Artykuł metodologiczny

Przewidywanie i walidacja regulacji uszkodzenia podocytów i leczenia cukrzycowej choroby nerek przez Yinhuo Tang

811 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67939

⸱

20 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nephropathy Department, the Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2College of Integrated Chinese and Western Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Korzystając z farmakologii sieciowej i walidacji eksperymentalnej, ten protokół ujawnia mechanizm działania Yinhuo Tang (YHT) w leczeniu cukrzycowej choroby nerek (DKD) i jak YHT zmniejsza uszkodzenia podocytów u myszy DKD poprzez hamowanie szlaku sygnałowego PI3K/AKT/NF-κB.

Streszczenie

Cukrzycowa choroba nerek (DKD) jest przewlekłą chorobą nerek charakteryzującą się masywnym białkomoczem i zmniejszonym współczynnikiem filtracji kłębuszkowej. Główną cechą patologiczną DKD jest mikroangiopatia nerkowa, a u ~40% pacjentów z cukrzycą rozwinie się DKD. Białka związane z podocytami CD2AP i WT-1 odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu prawidłowego funkcjonowania podocytów i integralności kłębuszkowej bariery filtracyjnej. Kiedy struktura lub funkcja podocytów jest zakłócona - z powodu stanu zapalnego, stresu oksydacyjnego lub innych patologicznych urazów - przepona szczeliny i cytoszkielet aktynowy ulegają uszkodzeniu, co prowadzi do zwiększonej przepuszczalności kłębuszkowej bariery filtracyjnej i powoduje białkomocz. Yinhuo Tang (YHT) to recepta tradycyjnej medycyny chińskiej, która ma funkcję zmniejszania białkomoczu i opóźniania pogorszenia funkcji nerek; jednak mechanizm YHT w leczeniu DKD nie jest jasny. W tym artykule, opartym na farmakologii sieciowej i doświadczeniach na zwierzętach, zbadaliśmy poziom glukozy we krwi, czynność wątroby, czynność nerek, lipidy we krwi, patologię nerek, poziomy ekspresji białek markerowych podocytów CD2AP i WT-1, a także szlak sygnałowy PI3K / AKT / NF-κB u myszy db / db po podaniu YHT przez 8 tygodni. Nasze wyniki pokazują, że YHT zmniejsza poziom ekspresji czynników zapalnych poprzez hamowanie szlaku sygnałowego PI3K / AKT / NF-κB, zmniejszając w ten sposób uszkodzenie podocytów, które odgrywa rolę w opóźnianiu postępu DKD.

Wprowadzenie

Cukrzycowa choroba nerek (DKD) jest powszechnym i poważnym powikłaniem cukrzycy i pozostaje główną przyczyną schyłkowej niewydolności nerek na całym świecie1. Choroba postępuje poprzez szereg złożonych procesów patologicznych, takich jak powiększenie kłębuszków nerkowych, ekspansja mezangialna, zwłóknienie cewkowo-śródmiąższowe i nadmierne nagromadzenie składników macierzy zewnątrzkomórkowej2,3. Pomimo poprawy w leczeniu cukrzycy, obecne terapie mają na celu głównie kontrolowanie poziomu glukozy we krwi i ciśnienia krwi, które jedynie spowalniają postęp DKD, a nie odwracają leżące u jego podstaw zmiany patologiczne. Podkreśla to pilną potrzebę bardziej kompleksowych i skutecznych opcji leczenia4,5.

Tradycyjna medycyna chińska (TCM) stała się obiecującą alternatywną terapią w leczeniu chorób przewlekłych, takich jak DKD6,7,8. TCM kładzie nacisk na holistyczne podejście do leczenia, które może zająć się złożoną, wielokierunkową naturą DKD. Wśród różnych preparatów TCM, wykazano, że Yinhuo Tang (YHT) posiada wiele funkcji fizjologicznych, takich jak odżywianie yin (w celu uzupełnienia objętości krwi), tonizowanie nerek (w celu poprawy funkcji nerek), usuwanie ciepła (w celu stłumienia stanu zapalnego) i ujarzmienie yang (w celu obniżenia ciśnienia krwi)9,10,11. Jednak nadal brakuje pełnego zrozumienia mechanizmów, za pomocą których YHT łagodzi DKD.

Białko związane z podocytami CD2AP jest kluczowym białkiem w podocytach, kluczowym dla utrzymania integralności bariery filtracyjnej, podczas gdy WT-1 odgrywa kluczową rolę w rozwoju nerek i zwłóknieniu12,13,14,15,16. Dlatego normalna funkcja tych dwóch białek jest niezbędna do prawidłowej funkcji filtracji kłębuszkowej. Istniejąca literatura sugeruje, że cele te są zaangażowane w progresję DKD i stawiamy hipotezę, że aktywne składniki YHT mogą wchodzić w interakcje z tymi celami, wywierając efekty terapeutyczne. Badanie to ma na celu potwierdzenie tych interakcji i dostarczenie głębszego wglądu w to, w jaki sposób YHT moduluje szlaki chorobowe DKD.

W tym badaniu wykorzystujemy kombinację farmakologii sieciowej i eksperymentów na zwierzętach, aby zbadać mechanizmy terapeutyczne YHT w DKD. Farmakologia sieciowa, która integruje narzędzia bioinformatyczne do analizy złożonych interakcji między związkami aktywnymi a celami biologicznymi, pozwala nam zbadać wielocelową, wielościeżkową naturę działania YHT17,18,19. Tradycyjne metody odkrywania leków często kładą nacisk na interwencje ukierunkowane na jeden cel. W przeciwieństwie do tego, farmakologia sieciowa służy jako narzędzie predykcyjne, które pomaga zidentyfikować potencjalne szlaki i cele molekularne, oferując wstępny wgląd w możliwe mechanizmy działania złożonych terapii. Chociaż farmakologia sieciowa nie zastępuje rygorystycznych etapów eksperymentalnych i regulacyjnych wymaganych do opracowania leku, może pomóc w generowaniu hipotez i usprawnić badania na wczesnym etapie20.

Ostatecznie, to badanie ma na celu wypełnienie luki między tradycyjną a nowoczesną medycyną, dostarczając naukowych dowodów na integrację TCM w leczeniu DKD. Wyniki tych badań mogą pomóc w opracowaniu skuteczniejszych i bezpieczniejszych strategii leczenia DKD, oferując alternatywę dla standardowej opieki, która często jest ograniczona przez skutki uboczne. Poprzez wyjaśnienie mechanizmów molekularnych YHT i walidację jego potencjału terapeutycznego, mamy nadzieję wykazać szerokie zastosowanie TCM w leczeniu DKD.

Protokół

Do tego badania wybrano łącznie trzydzieści samców 6-tygodniowych spontanicznych myszy z cukrzycą typu II (C57BL/Ksj db/db) i sześć samców myszy kontrolnych bez cukrzycy (db/m) o tym samym tle genetycznym. Myszy były trzymane przez 2 tygodnie w sterylnym środowisku klasy SPF w Centrum Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Changchun (numer licencji: SYXK (JI) 2023-0014). W tym okresie zapewniono im regularną dietę pielęgnacyjną i sterylną wodę. Poziom glukozy we krwi na czczo mierzono u myszy db / db na początku i na końcu okresu 2 tygodni i tylko te, których wyniki przekraczały 11,1 mmol / L w obu testach, zostały włączone do eksperymentu. Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Changchun (numer identyfikacyjny: 2024147).

1. Przygotowanie leku

  1. Przygotowanie YHT (Tabela 1)
    1. Wybierz Rehmannia glutinosa (30 g), Ophiopogon japonicus (10 g), Morindae Officinalis Radix (10 g), Poria cocos (15 g) i Schisandra chinensis (6 g) i spłucz zioła wodą, aby usunąć zanieczyszczenia i kurz z powierzchni. Następnie wymieszaj 71 g surowych ziół z 710 ml wody destylowanej i moczyć w ceramicznych doniczkach przez 60 minut
    2. Po zagotowaniu w temperaturze 100 °C należy obniżyć temperaturę wywaru do 80 °C na 60 minut, a następnie odfiltrować osady przez dwie warstwy gazy medycznej. Płyn należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.
    3. Dodać 710 ml wody destylowanej do powyższych fusów i powtórzyć namaczanie od kroku 1.1.1 i kroku 1.1.2 jeden raz; przechowywać płyn w lodówce w temperaturze 4 °C.
    4. Wymieszać powyższe dwa płyny lecznicze z etapów 1.1.2 i 1.1.3 i umieścić je w tacy na materiał liofilizatora próżniowego. Uruchom pompę próżniową, aby usunąć powietrze z komory liofilizacji, ustaw temperaturę na -40 °C i utrzymuj ją przez 6 godzin, aby zamrozić wodę w roztworze leku do stanu stałego. Następnie ustaw temperaturę na -20 °C przez 36 godzin, aby sublimować wodę w postaci kryształków lodu w gaz. Na koniec ustaw temperaturę na 40 °C, utrzymuj ją przez 24 godziny, aby usunąć pozostałą wilgoć z roztworu leku, wyłącz pompę grzewczą i próżniową i usuń liofilizowany proszek (proszek YHT).
    5. Odważyć 0,4615 g, 0,923 g i 1,846 g liofilizowanego proszku YHT, zawiesić w 1 ml soli fizjologicznej i przygotować zawiesinę YHT o stężeniach odpowiednio 0,4615 g/mL, 0,923 g/ml i 1,846 g/ml.
  2. Przygotowanie walsartanu
    1. Dodaj walsartan (10,29 mg) do 50 ml PEG300 i dobrze wstrząsnąć do całkowitego rozpuszczenia.
    2. Dodać 50 ml soli fizjologicznej do roztworu z kroku 1.2.1 i dobrze wstrząsnąć w celu homogenizacji i otrzymania roztworu walsartanu o stężeniu 10,29 mg/ml.

2. Leczenie farmakologiczne

UWAGA: Eksperyment został podzielony na sześć grup: normalna grupa kontrolna (CON), grupa modelowa (MOD), grupa kontrolna z dodatnim walsartanem (POS), grupa z niską dawką YHT (YH-L), grupa ze średnią dawką YHT (YH-M) i grupa z wysoką dawką YHT (YH-H). Dorośli ludzie potrzebują 71 g YHT dziennie. Zgodnie ze wzorem konwersji eksperymentalnej dawki leku dla myszy i ludzi, dzienna dawka dla myszy wynosiła ~9,23 g/kg:

Równoważna dawka doświadczalna dla myszy (g/kg) = dawka dla ludzi (g)/masa ciała (70 kg) × 9.1

  1. Chwyć mocno grzbiet myszy ręką niedominującą, tak aby ich głowy, szyje i ciała znajdowały się w linii prostej (aby uniknąć walki) i ustaw igłębnik o pojemności 1 ml odpowiednio pod kątem podobnym do fizjologicznej krzywizny przełyku myszy. Wciśnij igłębkę przez kącik ust myszy, dociśnij ją do języka, przyciśnij do podniebienia i delikatnie wepchnij do środka do żołądka.
  2. Powoli wepchnij lek za pomocą palca wskazującego ręki dominującej i wycofaj igłę pionowo, aby zakończyć operację zgłębnika.
    UWAGA: Dawka leku wynosiła 10 ml/kg przez łącznie 4 tygodnie.
    1. Podawać 10 ml∙kg-1∙day-1 soli fizjologicznej przez zgłębnik myszom CON i MOD.
    2. Podawać 10,29 mg∙kg-1∙day-1∙day-1 zawiesinę walsartanu przez zgłębnik myszom z grupy POS.
    3. Tym grupom należy podać następujące dawki YHT przez zgłębnik: 4,615 g∙kg-1∙dzień-1 do grupy YH-L; 9,23 g∙kg-1∙dzień-1 do grupy YH-M; 18,46 g∙kg-1∙dzień-1 do grupy YH-H.

3. Ocena skuteczności YHT

  1. Wykrywanie wskaźników biochemicznych krwi i moczu
    1. Po 8 tygodniach ciągłego podawania leku należy pobrać 24-godzinny mocz myszy za pomocą klatki metabolicznej, odwirować zebrany mocz w ilości 7 992 × g przez 10 minut, usunąć supernatant i zmierzyć poziom białka w moczu za pomocą zestawu do badania białka w moczu.
    2. Chwyć tył myszy ręką niedominującą, aby naprawić mysz i użyj małego palca i palca serdecznego tej samej niedominującej ręki, aby naprawić ogon myszy. Wysterylizuj czubek ogona myszy wacikami z jonu. Dominującą ręką przytrzymaj igłę do pobierania krwi, aby szybko nakłuć czubek ogona myszy, ściśnij od nasady ogona myszy do czubka ogona i upuść krew na papier do badania stężenia glukozy we krwi.
    3. Używając ręki niedominującej, chwyć ogon myszy, jednocześnie zabezpieczając obszar łopatki kciukiem i palcem wskazującym, upewniając się, że brzuch myszy jest skierowany do góry. Ręką dominującą trzymaj strzykawkę o pojemności 1 ml wypełnioną fenobarbitalem sodowym. Wbić igłę (o głębokości 3-5 mm) do jamy brzusznej pod kątem 30-45°, kierując igłę w obszar między pępkiem a kończynami tylnymi, z igłą skierowaną w stronę głowy. Powoli wyjąć tłok strzykawki, aby sprawdzić, czy nie ma krwi; Jeśli krew jest odsysana, należy odpowiednio zmienić położenie igły.
    4. Powoli wstrzykiwać roztwór pentobarbitalu sodu, aby zapewnić równomierne podawanie, i wyjmować strzykawkę po zakończeniu wstrzyknięcia. Odczekaj 10 minut, a następnie za pomocą kleszczy w dominującej dłoni delikatnie uszczypnij palce tylnych kończyn myszy, aby sprawdzić odpowiedź. Jeśli odpowiedź na leczenie jest nadal obserwowana, należy w razie potrzeby podać niewielką dodatkową dawkę (10 mg/kg).
      UWAGA: Zakładając, że mysz waży 60 g, a roztwór fenobarbitalu wynosi 1% w/v, 0,06 ml to dodatkowa dawka, którą należy podać w przypadku jakiejkolwiek odpowiedzi.
    5. Za pomocą nożyczek przyciąć wąsy i włosy wokół oczu myszy, używając niedominującej ręki do dociśnięcia skóry wokół oczu, z której mają zostać usunięte gałki oczne, tak aby gałki oczne wystawały. Wysterylizuj skórę wokół gałek ocznych etanolem, za pomocą pęsety szybko wyjmij gałki oczne, aby krew kapała do probówek mikrowirówek (1,5-2 ml), inkubuj probówki w temperaturze pokojowej przez 10 minut, odwiruj probówki przez 10 minut w temperaturze 7,992 × g i wyekstrahuj roztwór sklarowanego osadu.
    6. Zmierz poziomy ekspresji kreatyniny w surowicy (Scr), azotu mocznikowego we krwi (BUN), albuminy (ALB), aminotransferazy alaninowej (ALT), aminotransferazy asparaginianowej (AST), trójglicerydów (TG) i cholesterolu całkowitego (TC) w surowicy zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu.
  2. Separacja tkanek nerkowych
    1. Po pobraniu próbki krwi przymocuj myszy na płycie chirurgicznej w pozycji leżącej, przytnij włosy z przedniej części klatki piersiowej myszy, wysterylizuj przednią część klatki piersiowej za pomocą etanolu, przetnij skórę brzucha nożyczkami i odsuń na bok jelito cienkie i grube, aby odsłonić nerki.
    2. Usuń tkankę nerkową myszy, użyj kleszczy hemostatycznych, aby tępo oddzielić okostną i umieść lewą nerkę w zamrażarce o temperaturze -80 °C do przechowywania, a prawą nerkę w probówce o pojemności 20 ml zawierającej 4% roztwór paraformaldehydu w celu unieruchomienia nerki.
    3. Po 24 godzinach usuń prawe nerki z formaldehydu, krótko spłucz wodą destylowaną przez 5 minut, odwodnij za pomocą gradientu bezwodnego etanolu (100% → 95% → 85% → 75%, po 5 minut), przeźroczysty za pomocą gradientu ksylenu (2 x 10 min), zanurz w wosku parafinowym i pozwól blokom wosku zestalić się w temperaturze pokojowej21. Następnie wstaw go na noc do zamrażarki w temperaturze -20 °C.
    4. Wyjmij blok wosku, pokrój go na grubość 3 μm, umieść w wodzie do rozzłożenia, a następnie wyłowić go za pomocą szkiełka i umieść w piekarniku o stałej temperaturze 40 °C do pieczenia przez 30 minut, a następnie przechowuj do późniejszej analizy
  3. Analiza histopatologiczna nerek
    1. Usunąć prawą nerkę, przeprowadzić gradientowe odparafinowanie ksylenu i odwodnienie bezwodnego etanolu jak powyżej (krok 3.2.3) i przemyć wodą destylowaną.
    2. Wykonaj barwienie zgodnie z instrukcjami barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E), barwieniem kwasem okresowym Schiffa (PAS) i zestawami do barwienia Masson.
    3. Ponownie przeprowadzić gradientowe odwodnienie bezwodnego etanolu i przezroczystość ksylenu, jak w kroku 3.2.3.
    4. Po wyschnięciu w temperaturze pokojowej zamontuj skrawki tkanki na szkiełkach nakrywkowych, używając neutralnej gumy jako medium mocującego. Obserwuj szkiełka i zobrazuj je pod mikroskopem świetlnym w powiększeniu 400x.
  4. Analiza immunohistochemiczna tkanki nerkowej
    1. Usunąć prawą nerkę, odparafinować i odwodnić skrawki zgodnie z opisem w kroku 3.2.3, umieścić je w 10 mM roztworze buforowym cytrynianu sodu (pH 6,0) i podgrzewać (125 °C, 103 kPa) przez 5 minut w celu naprawy antygenu. Po 10 minutach wyjmij sekcje, ostudź do temperatury pokojowej i umyj je 3 x 5 min w 1x PBS.
    2. Umieść skrawki w 3% roztworze nadtlenku wodoru na 10 minut, aby zablokować endogenną peroksydazę i przemyć 3 x 5 minut w PBS.
    3. Dodaj 10% koziej surowicy kroplami do sekcji, upewniając się, że kozie serum równomiernie pokrywa całą sekcję. Umieścić skrawki w mokrym pojemniku, inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut i przemyć 3 x 5 minut PBS.
    4. Dodawać kroplami przeciwciała pierwszorzędowe COI-I (1:200), α-SMA (1:200), WT-1 (1:200), CD2AP (1:200) (patrz Tabela Materiałów) i inkubować w wilgotnym pudełku w temperaturze 4 °C w lodówce przez noc.
    5. Usunąć skrawek, przemyć PBS 3 x 5 min, dodać kroplami przeciwciało drugorzędowe (1:3 000), inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 min i przemywać PBS przez 3 x 5 min.
    6. Dodać roztwór do wywoływania barwy 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) przez 10 minut, zmyć roztwór do wywoływania koloru wodą destylowaną, inkubować ze 100 μl hematoksyliny przez 5 minut w temperaturze pokojowej i płukać wodą destylowaną przez 5 minut.
    7. Odwodnić, przeźroczyścić i uszczelnić zgodnie z opisem w kroku 3.2.3, a następnie zebrać obrazy za pomocą mikroskopu optycznego.
  5. Ilościowa analiza reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)
    1. Weź ~ 100 mg zamrożonej tkanki nerkowej do probówki homogenizatora o pojemności 10 ml, dokładnie zmiel ją tłuczkiem, aż nie będzie widocznej masy tkankowej, a następnie dodaj 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA do homogenizacji.
    2. Dodać 250 μl chloroformu, wstrząsać w mieszalniku wirowym przez 10 s, inkubować na lodzie przez 5 minut, odwirować w temperaturze 15,984 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odpipetować górną fazę wodną do nowej probówki.
    3. Do fazy wodnej dodać 500 μl izopropanolu, dokładnie wymieszać za pomocą mieszalnika wirowego przez 10 s i inkubować mieszaninę na lodzie przez 5 min. Następnie odwirować przy 15 984 × g przez 10 minut. Ostrożnie usunąć sklarowany osad i przemyć osad RNA 1 ml 75% etanolu. Po krótkim wirowaniu ponownie odwirować przy 15 984 × g przez 10 minut. Wyrzuć etanol i pozostaw osad RNA do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej.
    4. Dodać 30 μl wody z pirowęglanu dietylu w celu rozpuszczenia RNA i zmierzyć absorbancję roztworu RNA przy 260 nm i 280 nm za pomocą spektrofotometru w celu obliczenia stężenia RNA.
      UWAGA: Czystość RNA ocenia się za pomocą stosunku A260/A280. Idealny stosunek A260/A280 powinien wynosić od 1,8 do 2,0, co wskazuje na dobrą czystość RNA. Jeśli stosunek jest niższy niż 1,8, może to sugerować obecność zanieczyszczenia białkiem lub fenolem i wymagane jest dalsze oczyszczanie, takie jak wykonanie dodatkowej ekstrakcji fenolowo-chloroformowej lub wytrącanie etanolu w celu usunięcia zanieczyszczeń.
    5. Zmieszać 3 μg całkowitego RNA, 4 μl 4 gDNA Wiper Mix i DDH2O bez RNaz do końcowej objętości 16 μl, odwirować w temperaturze 1,250 × g przez 10 s i inkubować w temperaturze 42 °C przez 2 min. Dodać 4 μL 5x odwrotnej transkryptazy do 16 μl powyższego roztworu, Wirować przy 1 250 × g przez 10 s. Wykonaj program odwrotnej transkrypcji w temperaturze 50 °C (15 min) → 85 °C (5 s) → 4 °C (10 min). Zsyntetyzowany cDNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
    6. Wyjąć roztwór cDNA z zamrażarki i przeprowadzić wstępną denaturację w temperaturze 90 °C (10 min), a następnie 40 cykli w temperaturze 94 °C (30 s) → 60 °C (30 s) → 72 °C (24 s), a na koniec poddać lizie w temperaturze 95 °C (15 s) → 60 °C (60 s) → 95 °C (350 s), 60°C stopniowo wzrasta do 95°C z prędkością 0,1 °C/s).
    7. Obliczyć względną ekspresję WT-1, CD2AP, PI3K, AKT, NF-κB i IL-1β przy użyciu metody 2-ΔΔCt w oparciu o wartość Ct każdej próbki z Gapdh jako wewnętrznym odniesieniem (ΔΔCt = wartość Ct genu docelowego - wartość Ct wewnętrznego genu odniesienia) (patrz tabela 2).
  6. Analiza testu Western blot (WB)
    1. Weź ~ 100 mg zamrożonej tkanki nerkowej w probówce homogenizatora o pojemności 10 ml, a następnie 500 μl roztworu do lizy (inhibitor proteazy: inhibitor fosfatazy: RIPA = 1: 1: 100) i zmiel go tłuczkiem wystarczająco, aż nie będzie widocznej masy tkanki.
    2. Inkubować probówkę na lodzie przez 30 minut, odwirowywać przy 15,984 × g przez 10 minut i odsysać supernatant.
    3. Określić stężenie białka w każdej próbce za pomocą testu BCA. Na podstawie zmierzonych stężeń odpipetować równe ilości białka całkowitego (np. 30 μg) z każdej grupy do nowych probówek i dostosować końcową objętość za pomocą PBS, aby zapewnić spójność. Następnie dodaj 5x bufor ładujący białko, gotuj w 100 °C przez 10 minut, a następnie wyjmij i ostudź do temperatury pokojowej.
    4. Użyj 12,5% elektroforezy żelowej SDS-PAGE do oddzielenia białek. Najpierw użyj 80 V, aby próbka powoli przeszła przez żel stężający, a następnie dostosuj napięcie do 120 V, aż próbka dotrze do dna żelu separacyjnego i wyłącz urządzenie.
    5. Namocz bibułę filtracyjną w buforze transferowym membrany, użyj pęsety, aby przytrzymać róg membrany PVDF i zanurz ją w metanolu, aby ją aktywować. Usuń żel, użyj plastikowej płytki, aby odciąć skoncentrowany żel i spód żelu separacyjnego, a następnie, zgodnie ze strukturą warstwową bibuły filtracyjnej / żelu / membrany PVDF / bibuły filtracyjnej, aby ustawić urządzenie do przenoszenia membrany (żel jako biegun ujemny, membrana PVDF jako biegun dodatni), umieść zestaw w zbiorniku transferowym membrany wypełnionym wstępnie schłodzonym buforem transferowym, Otocz go kostkami lodu, aby utrzymać niską temperaturę, i wykonaj transfer przy stałym prądzie 200 mA.
      UWAGA: Zdecyduj o czasie transferu w zależności od masy cząsteczkowej białka (im większa masa cząsteczkowa, tym dłuższy czas transferu).
    6. Umieścić membranę PVDF w buforze blokującym, wstrząsać buforem blokującym przez 90 minut w temperaturze pokojowej i przemywać TBST (50 ml 20x TBS i 0,5 ml Tween-20 na L TBST) przez 3 x 5 min.
    7. Stosując rozcieńczalnik przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczone przeciwciała pierwszorzędowe: WT-1 (1:1,000), CD2AP (1:1,000), P-PI3K (1:1,000), P-AKT (1:1,000), P-NF-κB (1:1,000) i IL-1β (1:1,000), dodać przeciwciało pierwszorzędowe na membranę PVDF i inkubować w wilgotnym pudełku w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc (patrz Tabela materiałów).
    8. Wyjąć membranę PVDF z lodówki o temperaturze 4 °C, przemyć TBST przez 3 x 5 min, za pomocą rozcieńczalnika przeciwciał drugorzędowych rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (1:10000), dodać przeciwciało drugorzędowe inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 min, przemywać TBST przez 3 x 5 min, umieścić membranę PVDF w obrazie chemiluminescencyjnym i równomiernie dodawać kroplami ciecz luminescencyjną ECL (A: B = 1:1).

4. Analiza farmakologiczna sieci YHT w leczeniu DKD

  1. Badania przesiewowe składników aktywnych i celów YHT
    1. Oznaczyć składniki czynne Radix Rehmanniae Praeparata, Morindae Officinalis Radix, Poria i Schisandra Chinensis, korzystając z bazy danych TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) i Maitake z bazy danych BATMAN-TCM (http://bionet.ncpsb.org/batmantcm). Ustaw biodostępność po podaniu doustnym (OB) ≥ 30%, a podobieństwo do leku (DL) ≥ 0,18 jako kryteria przesiewowe w celu identyfikacji składników aktywnych.
    2. Przeszukaj bazę danych TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) w poszukiwaniu celów działania składników aktywnych z powyższych TCM.
    3. Zmniejsz nacisk na cele powyższych składników aktywnych i włącz je do listy w celu dalszej analizy. Standaryzacja nazw celów przy użyciu bazy danych białek Uniprot (https://www.uniprot.org).
  2. Budowa sieci docelowej składników aktywnych YHT
    1. Zaimportuj składniki aktywne i odpowiadające im cele do theoftware: Skonstruuj sieć "składnik aktywny-cel", wybierając Plik | Import | Sieć i wczytywanie odpowiednich danych.
    2. Wykonaj analizę topologii sieci, przechodząc do punktu menu Narzędzia | Analiza sieci | Analizuj sieć, aby zobrazować relacje między lekami, składnikami aktywnymi, celami i chorobami. W wizualizacji sieci węzły reprezentują składniki aktywne, a krawędzie reprezentują interakcje między składnikami aktywnymi a celami.
  3. Kontrola celów związanych z DKD
    1. Używając Cukrzycowej Choroby Nerek jako terminu wyszukiwania i ustawiając gatunek jako Człowiek, przesiewaj cele związane z DKD z następujących baz danych: Baza danych GeneCards (https://www.genecards.org); Baza danych OMIM (http://www.omim.org); Baza danych TTD (https://www.ttd.cn); Baza danych DrugBank (http://www.drugbank.ca); Baza danych DisGeNET (http://www.disgenet.org).
    2. Po uzyskaniu wyników z pięciu baz danych scal je w arkusz kalkulacyjny i usuń duplikaty za pomocą funkcji Usuń duplikaty w menu Dane, upewniając się, że zachowane zostaną tylko unikalne nazwy obiektów docelowych związanych z DKD.
  4. Budowa PPI (oddziaływanie białko-białko) i badania przesiewowe głównych celów
    1. Użyj arkusza kalkulacyjnego, aby zidentyfikować cele przecięć YHT i DKD, wprowadzając listę celów YHT w jednej kolumnie i listę celów DKD w drugiej. Zastosuj formatowanie warunkowe, aby wyróżnić typowe wpisy w obu kolumnach, identyfikując w ten sposób cele skrzyżowania.
    2. Otwórz witrynę internetową bazy danych ciągów (https://cn.string-db.org/), wybierz pozycję Dane wejściowe | Wklej/Prześlij, aby zaimportować dane wsadowo i ustaw próg Stopień ≥ 1, aby odfiltrować wolne cele (cele bez interakcji) w sieci.
    3. Wybierz punkt menu Plik | Import | Połącz sieć i zaimportuj przefiltrowane obiekty docelowe skrzyżowania do oprogramowania, aby utworzyć ostateczną wizualizację.
    4. Przejdź do Analiza sieci | Przeanalizuj sieć i odfiltruj podstawowe cele YHT-DKD na podstawie wartości stopnia.
  5. Analiza funkcjonalna ontologii genów (GO) i analiza wzbogacania szlaku w encyklopedii genów i genomów z Kioto (KEGG)
    1. Otwórz platformę Metascape, odwiedzając stronę http://metascape.org/gp/index.html, wybierz opcję Rozpocznij analizę, aby rozpocząć, wklej listę celów dla YHT i DKD w polu wejściowym w sekcji Analiza niestandardowa, ustaw gatunek na Homo sapiens z menu rozwijanego, wybierz Analiza niestandardowa i ustaw próg wartości P na <0,01, a następnie kliknij przycisk Prześlij , aby uruchomić analizę.
    2. Po zwróceniu wyników z Metascape przejdź do http://www.bioinformatics.com.cn/, wybierz Narzędzia | Wzbogacenie terminu GO, wklej warunki GO z wyników i kliknij przycisk Prześlij, aby wygenerować wykresy bąbelkowe. Wizualizuj 10 najpopularniejszych terminów GO, sortując je na podstawie wartości P.
    3. Posortuj ścieżki KEGG na podstawie wartości P z wyników analizy Metascape. Wejdź na tę samą stronę internetową Microbiology (http://www.bioinformatics.com.cn/), wybierz opcję go kegg pathway enrichment, wklej wybrane 10 najlepszych ścieżek KEGG i kliknij Prześlij, aby wyświetlić diagramy bąbelkowe KEGG.

5. Analiza statystyczna

  1. Jeśli dane są zgodne z rozkładem normalnym, a wariancje są jednorodne, należy użyć jednokierunkowej analizy ANOVA. Jeśli wariancje nie są jednorodne, należy użyć testu T3 Dunnetta lub testu t dla próby niezależnej.
  2. W przypadku danych, które nie są zgodne z rozkładem normalnym, należy użyć testu sumy rang z metod nieparametrycznych.
  3. Rozważmy, że P < 0,05 jest statystycznie istotne.

Wyniki

Poprawa glikemii, funkcji wątroby i nerek oraz zaburzeń metabolizmu lipidów u myszy z DKD
Po 8 tygodniach podawania, różne dawki YHT znacząco obniżyły poziomy losowej glikemii, 24 h UTP, Scr oraz BUN, poprawiając funkcję nerek (Rycyna 1A-D); zwiększyły poziom ALB; obniżyły poziomy ALT i AST; poprawiły funkcję wątroby (Rycyna 1E-G); obniżyły poziomy TC i TG oraz poprawiły regulację metabolizmu lipidów (Rycyna 1H,I). Powyższe wyniki wskazują, że YHT wykazuje działanie ochronne w zakresie glikemii, funkcji wątroby i nerek oraz regulacji lipidów.

Łagodzenie uszkodzeń histopatologicznych nerek u myszy z DKD
Aby sprawdzić, czy YHT może łagodzić uszkodzenia nerek u myszy z DKD, zakres zmian patologicznych w tkankach nerek zbadano przy użyciu barwień H&E, PAS i Massona oraz metody IHC. Barwienia H&E i PAS w grupie MOD ujawniły zanik kłębków nerkowych, poszerzenie obszaru tunica albuginea, obrzęk i odwarstwienie komórek nabłonka cewkowego, naciek zapalny komórek śródmiąższowych oraz wyraźne złogi glikogenu w kłębkach nerkowych (Rysunek 2A,B). Barwienie Massona wykazało znaczący wzrost ilości niebieskich włókien kolagenowych w nerkach grupy MOD w porównaniu z grupą CON (Rysunek 2C,D). Metoda IHC wykazała, że odsetek obszarów pozytywnych dla COI-I i α-SMA był istotnie wyższy w grupie MOD niż w grupie CON (Rysunek 2E-G). W przeciwieństwie do tego, po zastosowaniu YHT i POS, zanik kłębków nerkowych, poszerzenie strefy przyczepu, obrzęk i złuszczanie komórek nabłonka cewkowego, stopień nacieku zapalnego komórek śródmiąższowych oraz złogi glikogenu w kłębkach zostały istotnie zredukowane; obszar niebieskich włókien kolagenowych uległ znacznemu zmniejszeniu, a odsetek obszarów pozytywnych dla COI-I i α-SMA istotnie spadł. Powyższe wyniki wskazują, że YHT może łagodzić patologiczne uszkodzenia nerek oraz włóknienie nerek u myszy z DKD.

Łagodzenie uszkodzeń podocytów u myszy z DKD
Uszkodzenia komórek stopki u myszy z DKD obserwowano za pomocą IHC, PCR i WB. Wyniki IHC wykazały, że poziomy ekspresji białek markerowych funkcji komórek stopki, CD2AP i WT-1, były znacznie obniżone w grupie MOD w porównaniu z grupą CON, co wskazuje na uszkodzenie nerkowych komórek stopki. Leczenie YHT zwiększyło poziomy ekspresji CD2AP i WT-1 oraz zmniejszyło uszkodzenia komórek stopki (Ryc. 3A-C). Wyniki PCR i WB wykazały, że względne poziomy ekspresji mRNA i białka białek markerowych funkcji komórek stopki, CD2AP i WT-1, były znacznie obniżone w grupie MOD w porównaniu z grupą CON, natomiast względne poziomy ekspresji mRNA i białka CD2AP i WT-1 znacznie wzrosły po zastosowaniu leczenia YHT (Ryc. 3D-H). Powyższe wyniki wskazują, że YHT może łagodzić uszkodzenia podocytów u myszy z DKD.

Wyjaśnienie potencjalnych celów i szlaków sygnałowych powiązanych z działaniem YHT na DKD za pomocą farmakologii sieciowej
Składniki aktywne YHT (291) przeskanowano za pomocą baz danych TCMSP i BATMAN-TCM, z czego 39 składników aktywnych spełniło kryteria OB ≥ 30% i DL ≥ 0,18. Przeszukano bazy danych w celu zidentyfikowania celów dla składników aktywnych, a po scaleniu i usunięciu duplikatów uzyskano łącznie 303 cele (Rysunek 4A). Po scaleniu wyników z pięciu baz danych, w tym GeneCards, OMIM, TTD, Drugbank i DisGeNET, oraz usunięciu duplikatów, ostatecznie uzyskano 1 867 celów związanych z DKD. Następnie stronę http://www.bioinformatics.com.cn/ wykorzystano do znalezienia wspólnych celów dla aktywnych składników YHT i celów DKD, co zaowocowało 84 wspólnymi celami (Rysunek 4B). Te 84 cele zaimportowano do oprogramowania Cytoscape w celu narysowania sieci PPI, co pozwoliło zidentyfikować potencjalne kluczowe cele dla leczenia DKD za pomocą YHT, w tym AKT, IL-1 β, CASP3, APOE i JUN (Rysunek 4C). Analiza wzbogacenia funkcjonalnego GO przyniosła łącznie 1 246 pozycji, co wskazuje, że YHT może wywierać działanie terapeutyczne na DKD poprzez regulację procesów biologicznych, takich jak odpowiedź na hormony, oraz funkcji molekularnych, w tym aktywność homodimeryzacji białek i aktywność oksydoreduktazy, a także komponentów komórkowych, takich jak tratwy lipidowe i mikrodomeny błonowe (Rysunek 4D). Uzyskano łącznie 263 wyniki wzbogacenia KEGG, obejmujące głównie szlak sygnałowy AGE-RAGE w kompleksach cukrzycowych, alkoholową chorobę wątroby oraz szlaki lipidowe i miażdżycowe. Na podstawie wartości P wybrano 10 najlepszych wyników do narysowania wizualnego wykresu bąbelkowego KEGG (Rysunek 4E). Szlak sygnałowy AGE-RAGE jest silnie wzbogacony w kompleksach cukrzycowych, a w szlaku tym wzbogaconych jest wiele głównych celów PPI, takich jak PI3K, AKT i IL-1β. Dlatego szlak sygnałowy ten wybrano do dalszej walidacji.

Łagodzenie uszkodzenia podocytów poprzez hamowanie szlaku sygnałowego PI3K/AKT/NF-κB
Poziomy ekspresji genów i białek związanych ze szlakiem sygnałowym PI3K/AKT/NF-κB zostały dodatkowo zbadane za pomocą PCR i WB. Wyniki PCR wykazały, że względne poziomy ekspresji mRNA Pi3k, Akt, Nf-κb oraz Il-1β w grupie MOD były znacznie podwyższone w porównaniu z grupą CON i uległy znacznemu obniżeniu po podaniu YHT (Rycina 5A-D). Wyniki WB wykazały, że względne poziomy białek P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB oraz IL-1β były również znacznie podwyższone w grupie MOD w porównaniu z grupą CON, natomiast uległy one znacznemu obniżeniu po podaniu YHT (Rycina 5E-I). Wyniki te sugerują ponadto, że YHT może hamować szlak sygnałowy PI3K/AKT/NF-κB poprzez łagodzenie uszkodzenia podocytów u myszy z DKD.

Wykresy słupkowe dla glukozy na czczo, albumin, kreatyniny, BUN, analizy surowicy; wyniki badania porównawczego.
Rysunek 1: Poprawa poziomu glukozy we krwi, funkcji wątroby i nerek oraz zaburzeń metabolizmu lipidów u myszy z DKD. Wpływ YHT na (A) losowy poziom glukozy we krwi; (B-D) funkcję nerek, w tym białko w moczu w ciągu 24 h, kreatyninę we krwi i azot moczowy; (E-G) funkcję wątroby, w tym albuminy w surowicy, aminotransferazę alaninową i aminotransferazę asparaginianową; oraz (H,I) regulację metabolizmu lipidów, w tym cholesterol całkowity i trójglicerydy. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe sześciu niezależnych próbek; w porównaniu z grupą pustą *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, a w porównaniu z grupą modelową #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001; te oznaczenia statystyczne są stosowane konsekwentnie na wszystkich rysunkach. Skróty: YHT = yinhuo Tang; DKD = cukrzycowa choroba nerek; ALB = albuminy; ALT = aminotransferaza alaninowa; AST = aminotransferaza asparaginianowa; TC = cholesterol całkowity; TG = trójglicerydy; CON = grupa kontrolna; MOD = grupa modelowa; POS = grupa kontrolna pozytywna z walsartanem; YH-L = grupa z niską dawką YHT; YH-M = grupa ze średnią dawką YHT; YH-H = grupa z wysoką dawką YHT. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza histologiczna; barwienie H&E, PAS, Massona; badanie włóknienia; wykresy słupkowe, ekspresja COL1, α-SMA.
Rycina 2: Łagodzenie uszkodzeń histopatologicznych nerek u myszy z DKD. (A,B) Histologia nerek po barwieniu H&E i PAS (pasek skali = 20 µm); (C) barwienie Massona w celu oceny stopnia włóknienia nerek oraz (D) analiza półilościowa z wykorzystaniem oprogramowania ImageJ; (E-G) półilościowa analiza względnych poziomów ekspresji COI-I i α-SMA w tkankach nerek z zastosowaniem IHC i oprogramowania ImageJ (pasek skali = 20 µm). Skróty: YHT = yinhuo Tang; DKD = cukrzycowa choroba nerek; H&E = barwienie hematoksyliną i eozyną; PAS = barwienie kwasem okresowym i Schiffem; COI-I = kolagen typu I; α-SMA = α-aktyna mięśni gładkich; CON = grupa kontrolna; MOD = grupa modelowa; POS = grupa kontrolna pozytywna z walzartanem; YH-L = grupa z niską dawką YHT; YH-M = grupa z dawką średnią YHT; YH-H = grupa z wysoką dawką YHT. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza ekspresji CD2AP i WT-1; wyniki immunohistochemii, wykresy słupkowe i Western blot.
Rycina 3: Osłabienie uszkodzenia podocytów u myszy z DKD. (A-C) IHC wykazała względne poziomy ekspresji CD2AP i WT-1 w tkankach nerek (skala = 20 µm); (D,E) PCR wykazał względną ekspresję mRNA CD2AP i WT-1 w tkankach nerek; analizę półilościową przeprowadzono z użyciem oprogramowania Image J; (F-H) WB wykazała względne poziomy ekspresji białek CD2AP i WT-1 w tkankach nerek; analizę półilościową przeprowadzono z użyciem oprogramowania ImageJ. analiza ilościowa z użyciem oprogramowania Image J. Skróty: YHT = yinhuo Tang; DKD = cukrzycowa choroba nerek; IHC = immunohistochemia; WB = Western blotting; CD2AP = białko związane z CD2; WT-1 = białko guza Wilmsa 1; CON = grupa kontrolna; MOD = grupa modelowa; POS = grupa kontrolna pozytywna z walsartanem; YH-L = grupa z niską dawką YHT; YH-M = grupa ze średnią dawką YHT; YH-H = grupa z wysoką dawką YHT. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Schematy analizy sieci biologicznych; wykres Venna B: pokrycie DKD/YHT, D: wyniki wzbogacenia.
Rysunek 4: Analiza farmakologiczna sieci YHT w leczeniu DKD. (A) Wykres zależności składnik aktywny–cel choroby dla YHT w leczeniu DKD. (B) Diagram Venna przedstawiający wspólne cele YHT i DKD. Kolor pomarańczowy oznacza liczbę celów istotnych dla DKD; kolor zielony oznacza liczbę celów terapeutycznych składników aktywnych YHT; a część wspólna reprezentuje liczbę wspólnych celów (liczbę celów YHT dla DKD). (C) Schemat sieci PPI wspólnych celów YHT i DKD. (D) Analiza wzbogacenia GO dla 10 najważniejszych celów YHT w leczeniu DKD. (E) Analiza wzbogacenia KEGG dla 10 najważniejszych celów w leczeniu DKD za pomocą YHT. Skróty: YHT = yinhuo Tang; DKD = diabetic kidney disease; PPI = Protein-Protein Interaction; GO = Gene Ontology; KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; CON = grupa kontrolna; MOD = grupa modelowa; POS = grupa kontrolna pozytywna z walsartanem; YH-L = grupa z niską dawką YHT; YH-M = grupa z dawką średnią YHT; YH-H = grupa z wysoką dawką YHT. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Western blot i wykresy słupkowe przedstawiające analizę ekspresji białek, szlaki sygnalizacyjne w badaniu komórkowym.
Rysunek 5: Osłabienie uszkodzenia podocytów poprzez hamowanie szlaku sygnalizacyjnego PI3K/AKT/NF-κB. (A-D) PCR w celu wykrycia względnej ekspresji mRNA Pi3k, Akt, Nf-κb oraz Il-1β w tkankach nerkowych. (E-I) WB w celu wykrycia względnych poziomów ekspresji białek P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB oraz IL-1β w tkankach nerkowych; analizę półilościową przeprowadzono przy użyciu oprogramowania ImageJ. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Skład Yinhuo Tang. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Szczegóły dotyczące starterów qRT-PCR. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Jednym z kluczowych kroków w tym protokole jest wykorzystanie farmakologii sieciowej do identyfikacji aktywnych składników YHT i przewidywania ich interakcji z celami związanymi z DKD. Ten krok obejmuje analizę danych biologicznych na dużą skalę przy użyciu narzędzi bioinformatycznych, takich jak bazy danych (np. TCMSP, DrugBank i GeneCards) w celu zmapowania szlaków molekularnych i potencjalnych sieci biologicznych, na które wpływa YHT. Po tym przewidywaniu przeprowadzono walidację eksperymentalną za pomocą modeli zwierzęcych DKD, w których przetestowano hipotetyczny wpływ YHT na te szlaki. Integracja przewidywań obliczeniowych z danymi jest kluczowym aspektem naszego podejścia, ponieważ zwiększa wiarygodność naszych ustaleń i wypełnia lukę między przewidywaniami teoretycznymi a wynikami praktycznymi. Ponadto wykorzystanie modeli zwierzęcych jest kolejnym krytycznym krokiem w walidacji efektów terapeutycznych YHT. DKD u zwierząt ściśle naśladuje postęp choroby u ludzi, co pozwala na skuteczną ocenę wpływu YHT zarówno na uszkodzenie kłębuszków nerkowych, jak i zwłóknienie nerek. Skrupulatne monitorowanie markerów czynności nerek, takich jak Scr, BUM i białkomocz, wraz z oceną histopatologiczną, jest niezbędne do oceny skuteczności terapeutycznej YHT.

Chociaż nasz protokół łączy w sobie potężne metody obliczeniowe i eksperymentalne, istnieje kilka ograniczeń. Po pierwsze, podejście farmakologiczne oparte na sieciach opiera się w dużej mierze na danych dostępnych w publicznych bazach danych i mogą występować błędy systematyczne lub brakujące informacje dotyczące niektórych komponentów szlaków związanych z YHT lub DKD. Mimo że przeprowadziliśmy porównania z wieloma bazami danych, aby złagodzić ten problem, niektóre istotne interakcje mogą zostać przeoczone. Po drugie, w badaniu tym zbadano jedynie mechanizm YHT w zmniejszaniu uszkodzenia podocytów na poziomie zwierząt doświadczalnych, a do walidacji wyników eksperymentalnych potrzebne są eksperymenty komórkowe i badania kliniczne na dużych próbach. Wreszcie, farmakologia sieciowa wykazała, że leczenie DKD za pomocą YHT było również związane z alkoholową chorobą wątroby, metabolizmem lipidów i miażdżycą oraz regulacją lipolizy w adipocytach. W badaniu tym sprawdzono jedynie, czy modulacja szlaku sygnałowego PI3K/AKT/NF-κB przez YHT może opóźnić postęp DKD; Wyniki wymagają dalszych badań.

Szlak sygnałowy PI3K / AKT / NF-κB jest ważnym wewnątrzkomórkowym szlakiem sygnałowym zaangażowanym w regulację różnych procesów biologicznych, takich jak wzrost komórek, proliferacja, przeżycie i reakcje zapalne22. Badania wykazały, że odgrywa ważną rolę w postępie uszkodzenia pedikulocytów23,24. NF-κB jest ważnym dalszym składnikiem szlaku PI3K/Akt i uczestniczy w przekazywaniu różnych sygnałów wewnątrzkomórkowych oraz ekspresji wielu genów. Hamowanie szlaku sygnałowego PI3K/AKT prowadzi do degradacji białka hamującego NF-κB IκB, co z kolei prowadzi do fosforylacji NF-κB i jego wejścia do jądra oraz do produkcji różnych chemokin i czynników zapalnych, co prowadzi do uszkodzenia podocytów i zwłóknienia śródmiąższowego nerek25. Niektóre badania wykazały, że hamowanie aktywacji szlaku sygnałowego PI3K/AKT/NF-κB może skutecznie hamować reakcje zapalne i zwłóknienie nerek, opóźniając w ten sposób postęp DKD26.

Badania wykazały, że zaburzenia metabolizmu lipidów odgrywają znaczącą rolę w powstawaniu i progresji DKD27,28. Pacjenci z DKD często wykazują nieprawidłowy metabolizm lipidów, w tym podwyższony poziom LDL, TG i akumulacji kwasów tłuszczowych. Nieprawidłowości te są ściśle związane ze zmianami patologicznymi, takimi jak stwardnienie kłębuszków nerkowych i zwłóknienie cewkowo-śródmiąższowe29,30. Badania wskazują, że zaburzenia metabolizmu lipidów mogą sprzyjać progresji DKD poprzez wiele szlaków sygnałowych31,32. Po pierwsze, szlak sygnałowy mTOR jest kluczowym szlakiem w regulacji metabolizmu lipidów; Jego nadmierna aktywacja prowadzi do uszkodzenia podocytów i białkomoczu33,34. Środowisko o wysokiej zawartości tłuszczu może sprzyjać akumulacji lipidów przez oś PI3K/AKT/mTOR, indukując apoptozę podocytów i ostatecznie pogarszając pogorszenie funkcji nerek 35,36,37. Po drugie, kinaza białkowa aktywowana przez AMP (AMPK), krytyczny regulator metabolizmu energii komórkowej, chroni nerki przed zaburzeniami metabolicznymi poprzez promowanie utleniania kwasów tłuszczowych, hamowanie syntezy lipidów i zmniejszanie lipotoksyczności 38,39,40. Inaktywacja AMPK jest uważana za ważny mechanizm w progresji DKD. Aktywatory AMPK, takie jak metformina, wykazały znaczące działanie renoprotekcyjne i stanowią obiecujący cel terapeutyczny dla DKD41.

Wreszcie, badania wykazały, że receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów α/γ (PPARα/γ) odgrywają istotną rolę w regulacji metabolizmu lipidów i DKD42,43. PPARα aktywacja sprzyja utlenianiu kwasów tłuszczowych i zmniejsza akumulację lipidów w nerkach, podczas gdy PPARγ poprawia wrażliwość na insulinę i wywiera działanie przeciwzapalne44,45. Agoniści PPAR, tacy jak fibraty, wykazali potencjalne korzyści kliniczne w zmniejszaniu białkomoczu u pacjentów z DKD46. Podsumowując, zaburzenia metabolizmu lipidów wpływają na patologiczny postęp DKD poprzez wiele szlaków sygnałowych. Interakcje między tymi szlakami tworzą złożoną sieć patologiczną. Ukierunkowanie na metabolizm lipidów może zapewnić nowe strategie terapeutyczne w leczeniu DKD.

Rodzina kaspaz (CASP), rodzina proteaz specyficznych dla cysteiny, to grupa proteaz, które są powszechnie występujące w komórkach i są głównie zaangażowane w regulację apoptozy i odpowiedzi zapalnych47,48. Członkowie rodziny CASP mają podobieństwa strukturalne i zwykle występują jako zymogeny, które są aktywowane przez kaskadę reakcji, wywołując w ten sposób apoptozę, piroptozę i inne zaprogramowane procesy śmierci komórki49. Wśród nich CASP3, członek rodziny kaspazy (CASP) o konserwatywnej strukturze zwykle występującej jako zymogen, jest kluczową proteazą w fazie wykonawczej apoptozy, która katalizuje rozszczepienie określonych białek komórkowych, odgrywając w ten sposób kluczową rolę w regulacji prawidłowego wzrostu komórek i utrzymaniu wewnętrznej homeostazy50,51. Kaspaza-8 działa jako inicjator kaskad apoptotycznych i uczestniczy w modulacji odpowiedzi zapalnych poprzez aktywację NPK, który jest kluczowym czynnikiem w regulacji wzrostu komórek. Kaspaza-8 działa jako inicjator kaskady apoptotycznej, a także uczestniczy w regulacji odpowiedzi zapalnej poprzez aktywację pęcherzyków zapalnych, takich jak NLRP1 i NLRP3, wywołując w ten sposób piroptozę komórkową52. Opierając się na ważnej roli szlaku sygnałowego CASP w pośredniczeniu w apoptozie i piroptozie w komórkach szypułkowych, w przyszłości uzasadnione są dalsze dogłębne badania związku między YHT, CASP3 / 8, komórkami szypułkowymi i DKD.

W porównaniu z konwencjonalnymi podejściami do odkrywania leków, które zazwyczaj kładą nacisk na dobrze zdefiniowane mechanizmy pojedynczego celu w celu zapewnienia jasności regulacyjnej i przewidywalności, nasza strategia oparta na farmakologii sieciowej pozwala na systematyczne badanie interakcji wielocelowych nieodłącznie związanych z preparatami TCM, takimi jak YHT. Chociaż ta złożoność odzwierciedla holistyczną naturę TCM i jej potencjalny zakres terapeutyczny, podkreśla również wyzwanie związane z niezamierzonymi efektami poza celem, które wymagają starannej walidacji i interpretacji. Biorąc pod uwagę wielocelowy i wielościeżkowy charakter działania YHT, zapewniamy bardziej holistyczne zrozumienie jego efektów terapeutycznych w leczeniu DKD. Ponadto farmakologia sieciowa pozwala na przewidywanie potencjalnych interakcji leków i skutków ubocznych, co ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia bezpieczeństwa i skuteczności terapii wieloskładnikowych. Obecne metody leczenia DKD w dużej mierze koncentrują się na radzeniu sobie z objawami lub spowolnieniu postępu, a nie na zwalczaniu podstawowych mechanizmów choroby. Łącząc nowoczesne narzędzia bioinformatyczne z walidacją eksperymentalną, badanie to podkreśla znaczenie biologii systemowej w poprawie skuteczności TCM, szczególnie w chorobach przewlekłych, takich jak DKD.

Patrząc w przyszłość, technika ta jest bardzo obiecująca dla rozszerzenia zakresu farmakologii sieciowej w badaniach TCM, szczególnie w leczeniu złożonych chorób, takich jak DKD. Nasze podejście można zastosować do zbadania innych formuł TCM lub pojedynczych ziół pod kątem ich potencjału terapeutycznego w leczeniu chorób nerek, chorób sercowo-naczyniowych i zaburzeń metabolicznych. Co więcej, metodologia ta może zostać rozszerzona w celu zbadania zmiany przeznaczenia leków poprzez identyfikację nowych zastosowań istniejących leków w leczeniu DKD. Innym potencjalnym zastosowaniem naszego podejścia jest medycyna spersonalizowana. Włączając dane specyficzne dla pacjenta, farmakologia sieciowa może być wykorzystana do dostosowania strategii leczenia TCM w oparciu o indywidualne profile molekularne, zwiększając skuteczność leczenia i minimalizując działania niepożądane.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Jilin (nr 20210101201JC).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bezwodny etanolChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10009218
Centrum Eksperymentów na ZwierzętachChangchun Uniwersytet Tradycyjnej Medycyny ChińskiejSYXK (JI) 2023-0014
Baza danych BATMAN-TCMhttp://bionet.ncpsb.org/batmantcm--
Zestaw do oznaczania białek BCASolarbioPC0020
Bufor blokującyBeyotimeP0023B
Garnki ceramiczneMideaMD-DG30E103
System obrazowania chemiluminescencyjnegoHangzhou Shenhua Technology Co., LtdSH-523
ChloroformChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10006818
Oprogramowanie Cytoscape 3.8.0----
Zestaw odczynników DABServicebioG1212-200T
myszy db/dbNanjing Junke Biological spółka z ograniczoną odpowiedzialnościąSCXK (Su) 2020-009
Powinowactwodo roztworu substratu ECLKF8003
Elektryczny garnek do kąpieli wodnej o stałej temperaturzeFisaff Instrument (Hebei) Co., LtdDK-20000-IIIL
Zasilacz przyrządu do elektroforezyPekin Longfang Technology Co., LtdLF-600S
Homogenizator szkłaSolarbioYA0852
Szkiełko szklaneNantong Meiweide Life Science Co., LtdPC2-301
Kozioł IgG IgG HRP (przeciwciało wtórne)PowinowactwoS00011:3000 dla IHC, 1:10000 dla WB
HematoxylinWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG1140
Wirówka z chłodzeniem o dużej prędkości Hunan Kecheng Instrument Equipment Co., LtdH1-16KR
HiScript II Q RT SuperMix do qPCR (+ wycieraczka gDNA)VAZYMER223-01
Wytrząsarka poziomaJiangsu Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., LtdTS-1
System obrazowaniaNikonNikon DS-U3
Inteligentne cyfrowe magnetyczne mieszadło grzewczeHangzhou Miou Instrument Co., LtdTP-350E +
IzopropanolChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., LtdMarker 80109218
(20-120KD)GenScriptM00521
Zestaw do barwienia MassonBASOBA4079B
Gaza medycznaJianerkang Medical-
platforma Metascapehttp://metascape.org/gp/index.html--
MetanolThermo67-56-1
Strona internetowa mikrobiologiihttp://www.bioinformatics.com.cn/--
mikroskopKuchenka mikrofalowa NikonECLIPSE Ci
Kuchenka mikrofalowa Galanz Electrical Appliance Co., LtdP70D20TL-P4
Młynek do tkanek z wieloma próbkamiShanghai Jingxin Industrial Development Co., LtdTissuelyser-24L
Wielofunkcyjna elektroniczna waga analitycznaChangzhou Lucky Electronic Equipment Game CompanyFA1204
Neutralna żywicaWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG8590
Normalna kozia surowicaSolarbioSL038
piekarnikShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co., LtdDHG-9140A
Wirówka palmowaWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdD1008E
Zestaw do barwienia PASBASOBA4114B
Krajalnica patologicznaShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
Instrument PCR PBSSolarbioP1020
Hangzhou Miou Instrument Co., LtdPR-96
Pistolet do pipetDragonKE0003087/KA0056573
Bufor do rozcieńczania przeciwciał pierwotnychBeyotimeP0023A
Kompleks inhibitorów fosfatazy białkowejMembrana PVDF MeilunbioMB12707-1
(0,22 μ m)SolarbioISEQ00010
Szybki pierwszorzędowy/drugorzędowy rozcieńczalnik przeciwciałSolarbioA1811
Królik anty-CD2APPowinowactwoDF22981:200 dla IHC, 1:1000 dla WB
Rabbit anty-COI-IPowinowactwoDF121491:200 dla IHC, 1:1000 dla WB
Rabbit anty-IL-1βPowinowactwoAF51031:1000 dla
WB Rabbit anty-P-AKTPowinowactwoAF00161:1000 dla
WB Rabbit anty-P-NF-Κ bPowinowactwoAF32191:1000 dla WB
Rabbit anty-P-PI3KPowinowactwoAF32421:1000 dla WB
Rabbit anty-WT-1PowinowactwoDF63311:200 dla IHC, 1:1000 dla
WB Rabbit anty-α-SMAPowinowactwoAF10321:200 dla IHC, 1:1000 dla WB
Królik anty-β-aktynaPowinowactwoAF70181:1000 dla WB
System PCR w czasie rzeczywistymABI QuantStudio 6
Bufor do lizy RIPAMeilunbioMA0151
RNaz ddH2OSolarbioR1600
Wtórny bufor do rozcieńczania przeciwciałBeyotimeP0023D
Szkiełko szkiełkowe i nakrywkoweJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd10212432C
SPSS 26.0 oprogramowanie----
Strona internetowa bazy danych ciągów https://cn.string-db.org/-
Instrument do super czystej wodyZhiang Instrument (Shanghai) Co., LtdClever-S15
Taq Plus Polimeraza DNATIANGENET105-02
Baza danych TCMSP https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php-
Młynek do tkanekPiękna ścianaMB-96
TrizolAmbion15596-026
Tween 20China National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd30189328
Ultra mikro spektrofotometr UV w zakresie widzialnymHangzhou Miou Instrument Co., LtdND-100
Baza danych białek Uniprothttps://www.uniprot.org-
Pionowy mikroskop optycznyNikonNikon Eclipse CI
Zestaw do testowania białka moczowegoNanjing Jiancheng Bioengineering Research InstituteC035-2
Ningbo Xinzhi Biotechnology Co.A01-1-NA0959
Pionowy zbiornik do elektroforezyPekin 61 Fabryka instrumentówDYCZ-24DN
Mieszalnik wirowyWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdMX-F
Zachodni bufor blokującySolarbioSW3010
ksylenChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10023418
YihongWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdE8090
Bez Liofilizator próżniowy

Bibliografia

  1. Naaman, S. C., Bakris, G. L. Diabetic nephropathy: Update on pillars of therapy slowing progression. Diabetes Care. 46 (9), 1574-1586 (2023).
  2. Glastras, S. J., Pollock, C. A. Targeted identification of risk and treatment of diabetic kidney disease. Nat Rev Nephrol. 20 (2), 75-76 (2024).
  3. Gregory, G. A., et al. Global incidence, prevalence, and mortality of type 1 diabetes in 2021 with projection to 2040: a modelling study. Lancet Diabetes Endocrinol. 10 (10), 741-760 (2022).
  4. Rao, B. V., Tan, S. H., Candasamy, M., Bhattamisra, S. K. Diabetic nephropathy: An update on pathogenesis and drug development. Diabetes Metab Syndr. 13 (1), 754-762 (2019).
  5. Guo, M., He, F., Zhang, C. Molecular therapeutics for diabetic kidney disease: An update. Int J Mol Sci. 25 (18), 10051(2024).
  6. Shen, S., et al. Advances in traditional Chinese medicine research in diabetic kidney disease treatment. Pharm Biol. 62 (1), 222-232 (2024).
  7. Han, C., et al. Yi-Shen-Hua-Shi granule ameliorates diabetic kidney disease by the "gut-kidney axis". J Ethnopharmacol. 10 (307), 116257(2023).
  8. Ma, X., et al. Advances in oxidative stress in pathogenesis of diabetic kidney disease and efficacy of TCM intervention. Ren Fail. 45 (1), 2146512(2023).
  9. Liu, M., et al. A systematic review on polysaccharides from Morinda officinalis How: Advances in the preparation, structural characterization and pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 28 (328), 118090(2024).
  10. Zhang, X., et al. Network pharmacology-based identification of key pPharmacological mechanism of Shen-qi-di-huang decoction acting on uremia. Altern Ther Health Med. 30 (1), 44-50 (2024).
  11. Linlin, Z., et al. A multi-target and multi-channel mechanism of action for Jiawei Yinhuo Tang in the treatment of social communication disorders in autism: Network pharmacology and molecular docking studies. Evid Based Complement Alternat Med. 8 (2022), 4093138(2022).
  12. Husain, S. Role of podocyte in kidney disease. Front Biosci (Landmark Ed). 29 (7), 250(2024).
  13. Pavenstädt, H., Kriz, W., Kretzler, M. Cell biology of the glomerular podocyte. Physiol Rev. 83 (1), 253-307 (2003).
  14. Torban, E., et al. From podocyte biology to novel cures for glomerular disease. Kidney Int. 96 (4), 850-861 (2019).
  15. Yue, J. I., et al. Acupuncture improve proteinuria in diabetic kidney disease rats by inhibiting ferroptosis and epithelial-mesenchymal transition. Heliyon. 10 (13), e33675(2024).
  16. Liu, X. Q., et al. Wogonin protects glomerular podocytes by targeting Bcl-2-mediated autophagy and apoptosis in diabetic kidney disease. Acta Pharmacol Sin. 43 (1), 96-110 (2022).
  17. Nogales, C., et al. Network pharmacology: curing causal mechanisms instead of treating symptoms. Trends Pharmacol Sci. 43 (2), 136-150 (2022).
  18. Zhang, P., et al. Network pharmacology: towards the artificial intelligence-based precision traditional Chinese medicine. Brief Bioinform. 25 (1), bbad518(2023).
  19. Zhao, L., et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 12 (309), 116306(2023).
  20. Meek, R. L., et al. Glomerular cell death and inflammation with high-protein diet and diabetes. Nephrol Dial Transplant. 28 (7), 1711-1720 (2013).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
  22. Yusuf, J. A., et al. Molecular mechanism underlying stress response and adaptation. Prog Brain Res. 291, 81-108 (2025).
  23. Yu, M., et al. Baicalein increases cisplatin sensitivity of A549 lung adenocarcinoma cells via PI3K/Akt/NF-κB pathway. Biomed Pharmacother. 12 (90), 677-685 (2017).
  24. Chen, H., et al. The PI3K/AKT pathway in the pathogenesis of prostate cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 21 (5), 1084-1091 (2016).
  25. Wang, J., et al. Critical roles of PI3K/Akt/NF-κB survival axis in angiotensin II-induced podocyte injury. Mol Med Rep. 20 (6), 5134-5144 (2019).
  26. Zhang, S. J., et al. Integrated network pharmacology analysis and experimental validation to elucidate the mechanism of acteoside in treating diabetic kidney disease. Drug Des Devel Ther. 12 (18), 1439-1457 (2024).
  27. Rong, J., et al. Mechanisms of hepatic and renal injury in lipid metabolism disorders in metabolic syndrome. Int J Biol Sci. 20 (12), 4783-4798 (2024).
  28. Bi, Z., et al. Development of a clinical prediction model for diabetic kidney disease with glucose and lipid metabolism disorders based on machine learning and bioinformatics technology. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 28 (3), 863-878 (2024).
  29. Wei, L., Gao, J., Wang, L., Tao, Q., Tu, C. Multi-omics analysis reveals the potential pathogenesis and therapeutic targets of diabetic kidney disease. Hum Mol Genet. 33 (2), 122-137 (2024).
  30. Vartak, T., Godson, C., Brennan, E. Therapeutic potential of pro-resolving mediators in diabetic kidney disease. Adv Drug Deliv Rev. 178 (4), 113965(2021).
  31. Liu, S., et al. Renal tubule ectopic lipid deposition in diabetic kidney disease rat model and in vitro mechanism of leptin intervention. J Physiol Biochem. 78 (2), 389-399 (2022).
  32. Tang, C., et al. Fenofibrate attenuates renal tubular cell apoptosis by up-regulating MCAD in diabetic kidney disease. Drug Des Devel Ther. 17 (2), 1503-1514 (2023).
  33. Lu, H. T., et al. Unraveling DDIT4 in the VDR-mTOR pathway: a novel target for drug discovery in diabetic kidney disease. Front Pharmacol. 15 (10), 1344113(2024).
  34. Tang, G., et al. Clinical efficacies, underlying mechanisms and molecular targets of Chinese medicines for diabetic nephropathy treatment and management. Acta Pharm Sin B. 11 (9), 2749-2767 (2021).
  35. Zhang, P., et al. Huaiqihuang (HQH) protects podocytes from high glucose-induced apoptosis and inflammation response by regulating PI3K/AKT/mTOR pathway. Arch Physiol Biochem. 11 (27), 1-8 (2024).
  36. Zhaoan, G., et al. Qizhi Jiangtang capsule activates podocyte autophagy in diabetic kidney disease by inhibiting phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin pathways. J Tradit Chin Med. 43 (4), 667-675 (2023).
  37. Jin, D., et al. Jiedu Tongluo Baoshen formula enhances podocyte autophagy and reduces proteinuria in diabetic kidney disease by inhibiting PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. J Ethnopharmacol. 293 (3), 115246(2022).
  38. Zhou, Y., et al. Metrnl alleviates lipid accumulation by modulating mitochondrial homeostasis in diabetic nephropathy. Diabetes. 72 (5), 611-626 (2023).
  39. Shao, M., et al. Canagliflozin regulates metabolic reprogramming in diabetic kidney disease by inducing fasting-like and aestivation-like metabolic patterns. Diabetologia. 67 (4), 738-754 (2024).
  40. Tian, S., et al. GLP-1 receptor agonists alleviate diabetic kidney injury via β-klotho-mediated ferroptosis inhibition. Adv Sci (Weinh). 12 (4), e2409781(2024).
  41. Song, Y., et al. Identification of circular RNAs and functional competing endogenous RNA networks in human proximal tubular epithelial cells treated with sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor dapagliflozin in diabetic kidney disease. Bioengineered. 13 (2), 3911-3929 (2022).
  42. Fan, Y., et al. Identification of potential key lipid metabolism-related genes involved in tubular injury in diabetic kidney disease by bioinformatics analysis. Acta Diabetol. 61 (8), 1053-1068 (2024).
  43. Pan, S., et al. A comprehensive weighted gene co-expression network analysis uncovers potential targets in diabetic kidney disease. J Transl Int Med. 10 (4), 359-368 (2023).
  44. Chen, Y., et al. Curcumin targets CXCL16-mediated podocyte injury and lipid accumulation in diabetic kidney disease treatment. Arch Pharm Res. 47 (12), 924-939 (2024).
  45. Liu, K., et al. Design, synthesis, and biological evaluation of a novel dual peroxisome proliferator-activated receptor alpha/delta agonist for the treatment of diabetic kidney disease through anti-inflammatory mechanisms. Eur J Med Chem. 218 (5), 113388(2021).
  46. Kitada, M., Kanasaki, K., Koya, D. Clinical therapeutic strategies for early stage of diabetic kidney disease. World J Diabetes. 5 (3), 342-356 (2014).
  47. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Caspase-3 and prostaglandins signal for tumor regrowth in cancer therapy. Oncogene. 31 (23), 2805-2808 (2012).
  48. Li, L., Wang, S., Zhou, W. Balance cell spoptosis and pyroptosis of caspase-3-activating chemotherapy for better antitumor therapy. Cancers (Basel). 15 (1), 26(2022).
  49. Fan, T. J., et al. Caspase family proteases and apoptosis. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (11), 719-727 (2005).
  50. Asadi, M., et al. Caspase-3: Structure, function, and biotechnological aspects. Biotechnol Appl Biochem. 69 (4), 1633-1645 (2022).
  51. Eskandari, E., Eaves, C. J. Paradoxical roles of caspase-3 in regulating cell survival, proliferation, and tumorigenesis. J Cell Biol. 221 (6), e202201159(2022).
  52. Pang, J., Vince, J. E. The role of caspase-8 in inflammatory signalling and pyroptotic cell death. Semin Immunol. 42 (70), 101832(2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Redukcja bia komoczufiltracja k buszkowabia ka markerowe podocyt wekspresja CD2APekspresja WT 1PI3K AKT NF Bmikroangiopatia nerkowa
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły