Mikrofabrykacja wszczepialnej optyki zintegrowanej z mikrostrukturalnym oknem obrazowania w celu zaawansowanego obrazowania in vivo

Summary

Ten protokół opisuje wytwarzanie wszczepialnego, zintegrowanego okna obrazowania za pomocą laserowego druku 3D. Okno składa się z systemu mikrosoczewek sprzężonych z mikrorusztowaniami. Metoda polega na polimeryzacji dwufotonowej (2PP) biokompatybilnego fotorezystu SZ2080 w ciągłej sekwencji, optymalizując wydajność produkcji i wyrównanie między różnymi komponentami.

Abstract

W kontekście badań biomateriałów i leków na modelach zwierzęcych, to badanie przedstawia uproszczony protokół wytwarzania nowatorskiego zintegrowanego okna obrazowania implantowalnego. Mikrourządzenie składa się z zaawansowanego systemu mikrosoczewek sprzężonych z mikrorusztowaniami zaprojektowanymi specjalnie do ilościowego oznaczania odpowiedzi immunologicznej in vivo przy użyciu zaawansowanej nieliniowej mikroskopii wzbudzenia. Protokół opiera się na polimeryzacji dwufotonowej (2PP) biokompatybilnego fotorezystu SZ2080, co umożliwia wytwarzanie mikrorusztowań i mikrosoczewek w ciągłej sekwencji w celu zwiększenia wydajności i precyzji produkcji. Aby jeszcze bardziej poprawić szybkość, dokładność i integralność strukturalną, wdrożono hybrydowe podejście do produkcji optyki, obejmujące 2PP zewnętrznej powłoki mikrosoczewki, a następnie sieciowanie UV w rdzeniu wewnętrznym. Ta innowacyjna technika optymalizuje właściwości optyczne mikrosoczewek, jednocześnie usprawniając proces produkcji. Powstałe w ten sposób mikrourządzenie charakteryzuje się wysoką powtarzalnością i stabilnością mechaniczną, co czyni je skuteczną metodą prototypowania mikroskalowych systemów optycznych do szeregu zastosowań biomedycznych.

Introduction

Mikroskopia przyżyciowe umożliwia badanie procesów biologicznych u żywych zwierząt poprzez wizualizację w czasie rzeczywistym. W połączeniu z fluorescencyjnymi metodami obrazowania nieliniowego może nawet osiągnąć rozdzielczość w skali subkomórkowej¹. W związku z tym stał się ważnym narzędziem w wielu dziedzinach, takich jak testy immunologiczne czy badania nad nowotworami, gdzie ważna jest obserwacja komórek w ich rzeczywistym środowisku fizjologicznym.

Powszechne podejścia do kontroli przyżyciowej, takie jak komory grzbietowych fałdów skórnych lub okna obrazowania czaszki i brzucha, są wysoce inwazyjne i stwarzają trudności dla długotrwałych kontroli tego samego punktu. W związku z tym pożądane są nowe metody obrazowania in vivo, które zmniejszają stres zwierząt i umożliwiają łatwą zmianę położenia widoku optycznego².

W tym ramie, możliwe jest rozwinięcie nowatorskiego, zminiaturyzowanego okna obrazowania opartego na szklanym podłożu, które zawiera stronę obrazowania z mikrosoczewkami optycznymi oraz stronę odniesienia tkankowego z trójwymiarowymi (3D) mikro-rusztowaniami. To zminiaturyzowane okienko obrazowania może być wszczepione "podskórnie" zwierzęciu i będzie funkcjonować jako "wewnętrzny" obiektyw mikroskopu. Zasada działania urządzenia będzie polegała na wykorzystaniu mikrosoczewek sprzężonych z zewnętrznym obiektywem mikroskopu o niskiej aperturze numerycznej (NA) do wykonywania nieliniowego obrazowania in vivo procesów biologicznych zachodzących wewnątrz rusztowań. Mikrosoczewki skompensują aberrację sferyczną spowodowaną obrazowaniem przez niejednorodne podłoże jako tissue^3,4, podczas gdy mikro-rusztowanie będzie napędzać regenerację tkanek i będzie działać jako latarnie optyczne5^,6,7, umożliwiając w ten sposób długotrwałą inspekcję tego samego punktu.

Podstawowe elementy urządzenia, tj. mikro-rusztowania i mikrosoczewki, zostały już zademonstrowane osobno, ale ich integracja w tym samym urządzeniu stwarza kilka wyzwań ze względu na ich naturę 3D, ich mikrometrowy rozmiar i potrzebę idealnego optycznego wyrównania między nimi. Mikrorusztowania, składające się z prostokątnych prostopadłościennych siatek, o reprezentatywnych wymiarach całkowitych ~ 500 μm x 500 μm x 100 μm i rozmiarach porów ~ 50 μm x 50 μm x 20 μm, mogą kierować rekrutacją komórek i nowym unaczynieniem, sprzyjając w ten sposób integracji tkanek. Ponadto, ze względu na ich autofluorescencję, mikrorusztowania działają jako latarnia fluorescencyjna in situ, umożliwiając w ten sposób szybką zmianę położenia i wyrównanie pod mikroskopem, a nawet korekcję aberracji sferycznych podczas obrazowania nieliniowego, aby umożliwić obserwacje podłużne in vivo o wysokiej rozdzielczości⁵. Mikrosoczewki o dużej aperturze numerycznej, o profilach sferycznych lub quasi-parabolicznych i ogniskowych rzędu kilkuset mikrometrów, wykazały swoje możliwości w zakresie liniowego i nieliniowego obrazowania próbek biologicznych w połączeniu z mikroskopem konfokalnym lub dwufotonowym^3,4.

Mikrosoczewki i mikro-rusztowania są wytwarzane za pomocą laserowej inskrypcji 3D, znanej również jako polimeryzacja dwufotonowa (2PP). W 2PP wiązka lasera femtosekundowego w podczerwieni jest ściśle skupiona wewnątrz fotorezystu utwardzanego promieniami UV, a dzięki absorpcji wielu fotonów w ognisku powstaje zamknięty woksel spolimeryzowanego materiału o rozmiarze submikrometrowym (~100 nm). Przesuwając ognisko lasera względem próbki fotorezystu, można uzyskać trójwymiarowe struktury materiału spolimeryzowanego po wypłukaniu materiału niespolimeryzowanego⁸. Proces ten charakteryzuje się wysoką rozdzielczością i charakterem 3D, co pozwala na pozyskiwanie mikrostruktur 3D, takich jak rusztowania i soczewki, o dobrej stabilności i wysokiej jakości powierzchni^9,10,11. Istnieją różne techniki wytwarzania porowatych mikrorusztowań, takie jak druk 3D, nanoimprinting lub elektroprzędzenie^12,13,14,15. Wszystkie te techniki mają główną wadę; Nie są one w stanie osiągnąć rozdzielczości w zakresie submikrometrowym, dając tym samym struktury o rozmiarach porów (~100 μm) większych niż rozmiar komórkowy i nie naśladują macierzy zewnątrzkomórkowej, która jest niezbędna do dobrej regeneracji tkanek. Do wytwarzania mikrosoczewek można podejść metodami opartymi na replikacji soczewki z formy lub maski, takimi jak formowanie wtryskowe, wytłaczanie na gorąco lub formowanie UV, lub metodami bezpośrednimi, takimi jak rozpływ termiczny, wytłaczanie mikroplastiku lub natryskiwanie mikrokropelkami^16,17. Wszystkie z nich mają ograniczenia w morfologii powierzchni, które można uzyskać, i są trudne do zintegrowania z przepływem produkcyjnym, w którym konieczne jest również wyprodukowanie mikrorusztowań. Z drugiej strony, 2PP wykazał swoją wszechstronność w wytwarzaniu złożonych komponentów optycznych^18,19, takich jak soczewki sferyczne lub paraboliczne, soczewki dyfrakcyjne, a nawet kombinacje różnych soczewek w tym samym komponencie optycznym^{20,21,22,23,24}. W tym kontekście 2PP wydaje się być najlepszą techniką wytwarzania całości, która zawiera zarówno soczewki, jak i mikrorusztowania.

Pomimo tego, że jest to unikalny wybór do realizacji tych struktur 3D z rozdzielczością mikrometrów, 2PP ma dwa główne ograniczenia, tj. jest to czasochłonne podejście dla struktur o stosunkowo dużej objętości i przedstawia ograniczoną głębokość produkcji (wzdłuż osi optycznej) ze względu na krótką odległość roboczą obiektywów mikroskopowych używanych do ciasnego ustawiania ostrości.

Ten artykuł proponuje unikalny protokół wytwarzania mikro-rusztowań i mikrosoczewek po przeciwnych stronach szklanego podłoża w procesie napromieniania w jednym kroku podłużnym, który gwarantuje dobre wyrównanie obu elementów i pokonuje ograniczenia głębokości produkcji. Protokół jest również zoptymalizowany pod kątem czasu produkcji; z jednej strony jednoetapowe naświetlanie oszczędza czas wyrównania, a zastosowanie podejścia hybrydowego, które łączy 2PP powłoki soczewki i utwardzanie UV wewnętrznych fotorezystorów, skraca czas naświetlania soczewek o dużej objętości25. Zdolność 2PP do wytwarzania struktur 3D o dowolnym kształcie pozwala na wykorzystanie tego protokołu do dowolnego projektu mikrosoczewek i mikrorusztowań, wzmacniając w ten sposób obecną metodę.

Protocol

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie próbki

1. Pierwsze rzutowanie kroplowe (Rysunek 1A)
   1. Oczyścić acetonem obie powierzchnie okrągłego szklanego szkiełka nakrywkowego o średnicy 12 mm (grubość 170 μm).
   2. Osuszyć obie powierzchnie azotem o temperaturze pokojowej.
   3. Umieść kontrolowaną ilość 46 μl płynnego fotorezystu po jednej stronie szklanego szkiełka nakrywkowego za pomocą pipety objętościowej.
      UWAGA: Materiał światłoczuły użyty w tym protokole to biokompatybilny, hybrydowy organiczno-nieorganiczny fotorezystor znany jako SZ2080, który jest dobrze znany i zatwierdzony do zastosowań biomedycznych²⁶. Zwróć uwagę, aby pozostawić wolny pierścień zewnętrzny na szklanym podłożu. Będąc wolnym od fotorezystu, ta szklista przestrzeń zapewnia prawidłowe trzymanie próbki wewnątrz podpory, aby lepiej wspomóc przygotowanie.
   4. Pozostawić próbkę pod osłoną chemiczną na 48 godzin, aby umożliwić wysuszenie pierwszej kropli fotorezystu przez odparowanie rozpuszczalnika, osiągając stan zol-żel.
2. Drugie rzucanie kropli (Rysunek 1A)
   1. Gdy pierwsza kropla fotorezystu osiągnie stan zol-żel (krok 1.1.4.), odwróć próbkę do góry nogami, odsłaniając czystą powierzchnię.
   2. Umieść próbkę na uchwycie wsporczym, podnosząc z ziemi pierwszą odlewaną powierzchnię.
   3. Umieść drugą kroplę 46 μl ciekłego fotorezystu na czystej powierzchni szkła, pozostawiając zewnętrzny pierścień, jak również w kroku 1.1.3.
   4. Pozostawić próbkę pod maską chemiczną na co najmniej 48 godzin, pozwalając rozpuszczalnikowi odparować.
      UWAGA: Po 4-6 dniach podwójnie odlana próbka jest gotowa do użycia dla 2PP ( Rysunek 1B). Od teraz zwracaj uwagę, aby nie wystawiać próbki na działanie światła otoczenia ze względu na materiał światłoczuły. Ekspozycja na światło degraduje fotorezyst.

2. Polimeryzacja dwufotonowa (2PP) mikrostruktur

1. Ustawienie wyrównania (Rysunek 2)
   1. Włącz femtosekundowe źródło lasera bliskiej podczerwieni (długość fali 1030 nm, 1 MHz, przy minimalnym czasie trwania impulsu = 230 fs).
      UWAGA: Ustaw parametry lasera, takie jak szerokość impulsu i częstotliwość powtarzania.
   2. Ustaw ścieżkę optyczną wiązki laserowej, aż dotrze do obiektywu mikroskopu, przez szereg układów optycznych i luster zamontowanych na kinematycznych mocowaniach zwierciadła. Iteracyjnie obracaj lustra, aby wyśrodkować wiązkę w otworach wyrównania bliskiej podczerwieni (NIR).
      UWAGA: Odległość robocza obiektywu mikroskopu powinna być większa niż całkowita wysokość końcowego urządzenia, które ma być wyprodukowane (wysokość soczewki + grubość szkiełka nakrywkowego + wysokość mikrorusztowania). Otwory otworkowe NIR są odpowiednio zaprojektowane, aby uprościć wyrównanie wiązek podczerwieni. Zapewnia to precyzyjne wyrównanie wiązki wzdłuż ścieżki optycznej, przechodząc przez takie elementy, jak płytka półfalowa, ekspander wiązki i zwierciadło dichroiczne. Aby automatycznie sterować mocą lasera, wiązka przechodzi przez polaryzator poziomy i płytkę półfalową, a druga jest zamontowana na zmotoryzowanym rotatorze. W razie potrzeby wiązka może przejść przez ekspander wiązki, aby zwiększyć średnicę wiązki i wypełnić tylne wejście do obiektywu.
   3. Skieruj wiązkę laserową prostopadle do uchwytu próbki, wyrównując ją za pomocą centrowania odbicia wstecznego.
   4. Zamontuj obiektyw mikroskopu o dużej odległości roboczej na dedykowanym wsporniku na końcu ścieżki optycznej w pobliżu próbki (Rysunek 2).
      UWAGA: Kamera CCD jest zamontowana nad zwierciadłem dichroicznym ustawionym w linii ustawionej względem osi optycznej obiektywu w celu monitorowania procesu produkcyjnego. Pozwoli to zobaczyć punkt skupienia lasera i spolimeryzowane struktury.
2. Przykładowy montaż
   1. Przymocować (za pomocą taśmy) podwójnie upuszczone szklane szkiełko nakrywkowe do uchwytu próbki zamontowanego na stolikach do tłumaczenia. Zamontuj próbkę tak, aby druga osadzona kropla była skierowana w dół.
      UWAGA: Uchwyt na próbkę ma centralny otwór, w którym próbka może być zawieszona na stoliku naziemnym⁵. Uchwyt jest podłączony do mechanicznego systemu gimbala, który jest przykręcony do stolika translacyjnego X, Y w celu ruchu próbki.
   2. Wyśrodkuj próbkę ręcznie za pomocą zamontowanego obiektywu mikroskopu.
3. Centrowanie próbki
   1. Ustaw moc lasera na minimalną wartość wystarczającą do zobaczenia odbicia wiązki w oprogramowaniu kamery CCD (około 5 mW).
      UWAGA: Zmierz moc lasera w tylnej źrenicy obiektywu (transmisja obiektywu używana w tym protokole wynosi 70% przy długości fali 1030 nm).
   2. Włącz oprogramowanie interfejsu operatora dla sterownika ruchu i kamery CCD.
   3. Skoncentruj wiązkę lasera na górnej powierzchni pierwszej kropli fotorezystu.
   4. Podążając za zakrzywionym profilem kropli, znajdź krawędzie próbki wzdłuż kierunków X i Y. Ustaw środek kropli jako odniesienie do zera bezwzględnego za pomocą software.
      UWAGA: Taśma używana do mocowania próbki odgrywa rolę w wykrywaniu krawędzi poprzez modyfikację współczynnika załamania, a tym samym odbicia wiązki.
4. Kompensacja wychylenia próbki
   1. W środku próbki skoncentruj wiązkę lasera na powierzchni styku między górną powierzchnią szkiełka nakrywkowego a podstawą pierwszej kropli fotorezystu. Ustaw go jako odniesienie zerowe na osi Z.
   2. Biorąc pod uwagę średnicę próbki, przesunąć do pozycji krawędziowej (dla szkiełka nakrywkowego 12 mm jest to ~ - 4 mm) w kierunku ujemnym osi X. W tej pozycji skoncentruj powierzchnię styku (między szkłem a górnym spadkiem fotorezystu) i ustaw ją jako odniesienie do zera bezwzględnego wzdłuż kierunku pionowego Z.
   3. Przesunąć do pozycji krawędzi w dodatnim kierunku osi X (dla szkiełka nakrywkowego 12 mm jest to ~ + 4 mm). Znajdź tutaj powierzchnię interfejsu, przesuwając cel wzdłuż kierunku pionowego Z.
   4. Przechylić próbkę, aby skorygować odchylenie w kierunku Z między pozycjami ujemną i dodatnią wzdłuż osi X. Użyj regulowanego mocowania kinematycznego do przechylania uchwytu próbki (jak gimbal).
   5. Powtarzać kroki 2.4.2-2.4.4 iteracyjnie, aż próbka zostanie całkowicie zrównoważona na osi X.
   6. Wykonaj tę samą procedurę, która została opisana w krokach 2.4.2-2.4.5 wzdłuż kierunku Y.
   7. Gdy próbka jest idealnie zrównoważona zarówno na osi płaskiej X, jak i Y, wróć do pozycji środkowej i skoncentruj się w tym miejscu na granicy faz między szkłem a fotorezystem.
   8. Ustaw nową wartość Z fokusu jako odniesienie na osi Z (Z = 0).
      UWAGA: Procedura opisana w kroku 2.4 ma na celu zapewnienie idealnej prostopadłości między wiązką lasera a powierzchnią szkiełka nakrywkowego, aby zapewnić idealne zakotwiczenie struktur 2PP, które zostaną później wyprodukowane. Począwszy od punktu 2.4, wszystkie zabiegi muszą być wykonywane zgodnie ze współczynnikiem załamania światła. Dlatego w razie potrzeby dodaj medium dopasowania indeksu celu.
5. Mikrorusztowania 2PP na dolnym spadku fotorezystu
   1. Włącz czerwony system oświetlenia LED, aby monitorować proces polimeryzacji w czasie rzeczywistym.
      UWAGA: Oświetlenie diodą elektroluminescencyjną z czerwonym światłem jest umieszczone pod złożonym uchwytem na próbkę - gimbalem ( Rysunek 2). To oświetlenie pozwoli zobaczyć spolimeryzowaną objętość podczas procesu 2PP. Fotorezyst jest wrażliwy na krótsze fale (światło widzialne); w związku z tym czerwone światło LED nie będzie zakłócać próbki.
   2. Przy wyłączonym laserze przesuń obiektyw wzdłuż kierunku Z poniżej szkiełka nakrywkowego, aby znaleźć drugą powierzchnię interfejsu między dolną powierzchnią szkła a podstawą dolnego spadku oporu.
      UWAGA: Drugi interfejs zostanie znaleziony przy wartości Z w przybliżeniu równej grubości szkiełka nakrywkowego (170 μm).
   3. Zwiększ moc lasera do 100 mW, aby umożliwić polimeryzację dwufotonową w dolnym spadku.
   4. Dostosuj pozycję ogniskowej (zwiększając Z), aby znaleźć drugi interfejs, polimeryzując prostą strukturę odniesienia.
      UWAGA: Przykładem struktury referencyjnej jest linia polimeryzowana o długości 50 μm.
   5. Ustaw pierwszą pozycję ogniskowej, w której zachodzi polimeryzacja struktury odniesienia, jako odniesienie zerowe wzdłuż kierunku pionowego (oś Z).
      UWAGA: Odniesienie w kroku 2.5.5 podkreśla płaszczyznę podstawy dla 2PP mikrorusztowań.
   6. Ustaw moce polimeryzacji (~ 100-200 mW) i uruchom kod maszynowy jako program sterowany numerycznie (CNC) w celu prawidłowego ruchu etapów translacyjnych w celu wytworzenia pożądanej struktury 3D ( Rysunek 3A).
      UWAGA: Program CNC składa się z zestawu współrzędnych przestrzennych (x, y, z), które określają, w którą stronę poruszają się platformy translacyjne, aby wytworzyć ostateczny obiekt 3D. Na te zdolności polimeryzacji będzie miała wpływ wysokość górnego spadku i specyficzne warunki eksperymentalne (fotorezyst, laser i system ruchu).
6. Mikrosoczewki 2PP na górnym spadku fotorezystu
   1. Poruszając się wzdłuż osi Z, wróć do pierwszego interfejsu między górną powierzchnią szkła a górnym spadkiem fotorezystu (krok 2.4.8). Utrzymuj ten sam płaski układ odniesienia (współrzędne X, Y), aby zapewnić idealne wyrównanie mikrosoczewek 2PP z już wyprodukowanymi mikrostrukturami.
   2. Znajdź interfejs, polimeryzując prostą strukturę referencyjną.
      UWAGA: Użyj tego samego procesu, który opisano w kroku 2.5.4, ale różni się tylko kierunkiem ruchu pionowego.
   3. Ustaw pierwszą linię polimeryzacji jako odniesienie zerowe wzdłuż kierunku pionowego (oś Z).
      UWAGA: Odniesienie w kroku 2.6.3 podkreśla płaszczyznę uziemienia dla 2PP mikrosoczewek.
   4. Ustaw parametry produkcyjne dla 2PP konturu żądanej mikrosoczewki (Rysunek 3B). Wiązka laserowa opisuje kołową trajektorię zmniejszającą się w celu ciągłej polimeryzacji zewnętrznej powierzchni pojedynczej mikrosoczewki. Ustaw parametry kreskowania i cięcia odpowiednio wzdłuż kierunków X i Z.
      UWAGA: Konstrukcja soczewek powinna uwzględniać efektywną ogniskową pożądaną przez użytkownika. Z reguły powinna to być wartość większa niż grubość szkiełka nakrywkowego, co powinno pozwolić na zobrazowanie całego atlasu. Zalecana jest wstępna symulacja obliczeniowa końcowego układu optycznego.
   5. Ustaw moc polimeryzacji (~ 15-20 mW) i uruchom program, który kieruje ruchem etapów translacyjnych.
      UWAGA: Na te moce polimeryzacji będzie miała wpływ wysokość górnego spadku, specyficzne warunki eksperymentalne i konstrukcja pożądanej mikrosoczewki (Rysunek 3B). Rysunek 4 przedstawia reprezentatywny przykład mikrosoczewki parabolicznej z funkcją parametryczną, która opisuje profil mikrosoczewki i jej główne cechy geometryczne.

3. Opracowanie próbki

1. Usuń próbkę z eksperymentalnego zestawu produkcyjnego.
   1. Gdy laser jest wyłączony, wyłącz oś translacyjną X, Y i Z i wyjmij uchwyt.
   2. Odkleić taśmę klejącą i odłączyć próbkę od uchwytu.
      UWAGA: Przed opracowaniem próbki należy zwrócić uwagę, aby nie wystawiać próbki na działanie światła otoczenia ze względu na materiał światłoczuły. Ekspozycja na światło usieciowałaby całą ilość fotorezystu.
2. Przykładowy rozwój (Rysunek 5A)
   1. Umieść próbkę w odpowiednim podporze, aby podnieść ją z ziemi i przytrzymaj w pozycji poziomej.
      UWAGA: Ten uchwyt na próbki jest niestandardowym stojakiem na próbki wydrukowanym w SLA, odpowiednio zaprojektowanym tak, aby wystawić obie prototypowe powierzchnie 2PP na działanie rozwiązania rozwijającego⁵.
   2. Przygotować zlewkę o pojemności 50 ml i umieścić w niej podpórkę do przenoszenia próbki.
      UWAGA: Zwróć uwagę na utrzymanie mikrosoczewek 2PP na górnej powierzchni, aby uniknąć deformacji strukturalnych podczas rozwoju ze względu na ich niespolimeryzowany rdzeń wewnętrzny.
   3. Napełnić zlewkę ~20 ml roztworu rozwijającego, całkowicie pokrywając próbkę. Roztwór składa się z 50% (v/v) roztworu 2-pentanonu i 50% (v/v) alkoholu izopropylowego.
   4. Pozostawić próbkę w roztworze rozwijającym się na 45 minut.
3. Mycie próbek
   1. Podnieś wsparcie z rozwijającego się rozwiązania.
   2. Dotykając go ręcznie lub używając pęsety, pobierz próbkę i dokładnie umyj ją kilkoma kroplami alkoholu izopropylowego.
   3. Osuszyć obie wykonane powierzchnie szkiełka nakrywkowego delikatnym strumieniem azotu (w temperaturze pokojowej).
      UWAGA: Wszystkie procedury opisane w krokach 3.2-3.3 są wykonywane pod wyciągiem chemicznym.

4. Próbka promieniowania UV

1. Ekspozycja mikrosoczewek na promieniowanie UV (długość fali 385 nm) (Rysunek 5B)
   1. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na uchwycie na próbkę zawieszonym na płaszczyźnie uziemienia. Połóż próbkę mikrosoczewkami skierowanymi w dół.
      UWAGA: Uchwyt próbki ma centralny otwór do umieszczenia próbki zawieszonej na stopniu gruntowym, zachowując integralność mikrostruktury na dolnej powierzchni.
   2. Przygotuj lampę UV o długości fali 385 nm.
   3. Umieścić próbkę pod źródłem promieniowania UV prostopadle do powierzchni szkiełka nakrywkowego.
   4. Wystaw próbkę na działanie promieniowania UV ustawionego na 300 mW przez 120 s.
      UWAGA: Ekspozycja na promieniowanie UV następuje przechodząc przez mikrorusztowanie i szklane podłoże. W ten sposób jeszcze nie spolimeryzowany rdzeń soczewek zostanie usieciowany promieniami UV, unikając bezpośredniej i dodatkowej ekspozycji na wcześniej spolimeryzowaną powierzchnię.
   5. Ustawiając źródło UV pod kątem -45° i +45° w stosunku do normalnego położenia płaszczyzny próbki, powtórzyć krok 4.1.4.
      UWAGA: Ta trzyetapowa ekspozycja na promieniowanie UV pod różnymi kątami pozwoli na pełne usieciowanie całego niespolimeryzowanego oporu w objętości mikrosoczewek, osiągając stabilność. Jest to szczególnie ważne w przypadku szerokich mikrosoczewek.
   6. Wyjmij próbkę z uchwytu i przechowuj ją.

5. Charakterystyka morfologiczna

1. Akwizycja za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) (Rysunek 6)
   1. Przygotuj stację SEM. Przymocuj kawałek taśmy węglowej do uchwytu SEM, aby uzyskać próbkę przylegania.
   2. Umieścić szklaną próbkę na uchwycie pod kątem 45° w stosunku do orientacji kamery SEM. Zwróć uwagę na umieszczenie próbki w pustym miejscu na szkiełku nakrywkowym, aby zachować integralność struktury (Rysunek 6B).
   3. Powtórz akwizycję, jak w kroku 5.1.2 dla obu powierzchni szklanego szkiełka nakrywkowego, aby zebrać obrazy 3D SEM mikrorusztowań i mikrosoczewek (Rysunek 6A,C).
   4. Ostrożnie odłącz próbkę od taśmy węglowej i przechowuj ją w zakrytym pudełku.

Results

Dostarczono protokół produkcji dwustronnego wszczepialnego urządzenia mikrostrukturalnego, zawierającego system optyczny i odniesienie do analizy tkankowej. Proces ten wykorzystuje dwufotonową polimeryzację laserową do wytwarzania mikrostruktur 3D i mikrooptyki po przeciwnej stronie tego samego podłoża. Zastosowanie obiektywu o dużej odległości roboczej pozwala na wykonanie obu konstrukcji bez odwracania podłoża, oszczędzając etap ponownego wyrównywania i gwarantując idealne wyrównanie między oboma komponentami. Urządzenie to umożliwi zaawansowane obrazowanie in situ, umożliwiając korekcję aberracji optycznych i wielokrotne obserwacje tego samego obszaru, dzięki mikrooptyce i mikrofabrykowanemu układowi odniesienia. Rysunek 1 pokazuje procedurę przygotowania obu powierzchni podłoża nośnego do późniejszej produkcji. Szkic układu eksperymentalnego użytego do mikrofabrykacji obu powierzchni próbki jest przedstawiony na Rysunek 2. Obraz przedstawia również złożony uchwyt obiektywu na próbkę, przy czym pierwszy skupia się na próbce, która jest oświetlona przez system oświetlenia czerwoną diodą LED, umożliwiający monitorowanie produkcji w czasie rzeczywistym za pomocą wizji maszynowej. Rysunek 3 jakościowo pokazuje elastyczność protokołu w umożliwianiu mikroprodukcji różnych projektów mikro-rusztowań i mikrosoczewek. Rysunek 4 przedstawia funkcję zwisu używaną do projektowania mikrosoczewek o asferycznym profilu parabolicznym oraz szkic reprezentatywnego projektu skorelowanego z jego głównymi cechami jako przykład. W Rysunek 5, przedstawione są etapy rozwoju próbki i ekspozycji na promieniowanie UV niezbędne do pełnego usieciowania całej objętości mikrosoczewek. Na koniec, Rysunek 6 pokazuje przykłady wyników mikrofabrykacji. Przedstawiona procedura pozwala na polimeryzację mikrostruktur 3D obu powierzchni tego samego urządzenia, zapewniając doskonałą rozdzielczość i stabilność. Na koniec, Rysunek 7 to ilustracja przedstawiająca ogólny przebieg działania protokołu, kończąca się na Rysunek 8, który pokazuje przykład końcowego zastosowania proponowanego urządzenia, tj. obrazowania in vitro komórek hodowanych wewnątrz mikrorusztowania.

Rysunek 1: Protokół przygotowania próbki. Ten obraz przedstawia szkic dwuetapowego procesu odlewania kroplowego fotorezystu na podtrzymującym okrągłym szklanym szkiełku nakrywkowym (A). Po prawej stronie przedstawiono zdjęcie próbki z wysuszonym fotorezystem osadzonym po obu stronach (B). Próbka jest podtrzymywana przez posiadacza próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Konfiguracja do produkcji dwufotonowej polimeryzacji laserowej (2PP). Po prawej stronie przedstawiono reprezentatywny schemat konfiguracji produkcji. Głównymi elementami konfiguracji są femtosekundowe źródło lasera o długości fali 1030 nm, minimalnej szerokości impulsu 230 fs i częstotliwości powtarzania 1 MHz), stolik do kontroli mocy, ekspander wiązki, zwierciadło dichroiczne i obiektyw mikroskopowy o dużej aperturze numerycznej (100x, NA 1,1). Kamera CCD jest zamontowana nad zwierciadłem dichroicznym ustawionym w jednej linii z osią optyczną obiektywu w celu monitorowania procesu produkcyjnego. Po lewej stronie znajduje się powiększenie, z zoomem końcowej części zestawu optycznego pokazującym zdjęcie złożonego obiektywu/uchwytu na próbkę/systemu oświetlenia LED dla widzenia maszynowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wiele projektów mikrostruktur 3D i mikrosoczewek. Rysunek przedstawia różne przykłady (A) mikrorusztowań i (B) mikrosoczewek, które można wytworzyć przy użyciu proponowanej procedury. Wysoka elastyczność protokołu umożliwia wytwarzanie mikrostruktur o różnych cechach geometrycznych, rozdzielczości, wymiarach i objętości, co świadczy o jego wszechstronności. Skala szarości w panelu (B) ma na celu podkreślenie spadku mocy lasera i prędkości pisania, aby wygładzić powierzchnię i zminimalizować chropowatość powierzchni. Precyzyjne parametry produkcji są ustalane zgodnie z konkretną konstrukcją mikrosoczewki. Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przykład spreparowanej mikrosoczewki. Panel przedstawia reprezentatywny przykład asferycznego profilu parabolicznego, podkreślając parametryczny opis zakrzywionej powierzchni soczewki jako funkcji wklęsłości z(r) (A). Tutaj H_tot to grubość soczewki, r to współrzędna promieniowa, a f_n to ogniskowa parabolicznej soczewki refrakcyjnej, która różni się od jej efektywnej ogniskowej. Moc dioptrii zależy od współczynnika załamania światła soczewki i tego, jak różni się on od otaczającego ośrodka. Po prawej stronie szkic projektu podkreśla dwie główne płaszczyzny leżące w wierzchołku V1 i kilka μm nad powierzchnią 2 (Π1 i Π2, linie przerywane) (B). Szkic przedstawia pojedynczą asferyczną mikrosoczewkę paraboliczną o średnicy 600 μm, wykonaną na podłożu szklanym N-BK7 (o grubości 170 μm). (C) podkreśla parametry geometryczne asferycznej soczewki parabolicznej mikrowykonanej z fotorezystu SZ2080. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Protokoły dotyczące badania próbek i ekspozycji na promieniowanie UV. Na zdjęciu zaznaczono sfabrykowaną próbkę nasączoną roztworem deweloperskim jako szkic (A). Próbka jest podnoszona do wnętrza roztworu przez uchwyt, co pozwala na prawidłowy rozwój obu stron próbki i uzyskanie dwustronnego urządzenia mikrostrukturalnego. Po prawej stronie przedstawiono obraz konfiguracji konfiguracji naświetlania próbki promieniami UV (B). Na zdjęciu lampa UV umieszczona prostopadle do powierzchni próbki. Jak stwierdzono w karcie katalogowej lampy UV, aktualna odległość między lampą a próbką jest zgodna z odległością roboczą lampy. Próbka poddana promieniowaniu UV i obsługiwana przez uchwyt próbki jest podświetlona na powiększonym obrazie po prawej stronie. Podziałka: 12 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) nabywa reprezentatywne wyniki produkcji. Panel przedstawia dwustronnie wytworzone urządzenie poprzez widok boczny (B) i dwa reprezentatywne wyniki sfabrykowanych mikrosoczewek (A) i mikrorusztowania (C) za pomocą obrazów SEM. Dwie konstrukcje leżące na różnych powierzchniach tego samego szklanego podłoża są wyraźnie widoczne na centralnym zdjęciu (B). Mikrosoczewki są reprezentowane na dolnej powierzchni szkła, podczas gdy mikrorusztowania znajdują się na górnej. Obraz SEM wytworzonej mikrosoczewki o sferycznej konstrukcji jest pokazany po prawej stronie jako przykład stabilnego i płynnego wyniku produkcji (A). Po lewej stronie na zdjęciu przedstawiono reprezentatywny wynik porowatego mikrorusztowania 2PP o dowolnej geometrii (C). Podziałka skali: (A,C) - 50 μm; (B) - 1 cm. Proszę kliknąć tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Schemat ideowy przepływu pracy protokołu i zastosowania urządzenia: Rysunek przedstawia ogólny proces produkcyjny naszkicowany krok po kroku. Rozpoczyna się od przygotowania próbki przez sekwencyjne odlewanie kroplowe fotorezystu na obu powierzchniach szklanego podłoża (1). Gdy fotorezystor osiągnie stan zol-żel, próbka jest gotowa do wytworzenia przez dwufotonową polimeryzację laserową (2). W związku z tym obie krople fotorezystu są naświetlane sekwencyjnie, najpierw mikrostrukturyzując mikrostruktury, a następnie mikrosoczewki. Następnie dwustronnie wytworzone mikropodłoże poddawane jest procedurze wywoływania w celu usunięcia całego niespolimeryzowanego oporu otaczającego konstrukty (3). W tym celu próbkę moczy się w roztworze alkoholowym, a następnie delikatnie suszy. Następuje naświetlanie próbki promieniowaniem UV, przechodząc przez szkliste podłoże w celu całkowitego usieciowania niespolimeryzowanego wewnętrznego rdzenia mikrosoczewek (4). Na koniec przeprowadzana jest kontrola jakości mikrowytworzonej próbki za pomocą akwizycji za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) w celu morfologicznego scharakteryzowania mikrostruktur (5). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Potencjalne zastosowanie okna obrazowania mikrostrukturalnego. Po lewej stronie reprezentatywny szkic ilustruje układ optyczny, na który składa się urządzenie sprzężone z zewnętrznym obiektywem mikroskopu w standardowym systemie skanowania (A). Jest to tak zwana konfiguracja wirtualna stosowana w tym przypadku do obrazowania wzrostu żywych komórek wewnątrz mikrorusztowania. Fibroblasty fluorescencyjne (oznaczone białkiem czerwonej fluorescencji (RFP)) zostały wysiane na szklanej powierzchni urządzenia, na której znajdują się mikrostruktury 3D. Konfokalne obrazy fluorescencyjne komórek zostały wykonane w płaszczyźnie ogniskowej szkiełka nakrywkowego (B, zielony hashtag), a więc przy jedynym użyciu obiektywu zewnętrznego, oraz przez pojedynczą mikrosoczewkę w płaszczyźnie ogniskowej (A, fioletowy hashtag). Jądra komórkowe są widoczne na niebiesko (barwienie Hoechsta), a cytoszkielet na czerwono (RFP). Podziałka skali: (B) - 100 μm; (C) - 50 μm. Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Aby zapewnić dokładne zobrazowanie żądanego obszaru ^3,6 w oknie mikrostrukturalnym, konieczne jest precyzyjne ustawienie dwóch struktur (mikrorusztowania i mikrosoczewek). Stanowi to główne wyzwanie proponowanego protokołu, ponieważ wysoka rozdzielczość 2PP jest ściśle związana z ograniczeniem głębokości produkcji ^3,6. Odwrócenie próbki podczas produkcji w celu sekwencyjnego wystawienia obu powierzchni na działanie wiązki laserowej może być opcją, ale komplikuje ponowne wyrównanie i jest czasochłonne⁵. Wprowadziłoby to również trudności w znalezieniu tego samego systemu odniesienia, a tym samym zagroziłoby dobremu dopasowaniu między elementami mikrooptycznymi a mikrorusztowaniami. Prowadzenie całego procesu w sposób ciągły bez demontażu próbki utrzymuje spójny system odniesienia, ułatwiając w ten sposób i gwarantując dokładne wyrównanie struktur. W tym celu używamy obiektywu o dużym zasięgu roboczym (2,5 mm), który dzięki dużej aperturze numerycznej utrzymuje dobrą rozdzielczość (krok 1.1). Takie podejście również znacznie skraca czas wytwarzania, ponieważ oszczędza wyrównanie próbki po jej odwróceniu³. Ponadto obchodzenie się z próbkami stanowi kolejne wyzwanie ze względu na ich niewielkie rozmiary i kruchość, co sprawia, że manipulacja i precyzyjne wyrównanie są jeszcze bardziej krytyczne.

W procesach 2PP niezbędne jest szerokie badanie procesu produkcyjnego w celu ustalenia kluczowych parametrów, takich jak optymalna długość fali lasera, szerokość impulsu, a także moce lasera i ruchy sceniczne ^9,10,11. W związku z tym przeprowadzono kompleksową charakterystykę procesu 2PP, nawet biorąc pod uwagę różne konfiguracje układu eksperymentalnego, aby najpierw zapewnić wysoce stabilne struktury 3D o wysokiej rozdzielczości ze szczegółami w skali komórkowej do zastosowań biologicznych, 27,28,29,30. Dodatkowo, zminimalizowanie chropowatości powierzchni wszczepialnych mikrosoczewek miało kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości mikrooptyki o pożądanych cechach optycznych, zmniejszając w ten sposób odpowiedź immunologiczną na implant 19,22,31. W związku z tym wyzwanie procesu polega na dostosowaniu parametrów, takich jak moc i szerokość impulsu, w oparciu o czynniki eksperymentalne, takie jak współczynnik załamania światła i objętość materiału światłoczułego, warunki środowiskowe (np. wilgotność i temperatura) oraz wydajność lasera. Wymagana była również obszerna charakterystyka, aby czas i intensywność ekspozycji na promieniowanie UV w pełni usieciować całą objętość mikrosoczewek, zapewniając ich stabilność. Ustawienia te muszą być dostosowane do źródła promieniowania UV, odległości roboczej i objętości właściwej elementu, który ma być polimeryzowany promieniami UV.

Podstawowym ograniczeniem procesu 2PP jest jego niska przepustowość ze względu na niezwykle wysoką rozdzielczość, jaką oferuje. Biorąc to pod uwagę, cechy spolimeryzowane są bardzo małe, od setek nanometrów do kilku mikrometrów ^9,26. W związku z tym czas produkcji znacznie się wydłuża przy produkcji konstrukcji w skali setek mikrometrów, które są stosunkowo duże jak na standardy 2PP, zwłaszcza w przypadku konstrukcji wielkogabarytowych. W efekcie tworzenie zintegrowanych urządzeń z wieloma konstrukcjami o tak dużych gabarytach może zająć kilka godzin. W tym kontekście hybrydowy protokół UV-2PP zaproponowany do produkcji mikrosoczewek przyczynił się do skrócenia czasu produkcji pojedynczej mikrosoczewki o 98% w porównaniu z 2 warstwami soczewek w całej ich objętości. Pozwoliło to na zwiększenie precyzji skanowania 2PP zewnętrznej powłoki mikrosoczewki, zmniejszając chropowatość powierzchni przy jednoczesnym uzyskaniu powłoki mikrosoczewki wystarczająco grubej, aby zapewnić stabilność soczewki, a wszystko to w znośnym czasie produkcji. Aby jeszcze bardziej przyspieszyć ten proces, w przyszłości zostanie zaproponowane podejście równoległe, które umożliwi jednoczesny zapis wielu struktur³². Strategia ta polegałaby na podziale wiązki laserowej na wiele wiązek w celu stworzenia kilku punktów ogniskowych, co umożliwiłoby równoległą produkcję, a tym samym znacznie skróciłoby całkowity czas produkcji.

W przeciwieństwie do najpopularniejszych technik miękkiej litografii, jedną z kluczowych zalet 2PP jest to, że jest to metoda wytwarzania przyrostowego bez maski, która umożliwia wytwarzanie dowolnych struktur w objętości materiału światłoczułego¹¹. Ta zdolność pozwala na produkcję złożonych trójwymiarowych i porowatych struktur o wysokim potencjale dostosowywania. Ponadto, w oparciu o zasadę absorpcji nieliniowej, 2PP pozwala osiągnąć rozdzielczość poniżej granicy dyfrakcji, co jest nieosiągalne przy użyciu standardowych technik druku 3D lub modelowania osadzania topionego (FDM), na przykład³³. Jest to szczególnie cenne przy tworzeniu porowatych rusztowań 3D z funkcjami w skali komórkowej w celu wspierania wzrostu komórek, rekrutacji i integracji tkanek.

Produkcja mikrostrukturalnych urządzeń do implantacji ze zintegrowaną optyką w ramach proponowanego tutaj procesu może znacząco wpłynąć na zastosowania obejmujące mechanobiologię, modelowanie chorób in vitro i inżynierię tkankową (ryc. 7 i ryc. 8). Przedstawiony protokół umożliwia wytworzenie wysokiej jakości urządzenia technicznego wyposażonego w mikrostruktury wspomagające integrację tkankową, a jednocześnie pełniące funkcję punktów odniesienia do obrazowania in vivo . Dodatkowo, te odpowiednio zaprojektowane mikrosoczewki usprawniły zaawansowane obrazowanie nieliniowe, korygując aberracje sferyczne spowodowane przez tkankę otaczającą implant⁴. Wszechstronność procesu pozwala nam bowiem na dostosowanie konstrukcji urządzenia, jak na przykład tworzenie rusztowań i konstrukcji referencyjnych o geometrii zoptymalizowanej pod kątem konkretnych zastosowań, pomagając zarówno w rekonstrukcjach 3D, jak i korekcji aberracji obrazowych w post-processingu. Wreszcie, dostosowanie konstrukcji mikrosoczewek w oparciu o tkankowe współczynniki załamania światła usprawnia obrazowanie specyficzne dla aplikacji, skutecznie tworząc soczewkę optyczną in situ w urządzeniu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beam Expander	Thorlabs, Niemcy	GBE03-C	3X Achromatyczny ekspander wiązki Galileusza, pokryty AR: 650 - 1050 nm (GBE03-C)
Sterowany zmotoryzowany rotator	Aerotech, USA	MPS50GR	MPS50GR-TTM-G80-DC-LMO-PLOTS
Szkiełka nakrywkowe	Menzel-Glaser, Niemcy	CB00120RA1	okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm i grubości od 170 do 230 &mikro; m (#1.5)
Rozwiązanie rozwojowe	Sigma Aldrich, Stany Zjednoczone.	Roztwór niestandardowy	50% v/v 2-pentanon, 50% v/v roztwór alkoholu izopropylowego
Lustro dichroiczne (1030 nm)	Eskma Optics, Litwa	810-1030D	Ø 1-calowe krótkoprzepustowe zwierciadło dichroiczne, 805 nm Cutoff
Laser femtosekundowy	Satsuma, amplituda	Satsuma Series	Femtosecond Ytterbium (Yb) laser światłowodowy (λ = 1030nm, 1MHz, przy minimalnym czasie trwania impulsu = 230 fs,
Gimbal	Thorlabs, Niemcy	GMB100	Gimbal Mounts 100
Płyta półfalowa	Thorlabs, Niemcy	AHWP05M-980	λ/2 przy 690-1200 nm (AHWP05M-980)
Widzenie maszynowe	Thorlabs, Niemcy	DCU223M/DCU223C	Kamera CCD  zamontowana za zwierciadłem dichroicznym
Obiektyw mikroskopowy	Nikon, Japonia	MRD71100	plan CFI 100 razy; Obiektyw C WI z aperturą numeryczną  1.1
System ruchu	Aerotech, USA	ANT130-035-L-ZS; ANT95-50-XY	ANT130-035-L-ZS; ANT95-50-XY
NIR Tarcze otworkowe do wyrównywania	, Niemcy	VRC1D1	i Oslash; 1-calowy dysk wykonany z wolno blaknącego materiału fosforowego z otworem 1,5 mm pośrodku
Photoresist SZ2080	Forth, Grecja	SZ2080	Fotorezystor utwardzany promieniami UV SZ2080 + Irgacure-369 Pipeta fotoinizatora
	Gilson, USA	F123615	Pipetman 100G
(SEM)	Phenom World, Holandia	Phenom Pro	PHENOM PRO
Oprogramowanie CNC	Aerotech, USA	A3200	Automation 3200 Interfejs operatora CNC Lampa
UV	Hamamatsu, Japonia	LC-L1V3	LIGHTNINGCURE, LC-L1V3