Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowana i wysokowydajna mikrobiologiczna hodowla monoklonalna i zbiór z wykorzystaniem systemu omicznego do hodowli mikrolitrowych mikrolitrów

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67925

⸱

14 marca 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biobreeding Center, Wuxi Research Institute of Applied Technologies, Tsinghua University, 5Center for Synthetic and Systems Biology, Tsinghua University, 6Institute of Biomedical Health Technology and Engineering, Shenzhen Bay laboratory, 7Institute of Biopharmaceutical and Health Engineering, Shenzhen International Graduate School, Tsinghua University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak używać Jednokomórkowego Systemu Mikrolitrowego Zarządzania Kulturami Kropelkowymi (komórka MISS) do przeprowadzania izolacji, hodowli i pobierania mikrobiologicznego monoklonu. Komórka MISS osiąga zintegrowany przepływ pracy oparty na technologii mikroprzepływowej kropelkowej, która zapewnia doskonałą monodyspersyjność kropel, wysoką hodowlę równoległą i wysokowydajne wykrywanie biomasy.

Streszczenie

Czyste kultury bakteryjne są niezbędne do badania kulturomiki mikrobiologicznej. Tradycyjne metody oparte na płytkach litych, płytkach studzienkowych i mikroreaktorach są utrudnione ze względu na uciążliwe procedury i niską przepustowość, co utrudnia szybki postęp badań nad kulturomiką mikrobiologiczną. Aby sprostać tym wyzwaniom, z powodzeniem opracowaliśmy system omiczny do hodowli jednokomórkowych mikrolitrów kropelkowych (MISS cell), zautomatyzowaną platformę o wysokiej przepustowości, która wykorzystuje technologię mikroprzepływową kropelek do izolacji, hodowli i badań przesiewowych drobnoustrojów. System ten może generować dużą liczbę kropelek jednokomórkowych oraz hodować, przesiewać i zbierać kolonie monoklonalne w krótkim czasie, ułatwiając zintegrowany proces od izolacji drobnoustrojów do zbierania. W niniejszym protokole zademonstrowaliśmy jego zastosowanie na przykładzie izolacji i hodowli ludzkiej mikroflory jelitowej oraz porównaliśmy skuteczność izolacji drobnoustrojów, wydajność hodowli monoklonalnej i przepustowość badań przesiewowych przy użyciu metody hodowli na płytkach stałych. Przebieg eksperymentu był prosty, a zużycie odczynników było bardzo niskie. W porównaniu z metodami hodowli na płytkach stałych, komórka MISS może wyhodować większą różnorodność gatunków mikroflory jelitowej, oferując znaczny potencjał i wartość dla badań nad kulturomiką mikrobiologiczną.

Wprowadzenie

Kulturomika mikrobiologiczna ma szerokie zastosowanie w badaniach nad pożytecznymi mikroorganizmami w przemyśle spożywczym, różnorodnością mikroorganizmów środowiskowych, badaniami przesiewowymi pod kątem nowych związków przeciwdrobnoustrojowych oraz ludzkim mikrobiomem w odniesieniu do chorób1,2,3,4. Tradycyjne metody, oparte głównie na płytkach litych, płytkach studzienkowych lub mikroreaktorach do pozyskiwania i wybierania kolonii monoklonalnych, są łatwe w obsłudze, ale mają niską przepustowość ze względu na ich wieloetapowość. To ograniczenie utrudnia takie zastosowania, jak badania przesiewowe w kierunku mutagenezy mikrobiologicznej, badania kultururomii drobnoustrojów i selekcja kolonii o wysokiej wydajności, z których wszystkie wymagają rozległych badań przesiewowych monoklonalnych.

Ostatnio, różne urządzenia do wykrywania i dozowania pojedynczych komórek zostały zaprojektowane w celu znacznego zwiększenia szybkości przetwarzania próbek mikrobiologicznych, jednocześnie zmniejszając nakład pracy i minimalizując błędy związane z ręczną obsługą5. Jednak instrumenty te zazwyczaj dotyczą tylko określonych kroków w ramach tradycyjnych metod, często wymagają rozległej integracji sprzętu, zajmują znaczną przestrzeń i wiążą się z wysokimi kosztami. W związku z tym istniała pilna potrzeba opracowania taniej, uniwersalnej platformy do hodowli drobnoustrojów i badań przesiewowych, aby zrekompensować wyżej wymienione niedociągnięcia.

W naszej poprzedniej pracy udało nam się opracować zautomatyzowaną, wysokowydajną platformę przesiewową, znaną jako Jednokomórkowy System Mikrolitrowy Omiczny Hodowli Kropelkowej (komórka MISS, zwana dalej "systemem Omics")6. Platforma ta wykorzystuje technologię mikroprzepływową kropelkową, która daje nadzieję na osiągnięcie automatyzacji i integracji w izolacji, hodowli i zbieraniu mikroorganizmów7,8,9,10. System Omics składa się z kilku kluczowych modułów, w tym modułu pobierania próbek, chipa mikroprzepływowego, systemu wykrywania i zbierania kropel, umożliwiającego wydajną izolację pojedynczych komórek, hodowlę, badania przesiewowe monoklonalne i zbieranie w badaniach mikrobiologicznych. Wykorzystaliśmy już system Omics, aby uzyskać wysokoprzepustowe badania przesiewowe mutagenezy w kierunku Corynebacterium glutamicum6.

Ze względu na automatyzację i możliwości systemu Omics w zakresie badań przesiewowych o wysokiej przepustowości, oczekuje się, że zastosowanie go do kulturomiki mikrobiologicznej szybko uzyska dużą ilość danych mikrobiologicznych. W tym protokole przedstawiliśmy szczegółową procedurę operacyjną komórki MISS, na przykładzie izolacji i hodowli ludzkiej mikroflory jelitowej, aby zademonstrować proces izolacji, hodowli, wykrywania monoklonalnego i badań przesiewowych drobnoustrojów. Obsługa systemu Omics jest prosta, a badacze muszą jedynie postępować zgodnie ze wskazówkami oprogramowania dotyczącymi sekwencyjnej instalacji mikrorurkowego i układu mikroprzepływowego generującego kropelki, ustawień parametrów i przygotowania próbki.

W interfejsie operacyjnym oprogramowania, system Omiki jest podzielony na trzy główne funkcje - izolację, hodowlę i selekcję. Badacze mogą wybrać różne etapy w zależności od eksperymentu. Co więcej, na etapie badania przesiewowego kropelek naukowcy mają do wyboru dwa tryby detekcji: sygnał fluorescencyjny lub gęstość optyczną. Oprogramowanie zapewnia wizualizację procesu przesiewania kropel w czasie rzeczywistym. Wreszcie, badacze mają elastyczność w konfigurowaniu parametrów, takich jak warunki hodowli, wykryta długość fali i liczba studzienek zbiorczych w oparciu o ich specyficzne wymagania eksperymentalne, a także mogą wstrzymać instrument w dowolnym momencie, aby przeprowadzić inne operacje. Komórka MISS to przyjazna dla drobnoustrojów, wysokowydajna platforma do badań monoklonalnych o prostej obsłudze i minimalnym zużyciu odczynników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury badawcze są zgodne ze wszystkimi odpowiednimi przepisami etycznymi. Procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Nauki i Technologii Uniwersytetu Tsinghua. W celu zbadania ludzkiej mikrobioty jelitowej pobrano próbki kału od zdrowej osoby dorosłej bez istotnych schorzeń, która wyraziła pisemną świadomą zgodę.

1. Instalacja instrumentu

  1. Umieść instrument systemu Omics w czystym lub sterylnym środowisku (takim jak sterylne pomieszczenie lub stół beztlenowy). Przyrząd jest urządzeniem precyzyjnym, a umieszczając go w obiekcie, należy wziąć pod uwagę następujące kwestie:
    1. Utrzymuj instrument pod normalnym ciśnieniem i temperaturą.
    2. Trzymaj przyrząd z dala od silnych pól elektrycznych, pól magnetycznych i źródeł promieniowania cieplnego.
    3. Upewnij się, że obszar umieszczenia przyrządu przekracza wymiary 2,500 mm (gł.) x 1,500 mm (szer.) x 2,000 mm (wys.).
    4. Utrzymuj wilgotność otoczenia instrumentu poniżej 60%.

2. Przygotowania

  1. Sekwencyjnie włączaj zasilanie systemu Omics, komputera i oprogramowania operacyjnego systemu Omics.
  2. Instalacja mikrorurkowego układu mikroprzepływowego MISS z ogniwami MISS i generacją kropelkową:
    1. Otwórz drzwi komory do generowania kropel i hodowli (Rysunek 1A) i pionowo zdejmij osłonę mikrorurki i chip mikroprzepływowy do generowania kropel. Użyj jednorazowej strzykawki, aby dodać 10 ml sterylnej wody destylowanej do nawilżacza wewnątrz komory do hodowli kropel (Rysunek 1C) i ponownie zainstaluj osłonę ochronną mikrorurki i chip mikroprzepływowy do generowania kropel.
    2. Otwórz sterylne opakowanie mikrorurkowego i kropelkowego chipa mikroprzepływowego i umieść go pionowo bezpośrednio nad komorą uprawową (Rysunek 1C).
    3. W interfejsie oprogramowania kliknij Instalacja (Rysunek 2A). W tym momencie pojawi się wyskakujące okienko z monitem: Potwierdź wymianę mikrorurki i chipa mikroprzepływowego do generowania kropel? Kliknij przycisk Tak, aby rozpocząć instalację.
    4. Wyjmij zmywacz pęcherzyków powietrza i zamocuj go do góry nogami na umieszczeniu zmywacza pęcherzyków powietrza w komorze do wytwarzania kropel i uprawy. Uważaj, aby nie naciskać rurek wlotowych i wylotowych kropelki urządzenia do usuwania pęcherzyków powietrza (Rysunek 1E).
    5. Przymocuj rurkę odprowadzającą kropelki urządzenia do usuwania pęcherzyków powietrza do zaworu zaciskowego pod nim i pozwól mu przejść przez otwór, który jest skierowany do komory wykrywania i zbierania kropel (Rysunek 1B).
    6. Otwórz drzwiczki komory do wykrywania i zbierania kropel, włóż pionowo rurkę detekcyjną, już podłączoną do rurki wylotowej kropli, do gniazda detekcji i upewnij się, że rurka detekcyjna jest całkowicie włożona (Rysunek 1D).
      UWAGA: Podczas wkładania rurki detekcyjnej należy ją włożyć pionowo bez żadnych zagięć na rurce.
    7. Dokręć mocującą rurkę detekcyjną w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara. Po upewnieniu się, że rurka detekcyjna jest całkowicie włożona i zabezpieczona, zamknij drzwiczki komory wykrywania i zbierania kropel.
    8. Z mikrorurkowego i kropelkowego chipa mikroprzepływowego znajduje się 10 silikonowych rurek, z których każda jest oznaczona numerem (L01-L10). Podłącz każdą oznaczoną rurkę do odpowiedniego numerowanego zaworu zaciskowego (01-10) ( Rysunek 1C).
    9. Podłącz szybkozłącze z mikrorurkowego i mikroprzepływowego chipa generującego kropelki do odpowiedniego portu w systemie Omics: C1 do O1, C2 do O2, C4 do O4 i CF do OF.
      UWAGA: Instalacja mikrorurkowego i mikroprzepływowego chipa do generowania kropelek została zakończona. C3 nie musi być podłączony do O3.
    10. Po zakończeniu instalacji mikrorurkowego chipa mikroprzepływowego do generowania kropel pojawi się wyskakujące okienko z monitem o otwarcie zaworu zaciskowego rurki kropelkowej. Kliknij przycisk OK po zakończeniu instalacji mikroprzepływowego układu scalonego z mikrorurkami i kropelkami. Po upewnieniu się, że wszystkie rurki silikonowe z mikrorurki i chipa mikroprzepływowego do generowania kropelek są podłączone do odpowiedniego zaworu zaciskowego, kliknij OK.
  3. Inicjalizacja instrumentu
    1. Przed wykonaniem inicjalizacji kliknij na interfejs ustawień (Rysunek 2B), aby skonfigurować odpowiednie parametry: tryb wykrywania (wykrywanie oparte na OD lub fluorescencji; OD tutaj), temperatura inkubacji (37 °C) i czas (30 dni = 720 h), prędkość mieszadła (20 obr./min), długość fali wykrywania OD (600 nm) oraz długość fali wzbudzenia i emisji detekcji fluorescencji.
      UWAGA: Parametry stosowane do izolacji i hodowli mikrobioty jelitowej człowieka w niniejszym protokole podano w nawiasach. Podczas ustawiania parametrów temperatura uprawy powinna wynosić od 5 °C do 50 °C. Wybierając tryb wykrywania, światłowód musi zostać wymieniony, jeśli światłowód na module wykrywania kropelek nie jest taki sam (patrz krok 2.3.2). Podczas konfiguracji parametrów, wartość referencyjna fazy olejowej (podstawowe widmo) jest automatycznie identyfikowana przez oprogramowanie, co eliminuje potrzebę ręcznej regulacji.
    2. Wymiana wykrytego światłowodu
      1. Wyjmij wykryte włókno z uchwytu światłowodu (odkręć w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara) i poluzuj mocującą światłowód na module kropli (Rysunek 1D).
      2. Jeśli światłowód nie będzie używany, wyjmij go z modułu, włóż do uchwytu światłowodu i dokręć. Włóż wykryte światłowód do portu wykrywania i dokręć mocującą światłowód na module. Wymiana światłowodu została zakończona.
    3. Przejdź do interfejsu głównego i kliknij przycisk Zainicjuj, aby system Omics przeprowadził samokontrolę swoich komponentów, w tym pompy wtryskowej, ustawień temperatury, testowania odprowadzania cieczy odpadowych, modułu przesiewowego i modułu wykrywania kropel.
      1. Podczas inicjalizacji należy przeprowadzić test odprowadzania cieczy odpadowej z modułu wykrywania kropel, wstrzykując 1 ml 75% alkoholu do portu cieczy odpadowej i obserwując, czy ciecz wypływa normalnie.
      2. W przypadku testu modułu przesiewowego należy umieścić 96-dołkową płytkę na płytce i obserwować, czy ruch płytki jest normalny.

3. Generowanie kropel

  1. Pobieranie i przetwarzanie próbek mikrobioty jelitowej człowieka
    1. Przygotuj pojemnik na nocnik i stołek, umyj ręce i załóż rękawiczki, aby pobrać świeże próbki kału.
      UWAGA: Podczas pobierania próbek kału należy w miarę możliwości unikać zanieczyszczenia moczem. Lepiej jest wcześniej oddać mocz i umieścić stolec w czystym, suchym pojemniku.
    2. W asepcie zebrać odpowiednią ilość stolca środkowego segmentu i zamknąć go w wysterylizowanych kriowiałach (około 3-5 g na fiolkę). Natychmiast umieścić fiolki na lodzie w celu późniejszego porcjowania i etykietowania.
      UWAGA: Jeśli próbka kału jest duża lub nie można jej pobrać od razu, należy ją pobrać maksymalnie w ciągu 2 godzin.
    3. Na stanowisku beztlenowym użyj sterylnego wacika lub narzędzia do pobierania kału, aby pobrać próbkę środkowego segmentu.
      UWAGA: Warstwa powierzchniowa stolca zawiera złuszczone komórki błony śluzowej jelit i jest podatna na zanieczyszczenia zewnętrzne; po wystawieniu na działanie powietrza niektóre drobnoustroje DNA zaczynają ulegać degradacji.
    4. Pobrane próbki kału przenieść do sterylnych probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml lub sterylnych kriowialiów, przy czym każda probówka zawiera 0,5-2,0 g stolca. Przygotować dwie podwielokrotności do zamrożenia na próbkę.
    5. Zawiesić świeżą próbkę kału w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, przy czym każde 100 mg stolca rozcieńczyć w 1 ml roztworu. Dokładnie wymieszaj stolec, aż nie będą widoczne żadne duże cząstki.
    6. Po naturalnej sedymentacji przez 10 minut sekwencyjnie przefiltruj supernatant przez sterylne filtry siatkowe o wielkości porów 200 mesh (0,075 mm), 400 mesh (0,038 mm) i 800 mesh (0,018 mm) w celu usunięcia niestrawionego pokarmu i mniejszych cząstek stałych. Na koniec zebrać filtrat w sterylnych probówkach wirówkowych.
    7. Pobrać 10 μl przefiltrowanej zawiesiny kałowej i oznaczyć stężenie drobnoustrojów za pomocą hemocytometru i mikroskopu fluorescencyjnego z odwróconą fluorescencją.
      UWAGA: Po przefiltrowaniu supernatantu próbki kału przez różne rozmiary oczek pozostają pewne mniejsze cząstki kału. Dlatego przy określaniu stężenia drobnoustrojów cząstki aktywne obserwowane pod mikroskopem są uważane za mikroorganizmy, co pozwala jedynie na przybliżone obliczenie stężenia drobnoustrojów.
    8. Przenieś zawiesinę kałową do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i oznacz ją datą, stężeniem drobnoustrojów i nazwą próbki. Część należy zarezerwować na kolejne eksperymenty, a resztę przechowywać w temperaturze 4 °C na przyszłość.
      UWAGA: Niezwłocznie zapisz informacje o próbce (nazwa próbki, czas pobrania), aby upewnić się, że próbki są pobierane w tym samym czasie (biorąc pod uwagę zmiany rytmu czasowego drobnoustrojów jelitowych ssaków). Całe pobieranie i przetwarzanie próbek powinno odbywać się w środowisku beztlenowym.
  2. Przygotowanie do początkowej zawiesiny kału
    1. Przygotować pożywkę Brain Heart Bulion (BHI) zgodnie z protokołem producenta i sterylizować ją w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
    2. Pobrać zawiesinę kałową z kroku 3.1.8 i wykonać seryjne rozcieńczenia pożywką BHI, aby osiągnąć stężenie ~50 komórek/mL.
      UWAGA: Aby napełnić butelkę z próbką, przygotuj co najmniej 40 ml zawiesiny kałowej.
    3. Upewniając się, że na dole znajduje się małe mieszadło magnetyczne, wlej rozcieńczoną zawiesinę kału do butelki z próbką do pozycji dodawania próbki. Zakręć nakrętkę i dokręć ją. Następnie włóż szybkozłączkę A do szybkozłączki B, aby zakończyć proces ładowania próbki (Rysunek 3A).
    4. Umieść butelkę z próbką w wyznaczonej pozycji i oddziel szybkozłączki A i B od butelki na próbkę. Podłącz szybkozłączkę A butelki z próbką do portu O3 w systemie Omics, a złącze C3 na chipie mikroprzepływowym do generowania kropelek i kropli do szybkozłącza B. Zamknij drzwiczki komory generowania kropel i hodowli (Rysunek 3B).
  3. Generowanie kropel
    1. Wybierz żądaną liczbę rurek kropelkowych, które mają zostać wygenerowane w interfejsie głównym oprogramowania (Rysunek 2A).
      UWAGA: Każdy przebieg może wytworzyć do 10 rurek kropelkowych, przy czym każda rurka generuje około 5,000 kropel.
    2. Kliknij przycisk Produce (Wyprodukuj) w interfejsie głównym oprogramowania, aby rozpocząć generowanie kropel jednokomórkowych.
      UWAGA: Sprawdź, czy pompa odprowadzania zużytej cieczy działa, czy nie. Podczas wytwarzania kropel każda kropla ma objętość 2,0 μl. Zobacz sekcję dyskusji, aby zapoznać się z opisem generowania kropel.
    3. Poczekaj, aż sygnał dźwiękowy wskaże, że generowanie kropel zostało zakończone. Zamknij zacisk na złączu C3 (Rysunek 1E) i wyjmij butelkę z próbką.

4. Uprawa kropelkowa

  1. Wybierz ten sam numer rurki kropelkowej, co podczas generowania kropli w interfejsie domowym oprogramowania, kliknij Kultura, potwierdź czas i temperaturę uprawy, a następnie rozpocznij proces. Monitoruj pasek postępu w interfejsie głównym, który pokazuje postęp uprawy i pozostały czas.
  2. Poczekaj, aż sygnał dźwiękowy wskaże, że uprawa kropel została zakończona. Jeśli czas uprawy musi zostać wydłużony, dostosuj czas bezpośrednio w interfejsie ustawień.

5. Badanie przesiewowe kropelek

  1. Naciśnij przycisk UV w systemie Omiks, aby włączyć światło ultrafioletowe (UV) (Rysunek 1A), naświetlić komorę do wykrywania i zbierania kropel przez 30 minut, a następnie wyłączyć światło UV.
    UWAGA: Przed włączeniem światła UV upewnij się, że drzwi komory wykrywania i zbierania kropel są zamknięte.
  2. W super czystej ławce otwórz wszystkie 96-dołkowe płytki używane do zbierania kropelek i ułóż je jedna na drugiej bez pokrywek, numerując je sekwencyjnie od dołu do góry. Upewnij się, że górna płytka studzienki jest przykryta pokrywką.
    UWAGA: Każdy przebieg może pomieścić do dziesięciu płytek 96-dołkowych, a liczba płytek zależy od całkowitej liczby kropel.
  3. Otwórz drzwi komory do wykrywania i zbierania kropel, umieść płytki studzienki w wyznaczonych pozycjach ( Rysunek 1D), wyjmij pokrywę z górnej płytki studzienki i zamknij drzwi komory.
  4. Włącz światło UV w systemie Omics na 30 minut, aby przeprowadzić wtórną sterylizację.
  5. Montaż urządzenia do usuwania pęcherzyków powietrza
    1. Wyjmij urządzenie do usuwania pęcherzyków powietrza z pozycji umieszczenia, odkręć nakrętkę i wykręć w kształcie motyla z nasadki (Rysunek 3C).
    2. Wlej 200 ml oleju do usuwania pęcherzyków powietrza do środka do usuwania pęcherzyków powietrza, mocno przykręć butelkę z nakrętką środka do usuwania pęcherzyków powietrza w systemie Omics, a następnie zamocuj zmywacz do góry nogami na umieszczeniu środka do usuwania pęcherzyków powietrza. Instalacja urządzenia do usuwania pęcherzyków powietrza została zakończona.
      UWAGA: Podczas mocowania środka do usuwania pęcherzyków powietrza na miejscu należy upewnić się, że nie wycieka olej. Jeśli wystąpi jakikolwiek wyciek, dokręć pokrywę.
  6. Wybierz rurkę kropelkową do sortowania w interfejsie głównym, kliknij Sortowanie, wprowadź liczbę płytek studzienkowych do zebrania, a następnie rozpocznij proces. Po rozpoczęciu przesiewania kropelek obserwuj obszar wyświetlania procesu, który pokazuje pomiary gęstości optycznej kropelek (OD) lub wartości fluorescencji w czasie rzeczywistym.
  7. Przeanalizuj około 20-30 kropel, aby sprawdzić wartość OD. Na przykład, jeśli okaże się, że większość z nich ma wartość OD ~0,2, która odpowiada wartości OD pustych kropel, na podstawie rozkładu Poissona ustaw dolny próg OD na 0,5, a górny próg OD na 4,0. Kropelki w tym zakresie zostaną automatycznie zebrane do 96-dołkowych płytek (Rysunek 4A).
    UWAGA: Zgodnie z prawem Beera-Lamberta, wartość OD pustych kropel jest określana przez skład pożywki hodowlanej w kropelkach. Zazwyczaj dolny próg OD jest ustawiony o 0,2-0,3 jednostki wyżej niż wartość OD pustych kropel, aby zapewnić wyraźne rozróżnienie między pustymi kroplami a kropelkami zawierającymi mikroorganizmy.
  8. Poczekaj, aż alarm dźwiękowy wskaże, że przesiewanie i zbieranie kropel zostało zakończone. Otwórz drzwi komory do wykrywania i zbierania kropel, umieść pokrywę płytki studzienki na górnej płytce studzienki, a następnie wyjmij wszystkie płytki studzienki razem z komory, aby przeprowadzić późniejsze sekwencjonowanie i tworzenie kopii zapasowej.

6. Eksport danych i wyświetlanie map ciepła

  1. Kliknij przycisk Eksportuj dane, aby zapisać zebrane dane sygnału kropelki (Rysunek 4A,B).
  2. Kliknij Mapę cieplną, wybierz plik z danymi zbierania kropel i obserwuj wartości OD kropelek zebranych na mikropłytce wyświetlanej przez oprogramowanie. Wizualizuj te wartości OD jako mapę cieplną, gdzie intensywność koloru odpowiada rozkładowi OD w studzienkach, zapewniając przejrzystą i intuicyjną reprezentację zebranych wartości OD monoklonalnych (Rysunek 4A,C).

7. Czyszczenie komórki MISS

  1. Po zakończeniu eksperymentu wybierz rurkę kropelkową, która wymaga czyszczenia, i kliknij przycisk Wyczyść, aby rozpocząć czyszczenie instrumentu.

8. Mikrobiologiczne tworzenie kopii zapasowych monoklonalnych i sekwencjonowanie próbek

  1. Sekwencjonowanie przygotowania próbki
    1. Na stanowisku beztlenowym dodać 100 μl pożywki BHI do każdego dołka na zebranej płytce kropelkowej, dobrze wymieszać przez pipetowanie, a następnie pobrać 10 μl z każdej studzienki i przenieść wszystko do jednej sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Vortex w celu uzyskania mieszanej zawiesiny mikrobiologicznej.
    2. Dodać 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami do mieszaniny zawiesiny mikrobiologicznej, odwirować przy 1 000 × g przez 10 minut, usunąć supernatant i umieścić osad mikrobiologiczny w ciekłym azocie w celu szybkiego zamrożenia. Przygotowanie próbki do sekwencjonowania zostało zakończone.
    3. Użyj metod sekwencjonowania amplikonów 16S rDNA ukierunkowanych na domenę V3 i V4 rDNA 16S. Konkretne stosowane startery sekwencjonowania są następujące: 341F: ACTCCTACGGGGCAGCA i 806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT.
  2. Kriokonserwacja mikrobiologicznej próbki monoklonalnej:
    1. Po pobraniu 10 μl próbki z każdej studzienki do płytek kropelkowych (od etapu 8.1.1), dodać 30 μl glicerolu do każdego studzienki. Umieść płytki w temperaturze poniżej -80 °C w celu zachowania szczepu mikrobiologicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Szacuje się, że ludzkie mikrobiom jelitowy, stanowiący dominującą społeczność drobnoustrojów, zamieszkuje około 4 × 1013 mikroorganizmy w jelitach, obrazujące ich ogromną liczbę i złożony skład11W niniejszym badaniu dążyliśmy do wyizolowania i hodowli mikrobioty jelitowej, wykorzystując metodę wysiewu na pożywki stałe jako kontrolę w celu wykazania wydajności wysokoprzepustowej komórki MISS.

W pierwszej kolejności wykorzystaliśmy tę samą zawiesinę kałową, aby...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten określa działanie komórki MISS do zautomatyzowanej i wysokoprzepustowej izolacji, hodowli, wykrywania i zbierania drobnoustrojów. W porównaniu z tradycyjnymi metodami, za pomocą których można było wyizolować i wyhodować tylko ~20%-30% mikrobioty jelitowej 2,12, liczba klonów monoklonalnych uzyskanych przy użyciu systemu Omics była 1,97 razy wyższa niż tych uzyskanych z płytek litych. To porównanie pokazuje, że komórka MISS ma zalety w izolacji pojedy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez projekty badawczo-rozwojowe w kluczowych obszarach prowincji Guangdong (2024B1111130002), projekty badawczo-rozwojowe prowincji Hebei (22375503D) oraz projekt otwarcia Laboratorium Inżynieryjnego Anhui dla Przemysłowej Mikrobiologii Molekularnej (Grant ELMB-07).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szalka Petriego 100 mmMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyP5731-500EADo przygotowania płytek stałych
30 ml Pojemniki na stolecBoen Healthcare Co., Ltd611101Do pobierania próbek kału
37 ° C inkubator o stałej temperaturzeShanghai Yiheng Technology Co., Ltd.LRH-150Uprawiaj stałą płytkę w inkubatorze
96-dołkowe przezroczyste mikropłytki z polistyrenu płaskodennego poddanego działaniu TCCorning3599Do wykrywania ruchu płytki studziennej i zbierania kropelek
AgarBecton, Dickinson and Company214010Do przygotowania płytki stałej
Olej do usuwania pęcherzyków powietrzaLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-S-oilŚrodek do usuwania pęcherzyków powietrza w oleju podczas przesiewania kropelek
Środek do usuwania pęcherzyków powietrzaLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS komórka-SWyklucz fazę gazową między kropelkami przed wykonaniem wykrywania i zbierania kropel
Stanowisko beztlenoweDział Biznesowy Argonu i Azotu Sprzętu Kosmicznego, Miasto Haiyu, Miasto ChangshuVGB-4CM Do pracy aseptycznej i sterylizacji UV w warunkach beztlenowych
AutoklawPuhexi Zdrowie i Sprzęt Medyczny Co., Ltd.MLS-830LDo autoklawowania podłoża BHI, probówki EP i tak dalej.
Napar z mózgu i serca (BHI) RosółQingdao High-tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., LtdHB8297-1Składniki pożywki BHI
Lista składników:
38,5 g / L BHI Rosół w wodzie destylowanej
Rozsiewacz komórekMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyHS8151Zaszczepij roztwór mikrobiologiczny na stałej płytce
Probówka wirówkowa, 15 mlBeijing Xinhengyan Technology Co., LtdHB53397Do przygotowania roztworu mikrobiologicznego
KomputerLenovoE450Instalacja oprogramowania i sterowanie komórkami MISS
CryovialThermo Fisher2.0 mLDo konserwacji stolca
Woda destylowanaPekin Mreda Technology Co., Ltd.M306444-100mlDodaj do nawilżacza, aby utrzymać wilgotność w komorze do uprawy kropelek
Rurka EPThermo Fisher2,0 mlDo pobierania próbek kału
Fluorescencyjny mikroskop odwróconyOlympus Life Science (LS)CKX53Sprawdź i oblicz stężenie mikrobiologiczne
GlicerolODCZYNNIK OGÓLNYG66258ADo konserwacji
szczepuHemocytometrAcmecAYA0810-1eaObliczanie stężenia mikrobiologicznego
KClAmbeedA442876Składniki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (roztwór PBS)Lista składników: 8 g/L NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 w wodzie destylowanej
KH2PO4MACKLINP815661Składniki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (roztwór PBS)Lista składników: 8 g/L NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 w wodzie destylowanej
Filtr siatkowyAnping Jiufeng Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd200 oczek (0,075 mm), 400 oczek (0,038 mm), 800 oczek (0,018 mm) Usunąć niestrawiony pokarm i mniejsze cząstki stałe z próbek kału
Mikrorurki i układ mikroprzepływowy do generowania kropelekLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISC-B2Do wytwarzania kropel i inkubacji kropel
MISS olej komórkowyLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-BOS-BFaza olejowa do mikrofluidyki kropelkowej
Oprogramowanie komórkowe MISSLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.Komórka MISS V3.2.4Wykonaj operacje eksperymentalne na instrumencie komórkowym MISS
Na2HPO4SolarbioD7292Składniki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (roztwór PBS)Lista składników: 8 g/L NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 w wodzie destylowanej
NaClODCZYNNIK OGÓLNYG81793JSkładniki roztworu soli fizjologicznej
Lista składników:
9 g/L NaCl w wodzie destylowanej
Pipetaeppendorf2,5 μ L, 10 i mu; L, 100μ L, 1000μ LDo obsługi cieczy
Rurka z politetrafluoroetylenuShenzhen WOER Heat-shrinkable Material Co., Ltd.3401000141Do inkubacji kropelkowej. Materiał ten został już zawarty w mikrorurkach i chipie mikroprzepływowym do generowania kropelek
Butelka na próbkiLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.Butelka komórkowa MISSPobieranie próbek roztworu mikrobiologicznego
System hodowli mikrolitrowej mikrolitrowej (komórka MISS)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-G3fWykonywanie izolacji, hodowli, wykrywania i zbierania mikrobiologicznego monoklonalnego
wirówki SuperspeedThermo FisherSorvall Lynx 4000 Przygotuj roztwór mikrobiologiczny do sekwencjonowania
StrzykawkaJiangsu Zhiyu Medical Instructment Co., Ltd10 mlPobrać wodę destylowaną i wstrzyknąć ją do nawilżacza w komorze do uprawy kropelek
Lodówka niskotemperaturowaSANYO Ultra-niska MDF-U4086S Do zachowania szczepu (-80 ° C)

Bibliografia

  1. Hurst, C. J. Isolation and cultivation of bacteria. The structure and function of aquatic microbial communities. , Springer International Publishing. Cham. 313-351 (2019).
  2. Xu, M. Q., Pan, F., Peng, L. H., Yang, Y. S. Advances in the isolation, cultivation, and identification of gut microbes. Mil Med Res. 11 (1), 34(2024).
  3. Lattermann, C., Büchs, J. Microscale and miniscale fermentation and screening. Curr Opin Biotechnol. 35, 1-6 (2015).
  4. Huang, Y., et al. High-throughput microbial culturomics using automation and machine learning. Nat Biotechnol. 41 (10), 1424-1433 (2023).
  5. Brehm-Stecher Byron, F., Johnson Eric, A. Single-cell microbiology: Tools, technologies, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 68 (3), 538-559 (2004).
  6. Jian, X., et al. Single-cell microliter-droplet screening system (miss cell): An integrated platform for automated high-throughput microbial monoclonal cultivation and picking. Biotechnol Bioeng. 120 (3), 778-792 (2023).
  7. Hu, B., et al. One cell at a time: Droplet-based microbial cultivation, screening and sequencing. Mar Life Sci Technol. 3 (2), 169-188 (2021).
  8. Leygeber, M., et al. Analyzing microbial population heterogeneity-expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations. J Mol Biol. 431 (23), 4569-4588 (2019).
  9. He, Z., Wu, H., Yan, X., Liu, W. Recent advances in droplet microfluidics for microbiology. Chinese Chemical Letters. 33 (4), 1729-1742 (2022).
  10. Kaminski, T. S., Garstecki, P. Controlled droplet microfluidic systems for multistep chemical and biological assays. Chem Soc Rev. 46 (20), 6210-6226 (2017).
  11. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are we really vastly outnumbered? Revisiting the ratio of bacterial to host cells in humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
  12. Simrén, M., et al. Intestinal microbiota in functional bowel disorders: A rome foundation report. Gut. 62 (1), 159-176 (2013).
  13. Periyannan Rajeswari, P. K., Joensson, H. N., Andersson-Svahn, H. Droplet size influences division of mammalian cell factories in droplet microfluidic cultivation. Electrophoresis. 38 (2), 305-310 (2017).
  14. Jian, X., et al. Microbial microdroplet culture system (mmc): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnol Bioeng. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  15. Baret, J. -C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  16. Kubie, L. S. The solubility of O2, CO2, and N2 in mineral oil and the transfer of carbon dioxide from oil to air. J Biol Chem. 72 (2), 545-548 (1927).
  17. Poon, C. Measuring the density and viscosity of culture media for optimized computational fluid dynamics analysis of in vitro devices. J Mech Behav Biomed Mater. 126, 105024(2022).
  18. Yao, J., Lin, F., Kim, H. S., Park, J. The effect of oil viscosity on droplet generation rate and droplet size in a t-junction microfluidic droplet generator. Micromachines. 10 (12), 808(2019).
  19. Venkateshwarlu, A., Bharti, R. P. Effects of capillary number and flow rates on the hydrodynamics of droplet generation in two-phase cross-flow microfluidic systems. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 129, 64-79 (2021).
  20. Nekouei, M., Vanapalli, S. A. Volume-of-fluid simulations in microfluidic t-junction devices: Influence of viscosity ratio on droplet size. Physics of Fluids. 29, 032007(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kulturomika mikrobiologicznamikroprzepływy kropelkoweizolacja monoklonalnawysokoprzepustowe przesiewaniemikrobiota jelitowakropelki pojedynczych komórekzautomatyzowana hodowlaróżnorodność mikrobiologicznaporównanie z podłożem stałymdetekcja gęstości optycznej
Zautomatyzowana i wysokowydajna mikrobiologiczna hodowla monoklonalna i zbiór z wykorzystaniem systemu omicznego do hodowli mikrolitrowych mikrolitrów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.