Artykuł metodologiczny

Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

DOI:

10.3791/67906

⸱

6 czerwca 2025

 ,  ,  , 
1Shu Chien-Gene Lay Department of Bioengineering, University of California San Diego, 2Aiiso Yufeng Li Family Department of Chemical and Nano Engineering, University of California San Diego, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of California San Diego, 4Institute of Engineering in Medicine, University of California San Diego, 5Synthetic Biology Institute, University of California San Diego

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z platformy multimodalnej łączącej metody obrazowania optycznego bez znaczników, opracowaliśmy protokół do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej i metabolizmu. Dzięki obrazowaniu za pomocą fluorescencji wielofotonowej, generowania drugiej harmonicznej i wymuszonej mikroskopii rozpraszania Ramana możemy uzyskać całościowy przegląd środowiska komórkowego i molekularnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologie obrazowania optycznego są kluczowe w badaniach biomedycznych ze względu na ich zdolność do uzyskiwania zarówno informacji morfologicznych, jak i funkcjonalnych z próbek biologicznych w wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Te procesy optyczne wykorzystują różne interakcje światło-cząsteczki, takie jak rozpraszanie, absorpcja, emisja i generowanie harmonicznych, między fotonami a cząsteczkami w komórkach, tkankach lub narządach. Podczas gdy konwencjonalne obrazowanie biomedyczne historycznie koncentrowało się na zastosowaniu jednej modalności, ostatnie badania wykazały, że te różnorodne techniki zapewniają uzupełniający się wgląd, a ich połączone wyniki oferują bardziej kompleksowe zrozumienie zmian molekularnych w procesach starzenia się i rozwoju chorób oraz podstaw biologii komórki.

W ostatnich dziesięcioleciach rozwinęły się metody obrazowania optycznego bez znaczników, umożliwiając szczegółową eksplorację środowisk komórkowych i subkomórkowych. Na przykład fluorescencja wielofotonowa (MPF) nie tylko ułatwia celowane obrazowanie białek, ale także określa ilościowo aktywność metaboliczną za pomocą koenzymów autofluorescencyjnych, osiągając wysoką głębokość penetracji i rozdzielczość przestrzenną. Generacja drugiej harmonicznej (SHG) służy do obrazowania struktur takich jak kolagen w macierzy zewnątrzkomórkowej, podczas gdy stymulowane rozpraszanie ramanowskie (SRS) mapuje wiązania chemiczne i skład molekularny in situ z rozdzielczością subkomórkową.

Opracowaliśmy multimodalną platformę obrazowania, która łączy modalności MPF, SHG i SRS. Integracja tych modalności w jedną platformę umożliwia pozyskiwanie wieloaspektowych informacji z tej samej lokalizacji w komórkach, tkankach, narządach, a nawet ciałach, ułatwiając bardziej szczegółową eksplorację skomplikowanych relacji między metabolizmem komórkowym, strukturą macierzy zewnątrzkomórkowej i składem molekularnym. Ten multimodalny system oferuje rozdzielczość subkomórkową, głęboką penetrację tkanek, obrazowanie żywych komórek/tkanek in situ, a także wykrywanie bez znaczników i natychmiastową korejestrację bez konieczności regulacji położenia, przełączania urządzeń lub wyrównywania po analizie. W tym miejscu przedstawiamy protokół obrazowania bezznacznikowego za pomocą tej multimodalnej platformy i demonstrujemy jego zastosowanie w charakterystyce metabolizmu komórkowego i heterogeniczności molekularnej w komórkach i tkankach do badania starzenia się i chorób.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optyczne obrazowanie biomedyczne odegrało kluczową rolę w pogłębieniu naszego zrozumienia biologicznej struktury i funkcji. Obrazy są generowane poprzez modulację światła wzbudzającego i wykrywanie sygnałów z interakcji światło-tkanka. Pierwszy mikroskop złożony, opracowany przez Hansa i Zachariasa Janssenów około 1590 roku, wykorzystywał dwie wypukłe soczewki w tubusie, zapewniając powiększenie do 30x1. Nowoczesne mikroskopy optyczne, podążając za wiekami postępu, mogą teraz osiągać rozdzielczości tak dokładne, jak 1-3 nm2,3. Oprócz oferowania wysokiej rozdzielczości, zaawansowane systemy obrazowania zapewniają teraz głębszą penetrację tkanek, większą wydajność i minimalne uszkodzenia próbek, dzięki czemu nadają się szczególnie do obrazowania żywych komórek i tkanek. Obrazowanie bez znaczników jest szczególnie korzystne, ponieważ rejestruje informacje bez zakłócania procesów wewnątrzkomórkowych lub naruszania integralności próbki.

Mikroskopia fluorescencyjna wielofotonowa (MPF), szczególnie mikroskopia fluorescencyjna dwufotonowa, była szeroko stosowana do obrazowania bez znaczników. W przeciwieństwie do konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej, która opiera się na liniowej absorpcji i emisji pojedynczych fotonów, wzbudzenie MPF polega na jednoczesnej absorpcji wielu fotonów, których połączona energia wzbudza pojedynczą cząsteczkę fluoroforu4,5. Fotony te, zwykle w widmie podczerwonym, posiadają połowę lub mniej energii potrzebnej do wzbudzenia pojedynczych fotonów. Dłuższe fale i zlokalizowane wzbudzenie w punkcie ogniskowym w tym nieliniowym procesie skutkują mniejszym rozpraszaniem, głębszą penetracją tkanek i zmniejszoną fototoksycznością.

Komórkowe informacje metaboliczne mogą być przechwytywane przez mikroskopię MPF bez znaczników poprzez wykrywanie sygnałów autofluorescencyjnych z endogennych substratów metabolicznych, takich jak zredukowany dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NADH) i dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD). Koenzymy te wykazują wyraźne widma wzbudzenia i emisji, a ich współczynnik intensywności fluorescencji, znany jako stosunek redoks (NADH / FAD), odzwierciedla stan utlenienia komórki. Odkąd Britton Chance po raz pierwszy wprowadził koncepcję współczynnika redoks w 1979 roku, zaproponowano dodatkowe współczynniki, w tym NAD(P)H/FAD, NAD(P)H/(FAD + NAD(P)H) i FAD/(FAD + NAD(P)H), zaproponowano 6,7,8,9. Kwantyfikacja tych optycznych współczynników redoks za pomocą obrazowania MPF dostarcza cennych informacji na temat dynamiki metabolicznej. Na przykład obrazowanie MPF może odróżnić komórki rakowe od normalnych komórek na podstawie ich zmienionego metabolizmu, wykazując swój potencjał w diagnostyce raka10,11,12. Jednak detekcja autofluorescencji oparta na MPF ma ograniczenia. Inne wewnętrzne fluorofory, takie jak keratyna, mogą przyczyniać się do intensywności fluorescencji, prowadząc do przesłuchów spektralnych i niedokładnej interpretacji sygnału13. Dodatkowo, stosunek redoks odzwierciedla tylko ogólne zmiany oksydacji i redukcji utleniania komórkowego i nie rozróżnia NADH z różnych źródeł (np. cytoplazmatycznych lub mitochondrialnych) ani między NADH a NAD(P)H, ponieważ oba wykazują podobne piki widmowe przy 450 nm, co skutkuje sygnałami o mieszanej intensywności14.

Second Harmonic Generation (SHG), nieliniowy proces optyczny po raz pierwszy zademonstrowany w dziedzinie biomedycyny w latach 80., jest szeroko stosowany do bezznacznikowego obrazowania struktur komórkowych15,16. Podobnie jak MPF, SHG polega na jednoczesnej absorpcji dwóch fotonów o tej samej energii z ultraszybkiego lasera impulsowego. Fotony te są rekombinowane, aby wyemitować nowy foton o częstotliwości dwukrotnie większej niż częstotliwość padającego światła, co skutkuje wykryciem sygnału drugiej harmonicznej. To nieliniowe oddziaływanie optyczne występuje wyłącznie w materiałach niecentrycznych, które wykazują niezerową podatność drugiego rzędu na indukowanie polaryzacji w celu wygenerowania sygnału drugiej harmonicznej17,18. To sprawia, że SHG jest szczególnie skuteczny w obrazowaniu białek nitkowatych i struktur fibrylarnych, takich jak kolagen, miozyna i tubulina, bez konieczności stosowania egzogennych barwników fluorescencyjnych15,17,19,20. Nieprawidłowości w obfitości, sztywności, wyrównaniu i strukturze zwłóknienia i kolagenu są powszechne w wielu stanach, takich jak stany zapalne i nowotwory, co sprawia, że SHG jest obiecującym narzędziem do skutecznego i nieinwazyjnego wykrywania niektórych stanów chorobowych21,22,23. Szerokie zastosowanie obrazowania SHG w badaniach onkologicznych, w tym w badaniach nad rakiem piersi, jajnika i skóry, podkreśliło jego kluczową rolę zarówno w badaniach podstawowych, jak i potencjalnych zastosowaniach klinicznych24,25,26,27.

Różne cząsteczki wykazują różne poziomy energii wibracyjnej, które wywołują różne stopnie nieelastycznego rozpraszania, gdy są wzbudzone przez padające światło - zjawisko po raz pierwszy scharakteryzowane przez C. V. Ramana w 1928 roku28. Od tego czasu efekt Ramana jest szeroko wykorzystywany w mikroskopii optycznej do wykrywania składu molekularnego i tkankowego bez znakowania egzogennego. Zarówno wymuszone rozpraszanie Ramana (SRS), jak i koherentne rozpraszanie Ramanowskie anty-Stokesa (CARS) pobudzają wibracje molekularne w sposób spójny i wykorzystują nieliniowe oddziaływanie światła do wytworzenia silniejszego sygnału w porównaniu z konwencjonalną spontaniczną spektroskopią Ramana. Zjawisko SRS zostało po raz pierwszy opisane w 1962 roku29. W 2008 roku mechanizm ten został zintegrowany z trójwymiarowym obrazowaniem wielofotonowym, co pozwoliło na selektywne wykrywanie substancji chemicznych na podstawie zmian intensywności wiązek Pump i Stokesa spowodowanych molekularnymi przejściami wibracyjnymi30. Ta metoda minimalizuje nierezonansowe zakłócenia tła, generując czysty sygnał o natężeniu, który przewyższa sygnał CARS. Obrazowanie SRS doskonale sprawdza się w dostarczaniu obrazowania multipleksowego i hiperspektralnego, umożliwiając jednoczesne wykrywanie wielu wiązań chemicznych i umożliwiając wizualizację składu molekularnego w wysokiej rozdzielczości w próbkach o znacznej głębokości penetracji. Chociaż obrazowanie SRS jest stosunkowo nową techniką, okazało się skuteczne zarówno w diagnostyce klinicznej, jak i badaniach metabolicznych, in vivo i in vitro30,31,32,33,34,35,36. Na przykład SRS może różnicować tkanki naciekane przez guz mózgu od kory i istoty białej poprzez ilościowe określenie stosunku lipidów do białka, umożliwiając wyznaczenie marginesów guza w sposób nieinwazyjny bez znaczników37,38. Dodatkowo, zmiany metaboliczne, często uważane za cechy charakterystyczne chorób związanych ze starzeniem się i rakiem, mogą być ilościowo oceniane za pomocą SRS uzyskanego poprzez wykrycie wiązań węgiel-deuter w próbkach traktowanych ciężką wodą (D2O), co pozwala na ilościowy pomiar syntezy białek, lipogenezy i innych makromolekularnych procesów metabolicznych31,33,34,35,36. Możliwość śledzenia metabolitów z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną sprawia, że SRS jest obiecującym narzędziem do badania i diagnozowania chorób, z potencjałem do szerszych zastosowań klinicznych.

Obrazowanie multimodalne stało się potężnym podejściem w badaniach biomedycznych, integrując dwie lub więcej metod obrazowania w celu uzyskania bardziej wszechstronnego zrozumienia złożonych systemów biologicznych w obrębie tej samej próbki. W 2018 r. wprowadzono bezznacznikową technikę mikroskopii autofluorescencyjno-wieloharmonicznej (SLAM), integrującą fluorescencję dwufotonową (2PF), fluorescencję trzyfotonową (3PF), SHG i generowanie trzeciej harmonicznej (THG)39. Takie podejście ułatwia jednoczesną wizualizację interakcji komórkowych, procesów dynamicznych i poszczególnych składników w mikrośrodowisku guza. Mikroskopia SLAM zapewnia minimalne zakłócenia i zmniejszone zapotrzebowanie na moc lasera dla próbki, umożliwiając głębokie profilowanie tkanek i zapewniając bezpieczniejszą metodę monitorowania przyżyciowego40. Inna modalna modalność, łącząca wewnętrzną spektroskopię fluorescencyjną, spektroskopię odbicia dyfuzyjnego i spektroskopię Ramana, została opracowana do wykrywania raka in situ podczas zabiegów chirurgicznych41. Ponadto niedawno zaprojektowany multimodalny nieliniowy system endoskopowy, który integruje CARS, SHG i fluorescencję dwufotonową (TPF), wykazał zdolność do obrazowania próbek biologicznych w submikronowej i subkomórkowej rozdzielczości przestrzennej42. Połączona mikroskopia 2PF i SRS została podobnie wykorzystana do obrazowania in vivo w wysokiej rozdzielczości tkanek, komórek i organelli42,43,44,45. Te nowe techniki obrazowania multimodalnego wykorzystują mocne strony poszczególnych modalności, prowadząc do poprawy rozdzielczości, głębokości penetracji i wydajności pozyskiwania obrazów, wykazując w ten sposób znaczny potencjał w zastosowaniach klinicznych i chirurgicznych.

To podejście multimodalne jest coraz bardziej preferowane w stosunku do obrazowania jednomodalnego, ponieważ zapewnia szerszy zakres pomiarów, jednocześnie łagodząc ograniczenia związane z indywidualnymi technikami. Jak wspomniano wcześniej, MPF mierzy endogenną fluorescencję, aby odzwierciedlić zmiany metaboliczne, SHG może obrazować struktury niecentrosymetryczne, takie jak kolagen, w próbkach biologicznych, a SRS wykrywa głównie białka i lipidy ze względu na dużą gęstość wiązań chemicznych, które generują charakterystyczne sygnały Ramana w oparciu o ich tryby wibracyjne. Biorąc pod uwagę ich spójne właściwości i wspólną zasadę nieliniowych właściwości optycznych, te metody obrazowania można zintegrować w jednym mikroskopie wykorzystującym lasery o ultrakrótkich impulsach, co pozwala na pozyskiwanie różnych biomarkerów w zlokalizowanych regionach, aby zapewnić pełniejszy obraz procesów biologicznych44,45. W tym artykule przedstawiono protokół wdrażania multimodalnej platformy obrazowania, która integruje MPF, SHG i SRS do zastosowań w badaniach biomedycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Eksperymenty z obrazowaniem multimodalnym bez etykiet

UWAGA: Ten protokół skupia się na procedurze konfiguracji i akwizycji obrazowania multimodalnego bez etykiet

.
  1. Konfiguracja mikroskopu multimodalnego (Rysunek 1A) i kalibracja systemu
    1. Rozgrzej laser i odczekaj około 15-20 minut.
    2. Włączanie jednostek sterujących i monitorów w następującej kolejności: Skrzynka sterownicza | Kontroler z panelem dotykowym | Zasilacz sieciowy do głównego pilota laserowego Zasilacz sieciowy do pilota podrzędnego lasera.
    3. Włącz detektor fotodiody Si i wzmacniacz lock-in.
    4. Skonfiguruj wiązki laserowe pompy i wiązkę Stokesa. Skonfiguruj system laserowy z wiązką pompy przestrajaną od 780 nm do 990 nm, szerokością impulsu 5 - 6 ps i częstotliwością powtarzania 80 MHz. Wiązka laserowa Stokes ma stałą długość fali 1 031 nm z impulsem 6 ps i częstotliwością powtarzania 80 MHz. Upewnij się, że zarówno pompa, jak i belki Stokesa mają niską moc (co najmniej 20 mW), aby były widoczne na płycie wyrównującej.
    5. Umieść jedną płytkę wyrównującą w ścieżce optycznej (zaraz za skrzynką laserową), aby sprawdzić przestrzenne nakładanie się pomp i wiązek Stokesa i wyreguluj lustro, aż oba punkty zachodzą na siebie w środku płytki wyrównującej.
      UWAGA: Chociaż pompy i wiązki Stokesa z grubsza nakładają się na siebie, precyzyjne dostrojenie przestrzennego nakładania się dwóch wiązek laserowych może osiągnąć optymalny sygnał SRS.
    6. Po nakładaniu się przestrzennym dostosuj do PSD (Position Sensitive Detector), klikając najpierw oprogramowanie sterujące OPO. Użyj imbusowego, aby ostrożnie wyregulować lustro optyczne 1 (OM1) i obserwuj wyświetlacz PSD pod kątem zmiany pozycji XY, aby dążyć do minimalnego odchylenia od środka. Następnie, aby dokonać bardziej precyzyjnych regulacji, użyj klucza imbusowego na lustrze optycznym 2 (OM2), aż wskaźnik położenia zostanie wyśrodkowany na wyświetlaczu PSD.
      UWAGA: OM1 i OM2 to dwa lustra w głowicy OPO do regulacji wyrównania lasera.
    7. Na koniec wyśrodkuj kondensator, obracając dwie centrujące kondensator, aby przesunąć obraz przysłony przysłony przysłony do środka pola widzenia.
      UWAGA: Przysłona z przysłoną polową może ograniczać średnicę wiązki światła wpadającej do obiektywu, a tym samym wykluczać światło zewnętrzne, poprawiając kontrast obrazu.
  2. Etapy akwizycji obrazowania multimodalnego bez użycia znaczników
    1. Nanieś olej na skraplacz oleju o dużej aperturze numerycznej (1,4 NA) i zamontuj szkiełko mikroskopowe na naoliwionym skraplaczu. Na koniec umieść dużą kroplę wody na szkiełku mikroskopowym dla obiektywu wodnego 25x. Upewnij się, że mikroskop jest bezpiecznie zamontowany i nieruchomy, a następnie wyreguluj stolik z, aby dostroić ostrość, aż obraz w jasnym polu próbki biologicznej będzie widoczny pod obiektywem wodnym 25x.
    2. Rozpocznij proces obrazowania w odpowiedniej kolejności: MPF, SHG i SRS, aby uniknąć fotowybielania, które wpłynie na jakość obrazu i precyzyjną analizę MPF. Aby szybko przełączać się między MPF i SHG, przełącz się z belki pompy na stałą belkę Stokesa.
      UWAGA: Dostrojenie lasera pompującego z 800 nm (autofluorescencja NADH i FAD) do 791.3 nm (przesunięcie RamanaCH3) może zająć 1-2 minuty.
    3. Wybierz rozdzielczość obrazu (512 x 512 pikseli) i odpowiedni czas zatrzymania dla każdej modalności. Użyj 8 μs/piksel dla MPF i SHG przy średniej klatce powyżej 3. Użyj 40 μs/piksel ze średnią klatką 2 dla modalności SRS.
      UWAGA: Średnia klatka oznacza liczbę obrazów, które mają zostać uśrednione przed zapisaniem.
    4. Aby uzyskać autofluorescencję za pomocą MPF, wyłącz wiązkę lasera Stokesa i dostrój laser pompujący do 800 nm, aby uzyskać wzbudzenie NADH i flawiny. Zainstaluj kostkę filtrującą FVOPT na ścieżce światła o długości fali 460 ± 10 nm i 515 ± 10 nm odpowiednio dla NADH i flawiny. Moc na próbce wynosi zatem około 15 mW.
    5. Zdobądź sygnał z włókna kolagenowego za pomocą SHG. Wyłącz wiązkę laserową pompy, używaj tylko wiązki laserowej Stokes i ustaw moc na 500 mW. Pobieraj tylko kanał związany z filtrem 515 nm.
    6. Uzyskaj rozkład przestrzenny białek i lipidów za pomocą SRS. Pozostaw obie wiązki laserowe włączone i dostosuj częstotliwość wiązki laserowej, aby dopasować ją do określonego trybu wibracji dla każdej cząsteczki.
      UWAGA: Zazwyczaj 791,3 nm jest używane dla CH3, 797 nm jest używane dla CH2, 787 nm jest używane dla lipidów nienasyconych, a 794,6 dotyczy lipidów nasyconych. Moc na próbce wynosi zatem około 40 mW.
    7. Aby uzyskać zestawy danych obrazu hiperspektralnego SRS, otwórz oprogramowanie sterujące OPO, aby wybrać przemiatanie, ustaw zakres długości fali od 780 nm do 806,5 nm i wybierz numer stosu co najmniej 60. Następnie przechwyć stos obrazów hiperspektralnych.
      UWAGA: Wynikowy zestaw danych zawiera 60 obrazów, z których każdy reprezentuje rozkład przestrzenny przy określonym przesunięciu Ramana (od 2 700 cm-1 do 3 150 cm-1). Czas akwizycji hiperspektralnej zależy od pola widzenia (FOV) obrazu i czasu skanowania, ale w przypadku obrazu o wymiarach 512 x 512 wynosi w przybliżeniu od 5 minut do 8 minut. W przypadku większych obrazów należy zachować ostrożność, aby zminimalizować czas przebywania pod laserem, aby zapobiec fotouszkodzeniom, które mogą wystąpić po 2 godzinach (w zależności od grubości próbki i wielkości pola widzenia).
    8. Zapisz wszystkie obrazy z tych samych obszarów zainteresowania (ROI) w tym samym folderze. Format obrazu to plik Olympus .oir.

2. Analiza obrazu

  1. Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby otworzyć wszystkie zapisane obrazy RAW w celu przypisania koloru i dodania paska skali do wyświetlania obrazu. Użyj go również do wygenerowania binarnej maski obrazów NADH i nasyconych kwasów tłuszczowych (SFA, 2,880 cm-1) do optycznego stosunku redoks i analizy nienasycenia lipidów.
    UWAGA: Upewnij się, że intensywność maski ma tylko 0 i 1.
  2. Użyj domowego skryptu Pythona, aby przeprowadzić dowolną analizę podrzędną (kod jest dostępny pod adresem https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis).
    UWAGA: Ten skrypt jest przeznaczony do przetwarzania wielu regionów zainteresowania (ROI) zarówno z próbek kontrolnych, jak i rakowych. Główna funkcja skryptu wymaga tylko dwóch danych wejściowych: ścieżek plików do folderów kontrolnych i obrazów raka.
    1. Iteruj po folderach, dopasowując obrazy o tej samej nazwie podstawowej (np. "roi_1_flavin.tif", "roi_1_nadh.tif", "roi1_mask.tif").
    2. Dla każdego zestawu dopasowanych obrazów pozwól skryptowi przeprowadzić analizę ratiometryczną i wygenerować nowe obrazy ratiometryczne na podstawie tych obliczeń.
      Optyczny współczynnik redoks oblicza się jako flawinę / (NADH + flawinę).
      Nienasycenie lipidów oblicza się jako: USFA / (SFA + USFA), gdzie USFA reprezentują nienasycone kwasy tłuszczowe.
    3. Wszystkie wartości ratiometryczne z obrazów są następnie przechowywane w ramce danych biblioteki pandas w celu łatwej manipulacji. Wykonaj jednokierunkową ANOVA i użyj matplotlib ze styple "ggplot" lub seaborn, aby wykonać wykres słupkowy lub pudełkowy do kwantyfikacji.
    4. Użyj obrazów 2,930 cm-1 (CH3) i 2,850 cm-1 (CH2), aby wygenerować odjęty obraz (CH3 - CH2). Następnie zmieszaj obraz CH2 CH3 - CH2 obraz w przestrzeni kolorów RGB z niestandardową tablicą LUT, która naśladuje barwienie H&E, aby wygenerować cyfrowy obraz histologiczny46.
  3. Po uzyskaniu hiperspektralnych obrazów SRS użyj domowego skryptu Pythona, aby wykonać grupowanie k-średnich w celu segmentacji obrazów na podstawie podobieństw spektralnych (kod jest dostępny pod adresem https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis).
    1. Załaduj stosy obrazów .tiff za pomocą pakietu tifffile. Przekształć stos obrazów hiperspektralnych SRS (x, y, widma) w matrycę 2D (piksele, widma).
    2. Użyj pakietu scikit-learn, aby wdrożyć algorytm k-średnich w tej tablicy 2D ze zdefiniowaną liczbą klastrów.
    3. Przekształć wynikowe etykiety klastrów z powrotem do oryginalnych wymiarów obrazu, tworząc mapę segmentacji.
    4. Przypisz unikalne kolory do każdego klastra, generując obraz w sztucznych kolorach, który reprezentuje różne składy biochemiczne w tkance.
    5. Użyj matplotlib, aby wykreślić widma każdej grupy z wartością średnią (linia ciągła) i odchyleniem standardowym (obszar cienia)
    6. Postępuj zgodnie z protokołem ukaranego referencyjnego protokołu dopasowywania SRS (PRM-SRS) za pomocą MATLAB, aby utworzyć przestrzenne wykrywanie podtypów lipidów bez znaczników za pomocą zestawów danych obrazu hiperspektralnego SRS47.
    7. Uporządkuj obrazy i zapisz je w formacie .tif 300 dpi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazy w Rysunek 2 są reprezentatywne dla wyników uzyskanych zgodnie z protokołem rejestracji autofluorescencji FAD i NADH, jak również czterech kanałów SRS dla białka, lipidów całkowitych, lipidów nienasyconych i lipidów nasyconych. Tutaj również generujemy obraz pseudohistologiczny zgodnie z opisem w protokole poprzez mieszanie kolorów RGB. Akwizycja kanałów MPF i SRS dostarcza plików graficznych, które zostaną później wykorzystane w analizie ratiometrycznej. Przykład takiej analizy można ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten multimodalny system jest potężną platformą obrazowania do uchwycenia holistycznej wizualizacji środowiska molekularnego próbek o szerokim pochodzeniu biologicznym i stanach patologicznych. Zaletą wykorzystania różnych metod bezznacznikowych jest możliwość pozyskiwania informacji uzupełniających i celowania w określone anality, które w przeciwnym razie mogłyby być trudne lub niemożliwe w przypadku jednej techniki obrazowania bez znaczników. W szczególności trzy techniki obrazowania nieliniowego (SRS, MPF, SHG) wymieni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Glorii Pryhuber i członkom jej zespołu HuBMAP za dostarczenie wycinków ludzkiej tkanki płucnej. Dziękujemy dr Kun Zhang za dostarczenie ludzkich tkanek mózgowych. Dziękujemy również dr Gen-Sheng Feng za dostarczenie próbek wątroby myszy. Dziękujemy za wsparcie ze strony NIHU54DK134301, NIH R01GM149976, NIH U01AI167892, NIH R01HL170107, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIH U54CA132378, UCSD Startup funds, Sloan Research Fellow Award oraz CZI DAF2023-328667 Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kostka filtra 460 nmOlympusOCT-ET 460 / 50M32
Filtr pasmowo-przepustowyKR ElectronicsKR27248 MHz
BNC 50 OhmTerminator Mini obwodyprądu stałego STRM-50
TopWard6302D
Dichroic MountThorlabsKM100CL
FIJI ImageJ ImageJ
Skraplacz oleju o wysokiej średnicy NAOlympus6-U130
Filtr krótkoprzepustowy o średnicy �wiernejThorlabs950 nm
Odwrócony laserowy mikroskop skaningowyOlympusFV1200MPE
Wzmacniacz blokującyZurich Instruments
System laserowy picoEmeraldFizyka stosowana i Elektronika, Inc.  Zsynchronizowana pulsacyjna wiązka pompy (przestrajana 720– 990&cienkie; Długość fali nm, 5– 6 i cienkie; szerokość impulsu ps oraz 80  MHz) i Stokesa (długość fali przy 1032  nm, 6 i cienkie; szerokość impulsu ps oraz 80  Częstotliwość powtarzania MHz)
Detektor fotodiody SIDomowy
kontroler panelu dotykowegoOlympus
VF-300 Compresstome Precyzja
Zasilacz ,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wollman, A. J. M., Nudd, R., Hedlund, E. G., Leake, M. C. From Animaculum to single molecules: 300 years of the light microscope. Open Biol. 5 (4), 150019(2015).
  2. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nat Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  3. Weber, M., et al. MINSTED fluorescence localization and nanoscopy. Nat Photonics. 15 (5), 361-366 (2021).
  4. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. , (1990).
  5. Hell, S. W., et al. Three-photon excitation in fluorescence microscopy. J Biomed Optics. 1 (1), 71-74 (1996).
  6. Alhallak, K., Rebello, L. G., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N. Optical redox ratio identifies metastatic potential-dependent changes in breast cancer cell metabolism. Biomed Opt Express. 7 (11), 4364-4374 (2016).
  7. Pena, A. -M., et al. Multiphoton FLIM imaging of NADH and FAD to analyze cellular metabolic activity of reconstructed human skin in response to UVA light. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XIX. 10882, 23-33 (2019).
  8. Hu, L., Wang, N., Cardona, E., Walsh, A. J. Fluorescence intensity and lifetime redox ratios detect metabolic perturbations in T cells. Biomed Opt Express. 11 (10), 5674-5688 (2020).
  9. Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. J Biol Chem. 254 (11), 4764-4771 (1979).
  10. Ostrander, J. H., et al. Optical redox ratio differentiates breast cancer cell lines based on estrogen receptor status. Cancer Res. 70 (11), (2010).
  11. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of NADH and FAD redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (49), 19494-19499 (2007).
  12. Varone, A., et al. Endogenous two-photon fluorescence imaging elucidates metabolic changes related to enhanced glycolysis and glutamine consumption in precancerous epithelial tissues. Cancer Res. 74 (11), 3067-3075 (2014).
  13. Malak, M., James, J., Grantham, J., Ericson, M. B. Contribution of autofluorescence from intracellular proteins in multiphoton fluorescence lifetime imaging. Sci Rep. 12, 16584(2022).
  14. Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).
  15. Roth, S., Freund, I. Second harmonic generation in collagen. J Chem Phys. 70 (4), 1637-1643 (1979).
  16. Freund, I., Deutsch, M. Second-harmonic microscopy of biological tissue. Opt Lett. 11 (2), 94(1986).
  17. Boyd, R. W., Gaeta, A. L., Giese, E. Nonlinear optics. Springer Handbook of Atomic, Molecular, and Optical Physics. Drake, G. W. F. , Springer. 1097-1110 (2023).
  18. Aghigh, A., et al. Second harmonic generation microscopy: a powerful tool for bio-imaging. Biophys Rev. 15 (1), 43-70 (2023).
  19. Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
  20. Cox, G. Biological applications of second harmonic imaging. Biophys Rev. 3 (3), 131(2011).
  21. Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat Med. 9 (6), 796-800 (2003).
  22. Keikhosravi, A., Bredfeldt, J. S., Sagar, A. K., Eliceiri, K. W. Chapter 28 - Second-harmonic generation imaging of cancer. Methods Cell Bio. 123, 531-546 (2014).
  23. Hui Mingalone, C. K., et al. Bioluminescence and second harmonic generation imaging reveal dynamic changes in the inflammatory and collagen landscape in early osteoarthritis. Lab Invest. 98 (5), 656-669 (2018).
  24. Tsafas, V., et al. Polarization-dependent second-harmonic generation for collagen-based differentiation of breast cancer samples. J Biophotonics. 13 (10), e202000180(2020).
  25. Nadiarnykh, O., LaComb, R. B., Brewer, M. A., Campagnola, P. J. Alterations of the extracellular matrix in ovarian cancer studied by Second Harmonic Generation imaging microscopy. BMC Cancer. 10, 94(2010).
  26. Xiong, S. Y., Yang, J. G., Zhuang, J. Nonlinear spectral imaging of human normal skin, basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma based on two-photon excited fluorescence and second-harmonic generation. Laser Phys. 21 (10), 1844-1849 (2011).
  27. Tilbury, K., Campagnola, P. J. Applications of second-harmonic generation imaging microscopy in ovarian and breast cancer. Perspect Medicin Chem. 7, 21-32 (2015).
  28. Raman, C. V., Krishnan, K. S. A New type of secondary radiation. Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).
  29. Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Phys Rev Lett. 9 (11), 455-457 (1962).
  30. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  31. Li, Y., et al. Microglial lipid droplet accumulation in tauopathy brain is regulated by neuronal AMPK. Cell Metab. 36 (6), 1351-1370.e8 (2024).
  32. Lu, F. -K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. Cancer Res. 76 (12), 3451-3462 (2016).
  33. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nat Commun. 9 (1), 2995(2018).
  34. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nat Biomed Eng. 3 (5), 402-413 (2019).
  35. Li, Y., et al. Bioorthogonal stimulated Raman scattering imaging uncovers lipid metabolic dynamics in Drosophila brain during aging. GEN Biotechnol. 2 (3), 247-261 (2023).
  36. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by stimulated Raman scattering microscopy. Anal Chem. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  37. Ji, M., et al. Detection of human brain tumor infiltration with quantitative stimulated Raman scattering microscopy. Sci Transl Med. 7 (309), 309ra163(2015).
  38. Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Sci Transl Med. 5 (201ra119), 201ra119(2013).
  39. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nat Commun. 9, 2125(2018).
  40. You, S., et al. Label-free deep profiling of the tumor microenvironment. Cancer Res. 81 (9), 2534-2544 (2021).
  41. Jermyn, M., et al. Highly accurate detection of cancer in situ with intraoperative, label-free, multimodal optical spectroscopy. Cancer Res. 77 (14), 3942-3950 (2017).
  42. Pshenay-Severin, E., et al. Multimodal nonlinear endomicroscopic imaging probe using a double-core double-clad fiber and focus-combining micro-optical concept. Light Sci Appl. 10 (1), 207(2021).
  43. Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated Raman scattering microscopy. J Vis Exp. (178), e63411(2021).
  44. Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and stimulated Raman scattering microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. J Am Chem Soc. 139 (47), 17022-17030 (2017).
  45. Li, Z., et al. Multimodal imaging of metabolic activities for distinguishing subtypes of breast cancer. Biomed Opt Express. 14 (11), 5764-5780 (2023).
  46. Fung, A. A., et al. Label-free optical biopsy reveals biomolecular and morphological features of diabetic kidney tissue in 2D and 3D. , (2024).
  47. Zhang, W., et al. Multi-molecular hyperspectral PRM-SRS microscopy. Nat Commun. 15 (1), 1599(2024).
  48. Xu, F. X., et al. Discrimination of lipid composition and cellular localization in human liver tissues by stimulated Raman scattering microscopy. J Biomed Opt. 29 (1), 016008(2024).
  49. Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).
  50. Liaudanskaya, V., et al. Mitochondria dysregulation contributes to secondary neurodegeneration progression post-contusion injury in human 3D in vitro triculture brain tissue model. Cell Death Dis. 14 (8), 1-15 (2023).
  51. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, sub-types and early treatment response in breast cancer. Cancer Res. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  52. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  53. Sun, W., et al. Nonlinear optical microscopy: use of second harmonic generation and two-photon microscopy for automated quantitative liver fibrosis studies. J Biomed Optics. 13 (6), 064010(2008).
  54. Nejim, Z., Navarro, L., Morin, C., Badel, P. Quantitative analysis of second harmonic generated images of collagen fibers: a review. Res Biomed Eng. 39 (1), 273-295 (2023).
  55. Burke, K., Brown, E. The use of second harmonic generation to image the extracellular matrix during tumor progression. Intravital. 3 (3), e984509(2015).
  56. Balasubramanian, P., Prabhakaran, M. P., Sireesha, M., Ramakrishna, S. Collagen in human tissues: Structure, function, and biomedical implications from a tissue engineering perspective. Polymer Composites - Polyolefin Fractionation - Polymeric Peptidomimetics - Collagens. Abe, A., Kausch, H. H., Möller, M., Pasch, H. 251, 173-206 (2012).
  57. Dadsena, S., et al. Lipid unsaturation promotes BAX and BAK pore activity during apoptosis. Nat Commun. 15, 4700(2024).
  58. Barelli, H., Antonny, B. Lipid unsaturation and organelle dynamics. Curr Opin Cell Biol. 41, 25-32 (2016).
  59. Harayama, T., Antonny, B. Beyond fluidity: The role of lipid unsaturation in membrane function. Cold Spring Harb Perspect Biol. 15 (7), a041409(2023).
  60. Yoon, H., Shaw, J. L., Haigis, M. C., Greka, A. Lipid metabolism in sickness and in health: Emerging regulators of lipotoxicity. Mol Cell. 81 (18), 3708-3730 (2021).
  61. Villazon, J., Shi, L. Utilizing K-means clustering on hyperspectral DO-SRS images of the mouse hippocampus. CLEO 2024, Technical Digest Series. , Optica Publishing Group. (2024).
  62. Fu, D., et al. Quantitative chemical imaging with multiplex stimulated Raman scattering microscopy. J Am Chem Soc. 134 (8), 3623-3626 (2012).
  63. Periasamy, A., Diaspro, A. Special section guest editorial: Multiphoton microscopy. J Biomed Optics. 8 (3), 327(2003).
  64. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  65. Blacker, T. S., et al. Separating NADH and NADPH fluorescence in live cells and tissues using FLIM. Nat Commun. 5, 3936(2014).
  66. Xiong, H., et al. Background-free imaging of chemical bonds by a simple and robust frequency-modulated stimulated Raman scattering microscopy. Opt Express. 28 (10), 15663-15677 (2020).
  67. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  68. Alam, S. R., Wallrabe, H., Christopher, K. G., Siller, K. H., Periasamy, A. Characterization of mitochondrial dysfunction due to laser damage by 2-photon FLIM microscopy. Sci Rep. 12 (1), 11938(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

obrazowanie bezznakowefluorescencja wielofotonowagenerowanie drugiej harmonicznejstymulowane rozpraszanie Ramanowskiesk ad molekularnymetabolizm lipid woptyczny stosunek redoksrozdzielczo subkom rkowa

Powiązane artykuły