% Triton X-100 w końcowej objętości 100 mL 1x PBS.
      3. Przygotuj roztwory glicerolu 20%, 50% i 80%, rozcieńczając odpowiednio 3 mL, 7,5 mL i 12 ml 100% glicerol w końcowej objętości 15 ml 1x PBS.
   2. Przygotuj 4% paradehydu (PFA)/0,25% PBSTr (roztwór utrwalający) przez mieszanie 2,5 mL 16% PFA z 250 μL 10% Triton X-100 wcześniej rozpuszczonego w końcowej objętości 10 mL 1x PBS. Użyj tego roztworu do utrwalenia zarodków przy 6 hpf przez noc przy 4 °C. Używaj 2 mL rurek i maksymalnie pięciu zarodków na probówkę, aby umożliwić efektywne fiksowanie i płukanie.
      UWAGA: Zaleca się przygotowanie świeżego utrwalacza na każdą rundę fiksacji. UWAGA: Podczas obsługi formalnego dehydu w 16% należy nosić środki ochrony osobistej (PPE) oraz pod chemiczną maską.
   3. Przemyj zarodki w probówkach po 2 mL, napełniając je 1,5 mL 0,8% PBSTr przez kilka razy. Przenieś zarodki do nowych probówek po 2 ml i przechowuj je w 1x PBS do użycia.
      UWAGA: Jeśli nie zna się na obsłudze wczesnych zarodków danio pręgowanych, pracuj pod stereomikroskopem, aby uniknąć utraty zarodków podczas pipetowania. Używaj "niskowiążącego" plastiku, aby zmniejszyć potencjalne przyklejanie zarodków do ściany jajowódki.
2. Permeabilizacja tkanek i IHC wobec pERK i tERK (dni 7-9)
   UWAGA: Wyniki IHC zależą od wielu zmiennych, które mogą się różnić w zależności od laboratoriów, dlatego może być konieczna konkretna optymalizacja protokołów.
   1. Przemyj utrwalone zarodki danio dano w 1 ml 0,8% PBSTr przez 3 x 10 minut w RT.
   2. Przepuszczać próbki 2 μL Proteinazy K rozcieńczonej w 0,8% PBSTr (1:1 000) przez 2 minuty w RT.
   3. Zatrzymaj permeabilizację tkanki, płucząc próbki w 1 mL 0,8% PBSTr przez 3 x 10 minut, a następnie umieść próbki w 500 μL 4% PFA/1x PBS przez 20 minut w RT. Następnie przemyj próbki w 1 mL 0,8% PBSTr przez 3 x 10 minut.
      UWAGA: Metoda i czas użyty do permeabilizacji tkanek to kluczowe kroki, na które wpływ może mieć typ antygenu, jakość zachowania tkanek oraz czynniki środowiskowe. Zoptymalizuj protokół przed zastosowaniem go na cennych próbkach.
   4. Inkubuj próbki z buforem blokującym 1x (BB) zawierającym 5% normalnej surowicy koziej (NGS), 1% albuminy surowicy bydłej (BSA), 1% DMSO, przygotowane w następujący sposób: 75 μL 100% NGS, 150 μL 10% BSA oraz 15 μL 100% DMSO w końcowej objętości 1,5 mL 0,8% PBSTr. Użyj 200 μL roztworu w probówce i inkubuj zarodki przez 20-30 minut w RT w roztworze.
   5. Usuń 1x BB z poprzedniego etapu i inkubuj próbki w roztworze zawierającym mieszankę pożądanych przeciwciał pierwotnych (tutaj: rozcieńczenie 1 μL pierwotnego przeciwciała monoklonalnego myszy p44/42 MAPK, całkowity ERK, tERK, + 1 μL poliklonalnego fosfo-p44/42 MAPK królika, fosforylowanego ERK, pERK) w 250 μL świeżo przygotowanego 1x roztworu BB. Użyj 200 μL roztworu na probówkę i inkubuj zarodki w roztworze przez noc w temperaturze 20 °C.
   6. Aby wyeliminować wiązanie niespecyficzne, myj próbki 1 mL 0,8% PBSTr kilka razy (najpierw co 10 minut, potem co 30 minut).
   7. Inkubuj próbki w świeżo przygotowanej 1x BB przez 20 minut w RT. Użyj 200 μL w probówce.
   8. Usuń 1x BB z poprzedniego etapu i inkubuj próbki mieszanką przeciwciał wtórnych (1 μL fluorescencyjnie 488 sprzężonego przeciwmysza koziego, + 1 μL fluorescencyjnie sprzężonego 633 koziego przeciw królikom w 600 μL roztworu 1x BB). Pozostawiaj zarodki delikatnie potrząsające przez noc w temperaturze 20 °C.
      UWAGA: Przeprowadziliśmy IHC na negatywnych (nie transgenicznych) nastolatkach z tej samej partii, która była używana do obrazowania FRET. Alternatywnie można użyć ryb Teen⁺ , ale w tym przypadku należy zastosować przeciwciała wtórne sprzężone z fluoroforami, które nie pokrywają się ze widmami emisji CFP lub YFP.
   9. Eliminuj wiązanie niespecyficzne, jak opisano powyżej.
   10. Przemyj próbki w gradientzie glicerolu/1x roztworów PBS (20%, 50%, 80%) przez 15 minut na każdy roztwór w RT. Przechowuj próbki w 90% glicerolu/1x PBS w temperaturze 4 °C.
       UWAGA: Aby zminimalizować możliwy rozpad fluorescencji, przechowuj próbki w ciemności.
3. Mikroskopia konfokalna tkanki immunobarwionej i analiza ilościowa (dni 10-11) (Rysunek 3B-E)
   1. Osadz zarodki tak, jak opisano wcześniej.
   2. Ustaw parametry przejęcia mikroskopii konfokalnej następująco: biały laser na 80%, zakres emisji fluorescencyjnej na 507 - 551 nm dla fluorescencyjnie sprzężonej koziej anty-myszy (w tym przypadku ze spektrum emisji 488 nm, stosowane dla tERK), 644 - 740 nm dla fluorescencyjnie sprzężonej koziej anty-króliczkowej (w tym przypadku ze spektrum emisji 633 nm), używany dla pERK). Wybierz sekwencyjny tryb akwizycji, skanowanie formatu 512 x 512 px oraz prędkość 400 Hz. Zdefiniuj początek i koniec skanowania z grubością kroku z-kroku 4 - 5 μm oraz standardowym cyfrowym zoomem 1. Użyj obiektywu 25x z zanurzaniem w wodzie (z aperturą numeryczną 0,05), aby uchwycić całą gastrulę przy 6 hpf
      UWAGA: Protokół ten obejmuje stosowanie laserów, które mogą być szkodliwe; dlatego wymaga szkolenia personelu zgodnie ze specyficznymi wymaganiami krajowymi.
   3. Po uzyskaniu zdjęć konfokalnych sprawdź plik raw uzyskany za pomocą pakietu do przetwarzania obrazu, takiego jak otwartoźródłowe oprogramowanie Fiji.
      1. Na Fidżi użyj polecenia Split channels z menu Image and submenu Color , aby uzyskać obraz pojedynczego kanału (łączny ERK: kanał = 0, C = 0; pERK: kanał =1, C = 1) i wygenerować obraz projekcji z-o maksymalnej intensywności dla obu kanałów, klikając na Image | Stosy | Projekt Z.
      2. Powtórz procedurę pomiarów intensywności ROI opisaną wcześniej i wyodrębnij dane do arkusza roboczego.
      3. Aby wywnioskować zmiany intensywności sygnału p-ERK w pożądanym ROI między grupami eksperymentalnymi, oblicz stosunek p-ERK/t-ERK przez podzielenie surowych wartości gęstości zintegrowanej barwienia p-ERK przez surową zintegrowaną gęstość sygnału t-ERK. Przechodzimy do oceny istotności statystycznej, jak w kroku 2.4.
         UWAGA: Ustawienia parametrów obrazowania mogą być modyfikowane w zależności od potrzeb oraz uwzględnienia czasu trwania każdej próbki, pożądanej jakości obrazów oraz liczby planów do uzyskania.
4. Pomiary osi w 11 zarodkach HPF (dzień 4 na fiksację zarodków, dzień 12 na pozyskiwanie i analizę danych) (Rysunek 4A-D)
   1. Po zakończeniu gastrulacji (11 hpf) utrwal zarodki 4% PFA w 1x PBS przez 20 minut w RT, myj kilka razy w 1x PBS i przechowuj w 4 °C do czasu uzyskania obrazu.
   2. Orientuj zarodki bocznie za pomocą pipety Pasteura w pojedynczej dołku z 12-dołkową płytką zawierającą świeże 1x PBS.
   3. Aby ocenić obecność owalnego kształtu (stosunek osi zarodków Y/X > 1), charakterystyczny fenotyp rasopatii u danio pręgowanego oraz morfologiczne ratowanie stosunku osi zarodków w wyniku skuteczności leczenia, należy wykonać obrazy całych embrionów za pomocą mikroskopu stereo z obiektywem powiększeniem 3,4x (0,63x obiektyw skanujący x 8,60 współczynnik zoomu) po prostu wykonując obrazy w trybie jasnego pola.
   4. Zaimportuj plik obrazu do pakietu do analizy obrazów, takiego jak open source Fiji.
      1. Zmierz długość osi zarodków (x, oś boczna; oś główna, y), wybierając narzędzie proste z paska narzędzi i klikając Analizuj | Zmierz. Po wykonaniu wybranych pomiarów dodaj je do listy menedżerów ROI i zapisz plik ROI, jak wyjaśniono powyżej do analizy obrazowania FRET.
         UWAGA: Powtarzaj te kroki dla każdego obrazu zarodka.
   5. Kontynuuj eksport danych w arkuszu i obliczaj stosunek osi, dzieląc długość osi głównej (y) przez długość osi pomocniczej (x). Oblicz średnią, odchylenie standardowe średniej lub błąd standardowy średniej różnych replikatów.
   6. Przejdź do analizy danych statystycznych, jak w kroku 2.4.

Wyniki

Protokół ten pokazuje prosty sposób pracy umożliwiający szybkie generowanie przejściowych modeli RASopatii w embrionach danio pręgowanego oraz ocenę fluktuacji ERK u wczesnych mutantów za pomocą standardowej metody obrazowania na żywo FRET zastosowanej na nowo opracowanym czujniku ERK^{danio pręgowanego 6,9}. Jak niedawno pokazano ^6,7 w tym samym procesie eksperymentalnym, wyniki FRET mogą być weryfikowane przez standardowy IHC wzg...

Dyskusja

Pomimo dziesięcioleci badań i licznych mutacji prowadzących do wysoce heterogenicznych form RASopatii obecnie zmapowanych, warianty genetyczne o nieznanym znaczeniu nadal pojawiają się w wyniku sekwencjonowania u niezdiagnozowanych pacjentów. W rzeczywistości w wielu przypadkach diagnoza oparta wyłącznie na cechach klinicznych może być wyzwaniem, a funkcjonalne podejścia genomowe do weryfikacji wyników sekwencjonowania pozostają kluczowe. Co więcej, pomimo proponowanych niektórych dostępnych cząsteczek przeciwnowotworowy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Plastiki
Zbiornik hodowlany 1,7 l - projekt w stylu plażowym	Tecniplast	1,7L NACHYLONY	Zbiornik hodowlany
Kapilary GC100F-10	Aparat Harvarda	30-0019	Mikroiniekcja zarodka w stadium jednej komórki
Płytki do hodowli komórkowych i tkankowych - 12 dołków	BIOFIL	TCP011012	Pobieranie i leczenie zarodków
Płytki do hodowli komórkowych i tkankowych - 6 dołków	BIOFIL	TCP011006	Pobieranie i leczenie zarodków
Naczynie do hodowli komórkowych	SPL Nauki o Życiu	20100	Pobieranie zarodków
Nunc Glass Dishes 12mm	Thermo Fisher	150680	Obrazowanie spektralne zarodków FRET
Pipette Pasteur	Corning	357524	Transfer zarodka
Białkowe rurki wiązające 2ml	Eppendorf	30108450	Badanie IHC
odczynniki i inne
Kawior 500-800 & mikro; m	Rettenmaier Italia	BE2269 (500-800)	Sucha karma dla ryb
Torbiele artemii błękitnej w Great Salt Lake	Sanders	00004727	Pokarm dla żywych ryb
Natychmiastowa sól oceaniczna	Tecniplast	XPSIO25R	Suszona sól morska do przygotowywania żywej żywności
Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Teen)	Kontakty do zamówień*: National BioResource Project Danio, Jednostka Wsparcia Rozwoju Zasobów Zwierzęcych, RRD, RIKEN Center for Brain Science, Japonia. https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *po podpisie MTA.	-	Dostawca linii danio danych ERK Reporter. Zarodki ryb można uzyskać po podpisie MTA z Narodowego Projektu BioZasobów Japonii dla danio dano (RIKEN, Japonia). Linia danio była deponowana przez Nara Institute of Science and Technology (Takaaki Matsui) oraz National Institute of Genetics (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami, patent na system Tol2) (Wong i in., 2018, Urasaki i in., 2006, Okamoto i Ishioka, 2010).
Barwnik ładowający 6x	Sygnalizacja komórkowa	B7024S	Elektroforeza żelowa
Drabinka DNA 100 bp	NEB	N3231S	Elektroforeza żelowa
Agarose	Sigma-Aldrich	1,01,236	Elektroforeza żelowa
Agaroza, niska temperatura żelowania	Sigma-Aldrich	A9414-10G	Montaż zarodków do obrazowania spektralnego FRET i testu IHC
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A8022	Badanie IHC
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	223506	Komponent średni E3
Azotan wapnia	Sigma-Aldrich	237124	Komponent rozwiązania stockowego Danieau
Dimetylsulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	Badanie IHC
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Składnik buforowy TBE do przygotowania żelu
Etanol 99%+	Fisher Scientific	10048291	Oczyszczanie RNA in vitro
Formaldeid 16%	Thermo Fisher	28908	Utrwalanie zarodków
Formamide	Sigma-Aldrich	F9037	Elektroforeza żelowa
Bufor załadowujący żel II (DENATURUJĄCA STRONA)	Thermo Fisher	AM8546G	Transkrypcja RNA in vitro
Kwas octowy lodowcowy	Sigma-Aldrich	695092	Składnik buforowy TBE do przygotowania żelu
Glicerol & nbsp;	Sigma-Aldrich	G6279-1L	Badanie IHC
Antymyszy dla kóz Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11001	Badanie IHC
Antykrólikowy Alexa Fluor 633	Thermo Fisher	A21070	Badanie IHC
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Komponent rozwiązania stockowego Danieau
KpnI - HF (Enzyme + rCutSmart Buffer)	NEB	R3142	Linearyzacja plazmidów
Siarczan magnezu	Sigma-Aldrich	230391	Komponent średni E3/komponent roztworu Danieau
Markery RNA Milenium	Thermo Fisher	AM7150	Elektroforeza żelowa
Zestaw do oczyszczania DNA genomowego Monarch	NEB	T3010L	Linearyzacja plazmidów
Myszy monoklonalny p44/42 MAPK	Sygnalizacja komórkowa	4696S	Badanie IHC
zestaw transkrypcji mMACHINE SP6	Thermo Fisher	AM1340	Transkrypcja RNA in vitro
Normalne serum dla kóz (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	Badanie IHC
Ambion bez nukleazy	Thermo Fisher	AM9937	Transkrypcja RNA in vitro
PD0325901	Sigma-Aldrich	PZ0162	Inhibitor MEK
Roztwór fenolu czerwonego	Sigma-Aldrich	P0290	Składnik mieszanki do mikroiniekcji & nbsp;
Zestaw do ogoniania Poly A	Thermo Fisher	AM1350	Transkrypcja RNA in vitro
Chlorek potasu bioxtra	Sigma-Aldrich	P9333	Komponent średni E3/Danieau roztwór stock/komponent PBS stock solution
Fosforan diwodoru potasu	Sigma-Aldrich	P0662	Komponent roztworu zapasowego PBS
Proteinaza K	Sigma-Aldrich	P2308	Badanie IHC
Królik poliklonalny fosfo-p44/42 MAPK	Sygnalizacja komórkowa	4695S	Badanie IHC
Bezpieczne barwienie DNA w żelu SYBR	Thermo Fisher	S33102	Elektroforeza żelowa
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	31434-M	Komponent średni E3/Danieau roztwór stock/komponent PBS stock solution
Dwubazowy fosforan sodu	Sigma-Aldrich	71643	Komponent roztworu zapasowego PBS
Baza Trizma	Sigma-Aldrich	T1503	Składnik buforowy TBE do przygotowania żelu
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Komponent bufora PBSTr
Sprzęt
Alliance Mini HD9	Uvitec	-	System obrazowania
Wirówka 5430 R	Eppendorf	5428000205	Mikrowirówka
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	-	Montaż zarodka
FemtoJet 4x	Eppendorf	-	System mikrowtrysku
Infinite M Plex	Tecan	-	Czytnik płyt wielomodowych
Leica M205FA	Leica Microsystems	-	Mikroskop stereomikroskopowy fluorescencyjny
Leica TCS-SP8X wyposażona w inkubator (OkoLab)	Leica Microsystems	-	Mikroskop konfokalny
Mini-subkomórka GT system horiziontalnej elektroforezy	Bio-Rad	1704406	Elektroforeza żelowa
PC-100 Pionowy ciągnik	Narishige	-	Ciągarka igieł
Zasilacz uniwersalny PowerPac	Bio-Rad	1645070	Elektroforeza żelowa
Stellaris 5	Leica Microsystems	-	Mikroskop konfokalny
Vortex MiniStar silverline	VWR	-	Przygotowanie plazmidów
Oprogramowanie
Biorender	Biorender	Licencja CC-BY 4.0	Komiksowe rozwinięcie figurek
Excel	Microsoft Office Professional Plus 2019	-	Analizy danych
Oprogramowanie Fiji	ImageJ	15.3T	Obrazowanie obrazowe i analizy ilościowe (pomiary sygnałów FRET, intensywność fluorescencji ERK w teście IHC, długość osi zarodka)
GraphPad Prism	GraphPad Software LLC	w. 9	Analizy danych statystycznych
Oprogramowanie spektrofotometru iControl	Tecan	v. 2.0	Ilościowość RNA
Ilustrator	Adobe	26.0.3 (64-bitowy)	Montaż figur
Oprogramowanie LASX	Leica Microsystems	v. 4.5 (Stellaris 5), v. 3.0 (M205FA), v. 3.5 (TCS-SP8X)	Pozyskiwanie obrazów do eksperymentów spektralnych FRET oraz obrazowanie zarodków do pomiarów długości osi
Oprogramowanie Q9 Mini 18.02-SN	Uvitec	-	Pozyskiwanie obrazów żelowych