Artykuł metodologiczny

Szybkie zubożenie makrofagów nerkowych przy użyciu ludzkiego narzędzia do ablacji komórek CD59 / Intermedialysin

890 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67957

⸱

9 maja 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Comparative Pathology, Tulane National Primate Research Center, 2Department of Microbiology and Immunology, Tulane University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Podano tutaj protokół selektywnej ablacji makrofagów nerkowych w celu zbadania ich regeneracji przy użyciu ludzkiego narzędzia do ablacji komórek CD59 / intermedialyzyny. Metoda ta ma również zastosowanie do badania funkcji i regeneracji innych populacji komórek w nerkach, wątrobie i tkance tłuszczowej.

Streszczenie

Makrofagi nerkowe (RM) są niezbędne dla zdrowia nerek, koordynowania nadzoru immunologicznego, homeostazy tkanek i reakcji na urazy. Wcześniej informowaliśmy o użyciu ludzkiego narzędzia do ablacji komórek CD59 (hCD59) / pośredniej lizyny (ILY) w celu zbadania odrębnego losu, dynamiki i nisz RM szpiku kostnego lub pochodzenia embrionalnego. RM pochodzą z makrofagów pochodzących z woreczka żółtkowego, monocytów wątroby płodu i monocytów pochodzących ze szpiku kostnego i są utrzymywane w wieku dorosłym poprzez lokalną proliferację i rekrutację krążących monocytów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół selektywnej ablacji RM w celu zbadania ich regeneracji, w tym 1) generowanie i charakterystykę indukowanej przez Cre ekspresji hCD59 w RM myszy, 2) oczyszczanie ILY i charakterystykę aktywności ILY, 3) indukcję ekspresji hCD59 na RM u myszy złożonych oraz 4) charakterystykę regeneracji po ablacji RM za pośrednictwem ILY. ILY specyficznie i szybko wyczerpuje RM u myszy złożonych, zapewniając skuteczną ablację makrofagów w ciągu 1 dnia po podaniu ILY. Regeneracja makrofagów nerek rozpoczęła się w 3 dniu po ablacji, z ~88% powrotem do 7 dnia. Model ten stanowi potężne narzędzie do badania biologii makrofagów i może być wykorzystany do selektywnej ablacji innych populacji komórek w nerkach, wątrobie i tkankach tłuszczowych w celu zbadania ich funkcji i regeneracji.

Wprowadzenie

Makrofagi nerkowe (RM) są niezbędnymi komórkami odpornościowymi, które utrzymują homeostazę nerek, regulują odpowiedzi immunologiczne i wspomagają naprawę tkanek po urazie. Pełnią one różne funkcje, w tym fagocytozę, prezentację antygenu oraz orkiestrację odpowiedzi zarówno zapalnych, jak i przeciwzapalnych 1,2,3. W zależności od lokalnego środowiska, RM mogą polaryzować się w fenotypy prozapalne (M1) lub przeciwzapalne (M2), pogarszając uraz lub ułatwiając gojenie 4,5,6. Dysregulacja RM jest związana z wystąpieniem i progresją ostrego uszkodzenia nerek (AKI) i przewlekłej choroby nerek (PChN), co czyni je kluczowymi graczami w zdrowiu i patologii nerek 7,8. RM powstają z różnych źródeł, w tym makrofagów pochodzących z woreczka żółtkowego podczas embriogenezy, monocytów wątroby płodu i monocytów pochodzących ze szpiku kostnego w wieku dorosłym. RM rozszerzają się i dojrzewają równolegle ze wzrostem nerek po urodzeniu, głównie pochodzące z monocytów wątroby płodu przed urodzeniem, z samozachowaniem przez dorosłość uzupełnionym przez monocyty obwodowe9. U dorosłych krążące monocyty są rekrutowane do nerki przez sygnały homeostatyczne lub urazowe, różnicując się w makrofagi pod wpływem lokalnych wpływów mikrośrodowiska. Utrzymanie RM jest utrzymywane poprzez miejscową proliferację i okresowe uzupełnianie z krążących monocytów 9,10,11,12.

Wcześniej wykazaliśmy zastosowanie ludzkiego systemu ablacji komórek CD59 (hCD59) / intermedialysin (ILY) jako narzędzia13,14 do badania odrębnych losów, dynamiki i nisz mikrośrodowiskowych RM pochodzących ze szpiku kostnego lub pochodzenia embrionalnego9. ILY selektywnie lizuje ludzkie komórki w ciągu kilku sekund, tworząc pory w docelowych błonach komórkowych15. Ta specyficzność wynika z wyłącznego powinowactwa ILY do ludzkiego CD59 (hCD59), bez interakcji lub wpływu litycznego na komórki innych gatunków pozbawionych tego receptora15. Opierając się na tej koncepcji, opracowaliśmy narzędzie umożliwiające szybką, warunkową i celowaną ablację ludzkich komórek wykazujących ekspresję CD59 w transgenicznych modelach myszy poprzez zastosowanie pośredniej lizyny (ILY)14. Aby ułatwić korzystanie z tego narzędzia, opracowaliśmy model warunkowej i celowanej ablacji komórek, generując myszy knockin STOP-CD59 z floksacją (ihCD59), w której ekspresja ludzkiego CD59 występuje dopiero po rekombinacji za pośrednictwem Cre13. Wcześniej stwierdzono, że gen CX3CR1cre-EFP ulega ekspresji wyłącznie na CD11bintF480hi, zdefiniowany jako makrofagi nerkowe9. Dlatego użyliśmy linii CX3CR1CreER2 + / + do krzyżowania z myszami ihCD59 w celu ekspresji hCD59 na makrofagach nerkowych. Udało nam się wygenerować myszy złożone z genotypem ihCD59 +/-/CX3CR1CreER+/-9 (+/-, +/+ i -/- wskazują odpowiednio myszy transgeniczne homozygoty, hemizygotę i niebędące nosicielami). Podawanie tamoksyfenu myszom ze związkiem ihCD59 +/-/CX3CR1CreER+/- warunkowo znakowanym i oznaczanym RM przez ekspresję hCD599. Po wyczerpaniu niszy RM poprzez leczenie ILY, monocyty obwodowe szybko różnicowały się w RM pochodzące ze szpiku kostnego, skutecznie ponownie zasiedlając niszę, jak opisano wcześniej w9. Regeneracja ta była krytycznie zależna od osi sygnalizacyjnej CX3CR1/CX3CL1, co podkreśla jej zasadniczą rolę zarówno w utrzymaniu, jak i odbudowie populacji RM9. Pokazujemy również, że ze względu na ich wyraźne zdolności glikolityczne, RM pochodzenia embrionalnego mają większą zdolność do wymiatania kompleksów immunologicznych i są bardziej wrażliwe na wyzwania immunologiczne niż RM pochodzące ze szpiku kostnego9.

Przedstawiamy szczegółowy protokół selektywnej ablacji RM w celu zbadania ich regeneracji za pomocą szybkiej ablacji komórek za pośrednictwem indukowanej przez Cre hCD59 (ihCD59) po podaniu ILY. Wstrzyknięcie ILY spowodowało celowaną ablację RM, które warunkowo i swoiście eksprymują hCD59 u myszy ze związkiem CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/-. Po ablacji monitorowaliśmy dynamiczne zmiany makrofagów za pomocą cytometrii przepływowej i stwierdziliśmy szybkie zubożenie makrofagów, a następnie regenerację RM. Rekombinowany ILY ulegał ekspresji w komórkach E. coli BL21(DE3) i został oczyszczony za pomocą chromatografii powinowactwa niklowo-NTA. Czystość i funkcjonalność rekombinowanego ILY potwierdzono za pomocą SDS-PAGE, spektrofotometrii i testu hemolizy, wykazując jego charakterystyczną aktywność cytolizyny zależnej od cholesterolu. Użyliśmy ILY do wyczerpania RM u myszy, osiągając skuteczną ablację makrofagów w ciągu 1 dnia od podania ILY. Regeneracja makrofagów nerek rozpoczęła się w 3 dniu po ablacji, z ~85% powrotem do 7 dnia. Dane sugerują, że regeneracja jest napędzana przede wszystkim przez rekrutację monocytów. Model ten stanowi potężne narzędzie do badania biologii makrofagów i ma potencjał terapeutyczny w zakresie ukierunkowanej manipulacji populacjami makrofagów w chorobach nerek. Narzędzie do ablacji komórek ihCD59/ILY może być używane do badania funkcji i regeneracji komórek w nerkach, wątrobie, tkance tłuszczowej i innych narządach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokoły badań na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Tulane, Szkoły Medycznej (Protokół nr 1482). Myszy eksperymentalne, Cx3cr1CreER+/+ i ihCD59+/+, w wieku 10-12 tygodni i ważące 25-30 g, były trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF) w uniwersyteckim ośrodku dla zwierząt. Wszystkie procedury związane z izolacją nerek przeprowadzono w sterylnym środowisku, a naukowcy nosili rękawiczki i maski na twarz, aby zapobiec zakażeniu. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu wykorzystywanego w badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Uzyskaj myszy CX3CR1CreER+/+ z The Jackson Laboratory. Trzymaj myszy w Tulane University School of Medicine (SOM) w określonym obiekcie wolnym od patogenów (SPF). Utrzymuj zwierzęta w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w kontrolowanych warunkach środowiskowych.
  2. Do hodowli należy użyć wcześniej wygenerowanych myszy ihCD59+/+ z tłem genetycznym C57BL/6. Skrzyżowanie homozygotycznych myszy CX3CR1CreER+/+ (z niedoborem ekspresji CX3CR1) z myszami ihCD59+/- w celu uzyskania następujących genotypów potomstwa: CX3CR1CreER+/-/ihCD59-/-i CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/-.
  3. Upewnij się, że heterozygotyczne myszy CX3CR1CreER+/- zachowują funkcjonalną ekspresję CX3CR1, podczas gdy homozygotyczne myszy CX3CR1CreER+/+ mają niedobór CX3CR1 przez analizę cytometrii przepływowej z przeciwciałem anty-CX3CR19.

2. Produkcja ILY (pochodząca z14,15 )

  1. Dzień 0
    1. Pobrać zamrożony wywar szczepu bakteryjnego ILY BL21-DE3-RIPL przenoszący sekwencje ILY znakowane przez Hisa w plazmidzie pTrcHis-A (rysunek uzupełniający 1) przechowywany w temperaturze -80 °C. Zaszczepić 10 μl materiału bakteryjnego w 40 μl pożywki bulionowej Luria (LB) zawierającej ampicylinę o stężeniu 1 μg/ml.
    2. Rozprowadzić zaszczepioną mieszaninę na płytce agarowej LB uzupełnionej ampicyliną (1 μg/ml). Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze bakteryjnym.
  2. Dzień 1
    1. Wybierz sześć pojedynczych kolonii z płytki agarowej LB. Zaszczepić każdą rodzinę w 3,5 ml pożywki LB zawierającej ampicylinę. Inkubować kultury przez noc w temperaturze 37 °C.
  3. Dzień 2
    1. Przenieś każdą 3,5 ml kultury starterowej do 250 ml pożywki LB uzupełnionej ampicyliną. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C przez 3 godziny, wytrząsając przy 230 x g , aby umożliwić rozwój bakterii.
    2. Po 3 godzinach dodać β-D-1-tiogalaktopiranozyd izopropylu (IPTG) z 1 M roztworu podstawowego (przechowywanego w temperaturze -20 °C) w rozcieńczeniu 1:1000 do uzyskania końcowego stężenia 1 mM. Kontynuuj inkubację przez dodatkowe 4 godziny w celu wywołania ekspresji białka.
    3. Zważyć pustą butelkę wirówki i zanotować masę. Przenieść około 250 ml indukowanej kultury do butelki wirówkowej.
    4. Osadzać komórki przez odwirowywanie w stężeniu 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, a następnie zważyć butelkę zawierającą osad. Obliczyć masę granulki, odejmując masę pustej butelki od całkowitej masy po odwirowaniu.
    5. Przechowywać osad bakteryjny w temperaturze -20 °C w celu późniejszej ekstrakcji i oczyszczenia ILY.
  4. Dzień 3: Ekstrakcja i oczyszczanie ILY
    1. Przygotuj bufor do lizy, łącząc 30 ml odczynnika do ekstrakcji białek Bug Buster z 30 μl nukleazy benzonazy (1200 jednostek Kunitza) i 0,9 μl lizozymu (10 000 jednostek aktywności enzymatycznej) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    2. Delikatnie wymieszać roztwór, aby upewnić się, że bufor do lizy jest jednorodny. Przygotowany bufor do lizy dodać do osadu bakteryjnego (2-5 g). Dokładnie mieszaj mieszaninę przez 30-60 sekund, aby całkowicie zawiesić komórki bakteryjne.
    3. Ponownie zawieszony roztwór podzielić równo między dwie probówki wirówkowe o pojemności 50 ml. Umieść probówki na lodzie i inkubuj przez 30-90 minut. Podczas inkubacji delikatnie potrząśnij probówkami za pomocą wytrząsarki orbitalnej i krótko wiruj co 5-10 minut przez 10-15 s, aby zwiększyć lizę komórek.
    4. Po inkubacji odwirować lizaty w temperaturze 4,900 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Dokładnie umyj kolumnę wodą z kranu za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml, aby usunąć resztki żywicy z poprzedniego użycia.
    6. Przepłucz kolumnę 70% etanolem, aby ją odkazić. Przemyć kolumnę 2x-3x zimnym ddH2O, aby usunąć resztki etanolu. Umieść kolumnę w uchwycie.
    7. Dodać 6-10 ml zimnego ddH2O w celu dalszego przemycia i wyrównania kolumny do oczyszczenia. Dodaj około 3 ml kulek żywicy do kolumny. Podłącz kolumnę do pompy perystaltycznej ustawionej na prędkość 30.
    8. Dodaj 10 ml zimnego ddH2O, aby całkowicie zawiesić żywicę i przygotować ją do wiązania białek. Umyj kulki żywicy 15 ml 1x buforu ładującego, aby przygotować żywicę do wiązania białek.
    9. Zebrać supernatant lizatu bakteryjnego po odwirowaniu w świeżej probówce, upewniając się, że osad został wyrzucony. Przefiltrować supernatant za pomocą filtra 0,45 μm ze strzykawką, aby usunąć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia komórkowe.
    10. Przepuść 20-25 ml przefiltrowanego lizatu bakteryjnego przez kolumnę w trzech oddzielnych rundach. Po każdym przejściu należy zebrać 20 μl przepływowego płynu i oznaczyć go jako PE w celu późniejszego pomiaru gęstości optycznej (OD).
    11. Przemyć kolumnę 20-30 ml buforu wiążącego w celu usunięcia niezwiązanych białek. Przemyć kolumnę 20-30 ml buforu do mycia. Zebrać 20 μl frakcji płuczącej do pomiaru średnicy zewnętrznej.
    12. Eluować związane białko, dodając 10-20 ml buforu elucyjnego. Zbieranie elucji należy rozpocząć po 3-4 minutach za pomocą probówek do mikrowirówek. Zbierz około 1 ml na probówkę, wypełniając 15-17 probówek.
    13. Zmierzyć absorbancję każdej frakcji elucyjnej w A280 za pomocą spektrofotometru. Użyj buforu elucyjnego jako ślepej próby podczas odczytów A280. Zbierz probówki o znacznie zwiększonej absorbancji w A280, ponieważ zawierają one białko ILY znakowane przez Hisa, które zwykle znajduje się we frakcjach wokół probówki 13.
    14. Frakcje elucyjne (lub probówki) zawierające białko ILY należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Kontynuować dalsze kroki w ciągu następnego dnia, aby zapewnić optymalną stabilność białka.
      UWAGA: Jeśli to możliwe, wszystkie czynności należy wykonywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby zachować integralność białka.
  5. Dzień 4: Usunięcie endotoksyny z elucji
    1. Przepłucz kolumnę z żywicą usuwającą endotoksyny 6-10 ml ultraczystej wody. Delikatnie dociśnij kolumnę, aby wyregulować przepływ.
    2. Przepłukać kolumnę 10 ml 1% roztworu deoksycholanu sodu (świeżo przygotowanego lub nie starszego niż 1 miesiąc) w celu usunięcia związanych endotoksyn. Ponownie przepłucz kolumnę 6-10 ml ultraczystej wody, aby usunąć resztki detergentu.
    3. Nałożyć przygotowaną próbkę białka na kolumnę z żywicą. Inkubować próbkę w kolumnie przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT), aby umożliwić optymalne wiązanie endotoksyn.
    4. Zebrać początkową frakcję przepływu. Dodać ddH2O do kolumny w celu dalszej elucji i zebrać eluowane frakcje w około 10 probówkach (1 ml na probówkę).
    5. Przechowuj kolumnę z żywicą w 25% etanolu w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) eluowanych próbek białek, aby określić ilościowo wydajność. Spodziewaj się odzyskania około 50%-70% całkowitego białka z pierwszej partii elucyjnej.
  6. Dzień 5-6: Dializy
    1. Przygotować 2 l buforu do dializy przez autoklawowanie 1600 ml destylowanej wody dejonizowanej (ddH2O). Dodaj 200 ml 10x PBS, 200 ml glicerolu i 3,5115 g MES (kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy) do autoklawizowanej wody.
    2. Mieszaj mieszaninę za pomocą mieszadła magnetycznego, aż wszystkie odczynniki całkowicie się rozpuszczą. Powstały bufor przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Zmagazynowane frakcje elucyjne dodać do zestawu do dializy, a następnie usunąć powietrze z zestawu do dializy za pomocą igły. Dializować roztwór białkowy za pomocą zestawu do dializy przez 24 godziny w temperaturze 4 °C z prędkością mieszania ustawioną na około 2.
    4. Skonfiguruj zestaw do dializy tak, aby upewnić się, że jest całkowicie zanurzony w buforze. Następnego dnia należy wymienić bufor do dializy w zestawie do dializy na świeży bufor do dializy w pojemniku o pojemności 2 l. Dializę należy kontynuować przez dodatkowe 24 godziny.
    5. Ostrożnie przenieść cały roztwór, w tym wszelkie białe osady, do sterylnej probówki, aby zachować białko ILY, które może się agregować. Zagęścić białko ILY za pomocą filtra odśrodkowego, postępując zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi wirowania.
    6. Podwielokrotność skoncentrowanego białka ILY podzielić na porcje o objętości 200 μl w sterylnych probówkach. Oznacz każdą probówkę datą i nazwą. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości w testach elektroforezy żelowej i hemolizy.

3. Charakterystyka ILY za pomocą elektroforezy SDS-PAGE

  1. Przygotuj bufor uruchomiony MOPS SDS (1x), rozcieńczając bufor uruchomiony (20x) za pomocą ddH2O.
  2. Przygotować bufor do próbek w dygestorium, mieszając 90 μl buforu 6-krotnie ładującego z 10 μl β-merkaptoetanolu (β-ME). Dokładnie wymieszaj roztwór, aby zapewnić całkowitą homogenizację.
  3. Połączyć przygotowaną próbkę z buforem ładującym, aby uzyskać końcową objętość 30 μl. Rozmrozić próbki i energicznie je wymieszać, aby zapewnić całkowite wymieszanie.
  4. Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut w celu denaturacji białek. Załaduj próbki do żelu SDS-PAGE 4%-20%. Uruchomić elektroforezę przy stałym napięciu 80 V przez 90 minut.
  5. Ostrożnie otwórz kasetę z żelem i zanurz żel w ddH2O na 5 minut. Powtórz krok prania 2x za pomocą shakera.
  6. Żel należy barwić preparatem Coomassie Brilliant Blue przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Myć żel przez 30 minut w ddH2O. Zastąp wodę świeżą ddH2O i inkubuj żel na wytrząsarce przez okres od nocy do 3 dni w celu całkowitego odbarwienia.
  7. Zrób obraz poplamionego żelu za pomocą aparatu (Rysunek 1A). Przeanalizuj żel za pomocą oprogramowania ImageJ do oceny ilościowej i jakościowej.

4. Test hemolityczny na aktywność ILY

  1. Całkowicie rozmrozić przechowywane próbki ILY (Intermedilysin) w temperaturze pokojowej. Rozmrożone próbki należy dokładnie zmieszać, aby zapewnić jednorodność, ponieważ ILY może się agregować po rozmrożeniu.
  2. Ustawić 96-dołkową płytkę do seryjnych rozcieńczeń. Dodać 160 μl roztworu podstawowego ILY (26,7 ng/μl) do pierwszego dołka. Dodaj 80 μl 1x PBS do każdego z kolejnych studzienek w tym samym rzędzie lub kolumnie.
  3. Przenieść 80 μl roztworu ILY z pierwszego dołka do drugiego dołka. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół, aby upewnić się, że roztwór jest jednorodny. Przenieść 80 μl z drugiego dołka do trzeciego dołka i dokładnie wymieszać.
  4. Powtórz ten proces dla każdej studzienki, przenosząc 80 μl z poprzedniej studzienki do następnej, aż do przygotowania żądanej liczby rozcieńczeń. Po przeniesieniu 80 μl do ostatniego dołka, wyrzuć 80 μl z tego dołka, aby zapewnić stałe objętości na całej płytce.

5. Przygotowanie ludzkich krwinek czerwonych (RBC)

  1. Pobrać 1-2 ml świeżej krwi ludzkiej do probówki zawierającej antykoagulant, taki jak EDTA. Odwirować krew w temperaturze pokojowej przy 3 000 x g przez 5 minut.
  2. Odrzucić supernatant i przemyć ludzką osadkę RBC PBS 2x-3x, aż supernatant będzie klarowny. Rozcieńczyć przemyte ludzkie krwinki czerwone, dodając 10 μl erytrocytów do 900 μl 1x PBS, aby uzyskać rozcieńczenie 1:100.
  3. Dodać 10 μl rozcieńczonych ludzkich krwinek czerwonych do każdego dołka. Dodać 30 μl seryjnie rozcieńczonego roztworu ILY z płytki rozcieńczającej do każdego studzienki. Dodać 160 μL 1x PBS, aby doprowadzić końcową objętość do 200 μL na studzienkę (stężenie początkowe: 4 ng / μL).
  4. Dodać 10 μl rozcieńczonych ludzkich krwinek czerwonych (RBC) do studzienek kontrolnych. Dodaj 190 μl wody lub 1x PBS do studzienek kontrolnych w celu kontroli ujemnej. Wymieszaj talerze, delikatnie je stukając.
  5. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby umożliwić przeprowadzenie hemolizy. Odwirować płytki o masie 3 000 x g przez 5 minut, aby osadzać wszelkie nienaruszone ludzkie krwinki czerwone.
  6. Ostrożnie przenieść 100 μl supernatantu z każdej studzienki na nową płaskodenną płytkę 96-dołkową. Zmierzyć absorbancję supernatantów przy długości fali 405 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
  7. Obliczyć aktywność hemolityczną ILY, porównując wartości absorbancji próbek z kontrolą16.

6. Leczenie tamoksyfenem, wyczerpanie RM i regeneracja

  1. Rozgrzać olej kukurydziany do temperatury 42 °C. Rozpuścić 100 mg tamoksyfenu w 5 ml podgrzanego oleju kukurydzianego, aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 20 mg/ml.
  2. Tamoksyfen należy podawać dootrzewnowo (i.p.) 10-12-tygodniowym samcom myszy CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/- w dawce 100 μg/g masy ciała. Powtarzać wstrzyknięcie tamoksyfenu przez 3 kolejne dni.
  3. Należy odczekać 15 dni po ostatnim wstrzyknięciu tamoksyfenu, aby umożliwić ekspresję hCD59 za pośrednictwem Cre.
  4. Wstrzyknąć pojedynczą dawkę pośredniej lizyny (ILY) dożylnie myszom CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/- i CX3CR1CreER+/-/ihCD59-/- z miotu w dawce 120 ng/g masy ciała.
  5. Monitoruj i potwierdź ablację RM i późniejszą regenerację, wykonując cytometrię przepływową po 1, 3 i 7 dniach od podania ILY17.

7. Eutanazja myszy

  1. Umieścić zwierzę w odpowiedniej komorze i wystawić je na działanie izofluranu zgodnie z protokołami IACUC. Sprawdź znieczulenie, sprawdzając, czy nie ma odruchów, takich jak odruch wycofania pedału.
  2. Gdy mysz jest w pełni znieczulona i nie reaguje, wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić eutanazję. Potwierdź eutanazję, weryfikując brak odruchów, takich jak odruch wycofania się z pedału.
  3. Użyj drobnych kleszczy i nożyczek, aby wykonać poziome nacięcie w dolnej części brzucha. Przedłuż nacięcie pionowo wzdłuż linii środkowej aż do momentu tuż poniżej klatki piersiowej lub mostka. Delikatnie cofnij skórę i mięśnie, aby odsłonić klatkę piersiową.
  4. Użyj nożyczek chirurgicznych z końcówką, ostrożnie przetnij wzdłuż mostka, aby otworzyć klatkę piersiową i odsłonić serce. Wykonaj nacięcie w prawym przedsionku, aby umożliwić odpływ krwi z układu krążenia.
  5. Wbić igłę 21G–23G do lewej komory serca. Rozpocznij perfuzję za pomocą 10-20 ml lodowatego PBS, aby wypłukać krążącą krew. Kontynuuj perfuzję, aż nerki staną się blade, co sygnalizuje pomyślne usunięcie krwi z narządów.
  6. Zlokalizuj nerki przy grzbietowej ścianie ciała. Delikatnie oddziel nerki od otaczających tkanek za pomocą kleszczy i nożyczek. Wyciąć kapsułki nerkowe i natychmiast umieścić nerki w zimnym PBS, aby zapobiec degradacji.

8. Trawienie nerek

  1. Przygotuj 100 ml koktajlu enzymatycznego wytrawiania, mieszając HBSS (bez Ca/Mg), kolagenazę IV (5 mg/ml) i DNazę I (20 μg/ml). Przygotuj świeży roztwór enzymu i trzymaj go na lodzie do czasu użycia.
  2. Zmielić nerki na drobne fragmenty (najlepiej ≤ 1 mm) za pomocą sterylnych nożyczek na szalce Petriego zawierającej 5 ml HBSS. Przenieść fragmenty tkanki nerkowej do probówek o pojemności 15 ml zawierających 10 ml przygotowanego roztworu enzymu.
  3. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 30 minut, delikatnie mieszając w celu dysocjacji tkanki. Delikatnie rozcieraj tkankę za pomocą pipety lub tłoka strzykawki, aby jeszcze bardziej zdysocjować grudki komórek.
  4. Usuń resztki tkanek, przepuszczając zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 700 x g przez 10 minut w temperaturze 18 °C.
  5. Ostrożnie zdekantować bufor po odwirowaniu. Zawiesić osad w 5 ml buforu do lizy i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu lizy czerwonych krwinek.
  6. Przemyć komórki PBS w celu usunięcia buforu do lizy. Powstałą zawiesinę jednokomórkową należy utrzymywać na lodzie do czasu dalszego użycia.

9. Wirowanie w gradiacji gęstości

  1. Aby wzbogacić komórki krwiotwórcze, należy ponownie zawiesić osad komórkowy z poprzedniego prania w 10 ml roztworu o 30% gradiencie gęstości. Ostrożnie ułóż roztwór na 3 ml roztworu o gradiencie gęstości 70% w probówce wirówkowej.
  2. Odwirować nachylenie przy 500 x g przez 30 minut bez użycia hamulca. Po odwirowaniu ostrożnie zebrać warstwę interfazową między roztworami 30% i 70%; Ta warstwa zawiera wzbogacone pojedyncze komórki.
  3. Zebrane komórki przemyć 2x 10 ml PBS, odwirowując przy 500 x g przez 10 minut za każdym razem. Zawiesić ostatnią osadkę komórkową w 1 ml buforu FACS (1x PBS z 2% FBS) w probówce o pojemności 1,5 ml.
  4. Policz komórki za pomocą hemocytometru pod mikroskopem jasnego pola. Dostosuj stężenie komórek do 2 x 106 komórek/ml.

10. Barwienie cytometrią przepływową, akwizycja

  1. Granulować komórki w probówkach o pojemności 1,5 ml, odwirowując przy 650 x g przez 5 minut. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu FACS.
  2. Dodać przeciwciało anty-CD16/32 w rozcieńczeniu 1:200, aby zablokować niespecyficzne wiązanie receptora Fc. Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Wybarwić komórki barwnikiem Aqua Live/Dead i wstępnie sprzężonym koktajlem przeciwciał (rozcieńczenie 1:100), w tym CD45-e450, CD11b-PE-Cy7, hCD59-PE i F4/80-BV605. Dodaj koktajl przeciwciał bezpośrednio do zawiesiny komórek.
  4. Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności w celu ochrony fluoroforów przed fotobieleniem. Przepłukać wybarwione komórki 2x buforem FACS (PBS z 2% płodową surowicą bydlęcą) przez odwirowanie przy 650 x g przez 5 min.
  5. Utrwal komórki w 1% paraformaldehydzie (PFA) na 30 minut na lodzie. Umyj stałe komórki 2x buforem FACS, aby usunąć resztki PFA.
  6. Uzyskaj barwione i utrwalone komórki za pomocą cytometru przepływowego. Analizuj dane za pomocą oprogramowania.
  7. Zidentyfikuj makrofagi i mikroglej rezydujące w nerkach i innych tkankach za pomocą markerów CD45, CD11b i F4/80, jak opisano w9 .
  8. Wykonaj początkowe bramkowanie, aby wybrać aktywne komórki na podstawie profili rozproszenia do przodu (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC). Wyeliminuj dublety poprzez bramkowanie na obszarze rozproszenia z przodu (FSC-A) w stosunku do wysokości rozproszenia do przodu (FSC-H). Wyklucz martwe komórki za pomocą barwnika żywotności LIVE/DEAD.
  9. Wzbogać komórki odpornościowe poprzez bramkowanie w populacjach CD45+. Zdefiniuj makrofagi rezydujące w nerkach jako komórki CD11b + F4 / 80 ++ w populacji CD45 +, jak pokazano w strategii bramkowania (Figura 2A).
  10. Zdefiniuj populacje mikrogleju jako komórki CD11b + CD45iⁿt (Figura 2B). Wykonaj akwizycję danych na cytometrze przepływowym. Przeprowadź analizę końcową za pomocą oprogramowania, aby zakończyć badanie cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Oczyszczanie rekombinowanego ILY His-Tag przebiegało zgodnie z tym samym protokołem, który opisano wcześniej wpunkcie 14. ILY został pomyślnie poddany ekspresji w komórkach E. coli BL21(DE3), transformowanych plazmidem kodującym gen ILY ze Streptococcus intermedius. Po indukcji za pomocą IPTG widoczna była nadekspresja białka docelowego. Po ekspresji, ILY oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa niklowo-NTA, wykorzystując C-końcowy znacznik His do specyficznego wiązania....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Udana ekspresja, oczyszczenie i walidacja funkcjonalna rekombinowanego ILY znakowanego przez Hisa w tym badaniu przebiegała zgodnie z dobrze ugruntowanym protokołem15. Proces ten obejmował jednak kilka kluczowych etapów, które zapewniły wysoką wydajność białka, czystość i aktywność biologiczną. Indukcja komórek E. coli BL21 (DE3) za pomocą IPTG została zoptymalizowana w celu zrównoważenia poziomów ekspresji białek przy jednoczesnym zminimalizowaniu tworzen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani powiązań osobistych, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym manuskrypcie. Żadne konflikty interesów, w tym powiązania finansowe, niefinansowe, zawodowe lub osobiste, nie wpłynęły na projekt, przeprowadzenie, interpretację lub prezentację badania.

Podziękowania

Wyrażamy naszą wdzięczność zarówno byłym, jak i obecnym członkom Qin Lab za ich wkład w rozwój i udoskonalenie protokołów wykorzystanych w tym badaniu. Dziękujemy również grupie dr R. K. Twetena z Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Oklahomy za hojne dostarczenie rekombinowanego plazmidu ILY, który odegrał kluczową rolę w tych badaniach. Badanie to było wspierane przez National Institutes of Health (NIH) poprzez grant NIH 5 P51OD011104-58, R01DK129881 (X.Q.) i R21OD024931 (X.Q.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,45 &mikro; M Filtr strzykawkowyMiliporySLHVR33RS
4-15% TGX Bezplamne żele białkoweBio-Rad4568084
6X Bufor załadowczyRybak50-103-6570
70% etanoluWWR Nauki przyrodnicze64-17-5
Bufor lizujący ACK (chlorek amonu-potasu)Gibco (firma Gibco)A1049201
Koraliki z żywicy AffinityMilipory69670
Ampicylina roztwór sodowyBadania ZymoA1001-5
Anty-CD11b-PE-CY7 (klon M1/70)Invitrogen25-0112-82
Anty-CD16/32 (Fcγ RIII/II, Klon 93)eBionauka48-0161-80
Anty-CD45-e450 (klon 30-F11)eBionauka48-0451-82
Anty-F4 / 80-BV605 (klon BM8)Legenda biologiczna 123133
Anty-hCD59-PE (klon OV9A2)Invitrogen12-0596-42
Barwnik Aqua Alive/DeadInvitrogen      L34957A
Koraliki (żywica)Milipory69670
Nukleaza benzonazyMilipory70664-10KUN
Odczynnik do ekstrakcji białek BugBusterMilipory70584-4
Wirówka do mikroprobówekEppendorf powiedział:5424
Wirówka do probówekThermo Scientific75-001-241
Kolagenaza typu IVKorporacja Biochemiczna WorthingtonLS004188
Olej kukurydzianySigma AldrichZobacz materiał C8267
Deoksyrybonukleaza (DNAzy) IKorporacja Biochemiczna WorthingtonLS002007
Kolumna z żywicą Detoxi-GelMilipory69670
DPBS (Dulbecco' s roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanamiCorning21-031-CV
Rurki EDTABD365974
FBS (płodowa surowica bydlęca)Gibco (firma Gibco)10082-139
GlicerolRybakZobacz materiał BP229-1
HBSS (Hank' s Zbalansowany roztwór soli)Gibco (firma Gibco)24020117
IPTG (Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd) Millipore-Sigma206-703-0
IzofluranKształcenie i szkolenie zawodowe pierwsze502017
Nośniki LB
Cytometr przepływowy LSRFortessaBD Nauki biologiczne
MES [kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy]Rybak50-488-796
MOPS [kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy]Rybak50-213-522
Media gradientowe o gęstości PercollCytiva (Cytiwa)17089101
Pompa perystaltycznaFisher NaukowyWycofane teraz, użyj alternatywy
PFA (paraformaldehyd)Thermo ScientificI28800 powiedział:
Kolumna oczyszczającaMiliporyUFC900308
Roztwór rLizozymuNovagen20C71110 powiedział:
Kąpiel wodna z wytrząsaniem Thermo ScientificZobacz materiał TSSB15
Zestaw do dializy Slide-A-LyzerThermo66107
Deoksycholan soduRybakZobacz materiał BP349-100Świeżo wyprodukowane lub krócej niż miesiąc
Sterylne sitko do komórek (40 μ m)Fisher Naukowy22-363-547
TamoksyfenSigma Aldrich6734
Filtr ultra odśrodkowyMiliporyUFC900308
Woda ultraczystaThermo10977-015
Mieszalnik wirowyFisher Naukowy2215365
β-ME (β-merkaptoetanol)RybakZobacz materiał BP176-100

Bibliografia

  1. Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. Origin and functions of tissue macrophages. Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).
  2. Nelson, P. J., et al. The renal mononuclear phagocytic system. J Am Soc Nephrol. 23 (2), 194-203 (2012).
  3. Wang, Y., Harris, D. C. Macrophages in renal disease. J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).
  4. Islamuddin, M., Qin, X. Renal macrophages and NLRP3 inflammasomes in kidney diseases and therapeutics. Cell Death Discov. 10 (1), 229(2024).
  5. Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
  6. Mily, A., et al. Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection. J Vis Exp. (163), e61807(2020).
  7. Huen, S. C., Cantley, L. G. Macrophages in Renal Injury and Repair. Annu Rev Physiol. 79, 449-469 (2017).
  8. Tang, P. M., Nikolic-Paterson, D. J., Lan, H. Y. Macrophages: versatile players in renal inflammation and fibrosis. Nat Rev Nephrol. 15 (3), 144-158 (2019).
  9. Liu, F., et al. Distinct fate, dynamics and niches of renal macrophages of bone marrow or embryonic origins. Nat Commun. 11 (1), 2280(2020).
  10. Chew, C., et al. Kidney resident macrophages have distinct subsets and multifunctional roles. Matrix Biol. 127, 23-37 (2024).
  11. Cheung, M. D., et al. Resident macrophage subpopulations occupy distinct microenvironments in the kidney. JCI Insight. 7 (20), 161078(2022).
  12. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  13. Feng, D., et al. Cre-inducible human CD59 mediates rapid cell ablation after intermedilysin administration. J Clin Invest. 126 (6), 2321-2333 (2016).
  14. Hu, W., et al. Rapid conditional targeted ablation of cells expressing human CD59 in transgenic mice by intermedilysin. Nat Med. 14 (1), 98-103 (2008).
  15. Giddings, K. S., Zhao, J., Sims, P. J., Tweten, R. K. Human CD59 is a receptor for the cholesterol-dependent cytolysin intermedilysin. Nat Struct Mol Biol. 11 (12), 1173-1178 (2004).
  16. Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  17. Cao, Q., Harris, D. C., Wang, Y. Macrophages in kidney injury, inflammation, and fibrosis. Physiology. 30 (3), 183-194 (2015).
  18. Li, G., et al. The role of macrophages in fibrosis of chronic kidney disease. Biomed Pharmacother. 177, 117079(2024).
  19. Liu, F., et al. Versatile cell ablation tools and their applications to study loss of cell functions. Cell Mol Life Sci. 76 (23), 4725-4743 (2019).
  20. Yashchenko, A., et al. Cx3cr1 kidney resident macrophage heterogeneity. Front Immunol. 14, 1082078(2023).
  21. Duffield, J. S. Macrophages and immunologic inflammation of the kidney. Semin Nephrol. 30 (3), 234-254 (2010).
  22. Lee, S., et al. Distinct macrophage phenotypes contribute to kidney injury and repair. J Am Soc Nephrol. 22 (2), 317-326 (2011).
  23. Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in Tissue Repair, Regeneration, and Fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
  24. Guo, C., et al. Crosstalk between proximal tubular epithelial cells and other interstitial cells in tubulointerstitial fibrosis after renal injury. Front Endocrinol. 14, 1256375(2023).
  25. Guillot, A., et al. Bile acid-activated macrophages promote biliary epithelial cell proliferation through integrin αvβ6 upregulation following liver injury. J Clin Invest. 131 (9), 132305(2021).
  26. Kim, S. J., et al. Adipocyte Death Preferentially Induces Liver Injury and Inflammation Through the Activation of Chemokine (C-C Motif) Receptor 2-Positive Macrophages and Lipolysis. Hepatology. 69 (5), 1965-1982 (2019).
  27. Saxena, V., et al. Generation of Atp6v1g3-Cre mice for investigation of intercalated cells and the collecting duct. Am J Physiol Renal Physiol. 325 (6), F770-F778 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ablacja makrofag wnarz dzie Intermedilysinnadz r immunologiczny nerekrekrutacja monocyt wcytometria przep ywowamikroskopia wewn trz yciowawirowanie w gradiencie g sto cimarker F4 80

Powiązane artykuły