Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Identyfikacja inhibitorów PD-1/PD-L1 za pomocą technologii powierzchniowego rezonansu plazmonowego

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67859

⸱

2 maja 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Rhode Island

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje test blokady dla inhibitorów PD-1/PD-L1 przy użyciu technologii powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Wykorzystuje dwuetapową strategię unieruchomienia i dostosowany system buforowy do dokładnego pomiaru jednostek reakcji, ułatwiając ocenę wskaźników blokady dla związków lub leków biologicznych. Dodatkowo wspomaga wysokoprzepustową identyfikację inhibitorów PD-1/PD-L1.

Streszczenie

Zakłócenie interakcji PD-1/PD-L1 jest obiecującą strategią immunoterapii nowotworów. Wiarygodne platformy przesiewowe są niezbędne do oceny skuteczności inhibitorów PD-1/PD-L1. Wcześniej opracowany test blokady PD-1/PD-L1 u ludzi wykorzystujący technologię powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) (platforma przesiewowa SPR inhibitora PD-1/PD-L1 pierwszej generacji) wykazał wyniki porównywalne z wynikami uzyskanymi za pomocą jednorodnej fluorescencji rozdzielczej w czasie (HTRF) i testów komórkowych, z potencjałem do badań przesiewowych na dużą skalę. W niniejszym artykule przedstawiono zoptymalizowaną wersję tego testu (platforma przesiewowa SPR inhibitora PD-1/PD-L1 drugiej generacji), charakteryzującą się dwuetapowym procesem sprzęgania, który łączy sprzężenie aminy i bio-streptawidyny w celu poprawy kontroli orientacji PD-1 na chipie i zmniejszenia zużycia białka PD-1. Zaktualizowana platforma została pomyślnie zwalidowana przy użyciu inhibitora PD-1/PD-L1 BMS-1166, wykazując efekty blokady porównywalne z poprzednią metodą opartą na SPR i innymi uznanymi technikami, takimi jak ELISA. Wyniki te potwierdzają wiarygodność tego podejścia. Ta zoptymalizowana platforma przesiewowa SPR oferuje wysokowydajne i niezawodne narzędzie do identyfikacji nowych inhibitorów PD-1/PD-L1, postępu w badaniach nad immunoterapią nowotworów i podkreślenia potencjału SPR w badaniach przesiewowych inhibitorów immunologicznych punktów kontrolnych.

Wprowadzenie

Terapie blokujące immunologiczne punkty kontrolne, szczególnie te ukierunkowane na Programowaną Śmierć Komórki-1 (PD-1) i Ligand Programowanej Śmierci Komórki 1 (PD-L1), stoją w czołówce strategii immunoterapii raka. Terapie anty-PD-1/PD-L1 zostały zatwierdzone do stosowania w różnych typach nowotworów, takich jak rak hematologiczny, skórny, płucny, wątroby, pęcherza moczowego i nerki1. PD-1 jest transbłonową glikoproteiną należącą do nadrodziny immunoglobulin, charakteryzującą się pojedynczą domeną podobną do zmiennej immunoglobuliny (IgV) na N-końcu, około 20-aminokwasową łodygą oddzielającą domenę IgV od błony plazmatycznej, domeną transbłonową i cytoplazmatycznym ogonem zawierającym motywy sygnalizacyjne oparte na tyrozynie2. PD-L1, zidentyfikowany jako jeden z ligandów PD-1, jest białkiem transbłonowym typu I charakteryzującym się regionem transbłonowym, dwiema domenami zewnątrzkomórkowymi - stałą immunoglobuliny (IgC) i IgV - oraz stosunkowo krótką domeną cytoplazmatyczną, która wyzwala wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe3. Szlak hamujący PD-1/PD-L1 służy jako krytyczny immunologiczny punkt kontrolny, który reguluje aktywację limfocytów T i autoimmunizację4. PD-1 ulega ekspresji na limfocytach T, gdzie oddziałuje z PD-L1, hamuje sygnalizację receptora limfocytów T i blokuje stymulację cząsteczek CD28 i CD80 na komórkach prezentujących antygen i limfocytach T5. Tkanki nowotworowe wykorzystują ten fizjologiczny mechanizm poprzez nadekspresję PD-L1 podczas fazy ucieczki, tworząc w ten sposób środowisko immunosupresyjne, które sprzyja wzrostowi i progresji guza6. Inhibitory PD-1 i PD-L1 zakłócają tę interakcję, umożliwiając układowi odpornościowemu uniknięcie supresji wywołanej przez nowotwór i ponowne zainicjowanie procesu śmierci komórek nowotworowych za pośrednictwem limfocytów T7.

Opierając się na fundamencie położonym przez znaczącą rolę terapii blokujących immunologiczne punkty kontrolne, rozwój inhibitorów PD-1/PD-L1 oznaczał znaczący postęp w immunoterapii nowotworów. Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zatwierdziła dziewięć inhibitorów immunologicznych punktów kontrolnych, które są specyficznie ukierunkowane na szlak PD-1 / PD-L1. Należą do nich sześć inhibitorów PD-1 - pembrolizumab, dostarlimab, niwolumab, cemiplimab, orypalimab i tislelizumab - oraz trzy inhibitory PD-L1 - atezolizumab, awelumab i durwalumab8,9. Terapie te są skutecznie stosowane w leczeniu różnych nowotworów, takich jak czerniak, rak płuc, rak dróg moczowych, rak szyjki macicy, rak żołądka lub przełyku i inne guzy lite10. Pomimo swojej skuteczności, terapie oparte na przeciwciałach monoklonalnych napotykają na znaczne ograniczenia, w tym niskie wskaźniki odpowiedzi, wysokie koszty, wydłużone okresy półtrwania, poważne zdarzenia niepożądane związane z układem immunologicznym oraz ograniczenia w podawaniu dożylnym lub podskórnym11,12,13. W związku z tym badania coraz częściej koncentrują się na opracowywaniu małocząsteczkowych inhibitorów ukierunkowanych na oś PD-1/PD-L1. Te małe cząsteczki oferują wyraźne korzyści, takie jak lepsza penetracja komórkowa, modulacja różnych celów biologicznych, zwiększona biodostępność po podaniu doustnym i zmniejszone koszty, w celu osiągnięcia porównywalnych wyników terapeutycznych przy mniejszej liczbie działań niepożądanych14. Jednak rozwój inhibitorów małocząsteczkowych ukierunkowanych na interakcję PD-1/PD-L1 jest na wczesnym etapie, głównie ze względu na brak niezawodnej platformy do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Takie platformy są niezbędne do szybkiej oceny ogromnych bibliotek małych cząsteczek i identyfikacji związków wiodących w celu dalszej walidacji i optymalizacji. Sprostanie temu wyzwaniu ma kluczowe znaczenie dla postępu w immunoterapii nowotworów.

Technologia powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) jest szeroko stosowana do wykrywania różnych biomolekuł, w tym antygenów przeciwciał, enzymów, kwasów nukleinowych i leków, i jest szczególnie skuteczna w badaniach przesiewowych leków małocząsteczkowych15,16. W przeciwieństwie do innych technik biofizycznych, SPR oferuje detekcję bez znaczników, dane kinetyczne w czasie rzeczywistym i szeroki zakres wykrywania. Z kolei kalorymetria miareczkowa izotermiczna nie ma wglądu w kinetykę w czasie rzeczywistym i wymaga większych objętości próbek, co ogranicza przepustowość. Termoforeza w mikroskali jest podatna na zakłócenia buforowe i nie może dostarczyć danych kinetycznych, podczas gdy interferometria biowarstw ma ograniczenia specyficzne dla aplikacji oparte na wielkości i właściwościach molekularnych. Jednorodna fluorescencja czasowo-rozdzielcza wymaga znakowania i jest podatna na zakłócenia fluorescencyjne. Zdajemy sobie sprawę, że HTRF jest kolejną odpowiednią technologią do badania inhibitorów PD-1/PD-L1. Jednym z nieodłącznych ograniczeń HTRF, w porównaniu do SPR, jest wygaszanie fluorescencji spowodowane zewnętrznymi interakcjami z procesem wzbudzenia wewnątrzcząsteczkowego (np. transfer elektronów, FRET i bielenie), czułość jest zbyt niska w procesie przesiewowym leków ze względu na mały zakres okna i interferencję ze związkami z biblioteki fluorescencyjnej lub białkami biologicznymi17. Cechy te pozycjonują SPR jako doskonałe narzędzie do odkrywania leków. Nasze poprzednie badania wykazały, że SPR jest w stanie określić efekt blokady małych cząsteczek przeciwko PD-1/PD-L1, co jest korzystne w porównaniu z innymi technikami, które wymagają wysokich wymagań technologii znakowania, wielu etapów, słabej swoistości i wysokich kosztów w procesie odkrywania leków18.

To badanie wprowadza zoptymalizowaną platformę opartą na SPR, integrującą dwuetapowy proces sprzęgania, który wykorzystuje zarówno sprzężenie aminowe, jak i bio-streptawidynowe, aby poprawić orientację PD-1 na chipie i zminimalizować zużycie białka. To zaktualizowane podejście zostało pomyślnie zweryfikowane przy użyciu inhibitora PD-1/PD-L1 BMS-1166 jako spoiwa kontroli pozytywnej, wykazując efekty blokady porównywalne zarówno z naszą poprzednią metodą SPR, jak i innymi uznanymi technikami, takimi jak ELISA19,20. To nie tylko potwierdza niezawodność i odtwarzalność naszego protokołu, ale także ilustruje skuteczność naszej zmodyfikowanej platformy w ułatwianiu wysokoprzepustowych badań przesiewowych inhibitorów PD-1/PD-L1. Włączenie etapu wychwytywania biostreptawidyny zapewnia orientację białka skierowaną na miejsce, a nie losową, co pozwala na zmniejszenie stężenia PD-1 (40 μg/ml vs. 10 μg/ml) i oszczędność kosztów poprzez umożliwienie użytkownikowi końcowemu immobilizacji streptawidyny (SA) do chipa CM5, tańszej alternatywy dla skomercjalizowanych, wstępnie unieruchomionych chipów SA. To sprawia, że jest to korzystne dla dużych, opłacalnych badań przesiewowych bibliotek związków/peptydów. Chociaż dodatkowe metody charakteryzacji, w tym testy in silico, in vitro i in vivo, są niezbędne do oceny potencjału klinicznego inhibitorów PD-1/PD-L1 przeciwko nowotworom, nasza ulepszona platforma przesiewowa oparta na SPR wyróżnia się jako skuteczne narzędzie do badań przesiewowych na dużą skalę inhibitorów PD-1/PD-L1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Odczynniki i sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Unieruchomienie białka streptawidyny (SA) na chipie CM5

  1. Ustaw metodę immobilizacji w instrumencie SPR: Otwórz/nowy szablon kreatora, wybierz unieruchomienie, ustaw typ chipa na CM5 i przepływaj komórki na cykl na 1. Sprawdzić unieruchomioną komorę przepływową 1 i komorę przepływową 2.
    1. Ustaw aminę jako metodę unieruchomienia. Ustaw cel dla poziomu unieruchomionego, stężenie ligandów: 40 μg/ml streptawidyny, poziom docelowy: 2000 RU, roztwór do mycia: 50 mM NaOH. Następnie sprawdź prime przed uruchomieniem.
  2. Przygotuj następujące probówki: R2 B1 i R2 C1 - 40 μg/ml streptawidyny; R2 B2 i R2 C2: 50 mM NaOH; R2 B3 i R2 C3: EDC; R2 B4 i R2 C4: NHS; R2 B5 i R2 C5: Puste; R2 B6 i R2 C6: Etanoloamina.
    UWAGA: EDC i NHS aktywują grupy karboksylowe na chipie CM5, umożliwiając kowalencyjne sprzężenie z aminami na ligandzie. Etanoloamina jest stosowana jako bufor blokujący, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu podczas unieruchomienia.
  3. Rozcieńczyć 20 ml buforu HBS-EP+ 10× w 180 ml wody dejonizowanej (DI), aby przygotować 200 ml 1× roztworu buforowego HBS-EP+.
  4. Dodać 1 ml wody wolnej od DNaz do 1 mg streptawidyny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie rozcieńczyć roztwór streptawidyny do 40 μg/ml w buforze octanowym (pH 4,5). Przygotuj odczynniki z zestawu odczynników do sprzęgania aminowego zgodnie z instrukcjami producenta i umieść wszystkie odpowiednie układy odczynników, jak wskazano w kroku 1.2.
  5. Wymień chip czujnika konserwacji na chip CM5, a następnie umieść rurkę A w przygotowanym buforze 1× HBS-EP+, ponownie otwórz metodę immobilizacji i włóż rurki zgodnie z układem kroku 1.2. Uruchom metodę i zapisz plik wyników.
  6. Konserwacja po uruchomieniu: wymień chip CM5 na chip czujnika konserwacji, umieść rurkę A w butelce wypełnionej wodą dejonizowaną i uruchom prime. Po wyjęciu chipa CM5 umyj go kilkoma kroplami wody DI i wysusz na powietrzu. Umieścić chip w probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Unieruchomiony układ SA umożliwia chipowi CM5 działanie jako układ SA.

2. Immobilizacja białka PD-1 na chipie SA

  1. Ustaw metodę unieruchomienia w instrumencie SPR: Otwórz/nowy szablon kreatora, wybierz immobilizację, ustaw typ chipa na SA i przepływaj komórki na cykl na 1. Sprawdź unieruchomioną komórkę przepływu 1 i komórkę 2.
    1. Ustaw wychwytywanie biotyny SA jako metodę. W przypadku ślepej immobilizacji w komórce 1, w przypadku komórki 2 należy dążyć do unieruchomionego poziomu, 10 μg/ml PD-1 jako liganda, poziom docelowy: 4000 RU, a następnie sprawdź prime przed uruchomieniem.
      UWAGA: Przygotuj następujące probówki - R2 B1 i R2 C1: 1 M NaCl, 50 mM NaOH; R2 B2 i R2 C2: 50% izopropanolu/50 mM NaOH/1 m NaCl; R2 C3: 10 μg/ml PD-1.
  2. Rozpuścić 58,44 mg NaCl w 1 ml 50 mM NaOH w celu przygotowania 1 M NaCl i 50 mM roztworu NaOH. Rozpuścić 58,44 mg NaCl i 4,0 mg NaOH w 500 μl wody, a następnie dodać 500 μl izopropanolu, aby przygotować 50% roztwór izopropanolu/50 mM NaOH/1 M NaCl.
  3. Przygotuj roztwór PD-1: Dodaj 200 μl wody wolnej od DNaz do 100 μg Biotynylowanego ludzkiego PD-1 (Fc i Avitagged) i stabilizuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie rozcieńcz do 10 μg/ml w buforze octanowym (pH 5,0).
  4. Umieść wszystkie układy odczynników zgodnie z opisem w kroku 2.1. Umieść probówkę A w 1× roztworze buforowym HBS-EP+, a następnie wysuń chip czujnika konserwacji i włóż chip SA (chip CM5 pokryty białkiem streptawidyny z kroku 1). Ponownie otwórz metodę unieruchomienia, włóż stojak na odczynniki 2 i sprawdź pozycje, a następnie uruchom metodę dla szacowanego czasu działania.
  5. Powtórz krok 1.6.

3. Zwiad regeneracyjny dla PD-1 i PD-L1

  1. Ustaw metodę rozpoznania regeneracji: Otwórz/nowy szablon kreatora, wybierz Regeneration Scouting, ustaw ścieżkę przepływu: 2-1, 4-3, typ chipa na SA, sprawdź cykl kondycjonowania przebiegu, zapisz roztwór jako HBS-EP+, czas kontaktu jako 30 s, liczba wstrzyknięć jako 3, roztwór jako PD-L1, czas kontaktu: 30 s, natężenie przepływu: 30 μL/min.
    1. Dla parametrów regeneracji natężenie przepływu wynosi 30 μL/min, a okres stabilizacji wynosi 300 s. W projekcie eksperymentalnym ustaw liczbę warunków na 4, a liczbę cykli dla każdego warunku na 2. Ustaw warunki jako 4, roztwór regeneracyjny: Glicyna 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, czas kontaktu: 30 s, a następnie sprawdź zalanie przed uruchomieniem.
  2. Ustawić każde stężenie PD-L1 jako oddzielną pozycję dołka próbki w układzie 96-dołkowym mikropłytki: R1 A1 do R1 A9: 1 μM PD-L1; R1 A10 do R1 A12: bufor HBS-EP+; R1 B1: Glicyna 1,5; R1 B2: Glicyna 2; R1 B3: Glicyna 2,5; R1 B4: Glicyna 3,
    UWAGA: Jako bufor regeneracyjny stosuje się bufor glicynowy o różnym pH.
  3. Przygotuj roztwór PD-L1: Dodaj 200 μl wody wolnej od DNaz do 100 μg ludzkiego białka PD-L1 Fc Tag (9,42 μM), a następnie rozcieńcz do 1 μM w buforze HBS-EP+.
  4. Umieść wszystkie odpowiednie odczynniki w układzie zgodnie z opisem w kroku 3.2. Umieść rurkę A w buforze 1× HBS-EP+, a następnie wymień układ czujnika konserwacji na układ SA. Ponownie otwórz metodę Regeneration Scouting, postępuj zgodnie z pozycją probówki z kroku 3.2, włóż stojak na odczynniki, a następnie uruchom metodę dla szacowanego czasu działania.
  5. Powtórz krok 1.6.

4. Walidacja interakcji PD-1/PD-L1

UWAGA: Dla walidacji, poprzednio opublikowany raport18 został uzupełniony niewielkimi poprawkami.

  1. Użyj tych samych parametrów, co w opublikowanym raporcie, w obszarze Ustawienia ogólne, Etapy oznaczania i Typy cykli, ustaw czas kontaktu na 60 s, czas dysocjacji na 60 s, a natężenie przepływu na 30 μl/min. W obszarze zmiennych metody, zmiennych oceny i poleceń użyj tego samego ustawienia, z wyjątkiem użycia glicyny 2.0 jako regeneracji, ustaw natężenie przepływu na 30 μl/min, przechodzi przez ścieżkę przepływu 1, 2, 3, 4.
    1. Następnie skonfiguruj run i wybierz ścieżkę przepływu: 2-1, 4-3. Wprowadź PD-L1 o stężeniach od 0 μM, 0,037 μM, 0,111 μM, 0,333 μM i masie cząsteczkowej 51 300 Da. Sprawdź wszystkie kroki testu w celu weryfikacji i wybierz prime przed uruchomieniem.
    2. Następnie ustaw każde stężenie PD-L1 jako oddzielną pozycję dołka na próbkę w układzie Reagent Rack 2: R2 B1: PD-L1 0 μM; R2 B2: PD-L1 0,037 μM; R2 B3: PD-L1 0,111 μM; R2 B4: PD-L1 0,333 μM; R2 A1: Glicyna 2.0 jako bufor regeneracyjny; R2 A2: HBS-EP+ jako bufor startowy.
  2. Przygotować 200 ml 1× roztworu buforowego HBS-EP+. Przygotować stężenia PD-L1: rozcieńczyć białko PD-L1 w proporcjach 9,42 μM do 0,333 μM, 0,111 μM i 0,037 μM w HBS-EP+. Następnie umieść wszystkie odpowiednie odczynniki w układzie zgodnie z opisem w kroku 4.1.2.
    1. Włóż rurkę A do 1× roztworu buforowego HBS-EP+, wysuń układ czujnika konserwacji i włóż chip SA. Ponownie otwórz metodę zwiadowczą regeneracji, postępuj zgodnie z położeniem probówki z kroku 4.1, włóż stojak na odczynniki 2 i uruchom metodę przez szacowany czas.
  3. Powtórz krok 1.6.

5. Test blokady PD-1/PD-L1 z inhibitorem małych cząsteczek: BMS-1166

UWAGA: Dla testu blokady, poprzednio opublikowany raport18 został zastosowany z niewielkimi poprawkami.

  1. Użyj tych samych parametrów, co w opublikowanym raporcie, w obszarze Ustawienia ogólne, Etapy oznaczania i Typy cykli, ustaw czas kontaktu na 60 s, czas dysocjacji na 60 s, a natężenie przepływu na 30 μl/min. W ramach zmiennych metody, zmiennych oceny i poleceń również używa tego samego ustawienia, z wyjątkiem użycia glicyny 2.0 jako regeneracji, ustawienie natężenia przepływu na 30 μl/min, przechodzi przez ścieżkę przepływu 1, 2, 3, 4.
    1. Następnie skonfiguruj run i wybierz ścieżkę przepływu: 2-1, 4-3. Wprowadzić roztwór próbki: PD-L1 (0,111 μM, masa cząsteczkowa 51 300 Da) z BMS-1166 przy 0 μM, 0,125 μM, 0,625 μM, 3,125 μM. Sprawdź wszystkie etapy testu w celu weryfikacji i wybierz prime przed przebiegiem.
    2. Następnie ustaw każde stężenie PD-L1 jako oddzielną pozycję studzienki na próbkę w układzie Reagent Rack 2: R2 B1: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0 μM R2 B2: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0,125 μM; R2 B3: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0,625 μM; R2 B4: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 3,125 μM; R2 A1: Glicyna 2.0 do regeneracji.
  2. Przygotować 200 ml 1× roztworu buforowego HBS-EP+. Przygotować mieszaninę BMS-1166/PD-L1: Rozpuścić 5 mg BMS-1166 w 77,99 μl dimetylosulfotlenku (DMSO), aby przygotować 100 mM roztwór podstawowy. Rozcieńczyć roztwór podstawowy białkiem PD-L1 (0,11 μM) do docelowych stężeń BMS-1166 przy 0 μM, 0,125 μM, 0,625 μM i 3,125 μM w HBS-EP+. Umieść wszystkie odpowiednie układy odczynników zgodnie z opisem w kroku 5.1.2.
    1. Umieść rurkę A w 1× roztworze buforowym HBS-EP+, a następnie wysuń chip czujnika konserwacji i włóż chip SA. Ponownie otwórz metodę zwiadowczą regeneracji, postępuj zgodnie z pozycją probówki z 5.1 i włóż stojak na odczynniki 2, a następnie uruchom metodę dla szacowanego czasu działania.
  3. Powtórz krok 1.6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Immobilizacja SA na chipie CM5
Dane zostały poddane analizie poprzez wynik z urządzenia SPR i powiązanego oprogramowania analitycznego wskazujący na pomyślne osiągnięcie docelowej wartości RU (2000 RU) białka SA na komórce przepływowej 1 i komórce przepływowej 2. Na komórkach przepływowych 1 i 2 unieruchomiono SA (40 μg/mL) na powierzchni chipa CM5, z końcowym sygnałem odpowiedzi wynoszącym 1902,3 RU w komorce przepływowej 1 (Rysunek 1A) oraz 1900,7 RU na ogniwi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W ciągu ostatnich kilku dekad różne podejścia do immunoterapii – w tym szczepionki przeciwnowotworowe, inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych i terapie limfocytami T CAR – znacznie posunęłynaprzód leczenie raka. Immunologiczne punkty kontrolne odgrywają kluczową rolę w zapobieganiu ubocznym uszkodzeniom komórek odpornościowych podczas reakcji patogennych oraz w tłumieniu autoimmunizacji. Kluczowym przykładem jest interakcja między PD-L1 i PD-1, która tworzy główny immunologiczny punkt kon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy doceniają główny obiekt RI-INBRE na Uniwersytecie Rhode Island, wspierany przez Grant P20GM103430 z National Center for Research Resources (NCRR), składnika National Institutes of Health (NIH). Badania te były wspierane przez Pilot Grant Award z College of Pharmacy na University of Rhode Island, Small Grant Award z Rhode Island Life Science Hub (RILSH) oraz grant Rhode Island Foundation, wszystkie przyznane dr Chang Liu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
50 mM NaOHCytiva Life Sciences100358
50 mM NaOHFisher Scientific905376
96-dołkowe mikropłytki polistyrenoweCytiva Life SciencesBR100503
Amina Coupling KitCytiva Life Sciences35120
System i oprogramowanie ewaluacyjne Biacore T200 SPR 3.2Cytiva Life Sciences28975001
Biotynylowany ludzki PD-1 Fc, białko AvitagAcro BiosystemsPD1-H82F1
BMS1166MedChemExpressHY-102011
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-Aldrich276855
Woda wolna od DNazFisher Scientific188506
Glycine 1.5Cytiva Life SciencesBR100354
Glycine 2.0Cytiva Life SciencesBR100355
Glycine 2.5Cytiva Life SciencesBR100356
Glycine 3.0Cytiva Life SciencesBR100357
HBS-EP+ BufferCytiva Life SciencesBR100669
Human PD-L1 Fc Tag BiałkoAcro BiosystemsPD-1-H5258
IzopropanolFisher ScientificBP2618-1
Folia do mikropłytek, 96-dołkowa Cytiva Life Sciences28975816
NaClSigma-Aldrich746398
Fiolki plastikowe 7 mmCytiva Life SciencesBR100212
Gumowe nakrętki, typ 3Cytiva Life SciencesBR100502
Series S Sensor Chip CM5Cytiva Life Sciences29149603
Octan sodu 4.5Cytiva Life Sciences100350
Octan sodu 5.0Cytiva Life Sciences100351
StreptawidynaSigma-AldrichS4762

Bibliografia

  1. Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
  2. Zhang, X., et al. Structural and functional analysis of the costimulatory receptor programmed death-1. Immunity. 20 (3), 337-347 (2004).
  3. Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. J Exp Med. 192 (7), 1027-1034 (2000).
  4. Han, Y., Liu, D., Li, L. PD-1/PD-L1 pathway: Current researches in cancer. Am J Cancer Res. 10 (3), 727-742 (2020).
  5. Lyu, N., et al. Recognition of PDL1/L2 by different induced-fit mechanisms of PD1: A comparative study of molecular dynamics simulations. Phys Chem Chem Phys. 22 (3), 1276-1287 (2020).
  6. Taube, J. M., et al. Colocalization of inflammatory response with B7-H1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci Trans Med. 4 (127), 127ra37(2012).
  7. Sun, X., et al. Immune-related adverse events associated with programmed cell death protein-1 and programmed cell death ligand 1 inhibitors for non-small cell lung cancer: A PRISMA systematic review and meta-analysis. BMC Cancer. 19 (1), 558(2019).
  8. Alkholifi, F. K., Alsaffar, R. M. Dostarlimab an inhibitor of PD-1/PD-L1: A new paradigm for the treatment of cancer. Medicina. 58 (11), 1572(2022).
  9. Uzar, W., et al. An updated patent review on PD-1/PD-L1 antagonists (2022-present). Expert Opin Ther Pat. 34 (8), 627-650 (2024).
  10. Ai, L., et al. Research status and outlook of PD-1/PD-L1 inhibitors for cancer therapy. Drug Des Devel Ther. 14, 3625-3649 (2020).
  11. Conroy, M., Naidoo, J. Immune-related adverse events and the balancing act of immunotherapy. Nat Commun. 13 (1), 392(2022).
  12. Guzik, K., et al. Small-molecule inhibitors of the Programmed Cell Death-1/Programmed Death-Ligand 1 (PD-1/PD-L1) interaction via transiently induced protein states and dimerization of PD-L1. J Med Chem. 60 (13), 5857-5867 (2017).
  13. Sifniotis, V., Cruz, E., Eroglu, B., Kayser, V. Current advancements in addressing key challenges of therapeutic antibody design, manufacture, and formulation. Antibodies. 8 (2), 36(2019).
  14. Beck, H., Härter, M., Haß, B., Schmeck, C., Baerfacker, L. Small molecules and their impact in drug discovery: A perspective on the occasion of the 125th anniversary of the Bayer Chemical Research Laboratory. Drug Discov Today. 27 (6), 1560-1574 (2022).
  15. Nguyen, H. H., Park, J., Kang, S., Kim, M. Surface plasmon resonance: A Versatile technique for biosensor applications. Sensors (Basel, Switzerland). 15 (5), 10481-10510 (2015).
  16. Liu, C., Seeram, N. P., Ma, H. Small molecule inhibitors against PD-1/PD-L1 immune checkpoints and current methodologies for their development: A review. Cancer Cell Int. 21 (1), 239(2021).
  17. Hu, K., Li, X. -J., Asmamaw, M. D., Shi, X. -J., Liu, H. -M. Establishment of high-throughput screening HTRF assay for identification small molecule inhibitors of Skp2-Cks1. Sci Rep. 11 (1), 21105(2021).
  18. Puopolo, T., et al. Establishment of human PD-1/PD-L1 blockade assay based on surface plasmon resonance (SPR) biosensor. Bio-protoc. 13 (15), e4765(2023).
  19. Ding, M., Chen, Y., Lang, Y., Cui, L. The role of cellular prion protein in cancer biology: A potential therapeutic target. Front Oncol. 11, 742949(2021).
  20. Li, H., Seeram, N. P., Liu, C., Ma, H. Further investigation of blockade effects and binding affinities of selected natural compounds to immune checkpoint PD-1/PD-L1. Front Oncol. 12, 995461(2022).
  21. Kamrani, A., et al. New immunotherapeutic approaches for cancer treatment. Pathol Res Pract. 248, 154632(2023).
  22. Yan, Y., Zhang, L., Zuo, Y., Qian, H., Liu, C. Immune checkpoint blockade in cancer immunotherapy: mechanisms, clinical outcomes, and safety profiles of PD-1/PD-L1 inhibitors. Arch Immunol Ther Exp. 68 (6), 36(2020).
  23. Chandrasekharan, G., Unnikrishnan, M. High throughput methods to study protein-protein interactions during host-pathogen interactions. Eur J Cell Biol. 103 (2), 151393(2024).
  24. Zhang, Y., et al. BMS-202, a PD-1/PD-L1 inhibitor, decelerates the profibrotic effects of fibroblasts derived from scar tissues via ERK and TGFβ1/Smad signaling pathways. Immun Inflamm Dis. 10 (1), e591(2022).
  25. Surmiak, E., et al. PD-L1 inhibitors: Different classes, activities, and mechanisms of action. Int J Mol Sci. 22 (21), 11797(2021).
  26. Feoli, A., Sarno, G., Castellano, S., Sbardella, G. DMSO-Related effects on ligand-binding properties of lysine methyltransferases G9a and SETD8. ChemBioChem. 25 (4), e202300809(2024).
  27. Tjernberg, A., Markova, N., Griffiths, W. J., HalléN, D. DMSO-Related effects in protein characterization. SLAS Discov. 11 (2), 131-137 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Inhibitory PD 1przesiew SPRpunkt kontrolny uk adu odporno ciowegoimmunoterapia nowotwor wpowinowactwo wi zaniatest blokadywysokoprzepustowe przesiewanieBMS 1166
Identyfikacja inhibitorów PD-1/PD-L1 za pomocą technologii powierzchniowego rezonansu plazmonowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.