Zastosowanie taniej, wszechstronnej techniki fotonapromieniania manualną metodą IBEX pozwala na optymalne obrazowanie tkanki ludzkiej ze znaczną natywną autofluorescencją. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób uzyskać multipleksowane obrazy całych preparatów z archiwalnych próbek klinicznych przy użyciu odwróconego mikroskopu, powszechnie dostępnych odczynników i oprogramowania typu open source do wyrównywania i przetwarzania obrazu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zoptymalizowany przepływ pracy dla iteracyjnego wybielania rozszerza obrazowanie multipleksowe wysoce autofluorescencyjnych próbek klinicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Częstość występowania chorób płuc spowodowanych przez prątki niegruźlicze (NTM) wzrasta na całym świecie. Chociaż choroba płuc wywołana NTM często objawia się rozstrzeniem oskrzeli, guzkami płuc i chorobą jamy ustnej, odpowiedź gospodarza związana z tymi odrębnymi wzorcami uszkodzeń płuc nie została dobrze scharakteryzowana in situ. Staraliśmy się ocenić mechanizmy patologii wywołanej przez NTM, przeprowadzając głęboką analizę fenotypową populacji komórek odpornościowych w tkance płucnej od osób z chorobą NTM w porównaniu ze złotym standardem zapalenia ziarniniakowego, gruźliczej (TB) choroby płuc.
Utrwalone formaliną, zatopione w parafinie (FFPE) bloki płuc od pacjentów z rozsianym NTM, płucnym NTM lub gruźlicą płuc podzielono na sekcje i wybarwiono zgodnie ze zmodyfikowaną wersją metody obrazowania Iterative Bleaching Extends multi-pleXity (IBEX). Optymalizacja metody IBEX była najpierw konieczna, aby rozwiązać problem znaczącej endogennej fluorescencji skrawków płuc ze względu na dużą gęstość kolagenu, elastyny i erytrocytów natywnych dla tkanki płucnej, która jest pogarszana przez zachowanie FFPE i wiek bloków FFPE. W tym protokole szczegółowo opisujemy protokół fotonapromieniania i zmodyfikowaną metodę odzyskiwania antygenu, która zmniejsza autofluorescencję klinicznie zarchiwizowanych próbek.
Ponadto zapewniamy wskazówki dotyczące projektowania paneli przeciwciał, w tym typowych wyzwań, takich jak reaktywność krzyżowa, utrata epitopów po napromieniowaniu fotoelektrycznym, nakładanie się widm między sąsiednimi fluoroforami i niski stosunek sygnału do szumu dla niektórych celów. Aby ułatwić wydajne obrazowanie całych skrawków tkanki płucnej, preparaty zobrazowano za pomocą mikroskopu szerokokątnego i poddano obróbce końcowej za pomocą oprogramowania typu open source w celu poprawy jakości obrazu. Łącznie ten przepływ pracy odpowiada na krytyczną potrzebę, dokumentując sposób uzyskiwania wysoce multipleksowanych obrazów całych slajdów o wysokiej rozdzielczości z trudnych próbek przy użyciu powszechnie dostępnego oprzyrządowania i odczynników. Poza ilościowym obrazowaniem próbek klinicznych, techniki te można stosować do różnych typów próbek w celu wyeliminowania zarówno endogennych, jak i egzogennych źródeł fluorescencji.
Wprowadzenie
Gruźlica (TB) jest jedną z głównych przyczyn zgonów, a każdego roku z powodu zakażenia gruźlicą umiera około 1,3 miliona osób1. Chociaż nie jest tak śmiertelna jak gruźlica, w ostatnich latach nastąpił znaczny wzrost zakażeń płuc i wynikających z nich chorób wywoływanych przez prątki niegruźlicze (NTM)2. Na poziomie tkanek odpowiedź immunologiczna gospodarza na zakażenie Mycobacterium tuberculosis (Mtb) została dobrze zbadana i obejmuje tworzenie ziarniniaków, heterogenicznych agregatów limfocytów, komórek dendrytycznych, makrofagów i neutrofili3. Podczas gdy zapalenie ziarniniakowe jest również podstawową cechą odporności gospodarza na zakażenie NTM, populacje komórek odpornościowych i charakterystyka przestrzenna tej odpowiedzi pozostają niedostatecznie zbadane. Uzyskanie szczegółowego zrozumienia tkankowych składników immunopatologii w porównaniu z gojeniem się ran ma kluczowe znaczenie dla opracowania metod leczenia (np. terapii kierowanych przez gospodarza) i profilaktycznych (tj. szczepionek) strategii terapeutycznych.
W tym badaniu nasz zespół miał dostęp do rzadkich, archiwalnych próbek klinicznych pobranych podczas resekcji płuc lub sekcji zwłok od pacjentów z zakażeniem Mtb lub NTM. Większość z tych próbek miała ponad 10 lat i była zachowana jako próbki utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie (FFPE), co ograniczyło ich użycie do testów histologicznych. Aby przezwyciężyć ograniczenia markerów tradycyjnego obrazowania immunohistochemicznego (IHC) i immunofluorescencyjnego (IF), zastosowaliśmy metodę Iterative Bleaching Extends multi-pleXity (IBEX), metodę obrazowania o otwartym kodzie źródłowym, wysoce multipleksowaną 4,5. Rozszerzenie metody IBEX na próbki FFPE z ludzkich płuc wymagało znacznej optymalizacji ze względu na wysoki poziom endogennej fluorescencji, która jest dobrze opisaną przeszkodą w multipleksowanym obrazowaniu opartym na przeciwciałach6.
W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół redukcji autofluorescencji przy użyciu metody fotonapromieniania zoptymalizowanej pod kątem wycinków tkanek FFPE płuc 7,8. Co ważne, opisana tutaj metoda wykorzystuje niedrogą, powszechnie dostępną kaseton, którą można rozszerzyć na inne preparaty próbek o wysokiej autofluorescencji. Oprócz zmniejszenia autofluorescencji przed akwizycją obrazu, zapewniamy wskazówki dotyczące projektowania paneli przeciwciał, takie jak parowanie markerów niskiej liczebności z jasnymi znacznikami fluoroforowymi, ocena wpływu promieniowania fotologicznego na znakowanie przeciwciał oraz amplifikacja przeciwciałami drugorzędowymi w kanałach o wysokiej fluorescencji endogennej. Średnio przetworzyliśmy pięć preparatów odpowiadających jednemu przekrojowi tkanki, każdy o długości od 37 do 114mm2. Na koniec pokazujemy, jak pozyskiwać obrazy całych slajdów za pomocą instrumentu szerokokątnego. Podsumowując, protokół ten opisuje zastosowanie IBEX do archiwizowanych próbek klinicznych, a dodatkowo oferuje wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów często spotykanych przy obrazowaniu próbek o wysokiej autofluorescencji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Archiwalne sekcje autopsji i resekcji chirurgicznej tkanki płucnej pobrano zgodnie z protokołem 09-H-0172 (NCT00943514), Historia naturalna rozstrzeni oskrzeli, w Laboratorium Patologii National Institutes of Health Clinical Center. Protokół ten został zatwierdzony przez IRB, a uczestnicy wyrazili świadomą zgodę.
1. Automatyczne pobieranie antygenu
UWAGA: Deparafinowanie i pobieranie antygenu przeprowadzono przy użyciu zautomatyzowanej platformy do barwienia badawczego (ryc. 1). Wcześniejsze prace wykazały, że podejście polegające na podwójnym pobieraniu antygenu polegające na 30 minutach z roztworem do pobierania epitopów pH 6 na bazie cytrynianu (ER1), a następnie 30 minutach z roztworem do pobierania epitopów pH 9 na bazie EDTA (ER2) dało najlepsze wyniki znakowania immunologicznego dla tkanek FFPE9. Porównywalne wyniki można uzyskać, stosując ręczne odparafinowanie i podwójne pobieranie antygenu przy użyciu innych opisanych metod i wsparcia zapewnionego przez IBEX Imaging Community10,11.
- Zbierz szkiełka i zautomatyzowane materiały do pobierania antygenów (pokrywy slajdów, system wykrywania badań, roztwór do odzyskiwania epitopów pH 6 na bazie cytrynianu (ER1), roztwór do pobierania epitopów pH 9 na bazie EDTA (ER2) itp.).
- Włącz urządzenie, pozwól mu się zainicjować na 20 minut, umieść ramię wykrywania badań w przyrządzie i włóż pojemniki z odczynnikami na dno urządzenia.
- Otwórz oprogramowanie, kliknij przycisk konfiguracji slajdów i wybierz opcję dodaj badanie, a następnie utwórz nową nazwę badania.
- Wybierz pozycję Dodaj slajd i oznacz slajdy zgodnie z potrzebami.
- Aby postępować zgodnie z tym protokołem, wykonaj protokół pieczenia i dewaxowania z protokołem HIER składającym się z 30 minut ER1 i 30 minut ER2.
- Wydrukuj etykiety i umieść je na slajdach. Wyjmij stojak na prowadnice z instrumentu i umieść interesujące Cię slajdy na stojaku. Umieść przezroczyste osłony slajdów na każdym szkiełku, włóż stojak na szkiełka do urządzenia i naciśnij przycisk pod stojakiem, aby skłonić instrument do skanowania slajdów za pomocą kodów kreskowych.
- Wybierz play | ok i pozwól, aby automatyczne pobieranie antygenu rozpoczęło się w przybliżeniu po 3 godzinach.
2. Znakowanie przeciwciał przed fotonapromienianiem
- Po zakończeniu pobierania antygenu zanurz szkiełka w PBS.
UWAGA: Niektóre epitopy są wrażliwe na promieniowanie fotologiczne i ulegają degradacji po nocnej ekspozycji na diodę LED. Wrażliwe epitopy muszą być określone empirycznie, a po wykryciu na tym etapie powinno nastąpić znakowanie immunologiczne tych epitopów. Upewnij się, że szkiełko pozostaje mokre przez cały czas po pobraniu antygenu. - Wyjmij jedno szkiełko z PBS i osusz cały nadmiar PBS na szkiełku za pomocą niestrzępiącej się chusteczki; Uważaj, aby nie dotknąć tkanki. Narysuj obramowanie wokół tkanki za pomocą hydrofobowego pisaka. Powtórz ten proces dla wszystkich pozostałych slajdów. Pozostaw barierę hydrofobową do wyschnięcia na 10 minut.
- Przygotuj szkiełkową komorę wilgotnościową, umieszczając niewielką ilość wody na dnie każdej studzienki. Umieść szkiełka w komorze wilgotnościowej szkiełka. Usunąć PBS z tkanki bez bezpośredniego dotykania próbki tkanki.
- Dodać 200 μl buforu blokującego (tabela materiałów) do każdego szkiełka. Umieść przesuwną komorę wilgotnościową w nienagrzewającej się naukowej kuchence mikrofalowej z mechanizmem utrzymującym stałą temperaturę.
- Zablokuj nieswoiste znakowanie przeciwciał, wykonując następujący program ustalony wcześniej4: 2-1-2-1-2-1-2-1-2, gdzie "2" oznacza 2 minuty przy 100 W , a "1" oznacza 1 minutę przy 0 W. Wykonaj powyższy program raz w celu zablokowania. Jeśli ten instrument nie jest dostępny, zablokuj skrawki tkanki (5-10 μm) na 1 godzinę w temperaturze 37 °C, jak opisano wcześniej5.
- Utworzyć roztwór do barwienia przeciwciał pierwotnych #1 (cykl 1) (tabela materiałów) podczas inkubacji buforu blokującego. Przygotować mieszaniny przeciwciał zgodnie z tabelą materiałów. Delikatnie wymieszaj koktajl przeciwciał i odwiruj mieszaninę przeciwciał za pomocą mini wirówki o masie 2 680 × g przez 30 sekund.
UWAGA: Ten roztwór barwiący zawiera rozcieńczenie Hoechsta w stosunku 1:5000, które powinno wystarczyć na czas trwania dwucyklowego eksperymentu. U użytkowników może być konieczne miareczkowanie przeciwciał Hoechst i innych przeciwciał w celu uzyskania optymalnych wyników dla ich tkanek i konfiguracji obrazowania. - Wyjmij szkiełkową komorę wilgotnościową z kuchenki mikrofalowej po zakończeniu cyklu i odetnij blokujący roztwór buforowy z każdej tkanki. Dodać 200 μl roztworu do barwienia przeciwciał pierwszorzędowych #1 (cykl 1) (tabela materiałów) do każdego szkiełka. Umieść komorę ze szkiełkami z powrotem w kuchence mikrofalowej i uruchom program przeciwciał pierwotnych na około 30 minut: wykonaj dwukrotnie program 2-1-2-1-1-1-2-2 w celu znakowania przeciwciał pierwotnych.
UWAGA: Tutaj 200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego jest szacunkowe. Użyć odpowiedniej objętości roztworu, aby pokryć całą powierzchnię wycinka tkanki. - Po zakończeniu etapu podstawowego znakowania przeciwciał przemyj każde szkiełko 1 000 μl PBS, przechylając szkiełko w pionie, pipetując PBS na tkankę i pozwalając PBS spłynąć. Powtórz ten krok 3-5 razy.
- Odetnij nadmiar PBS i przymocuj szkiełka 1% paraformaldehydem (PFA) przez 10 minut w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej.
UWAGA: Wiązanie PFA może maskować epitopy, zapobiegając wiązaniu przeciwciał z zamierzonymi celami. Podczas tworzenia panelu przeciwciał po raz pierwszy zalecamy ocenę wpływu delikatnego utrwalenia (1% PFA przez 10 minut) poprzez porównanie wzorca znakowania odcinków tkanek leczonych utrwalaczem lub bez niego przed immunoznakowaniem. Jeśli przeciwciało jest wrażliwe na wiązanie 1% PFA, należy przesunąć to przeciwciało przed etapem postfiksacji. - Dokładnie umyj szkiełka 1 000 μl PBS 3-5x. Pozostaw PBS na tkance do momentu etapu fotonapromieniania.
3. Fotonapromienianie tkanek
- Aby przygotować pudełko do naświetlania (Rysunek 2), zaopatrz się w lampę LED o mocy 150 W, lampę LED o mocy 40 W RGBW, duży plastikowy pojemnik (objętość 20 galonów [75.71 l] lub więcej), świeży 1x PBS i szalkę Petriego.
- Umieść szalkę Petriego na środku lampy o mocy 150 W i napełnij ją 1x PBS. Użyj wystarczającej objętości, aby zanurzyć slajdy w PBS. Przeprowadź proces naświetlania w chłodni, aby zminimalizować wytwarzanie ciepła przez lampy.
- Wyjmij szkiełka z komory wilgotnościowej szkiełka i umieść je na szalce Petriego, upewniając się, że wszystkie szkiełka są zanurzone w PBS.
- Umieść lampę o mocy 40 W bezpośrednio na szalce Petriego, tak aby źródło światła było skierowane w stronę szkiełek. Upewnij się, że 40 W lamp jest ustawiony na ustawienie czerwonego światła przed umieszczeniem.
- Włącz zarówno lampy o mocy 150 W, jak i 40 W. Przykryj zestaw do fotonaświetlania plastikową pokrywką pojemnika. Utrzymuj lampę o mocy 40 W na czerwonym świetle przez 2 godziny, a następnie przełącz na ustawienie zielonego światła za pomocą dołączonego pilota przez pozostałe 16 godzin.
UWAGA: Konieczne jest wykonanie naświetlania w temperaturze około 4 °C, aby zapobiec niepożądanym zniekształceniom cieplnym tkanki szkiełka. Punkt przerwy: naświetlanie foto można wykonać w nocy, a protokół można wznowić następnego dnia rano.
4. Znakowanie przeciwciał po napromieniowaniu fotologicznym
- Wyjmij szkiełka z szalki Petriego i zanurz je w 1x PBS w słoiku Coplin, stożkowej probówce 50 ml lub wiadrze z systemu barwienia szkiełek. Przygotować roztwór do barwienia przeciwciał pierwszorzędowych #2 (cykl 1) (tabela materiałów) w zalecanych rozcieńczeniach (tabela 1). Użyć 200 μl roztworu na każde szkiełko.
- Usuń nadmiar PBS z każdego pojedynczego szkiełka za pomocą niestrzępiącej się ściereczki, upewniając się, że wysuszyłeś obszar wokół tkanki bez dotykania samej tkanki. Umieść szkiełka w komorze wilgotnościowej szkiełka.
- Delikatnie zmieszać roztwór do barwienia przeciwciał pierwotnych #2 (cykl 1) i dodać 200 μl do każdego szkiełka, upewniając się, że cała tkanka jest pokryta.
- Umieść szkiełkową komorę wilgotnościową ze szkiełkami z powrotem w kuchence mikrofalowej i uruchom program przeciwciał pierwotnych na około 30 minut, jak opisano w kroku 2.7
- Podczas znakowania przeciwciał pierwotnych przygotuj roztwór do barwienia przeciwciał wtórnych #1 (cykl 1) (tabela materiałów).
- Po zakończeniu programu mikrofalowego wyjmij szkiełkową komorę wilgotnościową i umyj każde szkiełko 3-5 razy 1,000 μl 1x PBS.
- Odciąć nadmiar PBS z każdego pojedynczego szkiełka za pomocą niestrzępiącej się ściereczki, wymieszać wtórny roztwór barwiący przeciwciała i dodać 200 μl do każdego szkiełka.
- Umieść szkiełkową komorę wilgotnościową w kuchence mikrofalowej i uruchom program przeciwciał wtórnych: program 2-1-2-1-2-1-2-1-2, gdzie "2" oznacza 2 minuty przy 100 W, a "1" oznacza 1 minutę przy 0 W. Wykonaj powyższy program raz, aby znakować przeciwciała wtórne.
- Dokładnie umyj szkiełka 3-5 razy 1 ml 1 x PBS i odetnij nadmiar PBS z każdego szkiełka.
- Do każdego szkiełka dodać roztwór do barwienia przeciwciał pierwotnych #3 (cykl 1) zawierający bezpośrednio sprzężone przeciwciała. Barwienie przeciwciał należy przeprowadzić za pomocą kuchenki mikrofalowej lub alternatywnej metody (1 h w temperaturze 37 °C), jak opisano w kroku 2.7.
- Ponownie umyj szkiełka 3-5 razy 1 ml 1x PBS i ostrożnie usuń nadmiar PBS z każdego szkiełka.
- Dodać 30 μl podłoża montażowego bezpośrednio do każdego odcinka tkanki i umieścić szkiełko nakrywkowe pokrywające cały wycinek tkanki. Sprawdź szkiełko pod kątem pęcherzyków powietrza i delikatnie dociśnij pęcherzyki powietrza do obwodu szkiełka. Powtórz ten proces dla pozostałych slajdów.
- Usuń nadmiar nośnika montażowego za pomocą niestrzępiącej się ściereczki i użyj środka do czyszczenia soczewek optycznych, aby usunąć wszelkie pozostałości pozostały na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Pozwól, aby wszystkie szkiełka zastygły na 10-15 minut w temperaturze pokojowej przed wykonaniem akwizycji obrazu pod mikroskopem.
5. Konfiguracja mikroskopii i akwizycja obrazu
- Włącz mikroskop szerokokątny i źródło światła LED8; Uruchom oprogramowanie. Wybierz obiektyw (w tym przypadku obiektyw suchy 20x/0,8). Przełącz kamerę w tryb 16-bitowy w zakładce konfiguracji . Wybierz wymagane kanały na podstawie fluoroforów obecnych w panelach przeciwciał (patrz Tabela 1 w celu uzyskania dalszych wskazówek).
UWAGA: Dla mikroskopu referencyjnego określono następujące kroki. Można użyć równoważnego mikroskopu szerokokątnego z porównywalnym źródłem światła i kostkami filtrującymi do wzbudzenia i emisji kilku fluoroforów oraz stolika precyzyjnego. - Wyczyść szkiełko nakrywkowe środkiem do czyszczenia soczewek i papierem do soczewek bezpośrednio przed obrazowaniem. Przed obrazowaniem należy sprawdzić wzrokowo szkiełko nakrywkowe i usunąć kurz lub kłaczki z powierzchni. Umieść szkiełko mocno w lewym górnym rogu (lub odpowiedniku) wkładki stolika, tak aby tkanka była konsekwentnie umieszczona w płaszczyźnie XY (krytycznej dla wyrównania obrazów cyklicznych).
- Skonfiguruj ustawienia akwizycji, tworząc kanał odpowiadający każdemu fluoroforowi zawartemu w panelu przeciwciał. Wybierz odpowiednią kostkę filtra i diodę LED dla każdego fluoroforu. Dostosuj intensywność każdej diody LED i czasy ekspozycji dla każdego kanału. Tabela 1 zawiera listę używanych tutaj ustawień obrazu.
- Przed pobraniem obrazu wybierz kanał Hoechst i włącz opcję Linked Shading. Użyj kreatora Połączone cieniowanie, aby ustawić tę opcję dla wybranego celu.
UWAGA: Ten protokół szczegółowo opisuje, jak wykonywać całe obrazy slajdów poprzez pozyskiwanie dużych skanów kafelków. Cieniowanie połączone lub korekcja cieniowania jest potrzebna, aby przezwyciężyć nierównomierne oświetlenie obrazów sąsiadujących. - W oprogramowaniu kliknij przycisk Na żywo , aby wyświetlić wizualizację kanału Hoechst. Użyj pokrętła zgrubnej ostrości, aby ustawić ostrość na sekcji tkanki.
- Wybierz każdy kanał fluorescencyjny i oceń wycinek tkanki pod kątem oczekiwanego wzoru barwienia dla wszystkich fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał w cyklu.
- Wybierz Navigator w oprogramowaniu. Korzystając z funkcji kanału Hoechsta i spirali w programie Navigator, zmapuj cały wycinek tkanki lub obszar zainteresowania, który ma zostać zobrazowany. Jeśli na jednym slajdzie zostanie zobrazowanych wiele odcinków tkanki, powtórz ten krok, aby utworzyć mapę tkanki za pomocą programu Navigator.
- Zidentyfikuj ROI, które mają zostać zobrazowane, za pomocą wielokąta, magicznej różdżki lub innych narzędzi do wyboru ROI w Navigatorze. Ostrożnie narysuj kontur tkanki, aby uchwycić jak najmniej płytek potrzebnych do pokrycia pożądanego ROI. Usuń dodatkowe kafelki, aby skrócić całkowity czas pozyskiwania.
- Po utworzeniu ROI przejrzyj i dostosuj ustawienia kanału, aby zminimalizować nasycone piksele i zoptymalizować stosunek sygnału do szumu. Wybierz tabelę przeglądową mapy cieplnej w oknie wyświetlania obrazu. Kolory wskazują poziom wypełnienia pikseli, a czerwienie, pomarańcze, żółcie i biele wskazują łatwiejsze do zauważenia różnice w intensywności; Niebieskie piksele oznaczają nasycone piksele. Aby uniknąć utraty informacji i pogorszenia jakości obrazu, skróć czas naświetlania, aby zminimalizować liczbę nasyconych (niebieskich) pikseli.
- W Nawigatorze użyj narzędzia Mapa ostrości , aby utworzyć mapę topograficzną tkanki. Ustaw punkt mapy ostrości co 3-4 pola widzenia dla dużych kafelków lub nierównych próbek.
UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie w przypadku dużych skanów kafelków wymaganych do obrazowania całego slajdu. Ogólnie rzecz biorąc, jakość obrazu skaluje się wraz z liczbą wybranych punktów mapy ostrości; Jednak proces ten może być dość czasochłonny, szczególnie w przypadku dużych skanów kafelków.- Utwórz punkty mapy ostrości w kolejności, w jakiej będą skanowane przez mikroskop. Aby dopasować kolejność skanowania kafelków w mikroskopie, do którego istnieje odniesienie, wybierz opcję Punkty mapy ostrości wzdłuż ścieżki serpentynowej zgodnej ze ścieżką używaną przez mikroskop.
- Ustaw pierwszy punkt mapy ostrości za pomocą ręcznego ustawiania ostrości. Użyj autofokusa dla pozostałych punktów mapy ostrości. Usiądź i obserwuj, aby upewnić się, że dla każdego punktu mapy ostrości wybrano optymalną ostrość. W razie potrzeby ręcznie dostosuj punkty mapy koncentracji uwagi. Zwiększa zakres używany do znajdowania każdego punktu mapy ostrości dla nierównych i/lub dużych tkanek.
- Skonfiguruj przetwarzanie przy użyciu następujących parametrów: Small Volume Computational Clearing (SVCC) z indeksem refrakcyjnym (RI) ustawionym tak, aby pasował do medium montażowego (tutaj, 1.4); wytrzymałość ustawiona na 98%, a rozmiar cechy ustawiony na 2,000 nm dla markerów membranowych lub 3,000 nm dla markerów jądrowych. Uruchom protokół rozliczania obliczeniowego podczas akwizycji obrazu.
- Rozpocznij skanowanie kafelków. Zapisz numer kafelka i utrzymuj stały zwrot z inwestycji we wszystkich cyklach.
- Po pobraniu obrazu scal wyczyszczone obliczeniowo obrazy za pomocą funkcji Scalanie mozaiki znajdującej się na karcie Proces z zaznaczoną opcją Wygładzanie . Sprawdź wzrokowo każdy obraz pod kątem błędów łączenia i powtórz scalanie mozaiki z nowymi parametrami, jeśli występują błędy kafelkowania.
UWAGA: Źle wyrównane obrazy uniemożliwią rejestrację obrazów pozyskiwanych iteracyjnie. - W razie potrzeby użyj modułu separacji barwników , aby skompensować rozlanie widma między kanałami, jak opisano wcześniej5.
6. Cykle inaktywacji barwnika, znakowania przeciwciał i akwizycji obrazu
- Po zakończeniu akwizycji obrazu zanurz szkiełka w stożkowej probówce o pojemności 50 ml sterylnego 1x PBS, aż szkiełka nakrywkowe odpadną. Jeśli szkiełko nakrywkowe nie odpadnie, przeciągnij PBS bezpośrednio po szkiełku lub użyj pęsety, aby delikatnie usunąć szkiełko nakrywkowe.
- Przygotować roztwór borowodorku litu (LiBH4), odmierzając 3-5 mg proszku do plastikowej łódki wagowej. Dodać diH2O w stosunku 1:1 bezpośrednio do proszku (np. 3,2 mg LiBH4 i 3,2 ml diH2O) i homogenizować roztwór za pomocą pipety. Za pomocą strzykawki przepuścić roztwór przez filtr 0,2 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zapisać stężenie oraz dokładny czas powstania roztworu. Pozostaw roztwór do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 3-5 minut, aż w całym roztworze pojawią się duże pęcherzyki.
UWAGA: Zalecamy użycie roztworu do inaktywacji barwnika w ciągu 4 godzin od przygotowania. UWAGA: Wykonaj następujące czynności pod wyciągiem chemicznym i używaj odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (PPE). W wyniku tej reakcji może powstać gazowy wodór, który jest wysoce łatwopalny. Ważne jest, aby przez cały czas pracować z małymi ilościami LiBH4 (<10 mg). Aby uzyskać więcej wskazówek, obejrzyj filmy instruktażowe na temat bezpiecznego przygotowania LiBH4 w bazie wiedzy IBEX10,11.
Fiolkę LiBH4 należy wymienić po 4 tygodniach stosowania ze względu na zmniejszoną skuteczność wybielania po wielokrotnym wystawieniu na działanie powietrza. Zalecamy zakup małych porcji LiBH4 (1 gram). - Wyjmij każde szkiełko z 1x namaczania PBS, odchąć nadmiar PBS niestrzępiącą się chusteczką i umieść je w komorze wilgotnościowej szkiełka.
- Traktować każde niepokryte szkiełko LiBH4 przez 30 minut, pipetując roztwór bezpośrednio na szkiełko o objętości wystarczającej do pokrycia tkanki. Usunąć stary roztwór LiBH4 z każdego szkiełka i odświeżyć nową podwielokrotnością LiBH4 po 10 minutach i 20 minutach od tego samego roztworu podstawowego LiBH4 .
- Umyj szkiełka dokładnie 3-5 razy za pomocą 1x PBS. Stosuj szybkie wymiany PBS, mocząc szkiełka przez 1 minutę na pranie.
- Aby uzyskać obraz do odejmowania tła, umieść nowe szkiełko nakrywkowe na każdym szkiełku zgodnie z opisem w krokach 4.12-4.13 i uzyskaj obrazy inaktywacji tkanki po barwniku. Utwórz nowy projekt dla obrazu odejmowania tła i powtórz kroki 5.2-5.14, aby uzyskać obraz. Obraz przy użyciu tej samej liczby kafelków, kanałów, ustawień kanałów i pól widzenia ustalonych dla obrazu cyklu 1. Utrzymuj punkty mapy ostrości w tych samych polach widzenia, ale użyj autofokusa, aby dostosować każdy punkt mapy ostrości do tego nowego obrazu.
UWAGA: Użyj kanału, który zawiera powtarzający się znacznik odniesienia (Hoechst), aby zidentyfikować unikalne struktury (kształty jądrowe), które są obecne na obrazie "na żywo" (na przykład obraz odejmowania tła) i poprzednim obrazie (cykl 1). - Aby zminimalizować niespecyficzne sygnały fluorescencyjne z biotynylowanych przeciwciał w drugim cyklu przeciwciał, należy wykonać blokowanie awidyny i biotyny.
- Odciąć nadmiar PBS i nałożyć roztwór blokujący awidynę na każde szkiełko w temperaturze pokojowej na 15 minut.
- Umyj szkiełka 3-5 razy za pomocą 1x PBS i odstrzyj nadmiar PBS po zakończeniu prania.
- Nałóż roztwór blokujący biotynę na każde szkiełko w temperaturze pokojowej przez 15 minut i umyj szkiełka 3-5 razy 1x PBS, jak w kroku 6.7.2.
- Przygotowanie nowego bufora blokującego wolnego od BSA (cykl 2) (tabela materiałów) dla
Roztwór do barwienia przeciwciał pierwotnych #4 (cykl 2) i roztwór do barwienia przeciwciał drugorzędowych #2 (cykl 2).
UWAGA: Roztwory te nie będą wymagały albuminy surowicy bydlęcej, ponieważ BSA może zagrozić etapowi blokowania awidyny/biotyny. - Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w stężeniach zalecanych przez producenta w roztworze barwiącym przeciwciała pierwszorzędowe #4 (cykl 2). Delikatnie zmieszaj ten roztwór i dodaj do każdego szkiełka w komorze wilgotnościowej, upewniając się, że tkanka jest całkowicie pokryta roztworem przeciwciała pierwotnego. Umieść szkiełkową komorę wilgotnościową ze szkiełkami w kuchence mikrofalowej i uruchom program przeciwciał pierwotnych na około 30 minut, jak opisano w kroku 2.7-2.8.
- Wykonaj znakowanie przeciwciał wtórnych za pomocą roztworu do barwienia przeciwciał wtórnych #2 (cykl 2) zgodnie z opisem w krokach 4.6-4.9. Po zakończeniu barwienia umieść nowe szkiełko nakrywkowe na każdym szkiełku, jak opisano wcześniej w krokach 4.12-4.13. Umieść szkiełko z powrotem na stoliku mikroskopu i zmień jego położenie tak, aby znajdowało się w tej samej płaszczyźnie XY dla poprzednich obrazów.
UWAGA: Użyj kanału, który zawiera powtarzający się znacznik odniesienia (Hoechst), aby zidentyfikować unikalne struktury (kształty jądrowe), które są obecne na "żywym" obrazie (na przykład cykl 2) i poprzednim obrazie (cykl 1). - Utwórz nowy projekt dla obrazu cyklu 2 i powtórz kroki 5.2-5.14, aby uzyskać obraz cyklu 2. Obraz przy użyciu tej samej liczby kafelków, kanałów, ustawień kanałów i pól widzenia ustalonych dla obrazu cyklu 1. Utrzymuj punkty mapy ostrości w tych samych polach widzenia, ale użyj autofokusa, aby dostosować każdy punkt mapy ostrości do tego nowego obrazu. Po uzyskaniu obrazu z cyklu 2 przejdź do wyrównania obrazu lub powtórz kroki opisane w sekcji 6 dla dodatkowych cykli z bezpośrednio sprzężonymi przeciwciałami. UWAGA: Użyj kanału, który zawiera powtarzający się znacznik odniesienia (Hoechst), aby zidentyfikować unikalne struktury (kształty jądrowe), które są obecne na obrazie "na żywo" (na przykład obraz z cyklu 2) i poprzednim obrazie (cykl 1). Dodatkowe cykle wymagają bezpośrednio sprzężonych przeciwciał, ponieważ IBEX nie usuwa przeciwciał.
7. Wyrównanie obrazu
- Konwertuj surowe obrazy z wyjściowych plików .lif mikroskopu na pliki .ims za pomocą bezpłatnego konwertera plików i przetwarzania obrazów za pomocą oprogramowania open source, jak opisano wcześniej5 i szczegółowo opisano w filmach w bazie wiedzy IBEX10,11.
- Dla każdego cyklu obrazowania edytuj plik i zastosuj dowolne żądane kroki przetwarzania (np. nazewnictwo kanałów, pseudokolorowanie kanałów).
- Wykonaj odejmowanie tła i progowanie kanałów za pomocą funkcji arytmetyki kanałów utworzonych dla SimpleITK w celu zmniejszenia sygnału autofluorescencji (https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTChannelArithmetic.html).
UWAGA: Wykonujemy te kroki na każdym obrazie (np. Cykl 1, Cykl 2) przed wyrównaniem ich w jeden obraz kompozytowy. Dzieje się tak, ponieważ łatwiej jest pracować na mniejszych, pojedynczych obrazach niż na większych, połączonych obrazach.
- Wykonaj odejmowanie tła i progowanie kanałów za pomocą funkcji arytmetyki kanałów utworzonych dla SimpleITK w celu zmniejszenia sygnału autofluorescencji (https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTChannelArithmetic.html).
- Opracuj spójną strategię nazewnictwa, aby korzystać z oprogramowania rejestracyjnego. Nazwij kanały za pomocą przedrostka-separatora-przyrostka (np. "Cycle1 CD8_AF647") ze spacją jako znakiem separatora, aby oznaczyć kanał, w którym przeciwciało anty-CD8 AF647 zostało użyte w pierwszym cyklu.
UWAGA: Więcej informacji można znaleźć w rozszerzeniu pliku pomocy: https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTRegisterSameChannel.html. - Po odpowiednim nazwaniu wszystkich kanałów uruchom oprogramowanie rejestracyjne, kliknij Imaris Extensions | Prosty ITK | Afine.
- Prześlij plik .ims dla każdego cyklu, używając przycisku przeglądania obok pozycji Nazwy plików. Wprowadź znak separatora prefiksu nazwy kanału. Jeśli postępujesz zgodnie z powyższym przykładem, wpisz pojedynczą spację, a następnie kliknij przycisk Dalej.
- Należy wybrać kanał rejestracji używany jako wspólny znacznik odniesienia między cyklami (np. Hoechst).
- Wybierz obraz stały, czyli obraz, do którego zostaną zarejestrowane inne obrazy.
UWAGA: Zalecamy zarejestrowanie się w cyklu 2 obrazów iteracyjnych. - Wybierz żądany katalog dla 'Pliku wyjściowego'. Opcja Rozpocznij rejestrację w rozdzielczości zostanie domyślnie ustawiona na maksymalną rozdzielczość, aby umożliwić najlepszą możliwą rejestrację. Jeśli moc obliczeniowa jest ograniczona, zmniejsz ten parametr.
UWAGA: Dla opisanych tutaj danych (12-15 GB na obraz) zastosowaliśmy maksymalną rozdzielczość 5. - Kliknij Zarejestruj , aby rozpocząć. Po zakończeniu rejestracji poczekaj, aż pojawi się przycisk Ponowne próbkowanie i zapisywanie połączonego obrazu , kliknij go i poczekaj, aż pasek postępu przejdzie do końca.
- Otwórz gotowy plik wyjściowy w oprogramowaniu do przetwarzania. Zarejestrowany obraz ze wszystkimi cyklami i informacjami o kanałach będzie dostępny i gotowy do analizy lub publikacji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Projektowanie multipleksowego panelu obrazowania opartego na przeciwciałach wymaga znacznej ilości czasu, wysiłku i zasobów12Wyzwania te są szczególnie widoczne podczas projektowania panelu dla zarchiwizowanych próbek FFPE z tkanek wykazujących silną autofluorescencję, opisanych w niniejszym opracowaniu (Rycina 1). Aby przezwyciężyć te trudności, w pierwszej kolejności zidentyfikowano najjaśniejsze fluorofory kompatybilne z naszym protokołem inaktywacji barwnika (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kliniczna patologia płuc z gruźlicy płuc charakteryzuje się martwiczym zapaleniem ziarniniakowym. Patologia płuc NTM występuje głównie w dwóch odrębnych populacjach pacjentów z dwoma odrębnymi wzorcami patologicznymi: izolowanym uszkodzeniem płuc charakteryzującym się ziarniniakowym zapaleniem z zatarciem oskrzelików i tworzeniem się jam u osób immunokompetentnych lub rozlana choroba guzkowa wpływająca na płuca i inne narządy u osób z niedoborem odporności 13,14,15,16<...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
A.J.R. jest pracownikiem Leica Microsystems, Inc. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Prace te były wspierane przez Intramural Research Program DIR/NIAID, NCI i NHLBI. Rysunek 1 został stworzony przy użyciu BioRender na podstawie umowy licencyjnej z NIH.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,3% Tryton-X-100 | Sigma-Aldrich | Zobacz materiał T8787 TGL | Rozwiązanie do blokowania bufora |
| 1% powierzchni ciała | Sigma-Aldrich | A4503 (wersja angielska) | Rozwiązanie do blokowania bufora |
| 1% ludzki blok BD Fc | BD Nauki biologiczne | 564220 | Blok Fc wymagany do blokowania bufora |
| Lampa LED o mocy 150 W | Amazonka | B07VH3CVSF | Źródło światła LED do fotonaświetlania tkanek |
| 1x PBS | Gibco (firma Gibco) | 10010-023 | Rozwiązanie do blokowania etapów buforowania i mycia |
| Pojemnik do przechowywania o pojemności 20 galonów | Amazonka | B001B1C4G0 | Pojemnik do procesu fotonaświetlania |
| Lampa LED naświetlająca RGBW o mocy 40 W | Amazonka | B08QFPJSMD | Źródło światła RGB do fotonapromieniania tkanek |
| Ag85B (Biblioteka Ag85B) | Księga Abcam | ab43019/NA | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| Aktyna alfa-mięśni gładkich DyLight 755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R/NA | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| Zestaw blokujący awidynę/biotynę | Księga Abcam | ab64212 powiedział: | Roztwór blokujący awidynę i biotynę |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD Nauki biologiczne | 554714 | Rozwiązanie do utrwalania |
| Roztwór do usuwania wosku BOND | Leica Biosystems | NC0221076 | Roztwór do deparafiniowania |
| Roztwór do odzyskiwania epitopów BOND 1 | Leica Biosystems | NC0235529 | Roztwór do odzyskiwania epitopów pH 6 na bazie cytrynianu (ER1) |
| Roztwór do odzyskiwania epitopów BOND 2 | Leica Biosystems | NC0235530 | Roztwór do odzyskiwania epitopów pH 9 na bazie EDTA (ER2) |
| System detekcji badań BOND | Leica Biosystems | NC0396648 | Zautomatyzowany odczynnik do barwienia badań |
| Barwnik badawczy BOND RX | Leica Biosystems | NIE | Zautomatyzowana platforma do barwienia badawczego |
| Roztwór do mycia BOND | Leica Biosystems | NC0221077 | Bufor do płukania |
| Płyta CD15 | BD Nauki biologiczne | 347420/AB_400298 | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Naukowy | 50-0202-82/AB_11150959 | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| CD4 Alexa Fluor 488 | R& Systemy D | FAB8165G/AB_2728839 | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| CD45 Fikoerytryna (PE) | Novus Biologicals | NBP2-34528PE/NA | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| CD68 iFluor 594 | Caprico Biotechnologie | 1064135/AB_2892745 | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| Osioł anty-kozy IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Naukowy | Nr kat. A32814/AB_2762838 | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| Ośli anty-mysz IgG Alexa Fluor Plus AF647 | Thermo Fisher Naukowy | A32787/ AB_2762830 | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| Oślica przeciw myszom IgM Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020/AB_2340844 | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| Osioł anty-królik IgG Alexa Fluor Plus AF555 | Thermo Fisher Naukowy | Nr kat. A32794/AB_2762834 | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| System barwienia EasyDip | Zaopatrzenie dla nowicjuszy | 5300KIT (ZESTAW 5300) | System barwienia szkiełek |
| Fluoromount-G | Thermo Fisher Naukowy | 00-4958-02 | Nośniki montażowe |
| Hoechst powiedział: | Biot | 40046 | Barwienie jądrowe do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| Imaris Konwerter Plików x64 10.2.0 | Imaris Instrumenty Oksfordzkie | Darmowy konwerter plików | |
| Oprogramowanie ImarisViewer x64 10.2.0 | Imaris Instrumenty Oksfordzkie | Darmowe oprogramowanie do przetwarzania obrazu | |
| Pióro ImmEdge | Laboratoria wektorowe | H-4000 | Hydrofobowy długopis barierowy |
| Bowodorek litu (1 gram) | Chemikalia STREM | 93-0397 | Substancja chemiczna do inaktywacji barwnika, kup małe porcje tej substancji chemicznej (1 gram) |
| Lumican Biotyna | R& Systemy D | BAF2846 | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| Okulary z mikro osłonką | Firma VWR | 48393-241 | Szklane osłony prowadnic |
| Pan-cytokeratyna Alexa Fluor 750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750/AB_2868569 | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| System mikrofalowy PELCO BioWave Pro | Ted Pella Inc | 36500-230 | Nienagrzewająca się naukowa kuchenka mikrofalowa |
| PELCO SteadyTemp Pro | Ted Pella Inc | 50062 | W pełni zautomatyzowana kontrola temperatury dla naukowej kuchenki mikrofalowej |
| SimpleITK (Prosty ITK) | Oprogramowanie typu open source | Oprogramowanie do rejestracji i przetwarzania kanałów | |
| Streptawidyna Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Naukowy | S11227 powiedział: | Odczynnik do znakowania do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| Mikroskop szerokokątny | Mikrosystemy Leica | NIE | Imager Leica Microsystems THUNDER ze źródłem światła LED8 i oprogramowaniem LAS X (3.7.1.21655). Do obrazowania fluorescencyjnego użyto niestandardowego filtra czteropasmowego z zewnętrznym kołem filtrów (PN: 11536075) z dwoma dodatkowymi filtrami jednopasmowymi (PN: 8118215) do obrazowania siedmiu kanałów barwnika na przejście. Linie wzbudzenia, dichroicznego i emisyjnego filtra to (1) sześcian czteropasmowy: dichroiczny w 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, bez filtrów wzbudzenia lub emisji; (2) Zewnętrzne koło filtrowe pozycja 1: 434/32, pozycja 2: 520/40, pozycja 3: 585/20, pozycja 4: 720/60, pozycja 5: przepustowe; (3) jednopasmowy 1— 585/22 wzbudzenie, 594 dichroiczne, 625/30 emisja; (4) jednopasmowy 2— 635/20 wzbudzenie, 647 dichroiczne, 667/30 emisja. |
| Zeiss Środek do czyszczenia soczewek optycznych | Amazonka | B00GPVQVCO | Środek do czyszczenia soczewek obiektywów mikroskopowych |
| przeciwciała | |||
| Ag85B (Biblioteka Ag85B) | Księga Abcam | ab43019 powiedział: | Poliklonalna IgG królika, cykl 1 |
| Aktyna alfa-mięśni gładkich DyLight 755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R | 1A4/asm-1, cykl 1 |
| CD4 Alexa Fluor 488 | R& Systemy D | FAB8165G | Poliklonalna kozia IgG, cykl 1 |
| CD8 Alexa Fluor 647 | Legenda biologiczna | 372906 | C8/144B, cykl 1 |
| CD68 iFluor 594 | Caprico Biotechnologie | 1064135 | KP1, cykl 1 |
| Osioł anty-kozy IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Naukowy | A32814 powiedział: | Osioł poliklonalny, cykl 1 |
| Ośli anty-mysz IgG Alexa Fluor Plus AF647 | Thermo Fisher Naukowy | A32787 | Osioł poliklonalny, cykl 1 |
| Osioł anty-królik IgG Alexa Fluor Plus AF555 | Thermo Fisher Naukowy | Numer telefonu A32794 | Osioł poliklonalny, cykl 1 |
| Hoechst powiedział: | Biot | 40046 | Etykieta jądrowa, cykl 1 |
| Płyta CD15 | BD Nauki biologiczne | 347420 | MMA, cykl 2 |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Naukowy | 50-0202-82 | L26, cykl 2 |
| CD45 Fikoerytryna (PE) | Novus Biologicals | NBP2-34528PE | 2B11 + PD7/26, cykl 2 |
| Oślica przeciw myszom IgM Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020 | Osioł poliklonalny, cykl 2 |
| Lumican Biotyna | R& Systemy D | BAF2846 | Poliklonalna kozła IgG, cykl 2 |
| Pan-cytokeratyna Alexa Fluor 750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750 | AE-1/AE-3, cykl 2 |
| Streptawidyna Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Naukowy | S11227 powiedział: | Nie dotyczy, cykl 2 |
| Hoechst powiedział: | Biot | 40046 | Cykl 2 |
| Solutions | |||
| Bufor blokujący (cykl 1) | |||
| Tryton-X-100 | Sigma-Aldrich | Zobacz materiał T8787 TGL | 0,3% objętościowo |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 (wersja angielska) | 1% objętościowo |
| Ludzki blok BD Fc | BD Nauki biologiczne | 564220 | 1% objętościowo |
| 1x PBS | Gibco (firma Gibco) | 10010-023 | 97,7% objętościowo |
| Primary Antibody Staining Solution #1 (Cykl 1) | |||
| Bufor blokujący (cykl 1) | Patrz wyżej | Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał | |
| Hoechst powiedział: | Biot | 40046 | 1:5000 |
| CD8 AF647 | Legenda biologiczna | 372906 | 1:10 |
| Primary Antibody Staining Solution #2 (Cykl 1) | |||
| Bufor blokujący (cykl 1) | Patrz wyżej | Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał | |
| Płyta CD4 AF488 powiedział: | R& Systemy D | FAB8165G | 1:10 |
| Ag85B (Biblioteka Ag85B) | Księga Abcam | ab43019/NA | 1:100 |
| wtórny roztwór do barwienia przeciwciał #1 (cykl 1) | |||
| Bufor blokujący (cykl 1) | Patrz wyżej | Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał | |
| Osioł Anti-Goat AF Plus 488 | Thermo Fisher Naukowy | Nr kat. A32814/AB_2762838 | 1:100 |
| Osioł anty-Królik AF Plus 555 | Thermo Fisher Naukowy | Nr kat. A32794/AB_2762834 | 1:100 |
| Oślica przeciw myszom AF Plus 647 | Thermo Fisher Naukowy | Nr kat. A32787/AB_2762830 | 1:50 |
| Primary Antibody Staining Solution #3 (Cykl 1) | |||
| Bufor blokujący (cykl 1) | Patrz wyżej | Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał | |
| Płyta CD68 iF594 | Caprico Biotechnologie | 1064135 | 1:10 |
| a-SMA DL755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R/NA | 1:30 |
| Bufor blokujący wolny od BSA (cykl 2) | |||
| Tryton-X-100 | Sigma-Aldrich | Zobacz materiał T8787 TGL | 0,3% objętościowo |
| Ludzki blok BD Fc | BD Nauki biologiczne | 564220 | 1% objętościowo |
| 1x PBS | Gibco (firma Gibco) | 10010-023 | 98,7% objętościowo |
| Primary Antibody Staining Solution #4 (Cykl 2) | |||
| Bufor blokujący wolny od BSA (cykl 2) | Patrz wyżej | Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał | |
| Płyta CD15 | BD Nauki biologiczne | 347420 | 1:30 |
| Lumican Biotyna | R& Systemy D | BAF2846 | 1:100 |
| CD45 PE | Novus Biologicals | NBP2-34528PE | 1:20 |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Naukowy | 50-0202-82 | 1:10 |
| Pan-cytokeratyna AF750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750 | 1:10 |
| Wtórny roztwór do barwienia przeciwciał #2 (cykl 2) | |||
| Bufor blokujący wolny od BSA (cykl 2) | Patrz wyżej | Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał | |
| Osioł anty-mysz IgM AF488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020/AB_2340844 | 1:100 |
| Strepowidyna AF594 | Thermo Fisher Naukowy | S11227 powiedział: | 1:200 |
Bibliografia
- Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1 (2023).
- Dahl, V. N., et al. Global trends of pulmonary infections with nontuberculous mycobacteria: A systematic review. Int J Infect Dis. 125, 120-131 (2022).
- Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nat Rev Immunol. 17 (11), 691-702 (2017).
- Radtke, A. J., et al. Ibex: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
- Radtke, A. J., et al. Ibex: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
- Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: A primer for multiplexed antibody-based imaging. Nat Methods. 19 (3), 284-295 (2022).
- Duong, H., Han, M. A multispectral led array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Nolta, N. F., Liberti, A., Makol, R., Han, M. Gelatin embedding and LED autofluorescence reduction for rodent spinal cord histology. J Neurosci Methods. 346, 108924(2020).
- Radtke, A. J., et al. Multi-omic profiling of follicular lymphoma reveals changes in tissue architecture and enhanced stromal remodeling in high-risk patients. Cancer Cell. 42 (3), 444-463.e10 (2024).
- Radtke, A. J., et al. The IBEX knowledge-base: A central resource for multiplexed imaging techniques. PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).
- Yaniv, Z., et al. The IBEX imaging knowledge-base: A community resource enabling adoption and development of immunofluoresence imaging methods. ArXiv. , (2024).
- Quardokus, E. M., et al. Organ mapping antibody panels: A community resource for standardized multiplexed tissue imaging. Nat Methods. 20 (8), 1174-1178 (2023).
- Mcshane, P. J., Glassroth, J. Pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria: Current state and new insights. Chest. 148 (6), 1517-1527 (2015).
- Hsu, A. P., et al. Mutations in GATA2 are associated with the autosomal dominant and sporadic monocytopenia and mycobacterial infection (monomac) syndrome. Blood. 118 (10), 2653-2655 (2011).
- Vinh, D. C., et al. Autosomal dominant and sporadic monocytopenia with susceptibility to mycobacteria, fungi, papillomaviruses. Blood. 115 (8), 1519-1529 (2010).
- Filipe-Santos, O., et al. X-linked susceptibility to mycobacteria is caused by mutations in nemo impairing CD40-dependent IL-12 production. J Exp Med. 203 (7), 1745-1759 (2006).
- Galeotti, T., Van Rossum, G. D., Mayer, D. H., Chance, B. On the fluorescence of NAD(P)H in whole-cell preparations of tumours and normal tissues. Eur J Biochem. 17 (3), 485-496 (1970).
- Schneckenburger, H., Gessler, P., Pavenstadt-Grupp, I. Measurements of mitochondrial deficiencies in living cells by microspectrofluorometry. J Histochem Cytochem. 40 (10), 1573-1578 (1992).
- Harman, D. Lipofuscin and ceroid formation: The cellular recycling system. Adv Exp Med Biol. 266, 3-15 (1989).
- Brunk, U. T., Terman, A. Lipofuscin: Mechanisms of age-related accumulation and influence on cell function. Free Radic Biol Med. 33 (5), 611-619 (2002).
- Jung, T., Bader, N., Grune, T. Lipofuscin: Formation, distribution, and metabolic consequences. Ann N Y Acad Sci. 1119, 97-111 (2007).
- Sherratt, M. J. Tissue elasticity and the ageing elastic fibre. Age (Dordr). 31 (4), 305-325 (2009).
- Laurent, G. J. Lung collagen: More than scaffolding. Thorax. 41 (6), 418-428 (1986).
- Lakowicz, J. R. Principles of frequency-domain fluorescence spectroscopy and applications to cell membranes. Subcell Biochem. 13, 89-126 (1988).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
