Opracowanie i ocena zaawansowanego modelu zwłóknienia płuc in vitro opartego na człowieku

Summary

Opracowano metodę obrazowania do oceny aktywacji fibroblastów w precyzyjnie wyciętych ludzkich wycinkach płuc w oparciu o białko aktywujące fibroblasty (FAP). Metodologia ta tworzy solidną i powtarzalną platformę do oceny stopnia zaawansowania progresji zwłóknienia, rozwijając translacyjne modele in vitro na potrzeby rozwoju terapeutycznego przy jednoczesnym zachowaniu wierności mikrośrodowiska tkanek ludzkich.

Abstract

Zwłóknienie płuc charakteryzuje się nieodwracalnym zniszczeniem struktury pęcherzyków płucnych i nadmiernym odkładaniem się macierzy zewnątrzkomórkowej. Chociaż modele zwierzęce są szeroko stosowane w badaniach nad zwłóknieniem płuc, żaden z obecnie dostępnych modeli nie oddaje w pełni postępującego charakteru IPF ani jego definiującej cechy histologicznej, takiej jak ogniska fibroblastyczne. Zaawansowane modele in vitro, w tym precyzyjnie wycinane plastry płuc (PCLS), są często uważane za najbardziej fizjologicznie istotny system badania płuc i są z powodzeniem stosowane do badań przesiewowych leków. Niemniej jednak niemożność zróżnicowania stopnia zwłóknienia w płucach IPF spowodowała zaślepienie i niepewność uzyskanych PCLS. Wcześniejsze badania wykazały, że białko aktywujące fibroblasty (FAP) może oceniać aktywność prozwłóknieniową ILD, potencjalnie przyczyniając się do wczesnej diagnozy i wyboru odpowiednich okien terapeutycznych. W tym badaniu 600 μm PCLS zostanie uzyskanych od zdrowych dawców i pacjentów z IPF za pomocą slicera szokowego i ocenione za pomocą sond molekularnych ukierunkowanych na FAP w celu określenia stopnia aktywności fibroblastów w oparciu o intensywność sygnału fluorescencyjnego. Podejście to zapewnia zaawansowany model in vitro i technikę oceny do badań nad zwłóknieniem płuc, zwiększając zdolność do badania mechanizmów chorobowych i oceny interwencji terapeutycznych.

Introduction

Zwłóknienie płuc (PF) jest powszechną postacią o nieznanej etiologii i szczególnie złym rokowaniu, z medianą pięcioletniego przeżycia wynoszącą zaledwie 25%¹. Dotchawiczy model podawania bleomycyny jest obecnie najczęściej stosowanym modelem zwierzęcym w badaniach przedklinicznych². Jednak zwłóknienie wywołane przez bleomycynę jest przejściowe i ustępuje z czasem, co ostro kontrastuje z nieodwracalną naturą IPF³. Co więcej, dotchawiczy model bleomycyny stanowi poważne wyzwanie ze względu na niejednorodne nasilenie zwłóknienia wynikającego z podawania dotchawiczego, zarówno chirurgicznego, jak i niechirurgicznego. Te ograniczenia obecnych modeli zwierzęcych przyczyniają się do wysokiego wskaźnika niepowodzeń badań klinicznych ukierunkowanych na IPF⁴.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc (PCLS) były używane w różnych chorobach, ponieważ wiernie zachowują specyficzne dla choroby sieci przesłuchów komórkowych i mikrośrodowisko5^,6^,7. W przypadku zwłóknienia płuc PCLS z płuc IPF zachowuje natywną architekturę tkankową i niejednorodność komórkową, umożliwiając obserwację różnych typów komórek i interakcji komórka-macierz zewnątrzkomórkowa^8,9, ustanawiając je reprezentatywnym modelem ex vivo do badania patofizjologii płuc. Ponieważ jednak zwłóknienie płuc charakteryzuje się niejednorodnymi zmianami zwłóknieniowymi w płucach, pobieranie próbek PCLS jest z natury ślepe. Nie jest możliwe wizualne rozróżnienie, czy uzyskane skrawki reprezentują obszary zwłóknienia w fazie spoczynku, fazie aktywnej, czy też prawidłową tkankę płucną. Ograniczenie to podkreśla konieczność stosowania narzędzi do oceny wizualnej i badań przesiewowych. Wcześniejsze badania wykazały, że białko aktywujące fibroblasty (FAP) było wysoce i specyficznie eksprymowane w tkance płucnej pacjentów z IPF, co wskazuje, że FAP może oceniać aktywność pro-fibrotyczną ILD¹⁰.

W tym badaniu, jednołańcuchowe przeciwciało przeciwko FAP zostało oznaczone zielenią indocyjaninową (ICG) w celu opracowania ukierunkowanej sondy do obrazowania molekularnego ze zwiększoną penetracją tkanek. 600 μm PCLS uzyskane od zdrowych dawców i pacjentów z IPF zobrazowano za pomocą tej sondy, a aktywność fibroblastów oceniono na podstawie intensywności sygnału fluorescencyjnego. Ta metoda obrazowania przewyższa konwencjonalne techniki oceny zwłóknienia (Western blotting, qPCR, barwienie trichromem Massona lub immunofluorescencja) dzięki prostocie obsługi, zachowaniu integralności cytoarchitektonicznej i żywotności, a jednocześnie umożliwieniu podłużnego śledzenia progresji patogenu. Co ważniejsze, jest łatwy w obsłudze i zajmuje tylko 90 minut. Stanowi to zaawansowane narzędzie do badań przesiewowych dla modelu PCLS in vitro, ułatwiając badania nad zwłóknieniem płuc.

Protocol

Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Pierwszego Szpitala Uniwersytetu Medycznego w Kantonie (2021G-29). IPF rozpoznano na podstawie badania fizykalnego i wyników tomografii komputerowej klatki piersiowej o wysokiej rozdzielczości, zgodnie z kryteriami diagnostycznymi ustalonymi przez ATS/ERS/JRS/ALAT (2022). Wszystkie próbki pacjentów z IPF zostały pobrane z przeszczepu płuc lub biopsji płuc. Próbki zdrowej tkanki płucnej pobrano od dawców narządów, u których zdiagnozowano śmierć mózgu10. Przed pobraniem tkanek uzyskano pisemną zgodę na pobranie tkanek od każdego pacjenta lub jego rodziny. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, rozwiązań i przyrządów użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie ludzkich PCLS

UWAGA: Pacjenci są rutynowo badani na obecność wirusów, takich jak HIV, HCV lub syfilis, przed przeszczepem płuc lub biopsją muszą uzyskać negatywny wynik testu, aby zapewnić bezpieczeństwo pracy personelu laboratoryjnego.

1. Przygotowanie roztworów
   1. Przygotować buforowany roztwór fosforanowy (1× PBS) i wstępnie schłodzić w temperaturze 4 °C.
   2. Przygotuj 2% roztwór agarozy. Odważyć 2 g agarozy i przenieść ją do kolby Erlenmeyera. Dodać 100 ml PBS, dokładnie wymieszać i podgrzewać w kuchence mikrofalowej, aż mieszanina osiągnie energiczne wrzenie (≥95 °C), stając się całkowicie klarowna, jednorodna i wolna od widocznych cząstek lub smug. Od czasu do czasu obracać kolbą podczas podgrzewania, aby zapobiec nadmiernemu wrzeniu. Umieścić roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do czasu użycia.
2. Precyzyjnie wykrojone plastry płuc
   1. Umyj zewnętrzną powierzchnię tkanki płucnej PBS, aby usunąć nadmiar zanieczyszczeń i krwi.
   2. Za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml (igła 1,2 mm) odessać odpowiednią objętość agarozy i wprowadzić ją do tchawicy. Agarozę należy wstrzykiwać powoli do płatów płuc, aż do całkowitego napompowania. Należy przerwać wstrzykiwanie po napotkaniu wyraźnego oporu, aby zapobiec wyciekowi agarozy.
      UWAGA: Potrzeba około 10 ml agarozy na każde 5 × 2 × 1 cm bloku tkanki, unikając przepełnienia. W przypadku mniejszych kawałków tkanek użyj strzykawki o pojemności 5 ml i form do zatapiania (np. form silikonowych, plastikowych tacek lub probówek wirówkowych przyciętych na wymiar), aby ułatwić osadzanie. Wlej do formy warstwę bazową agarozy o grubości 1-2 mm i pozwól jej częściowo zastygnąć. Delikatnie umieść tkankę płucną na półstałej agarozie, a następnie powoli wlej dodatkową agarozę, aby całkowicie pokryć tkankę, unikając pęcherzyków. Pozwól, aby agaroza całkowicie zastygła.
   3. Umieść płuca na lodzie na około 30 minut, aby umożliwić polimeryzację agarozy. Sprawdź opłucną pod kątem twardości i chłodu, aby potwierdzić polimeryzację; W razie potrzeby kontynuuj schładzanie.
   4. Pokrój tkankę płucną na 1-2 cm kawałki za pomocą ostrego ostrza.
   5. Wyśrodkuj tackę do kąpieli lodowej na stole do krojenia i wcześniej napełnij ją kostkami lodu w celu wstępnego schłodzenia.
   6. Włącz wyłącznik zasilania, a następnie naciśnij i przytrzymaj przycisk UP, aby podnieść sample stage do odpowiedniej pozycji.
   7. Ostrożnie załaduj ostrze na uchwyt noża.
      UWAGA: Z ostrzem należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć obrażeń. Zużyte ostrza należy utylizować w przeznaczonych do tego pojemnikach na ostre przedmioty.
   8. Wytnij kawałek taśmy o długości około 3 cm i szerokości 1 cm. Przymocuj lepką stronę do tacki i równomiernie pokryj nieklejącą się stronę klejem cyjanoakrylowym.
   9. Podnieś kawałek tkanki płucnej za pomocą kleszczy. Osusz powierzchnię papierem chłonnym i umieść ją na taśmie pokrytej klejem. Delikatnie dociśnij, aby zapewnić mocne przyleganie.
   10. Po związaniu kleju załaduj tackę na tackę do kąpieli lodowej. Napełnij wstępnie schłodzonym PBS, aż blok tkanki zostanie zanurzony.
   11. Ustaw częstotliwość wibracji na "10", a prędkość cięcia na "2". Naciśnij przycisk FWD, aby rozpocząć krojenie. Po całkowitym przecięciu pierwszego plastra naciśnij przycisk STP, aby zatrzymać, a następnie naciśnij przycisk RVE, aby schować ostrze. Odrzuć pierwszy plasterek.
   12. Ręcznie obróć gramofon 6 razy, aby ustawić grubość sekcji na 600 μm. Naciśnij przycisk FWD, aby wznowić krojenie, a po wycięciu sekcji naciśnij przycisk STP. Naciśnij RVE, aby schować nóż i wyjąć plasterek płuca za pomocą pęsety. Umieść plaster w PBS zawierającym 1% penicyliny/streptomycyny (P/S) i trzymaj go na lodzie.
   13. Powtórz powyższe etapy krojenia, aby uzyskać dodatkowe PCL, każdy o grubości około 600 μm.
   14. Gdy bieżący blok tkankowy jest prawie wyczerpany, zastąp go nowym blokiem tkankowym i powtórz kroki od 1.2.4 do 1.2.13.

2. Oczyszczanie przeciwciała FAP

UWAGA: Wygeneruj jednodomenowe przeciwciało specyficzne dla FAP zawierające C-końcowy znacznik His zgodnie z wcześniejszym opisem^11,12.

1. Wykonaj wyświetlanie fagów, aby umożliwić wysokoprzepustową selekcję fragmentów przeciwciał specyficznych dla FAP (scFv) poprzez powtarzalne przesuwanie bibliotek kombinatorycznych względem celów unieruchomionych lub w fazie roztworu. Odzyskaj związane fagi poprzez rygorystyczne mycie i elucję. Amplifikacja fagów poprzez ponowne zakażenie E. coli i wzbogacenie docelowych środków wiążących przez 3-4 cykle. Walidacja klonów za pomocą testu ELISA fagowego i sekwencjonowania DNA w celu identyfikacji przeciwciał o wysokim powinowactwie¹².
2. Sklonuj sekwencję DNA kodującą jednołańcuchowy fragment zmiennej anty-FAP do wektora pET-28a(+) połączonego ze znacznikiem His do ekspresji w E. coli¹³.
3. Przekształć rekombinowany plazmid w komórki E. coli BL21 (DE3). Indukować ekspresję białka za pomocą izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) w kulturach kolb wstrząsowych inkubowanych przez noc w temperaturze 20 °C¹⁴.
4. Oczyść przeciwciało FAP z supernatantu za pomocą kulek kwasu niklowo-nitrylotrioctowego (Ni-NTA). Wymiana buforu z Usługą PBS dla aplikacji podrzędnych.
5. Oceń czystość przeciwciał za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE). Pojedyncze dominujące prążki o oczekiwanej masie cząsteczkowej wskazują na wysoką czystość.

3. Ocena powinowactwa przeciwciał FAP

1. Hodowla ludzkich embrionalnych komórek nerkowych 293T (HEK 293T) w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną.
2. Dodaj białko aktywujące ludzkie fibroblasty z nadekspresją lentiwirusa (hFAP) do komórek 293T przy 90% zbiegu. Inkubować przez 96 godzin, aby wytworzyć stabilną linię komórkową 293T-hFAP.
3. Trawić zarówno komórki 293T, jak i 293T-hFAP za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA i zbierać komórki.
4. Umyj komórki PBS i inkubuj z przeciwciałem FAP, a następnie z anty-IgG sprzężonym z Alexa Fluor 488.
5. Analizuj intensywność fluorescencji za pomocą cytometru przepływowego NovoCyte^15,16.

4. Znakowanie sondy cząsteczkowej scFv-FAP-ICG

1. Dostosować stężenie FAP-scFv do 2 mg/ml za pomocą PBS.
2. Dodaj zielony ester indocyjaniny NHS (ICG-NHS), aby uzyskać stosunek molowy 5:1 (ICG-NHS:FAP-scFv).
3. Dokładnie wymieszaj, wirując i wstrząsając.
4. Inkubować reakcję w ciemności w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
5. Usuń niezwiązany barwnik za pomocą kolumny odsalającej. Końcowy sprzężony produkt należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.

5. Sonda molekularna scFv-FAP-ICG do oceny stopnia aktywności fibroblastów w PCLS

1. Po przecięciu PCLS umieścić jedną sekcję na studzienkę w płytce 12-dołkowej. Przepłucz każdą studzienkę dwukrotnie 1 ml PBS, aby usunąć resztki krwi i zanieczyszczenia.
2. Zanurz PCLS w 1 ml DMEM bez FBS. Dodać scFv-FAP-ICG w końcowym stężeniu 5 μg/ml. Inkubować na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z delikatnym potrząsaniem, chronić przed światłem.
3. Przemyć próbki PBS trzykrotnie, każda przez 5 minut.
4. Pozyskaj obrazy fluorescencyjne ICG PCLS za pomocą systemu obrazowania zwierząt in vivo z następującymi ustawieniami: długość fali wzbudzenia przy 785 nm i długość fali emisji przy 810 nm.
5. Oceń aktywność zwłóknienia PCLS na podstawie intensywności fluorescencji. Zdefiniuj obszary zainteresowania (ROI) za pomocą kompatybilnego oprogramowania, z promieniowaniem fluorescencyjnym wyrażonym jako fotony/s/cm²/sr.
   1. Kliknij przycisk Wybierz ROI, aby umożliwić oprogramowaniu automatyczne obrysowanie pseudo-kolorowego obszaru. Jeśli rozmieszczenie ROI jest niedokładne, dostosuj je ręcznie. Kliknij Oblicz, aby określić siłę sygnału w regionie. Jeśli wybrano wiele podregionów, zsumuj wartości ze wszystkich podregionów.

Results

Procedura przygotowania do PCLS ludzkiej tkanki płucnej jest przedstawiona w Rysunek 1. Ludzka tkanka płucna została osadzona w agarozie, a następnie przycięta do bloków tkankowych o wielkości około 1^cm3 za pomocą żyletki. Przycięte i spłaszczone tkanki umieszczono na platformie do cięcia o grubości 600 μm za pomocą mikrotomu (Rysunek 1A,B). PCLS inkubowano na płytkach 12-dołkowych (Ryc. 1C).

Przyg...

Discussion

Dzięki powyższym metodom badawczym przygotowano PCLS od zdrowych dawców i pacjentów z IPF. Jednocześnie komórki ssaków wykorzystano do ekspresji jednołańcuchowych zmiennych fragmentów FAP oraz zweryfikowano ich czystość i swoistość. Sonda molekularna ukierunkowana na FAP i znakowana ICG została wykorzystana do wykrycia poziomów ekspresji FAP, odzwierciedlających stopień aktywacji fibroblastów. Takie podejście zapewnia zaawansowaną metodę oceny leczenia zwłóknienia płuc.

PCLS zachowuje naturaln...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 % trypsyna-EDTA	Gibco	15050-057
2 razy; Kolor SYBR Green qPCR Master Mix (ROX2)	EZBioscience	A0012-R2
20 ml strzykawka	Winner	V532159
komórka 293T	Beyotime	C6008
502 klej	Żuolid	D-40
Agaroza, niska temperatura żelowania	Sigma Aldrich	A9414-25G
Przeciwciało antykolagenowe I	abcam	ab138492
Przeciwciało anty-fibronektyny	abcam	ab2413
Anti-His-tag mAb-Alexa Fluor 488	MBL	D291-A48
BL21	Beyotime	D1009S
Blade	Gillette	7in83a7Q
Kolorowy zestaw do odwrotnej transkrypcji (z usuwaczem gDNA)	EZBioscience	A0010CGQ
Coomassie Niebieski Super szybki Roztwór barwiący	Beyotime	P0017F
DMEM	Gibco	12800017
Kolba Erlenmeyera	Sichuan Shunbo	GG-17
FAP MAb królika	CST	66562
FBS	Gibco	10099-141
Kleszcze	Roboz	RS-5135
ICG-NHS	Ruixibio	R-TE-157
Mikrowaga IPTG	MCE	367-93-1
	Mikrofalówka Secura	Secura225D-1CN
	Mideo	PM2002
Wielomodowy system obrazowania zwierząt in vivo	BioLight	AniView600
Ni-NTA	Genscript	L00250
Cytometr przepływowy NovoCyte	ACEA  Nauki biologiczne	Novocyte
PBS	Gibco	10010023
Penicylina-Streptomycyna	Gibco	15140122
SDS-PAGE	Beyotime	P00528
Uniwersalne oczyszczanie RNA	EZBioscience	EZB-RN4
Wibratom	DOSAKA	DTK-1000N
β-aktyna Królik pAb	Yeasen	30102ES
Podkład
β-Primer-F	iGenebook Biotech		CATGTACGTTGCTATCCAGGC
β-Elementarz aktynowy-R	iGenebook Biotech		CTCCTTAATGTCACGCACGAT
Podkład FAP-F	iGenebook Biotech		TTGAGTGGATGGGAGGGAT
FAP primer-R	iGenebook Biotech		GCTGTGCTCGTGGATTTGT
Collagen-I primer-F	iGenebook Biotech		GAGGGCCAAGACGAAGACATC
Collagen-I primer-R	iGenebook Biotech		CAGATCACGTCATCGCACAAC
Fibronectin primer-F	iGenebook Biotech		CGGTGGCTGTCAGTCAAAG
Fibronectin primer-R	iGenebook Biotech		AAACCTCGGCTTCCTCCATAA