Zoptymalizowany przepływ pracy dla iteracyjnego wybielania rozszerza obrazowanie multipleksowe wysoce autofluorescencyjnych próbek klinicznych

Summary

Zastosowanie taniej, wszechstronnej techniki fotonapromieniania manualną metodą IBEX pozwala na optymalne obrazowanie tkanki ludzkiej ze znaczną natywną autofluorescencją. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób uzyskać multipleksowane obrazy całych preparatów z archiwalnych próbek klinicznych przy użyciu odwróconego mikroskopu, powszechnie dostępnych odczynników i oprogramowania typu open source do wyrównywania i przetwarzania obrazu.

Abstract

Częstość występowania chorób płuc spowodowanych przez prątki niegruźlicze (NTM) wzrasta na całym świecie. Chociaż choroba płuc wywołana NTM często objawia się rozstrzeniem oskrzeli, guzkami płuc i chorobą jamy ustnej, odpowiedź gospodarza związana z tymi odrębnymi wzorcami uszkodzeń płuc nie została dobrze scharakteryzowana in situ. Staraliśmy się ocenić mechanizmy patologii wywołanej przez NTM, przeprowadzając głęboką analizę fenotypową populacji komórek odpornościowych w tkance płucnej od osób z chorobą NTM w porównaniu ze złotym standardem zapalenia ziarniniakowego, gruźliczej (TB) choroby płuc.

Utrwalone formaliną, zatopione w parafinie (FFPE) bloki płuc od pacjentów z rozsianym NTM, płucnym NTM lub gruźlicą płuc podzielono na sekcje i wybarwiono zgodnie ze zmodyfikowaną wersją metody obrazowania Iterative Bleaching Extends multi-pleXity (IBEX). Optymalizacja metody IBEX była najpierw konieczna, aby rozwiązać problem znaczącej endogennej fluorescencji skrawków płuc ze względu na dużą gęstość kolagenu, elastyny i erytrocytów natywnych dla tkanki płucnej, która jest pogarszana przez zachowanie FFPE i wiek bloków FFPE. W tym protokole szczegółowo opisujemy protokół fotonapromieniania i zmodyfikowaną metodę odzyskiwania antygenu, która zmniejsza autofluorescencję klinicznie zarchiwizowanych próbek.

Ponadto zapewniamy wskazówki dotyczące projektowania paneli przeciwciał, w tym typowych wyzwań, takich jak reaktywność krzyżowa, utrata epitopów po napromieniowaniu fotoelektrycznym, nakładanie się widm między sąsiednimi fluoroforami i niski stosunek sygnału do szumu dla niektórych celów. Aby ułatwić wydajne obrazowanie całych skrawków tkanki płucnej, preparaty zobrazowano za pomocą mikroskopu szerokokątnego i poddano obróbce końcowej za pomocą oprogramowania typu open source w celu poprawy jakości obrazu. Łącznie ten przepływ pracy odpowiada na krytyczną potrzebę, dokumentując sposób uzyskiwania wysoce multipleksowanych obrazów całych slajdów o wysokiej rozdzielczości z trudnych próbek przy użyciu powszechnie dostępnego oprzyrządowania i odczynników. Poza ilościowym obrazowaniem próbek klinicznych, techniki te można stosować do różnych typów próbek w celu wyeliminowania zarówno endogennych, jak i egzogennych źródeł fluorescencji.

Introduction

Gruźlica (TB) jest jedną z głównych przyczyn zgonów, a każdego roku z powodu zakażenia gruźlicą umiera około 1,3 miliona osób¹. Chociaż nie jest tak śmiertelna jak gruźlica, w ostatnich latach nastąpił znaczny wzrost zakażeń płuc i wynikających z nich chorób wywoływanych przez prątki niegruźlicze (NTM)². Na poziomie tkanek odpowiedź immunologiczna gospodarza na zakażenie Mycobacterium tuberculosis (Mtb) została dobrze zbadana i obejmuje tworzenie ziarniniaków, heterogenicznych agregatów limfocytów, komórek dendrytycznych, makrofagów i neutrofili³. Podczas gdy zapalenie ziarniniakowe jest ....

Protocol

Archiwalne sekcje autopsji i resekcji chirurgicznej tkanki płucnej pobrano zgodnie z protokołem 09-H-0172 (NCT00943514), Historia naturalna rozstrzeni oskrzeli, w Laboratorium Patologii National Institutes of Health Clinical Center. Protokół ten został zatwierdzony przez IRB, a uczestnicy wyrazili świadomą zgodę.

1. Automatyczne pobieranie antygenu

UWAGA: Deparafinowanie i pobieranie antygenu przeprowadzono przy użyciu zautomatyzowanej platformy do barwienia badawczego (ryc. 1). Wcześniejsze prace wykazały, że podejście polegające na podwójnym pobieraniu antygenu polegające na 30 m....

Results

Zaprojektowanie multipleksowanego panelu obrazowania opartego na przeciwciałach wymaga znacznego czasu, wysiłku i zasobów¹². Wyzwania te są szczególnie widoczne podczas projektowania panelu dla archiwalnych próbek FFPE z tkanek o wysokim poziomie autofluorescencji, jak opisano tutaj (Rysunek 1). Aby sprostać tym wyzwaniom, najpierw zidentyfikowaliśmy najjaśniejsze fluorofory zgodne z naszym protokołem inaktywacji barwnika (Tabela 1). Na przykład donie.......

Discussion

Kliniczna patologia płuc z gruźlicy płuc charakteryzuje się martwiczym zapaleniem ziarniniakowym. Patologia płuc NTM występuje głównie w dwóch odrębnych populacjach pacjentów z dwoma odrębnymi wzorcami patologicznymi: izolowanym uszkodzeniem płuc charakteryzującym się ziarniniakowym zapaleniem z zatarciem oskrzelików i tworzeniem się jam u osób immunokompetentnych lub rozlana choroba guzkowa wpływająca na płuca i inne narządy u osób z niedoborem odporności 13,14,15,16^<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,3% Tryton-X-100	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T8787 TGL	Rozwiązanie do blokowania bufora
1% powierzchni ciała	Sigma-Aldrich	A4503 (wersja angielska)	Rozwiązanie do blokowania bufora
1% ludzki blok BD Fc	BD Nauki biologiczne	564220	Blok Fc wymagany do blokowania bufora
Lampa LED o mocy 150 W	Amazonka	B07VH3CVSF	Źródło światła LED do fotonaświetlania tkanek
1x PBS	Gibco (firma Gibco)	10010-023	Rozwiązanie do blokowania etapów buforowania i mycia
Pojemnik do przechowywania o pojemności 20 galonów	Amazonka	B001B1C4G0	Pojemnik do procesu fotonaświetlania
Lampa LED naświetlająca RGBW o mocy 40 W	Amazonka	B08QFPJSMD	Źródło światła RGB do fotonapromieniania tkanek
Ag85B (Biblioteka Ag85B)	Księga Abcam	ab43019/NA	Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.
Aktyna alfa-mięśni gładkich DyLight 755	Novus Biologicals	NBP2-345221R/NA	Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.
Zestaw blokujący awidynę/biotynę	Księga Abcam	ab64212 powiedział:	Roztwór blokujący awidynę i biotynę
BD Cytofix/Cytoperm	BD Nauki biologiczne	554714	Rozwiązanie do utrwalania
Roztwór do usuwania wosku BOND	Leica Biosystems	NC0221076	Roztwór do deparafiniowania
Roztwór do odzyskiwania epitopów BOND 1	Leica Biosystems	NC0235529	Roztwór do odzyskiwania epitopów pH 6 na bazie cytrynianu (ER1)
Roztwór do odzyskiwania epitopów BOND 2	Leica Biosystems	NC0235530	Roztwór do odzyskiwania epitopów pH 9 na bazie EDTA (ER2)
System detekcji badań BOND	Leica Biosystems	NC0396648	Zautomatyzowany odczynnik do barwienia badań
Barwnik badawczy BOND RX	Leica Biosystems	NIE	Zautomatyzowana platforma do barwienia badawczego
Roztwór do mycia BOND	Leica Biosystems	NC0221077	Bufor do płukania
Płyta CD15	BD Nauki biologiczne	347420/AB_400298	Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Naukowy	50-0202-82/AB_11150959	Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.
CD4 Alexa Fluor 488	R& Systemy D	FAB8165G/AB_2728839	Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.
CD45 Fikoerytryna (PE)	Novus Biologicals	NBP2-34528PE/NA	Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.
CD68 iFluor 594	Caprico Biotechnologie	1064135/AB_2892745	Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.
Osioł anty-kozy IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Fisher Naukowy	Nr kat. A32814/AB_2762838	Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.
Ośli anty-mysz IgG Alexa Fluor Plus AF647	Thermo Fisher Naukowy	A32787/ AB_2762830	Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.
Oślica przeciw myszom IgM Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	715-545-020/AB_2340844	Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.
Osioł anty-królik IgG Alexa Fluor Plus AF555	Thermo Fisher Naukowy	Nr kat. A32794/AB_2762834	Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.
System barwienia EasyDip	Zaopatrzenie dla nowicjuszy	5300KIT (ZESTAW 5300)	System barwienia szkiełek
Fluoromount-G	Thermo Fisher Naukowy	00-4958-02	Nośniki montażowe
Hoechst powiedział:	Biot	40046	Barwienie jądrowe do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.
Imaris Konwerter Plików x64 10.2.0	Imaris Instrumenty Oksfordzkie		Darmowy konwerter plików
Oprogramowanie ImarisViewer x64 10.2.0	Imaris Instrumenty Oksfordzkie		Darmowe oprogramowanie do przetwarzania obrazu
Pióro ImmEdge	Laboratoria wektorowe	H-4000	Hydrofobowy długopis barierowy
Bowodorek litu (1 gram)	Chemikalia STREM	93-0397	Substancja chemiczna do inaktywacji barwnika, kup małe porcje tej substancji chemicznej (1 gram)
Lumican Biotyna	R& Systemy D	BAF2846	Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.
Okulary z mikro osłonką	Firma VWR	48393-241	Szklane osłony prowadnic
Pan-cytokeratyna Alexa Fluor 750	Novus Biologicals	NBP2-33200AF750/AB_2868569	Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.
System mikrofalowy PELCO BioWave Pro	Ted Pella Inc	36500-230	Nienagrzewająca się naukowa kuchenka mikrofalowa
PELCO SteadyTemp Pro	Ted Pella Inc	50062	W pełni zautomatyzowana kontrola temperatury dla naukowej kuchenki mikrofalowej
SimpleITK (Prosty ITK)	Oprogramowanie typu open source		Oprogramowanie do rejestracji i przetwarzania kanałów
Streptawidyna Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Naukowy	S11227 powiedział:	Odczynnik do znakowania do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1.
Mikroskop szerokokątny	Mikrosystemy Leica	NIE	Imager Leica Microsystems THUNDER ze źródłem światła LED8 i oprogramowaniem LAS X (3.7.1.21655). Do obrazowania fluorescencyjnego użyto niestandardowego filtra czteropasmowego z zewnętrznym kołem filtrów (PN: 11536075) z dwoma dodatkowymi filtrami jednopasmowymi (PN: 8118215) do obrazowania siedmiu kanałów barwnika na przejście. Linie wzbudzenia, dichroicznego i emisyjnego filtra to (1) sześcian czteropasmowy: dichroiczny w 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, bez filtrów wzbudzenia lub emisji; (2) Zewnętrzne koło filtrowe pozycja 1: 434/32, pozycja 2: 520/40, pozycja 3: 585/20, pozycja 4: 720/60, pozycja 5: przepustowe; (3) jednopasmowy 1— 585/22 wzbudzenie, 594 dichroiczne, 625/30 emisja; (4) jednopasmowy 2— 635/20 wzbudzenie, 647 dichroiczne, 667/30 emisja.
Zeiss Środek do czyszczenia soczewek optycznych	Amazonka	B00GPVQVCO	Środek do czyszczenia soczewek obiektywów mikroskopowych
przeciwciała
Ag85B (Biblioteka Ag85B)	Księga Abcam	ab43019 powiedział:	Poliklonalna IgG królika, cykl 1
Aktyna alfa-mięśni gładkich DyLight 755	Novus Biologicals	NBP2-345221R	1A4/asm-1, cykl 1
CD4 Alexa Fluor 488	R& Systemy D	FAB8165G	Poliklonalna kozia IgG, cykl 1
CD8 Alexa Fluor 647	Legenda biologiczna	372906	C8/144B, cykl 1
CD68 iFluor 594	Caprico Biotechnologie	1064135	KP1, cykl 1
Osioł anty-kozy IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Fisher Naukowy	A32814 powiedział:	Osioł poliklonalny, cykl 1
Ośli anty-mysz IgG Alexa Fluor Plus AF647	Thermo Fisher Naukowy	A32787	Osioł poliklonalny, cykl 1
Osioł anty-królik IgG Alexa Fluor Plus AF555	Thermo Fisher Naukowy	Numer telefonu A32794	Osioł poliklonalny, cykl 1
Hoechst powiedział:	Biot	40046	Etykieta jądrowa, cykl 1
Płyta CD15	BD Nauki biologiczne	347420	MMA, cykl 2
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Naukowy	50-0202-82	L26, cykl 2
CD45 Fikoerytryna (PE)	Novus Biologicals	NBP2-34528PE	2B11 + PD7/26, cykl 2
Oślica przeciw myszom IgM Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	715-545-020	Osioł poliklonalny, cykl 2
Lumican Biotyna	R& Systemy D	BAF2846	Poliklonalna kozła IgG, cykl 2
Pan-cytokeratyna Alexa Fluor 750	Novus Biologicals	NBP2-33200AF750	AE-1/AE-3, cykl 2
Streptawidyna Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Naukowy	S11227 powiedział:	Nie dotyczy, cykl 2
Hoechst powiedział:	Biot	40046	Cykl 2
Solutions
Bufor blokujący (cykl 1)
Tryton-X-100	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T8787 TGL	0,3% objętościowo
BSA	Sigma-Aldrich	A4503 (wersja angielska)	1% objętościowo
Ludzki blok BD Fc	BD Nauki biologiczne	564220	1% objętościowo
1x PBS	Gibco (firma Gibco)	10010-023	97,7% objętościowo
Primary Antibody Staining Solution #1 (Cykl 1)
Bufor blokujący (cykl 1)	Patrz wyżej		Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał
Hoechst powiedział:	Biot	40046	1:5000
CD8 AF647	Legenda biologiczna	372906	1:10
Primary Antibody Staining Solution #2 (Cykl 1)
Bufor blokujący (cykl 1)	Patrz wyżej		Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał
Płyta CD4  AF488 powiedział:	R& Systemy D	FAB8165G	1:10
Ag85B (Biblioteka Ag85B)	Księga Abcam	ab43019/NA	1:100
wtórny roztwór do barwienia przeciwciał #1 (cykl 1)
Bufor blokujący (cykl 1)	Patrz wyżej		Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał
Osioł Anti-Goat AF Plus 488	Thermo Fisher Naukowy	Nr kat. A32814/AB_2762838	1:100
Osioł anty-Królik AF Plus 555	Thermo Fisher Naukowy	Nr kat. A32794/AB_2762834	1:100
Oślica przeciw myszom AF Plus 647	Thermo Fisher Naukowy	Nr kat. A32787/AB_2762830	1:50
Primary Antibody Staining Solution #3 (Cykl 1)
Bufor blokujący (cykl 1)	Patrz wyżej		Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał
Płyta CD68 iF594	Caprico Biotechnologie	1064135	1:10
a-SMA DL755	Novus Biologicals	NBP2-345221R/NA	1:30
Bufor blokujący wolny od BSA (cykl 2)
Tryton-X-100	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T8787 TGL	0,3% objętościowo
Ludzki blok BD Fc	BD Nauki biologiczne	564220	1% objętościowo
1x PBS	Gibco (firma Gibco)	10010-023	98,7% objętościowo
Primary Antibody Staining Solution #4 (Cykl 2)
Bufor blokujący wolny od BSA (cykl 2)	Patrz wyżej		Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał
Płyta CD15	BD Nauki biologiczne	347420	1:30
Lumican Biotyna	R& Systemy D	BAF2846	1:100
CD45 PE	Novus Biologicals	NBP2-34528PE	1:20
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Naukowy	50-0202-82	1:10
Pan-cytokeratyna AF750	Novus Biologicals	NBP2-33200AF750	1:10
Wtórny roztwór do barwienia przeciwciał #2 (cykl 2)
Bufor blokujący wolny od BSA (cykl 2)	Patrz wyżej		Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał
Osioł anty-mysz IgM AF488	Jackson ImmunoResearch	715-545-020/AB_2340844	1:100
Strepowidyna AF594	Thermo Fisher Naukowy	S11227 powiedział:	1:200