Wykorzystanie bibliotek przetwarzania obrazów w celu usprawnienia kwantyfikacji jąder

Summary

Ten artykuł opisuje krok po kroku metody automatyzacji kwantyfikacji jąder na podstawie obrazów za pomocą programu wykonywalnego o otwartym kodzie źródłowym, sprawdzanego w różnych gęstościach komórek. Ten program stanowi alternatywę, która usuwa bariery związane z kosztami, dostępnością dla użytkowników o ograniczonych umiejętnościach technologicznych oraz walidacją specyficzną dla aplikacji, która może ograniczać użyteczność istniejących technologii.

Abstract

Testy żywych komórek i analizy komórek oparte na obrazie wymagają normalizacji danych dla dokładnej interpretacji. Powszechnie stosowaną metodą jest barwienie i ilościowe oznaczanie jąder, a następnie normalizacja danych do liczby jąder. Ta liczba jąder jest często wyrażana jako liczba komórek w komórkach jednojądrowych. Chociaż ręczna kwantyfikacja może być pracochłonna i czasochłonna, dostępne zautomatyzowane metody mogą nie być preferowane przez wszystkich użytkowników, mogą nie mieć walidacji dla tego konkretnego zastosowania lub mogą być zbyt kosztowne. W tym miejscu przedstawiamy instrukcje krok po kroku dotyczące przechwytywania wymiernych obrazów jąder barwionych fluorescencyjnymi barwnikami DNA, a następnie ilościowego określania jąder za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania do liczenia obiektów opracowanego przy użyciu bibliotek widzenia komputerowego Python. Weryfikujemy również ten program w szerokim zakresie gęstości komórek. Chociaż dokładny czas wykonania programu różni się w zależności od liczby obrazów i sprzętu komputerowego, ten program konsoliduje godziny pracy, licząc jądra w sekundach, aby program mógł działać. Chociaż protokół ten został opracowany przy użyciu obrazów utrwalonych, barwionych komórek, obrazy barwionych jąder w żywych komórkach i zastosowania immunofluorescencji można również określić ilościowo za pomocą tego programu. Ostatecznie program ten zapewnia opcję, która nie wymaga wysokiego stopnia umiejętności technologicznych i jest zweryfikowaną alternatywą typu open source, która pomaga biologom komórkowym i molekularnym w usprawnianiu ich przepływów pracy, automatyzując żmudne i czasochłonne zadanie kwantyfikacji jąder.

Introduction

Eksperymenty funkcjonalne i oparte na obrazach są kluczowe dla zrozumienia wpływu eksperymentalnych terapii na biochemię i fizjologię całych komórek. Prawidłowa interpretacja danych z eksperymentów biologii komórki zależy od dokładności i odtwarzalności protokołu eksperymentalnego, w tym normalizacji danych. Na przykład analizy zużycia tlenu i wskaźników zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w żywych komórkach na początku badania i po leczeniu określonymi lekami pozwalają na ocenę różnych aspektów metabolizmu energetycznego^1,2. Pomiar aktywności enzymów, takich jak dehydrogenaza mleczanowa w supernatancie kultur kom....

Protocol

UWAGA: Dodatkowe pliki można znaleźć pod następującym linkiem https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. Przechwytywanie i zapisywanie obrazów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

1. Przygotuj próbki komórek lub tkanek do obrazowania, w tym barwienie wybranym barwnikiem DNA. Aby uzyskać wykorzystane tutaj obrazy, mioblasty C2C12 (CRL-1772, American Type Culture Collection) hodowano na 6-dołkowych płytkach przez 48-72 godziny w standardowych warunkach hodowli (5% CO₂, 37 °C, nawilżane), z lub bez 50 mM EtOH⁶ i utrwalone w lodowatym metanolu, jak wcześniej opisano

Results

Każdy cykl obrazu wsadowego tworzy: 1) zestaw plików graficznych z nałożonymi konturami pokazującymi kontury zidentyfikowanych jąder (Rysunek 5), oraz 2) plik .csv (arkusz kalkulacyjny) łączący nazwy plików graficznych i związane z nimi liczby. Przeglądanie konturów pozwoli użytkownikowi wizualnie ocenić jakość liczenia. W szczególności obrazy uzyskane zgodnie z sekcją 1 powinny mieć wszystkie (lub prawie wszystkie) jądra otoczone ciągłą zieloną linią wskazuj.......

Discussion

Nasz program do kwantyfikacji jąder ma kilka zalet w porównaniu z istniejącymi opcjami: wymaga jedynie minimalnych umiejętności technologicznych, jest walidowany pod kątem konkretnego zadania kwantyfikacji jąder i jest open-source; W ten ostatni sposób pokonuje się bariery związane z kosztami. Ostatecznie, program ten zapewnia biologom komórkowym i molekularnym dodatkową opcję szybkiego i dokładnego oznaczania ilościowego jąder na obrazach zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Obecnie dostępne programy.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Komputer z dostępem do pliku wyników z metody 2 lub 3	-		patrz krok 2.6 (dla metody 2) lub krok 3.3.9 lub 3.4.9 (dla metody 3)
Komputer z dostępem do Internetu, nowoczesna przeglądarka	-		np. Google Chrome
Komputer z dostępem do Internetu, nowoczesną przeglądarką i systemem operacyjnym Windows	Różni		W przypadku komputerów Mac, Linux lub innych systemów operacyjnych użyj metody 3
Komputer z oprogramowaniem do przechwytywania obrazów	Zeiss	AxioVision	Dopuszczalne jest inne oprogramowanie; musi być kompatybilny z mikroskopem fluorescencyjnym
Lokalizacja pliku wyjściowego (arkusz kalkulacyjny wyników i kontury obrazu)	-		Może to być nowy, pusty folder
Mikroskop fluorescencyjny	Zeiss	Axiovert 200M	Inne mikroskopy fluorescencyjne są dopuszczalne; muszą być wyposażone w odpowiednie kostki filtrujące, pożądany obiektyw i kamerę
Folder zawierający wszystkie obrazy do ilościowego określenia	-		patrz krok 1.12
Python w wersji 3.10 lub nowszej	Python	-	dostępny do bezpłatnego pobrania i instalacji pod adresem https://www.python.org/downloads/
Próbki do obrazowania	-		utrwalone lub żywe, barwione lub barwione fluorescencyjnymi barwnikami DNA
Oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych	Microsoft	Excel	Dopuszczalne jest również podobne oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych