Ten protokół opisuje metodę wywoływania jednostronnej niedrożności moczowodu (UUO) u myszy w celu zbadania postępu zwłóknienia tkanek w nefropatii obturacyjnej. Obejmuje zabiegi chirurgiczne, opiekę pooperacyjną i metody oceny zwłóknienia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model jednostronnej niedrożności moczowodu do badania zwłóknienia śródmiąższowego nerek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zwłóknienie nerek jest końcowym patologicznym skutkiem postępującej przewlekłej choroby nerek (PChN). Model jednostronnej niedrożności moczowodu (UUO) jest szeroko stosowany do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych i komórkowych leżących u podstaw zwłóknienia śródmiąższowego nerek oraz do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych. Model ten jest ustalany u myszy poprzez chirurgiczne podwiązanie jednostronnego moczowodu, procedurę, która jest stosunkowo prosta i łatwa do wykonania. Wiadomo jednak, że model myszy UUO wykazuje znaczną zmienność i niespójność, na co wpływają takie czynniki, jak szczep myszy, wiek, płeć, rodzaj znieczulenia, czas trwania operacji, temperatura ciała podczas zabiegu, umiejętności chirurgiczne operatora, warunki karmienia i ogólny stan zdrowia myszy. Różnice w technikach chirurgicznych, rozmieszczeniu szwów i czasie trwania niedrożności przyczyniają się do zmienności wyników. Ponadto niespójne pobieranie próbek z niedrożnych nerek dodatkowo zwiększa zmienność w ocenie zwłóknienia nerek. W niniejszym badaniu przedstawiono proces opracowywania mysiego modelu UUO i oceny zwłóknienia śródmiąższowego, omówiono wyzwania techniczne przyczyniające się do nieprzewidywalności modelu oraz zaproponowano potencjalne rozwiązania. Te spostrzeżenia mają na celu ustanowienie bardziej ustandaryzowanego i uniwersalnego podejścia do badania zwłóknienia nerek.
Wprowadzenie
Przewlekła choroba nerek (PChN) dotyka ponad 10% światowej populacji, a jej częstość występowania rośnie1. Różne schorzenia dróg moczowych, w tym wrodzone anomalie anatomiczne, kamica nerkowa, przerost gruczołu krokowego i guzy pęcherza moczowego, mogą prowadzić do niedrożności moczowodów². W rezultacie, mysi model jednostronnej niedrożności moczowodu (UUO) jest kluczowym narzędziem do identyfikacji nowych mechanizmów zwłóknienia śródmiąższowego nerek, zrozumienia progresji choroby i oceny potencjalnych strategii leczenia. Jest szeroko stosowany do badania pochodzenia miofibroblastów, podklastrów (mio)fibroblastów, metabolizmu komórek kanalików i zatrzymania cyklu komórkowego, częściowego przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego i innych powiązanych procesów3,4,5,6,7,8.
Oprócz zwłóknienia śródmiąższowego nerek wywołanego przez UUO, inne powszechnie używane modele zwłóknienia śródmiąższowego nerek u gryzoni obejmują modele indukowane toksynami, takie jak te wykorzystujące kwas arystolochowy, kwas foliowy i adeninę, a także modele indukowane chirurgicznie, takie jak nefrektomia 5/6 i uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (IRI). Model UUO ma kilka zalet w porównaniu z alternatywnymi modelami zwłóknienia nerek. Na przykład zwłóknienie nerek wywołane toksynami wymaga stosunkowo długiego okresu modelowania (około 1-2 miesięcy), a jego toksyczne skutki uboczne na inne narządy mogą skomplikować badanie mechanizmów zwłóknienia9,10,11. Modele indukowane chirurgicznie, takie jak nefrektomia 5/6, mogą prowadzić do znacznego krwawienia z nerek i infekcji, zwiększając ryzyko śmiertelności pooperacyjnej. Dodatkowo, zakres indukowanego zwłóknienia śródmiąższowego jest bezpośrednio skorelowany z objętością wyciętej tkanki nerkowej, co utrudnia konsekwentne odtworzenie tego samego stopnia zwłóknienia w każdej klasie mouse12.
Model IRI nerek jest podstawową metodą wywoływania ostrego uszkodzenia nerek w PChN i ma istotne znaczenie kliniczne. Nasilenie zwłóknienia można modulować, dostosowując czas niedokrwienia i temperaturę ciała; jednak w porównaniu z modelem UUO jest on bardziej złożony chirurgicznie, a indukcja zwłóknienia śródmiąższowego wymaga dłuższego czasu trwania13. W porównaniu z tymi modelami, model UUO ma kilka zalet, w tym krótki czas modelowania, minimalną zmienność, powtarzalność i stosunkowo prosty zabieg chirurgiczny. Mysi model UUO, który nie zawiera toksyn, jest tworzony przez podwiązanie jednego moczowodu, co prowadzi do nefropatii obturacyjnej w ciągu dwóch tygodni. Powoduje to wodonercze, poszerzenie kanalików i zwłóknienie śródmiąższowe, bardzo przypominające proces patologiczny obserwowany u ludzi14. Nasilenie zwłóknienia – łagodne, umiarkowane lub ciężkie – można kontrolować, dostosowując czas trwania eksperymentu.
Chociaż model myszy UUO jest prostszy do wykonania niż inne modele do badania PChN, kilka czynników może znacząco wpłynąć na jego stabilność. Czynniki te obejmują szczep myszy, wiek, płeć, rodzaj znieczulenia, czas trwania operacji, temperaturę ciała podczas operacji, umiejętności chirurgiczne operatora oraz warunki karmienia i stan zdrowia myszy15,16.
Minimalizacja chirurgicznego stresu i infekcji podczas wykonywania zabiegu w sposób stały i zorganizowany pod narkozą jest niezbędna do stworzenia powtarzalnego modelu myszy UUO. Ponadto badania nad mechanizmami i potencjalnymi celami terapeutycznymi PChN mogą być zagrożone przez niedoświadczonych operatorów, co prowadzi do zwiększenia strat myszy i większej heterogeniczności modelu. Aby sprostać tym wyzwaniom, przedstawiono kluczowe aspekty techniczne procesu chirurgicznego – przed, w trakcie i po zabiegu – podkreślając krytyczne kwestie, które wymagają uwagi. Co więcej, metodologia oceny modelu myszy UUO jest szczegółowa, aby zapewnić badaczom spójne i wiarygodne podejście.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi agencji i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Nankinie. Aby wyeliminować różnice płci i szczepu oraz zapewnić porównywalność wyników, wykorzystuje się wyłącznie samce myszy CD1 w wieku 8-10 tygodni i o wadze 22-25 g. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie zwierząt i instrumentów
- Autoklawuj wszystkie narzędzia chirurgiczne przed zabiegiem.
- Zważ i znieczul myszy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Prawidłowo podłącz urządzenie do znieczulenia wziewnego i umieść myszy w komorze indukcyjnej z 2% izofluranem zmieszanym z tlenem w tempie 1-2 l/min. Po potwierdzeniu indukcji znieczulenia (np. utraty odruchu prostowania) umieść nos myszy w stożku nosowym ze stałym dopływem znieczulenia. Podawać buprenorfinę (50 μg/kg) we wstrzyknięciu podskórnym jako przedoperacyjne działanie przeciwbólowe.
UWAGA: Regularnie sprawdzaj częstość oddechów i oceniaj poziom znieczulenia za pomocą odruchu pedałowania myszy. W razie potrzeby dostosować stężenie izofluranu. - Umieść mysz na zewnętrznym źródle ciepła w pozycji leżącej na plecach z wyciągniętą głową i szyją, aby utrzymać otwarte drogi oddechowe. Zabezpiecz łapy taśmą o niskiej przyczepności .
- Użyj termometru, aby monitorować temperaturę otoczenia i utrzymuj ją na poziomie 37-38 °C. Włóż sondę doodbytniczą i utrzymuj temperaturę ciała myszy na poziomie około 36,5-37 °C podczas zabiegu.
- Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec uszkodzeniu kserozy rogówki.
- Usuń włosy z obszaru operowanego za pomocą kremu do depilacji lub maszynki do strzyżenia i zdezynfekuj je trzykrotnie za pomocą roztworu betadyny i 75% etanolu.
2. Zabieg chirurgiczny
UWAGA: Gdy temperatura ciała ustabilizuje się na ustalonym poziomie, a odruch szczypania palców u nóg zniknie, rozpocznij następujące zabiegi chirurgiczne.
- Użyj ostrza chirurgicznego, aby wykonać pionowe nacięcie chirurgiczne o długości około 1-1,5 centymetra od pęcherza moczowego do lewej dolnej krawędzi żeber, aby odsłonić jamę brzuszną.
- Przenieś jelito na prawą stronę jamy brzusznej za pomocą bawełnianego wacika zwilżonego sterylnym solą fizjologiczną, aby odsłonić lewą nerkę, znajdującą się poniżej tylnej części śledziony i przylegającą do kręgosłupa.
- Użyj zakrzywionych kleszczyków tęczówki, aby usunąć tłuszcz i tkankę łączną otaczającą lewy moczowód. Po delikatnej izolacji podwiązać lewy moczowód w pobliżu dolnego bieguna nerki za pomocą szwu chirurgicznego 4/0. Wykonać drugie podwiązanie lewego moczowodu między pierwszym podwiązaniem a pęcherzem moczowym.
UWAGA: Aby zminimalizować zmienność wśród myszy, upewnij się, że pozycja podwiązania pozostaje spójna u wszystkich badanych. Użyj kleszczyków po lewej stronie, aby umieścić szew w końcówkach kleszczy praworęcznych i wsuń szew z powrotem pod moczowód17. Należy unikać włączania nadmiaru tłuszczu i tkanki łącznej do podwiązania, ponieważ może to prowadzić do niepełnej niedrożności nerek. Osiągnij to, delikatnie głaszcząc moczowód suchymi wacikami. - Ostrożnie przełóż jelita do jamy otrzewnej. Zszyj warstwy mięśniowe i skórne oddzielnie za pomocą szwów chirurgicznych 4/0.
UWAGA: Zszycie ze sobą warstwy skóry i mięśni może spowodować pęknięcie rany szwu i uszkodzenie wnętrzności jamy brzusznej. - Podczas operacji na wielu myszach użyj świeżego autoklawizowanego narzędzia chirurgicznego przed przejściem do następnej myszy.
3. Opieka pooperacyjna i monitorowanie
- Wstrzyknąć dootrzewnowo 0,5 ml ciepłej, normalnej soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu.
- Umieść myszy z powrotem w czystej klatce, aż odzyskają pełną świadomość.
- Buprenorfinę (50 μg/kg) należy podawać we wstrzyknięciu podskórnym co 8 godzin przez 3 dni po zabiegu. Codziennie monitoruj myszy pod kątem oznak braku pielęgnacji, zmniejszonego jedzenia i nieprawidłowej postawy.
4. Oceny pooperacyjne
- histologia
- Poddaj myszy eutanazji za pomocą przedawkowania izofluranu (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Zbierz niedrożne i przeciwległe niedrożne nerki18 po eutanazji.
- Do badania histologicznego należy wykorzystać największy przekrój poprzeczny odcinka nerkowego.
- Utrwal tkanki nerkowe w 4% paraformaldehydzie i pokrój otrzymane próbki na skrawki 4 μm.
- Wybarwić skrawki nerek kwasem okresowym Schiffa (PAS), barwieniem trichromem Massona (MTS) lub czerwonym barwieniem Sirius w celu wykrycia uszkodzenia kanalików nerkowych i zwłóknienia nerek.
- Wybierz dziesięć losowych pól odcinków nerek pod mikroskopem świetlnym w powiększeniu 200×.
- Oblicz proporcję niebieskiego obszaru kolagenowo-dodatniego za pomocą oprogramowania ImageJ.
- Plama zachodnia
- Pobrać około 20 mg tkanki nerkowej z tego samego bieguna nerek UUO za pomocą testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) buffer18.
- Określ ilościowo stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego19.
- Załaduj równe ilości próbek białka na 4%-10% żele Bis-Tris do elektroforezy i przenieś je do membran z polifluorku winylidenu (PVDF).
- Zablokować błony PVDF 5% mlekiem w tris-buffered Saline Tween (TBST) i inkubować je z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C.
- Przemyć membrany PVDF TBST i inkubować je z przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
- Wykrywanie poziomów białek za pomocą metody wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) i analizowanie ich za pomocą oprogramowania ImageJ, z dehydrogenazą 3-fosforanową aldehydu glicerynowego (GAPDH) jako kontrolą obciążenia.
- Nerek
- Znieczulić myszy wziewnym izofluranem (patrz krok 1.2).
- Zbierz 0,2-0,3 ml krwi zaoczodołowo po znieczuleniu.
- Odwirować próbki krwi o masie 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Zmierz stężenie kreatyniny w surowicy i azot mocznikowy (BUN) we krwi za pomocą automatycznego suchego analizatora chemicznego w celu monitorowania czynności nerek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Histologia
Barwienie kwasem okresowym i Schiffem (PAS) ujawniło rozszerzenie kanalików, zanik rąbka szczoteczkowego, tworzenie się złogów oraz obrzęk nabłonka kanalikowego. Barwienie trichromem Massona oraz czerwienią siriusem wykazało włóknienie śródmiąższowe po UUO, w przeciwieństwie do prawidłowych, zwartych kanalików z wyraźnymi światłami obserwowanych w grupie pozorowanej. Stopień włóknienia śródmiąższowego nerek, wskazany przez obszary niebieskie w barwieniu trichromem Massona i obszary czerwon...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiono kompleksową procedurę ustanawiania modelu UUO, szeroko stosowanego podejścia do badania zwłóknienia śródmiąższowego nerek. Dodatkowo przedstawiono identyfikację i ocenę modelu, w tym ocenę funkcji nerek i zmian histologicznych. Omówiono zmienne składające się na niejednorodność modelu oraz modyfikowalne czynniki techniczne.
Podatność na UUO różni się znacznie w zależności od wieku, płci i szczepu myszy. W porównaniu z myszami C57BL/6, myszy BALB/c są mniej podatne lub nawet odpor...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez National Science Foundation of China Grants (82370686/2024YFA1107704), Jiangsu Specially-Designated Professor Grant, Nanjing Science and Technology Innovation Project, Jiangsu Province Hospital High-level Talent Cultivation Program (Faza I) (CZ0121002010037), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20240055) oraz Jiangsu Medical Innovation Team dla JR; Szpital Prowincji Jiangsu (pierwszy szpital stowarzyszony z Uniwersytetem Medycznym w Nankinie) Projekt Zwiększenia Zdolności Klinicznych (JSPH-MA-2023-4), Priorytetowy Program Akademicki Rozwoju Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu (Chiny) i Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81970639/82151320) do HM.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 ml strzykawka | Mingankang | / | |
| 4/0 szew chirurgiczny | Jinhuan Medical | F401 | |
| 75% etanol | Lircon | 6303060031 | |
| anestezjologiczna pompa powietrza | RWD Life Science | R510-29 | |
| Anestezjologiczne komory indukcyjne | RWD Life Science | V102-V | |
| Maszynka do strzyżenia włosów zwierzęcych | Jinke | / | |
| Roztwór betadyny | Lircon | 6303030036 | |
| Buprenorfina (przeciwbólowa) | RWD Nauki przyrodnicze | / | |
| Zakrzywione kleszczyki do tęczówki | jinke | / | |
| Elektroniczna poduszka grzewcza | Reptizoo | AHM23 | |
| cienkie kleszcze proste | Jinke | / | |
| Kanister z filtrem gazu | RWD Life Science | R510-31-6 | |
| Pady z gazy | Winner Medical | 601-026576 | |
| Nożyczki do tęczówki | Jinke | / | |
| Izofluran (znieczulenie) | RWD Life Science | R510-22-10 | |
| Wielowyjściowy aparat do znieczulenia zwierząt | RWD Life Science | R550IE | |
| Uchwyt igły | jinke | / | |
| maść okulistyczna | Dechra NDC | 17033-211-38 | |
| Sterylny wacik bawełniany | Winner Medical | 601-015213 | |
| Sterylny sól fizjologiczna | Shimen | H20066533 |
Bibliografia
- Bello, A. K., et al. An update on the global disparities in kidney disease burden and care across world countries and regions. Lancet Glob Health. 12 (3), e382-e395 (2024).
- Klahr, S. Obstructive nephropathy. Intern Med. 39 (5), 355-361 (2000).
- Lovisa, S., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nat Med. 21 (9), 998-1009 (2015).
- Grande, M. T., et al. Snail1-induced partial epithelial-to-mesenchymal transition drives renal fibrosis in mice and can be targeted to reverse established disease. Nat Med. 21 (9), 989-997 (2015).
- Kang, H. M., et al. Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial cells has a key role in kidney fibrosis development. Nat Med. 21 (1), 37-46 (2015).
- Lebleu, V. S., et al. Origin and function of myofibroblasts in kidney fibrosis. Nat Med. 19 (8), 1047-1053 (2013).
- Yang, L., Besschetnova, T. Y., Brooks, C. R., Shah, J. V., Bonventre, J. V. Epithelial cell cycle arrest in g2/m mediates kidney fibrosis after injury. Nat Med. 16 (5), 535-543 (2010).
- Kuppe, C., et al. Decoding myofibroblast origins in human kidney fibrosis. Nature. 589 (7841), 281-286 (2021).
- Ren, J., et al. The transcription factor twist1 in the distal nephron but not in macrophages propagates aristolochic acid nephropathy. Kidney Int. 97 (1), 119-129 (2020).
- Perales-Quintana, M. M., et al. Metabolomic and biochemical characterization of a new model of the transition of acute kidney injury to chronic kidney disease induced by folic acid. PeerJ. 7, e7113(2019).
- Kim, K., et al. Skeletal myopathy in CKD: A comparison of adenine-induced nephropathy and 5/6 nephrectomy models in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 321 (1), F106-F119 (2021).
- Tan, R. Z., et al. An optimized 5/6 nephrectomy mouse model based on unilateral kidney ligation and its application in renal fibrosis research. Ren Fail. 41 (1), 555-566 (2019).
- Fu, Y., Xiang, Y., Wei, Q., Ilatovskaya, D., Dong, Z. Rodent models of aki and AKI-CKD transition: An update in 2024. Am J Physiol Renal Physiol. 326 (4), F563-F583 (2024).
- Kramann, R., Menzel, S. Mouse models of kidney fibrosis. Methods Mol Biol. 2299, 323-338 (2021).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Nørregaard, R., Mutsaers, H. aM., Frøkiær, J., Kwon, T. H. Obstructive nephropathy and molecular pathophysiology of renal interstitial fibrosis. Physiol Rev. 103 (4), 2827-2872 (2023).
- Thornhill, B. A., Chevalier, R. L. Variable partial unilateral ureteral obstruction and its release in the neonatal and adult mouse. Methods Mol Biol. 886, 381-392 (2012).
- Ren, J., et al. Twist1 in infiltrating macrophages attenuates kidney fibrosis via matrix metallopeptidase 13-mediated matrix degradation. J Am Soc Nephrol. 30 (9), 1674-1685 (2019).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Puri, T. S., et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298 (4), F1024-F1032 (2010).
- Falke, L. L., et al. Age-dependent shifts in renal response to injury relate to altered BMP6/CTGF expression and signaling. Am J Physiol Renal Physiol. 311 (5), F926-F934 (2016).
- Song, L., Shi, S., Jiang, W., Liu, X., He, Y. Protective role of propofol on the kidney during early unilateral ureteral obstruction through inhibition of epithelial-mesenchymal transition. Am J Transl Res. 8 (2), 460-472 (2016).
- Saad, K. M., et al. Reno-protective effect of protocatechuic acid is independent of sex-related differences in murine model of UUO-induced kidney injury. Pharmacol Rep. 76 (1), 98-111 (2024).
- Goorani, S., Khan, A. H., Mishra, A., El-Meanawy, A., Imig, J. D. Kidney injury by unilateral ureteral obstruction in mice lacks sex differences. Kidney Blood Press Res. 49 (1), 69-80 (2024).
- La Russa, D., Barberio, L., Marrone, A., Perri, A., Pellegrino, D. Caloric restriction mitigates kidney fibrosis in an aged and obese rat model. Antioxidants (Basel). 12 (9), 1778(2023).
- Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: Technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1487-F1494 (2012).
- Hammad, F. T. The long-term renal effects of short periods of unilateral ureteral obstruction. Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol. 14 (2), 60-72 (2022).
- Chevalier, R. L., Thornhill, B. A., Wolstenholme, J. T., Kim, A. Unilateral ureteral obstruction in early development alters renal growth: Dependence on the duration of obstruction. J Urol. 161 (1), 309-313 (1999).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
