Artykuł badawczy

Opracowanie mysich modeli choroby Ménétriera

648 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67981

⸱

6 czerwca 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Yale School of Medicine, 2Department of Internal Medicine, University of Cincinnati, 3Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Obecne badanie pokazuje, że myszy MT-TGFα wykazują spazmolityczną metaplazję z ekspresją polipeptydu (SPEM) w żołądku. Nieszczelność promotora uniemożliwiła wykazanie, że główne linie komórkowe są śledzone do SPEM. W związku z tym dodatkowo opracowaliśmy mysi model indukowany doksycykliną (Doxi-TGFα) i potwierdziliśmy, że SPEM pochodzi z głównych komórek.

Streszczenie

Choroba Ménétriera (MD) jest rzadką nabytą chorobą przednowotworową żołądka, charakteryzującą się gigantycznymi fałdami bruzdowymi, zmniejszonym wydzielaniem kwasu i utratą białka. Pacjenci z MD wykazują zwiększoną ekspresję liganda receptora EGF (EGFR), przekształcającego czynnik wzrostu-α (TGFα) w żołądku. Przeciwciało neutralizujące EGFR, cetuksymab, powoduje szybką poprawę kliniczną i remisję histologiczną. Poza tymi odkryciami etiologia i leżące u jej podstaw mechanizmy molekularne nie są dobrze poznane. Transgeniczna linia myszy metalotioneina (MT)-TGFα jest pierwszym modelem myszy MD, który podsumowuje cechy histopatologiczne MD, w tym przerost dołka i utratę komórek okładzinowych. W tym modelu mysim TGFα jest napędzany przez wzmacniacz/promotor MT indukowany metalami ciężkimi. We wcześniejszych badaniach stosowano siarczan (ZnSO4) w wodzie pitnej lub dootrzewnowe wstrzyknięcia siarczanu kadmu (CdSO4) w celu indukcji TGFα. Odkryliśmy jednak, że myszy MT-TGFα rozwijają fenotypy bez obróbki metalami ciężkimi, co wskazuje na nieszczelność promotora. Odkryliśmy również, że nadekspresja TGFα hamuje ekspresję Mist1, czynnika transkrypcyjnego ważnego dla różnicowania komórek głównych, utrudniając w ten sposób manipulację genetyczną w komórkach głównych przy użyciu linii myszy Mist1-CreERT2. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy indukowalny model myszy (Doxi-TGFα), w którym TGFα jest indukowany przez leczenie doksycykliną (CMV-rtTA; TetO-TGFα). Chociaż mysi model Doxi-TGFα rozwija łagodniejsze fenotypy niż model MT-TGFα, podsumował cechy MD, w tym przerost dołka środkowego i utratę komórek okładzinowych. Korzystając z mysiego modelu Doxi-TGFα, odkryliśmy, że spazmolityczny metaplazja z ekspresją polipeptydu (SPEM) jest indukowana w MD, a SPEM jest uzyskiwany z głównych komórek poprzez śledzenie linii przy użyciu linii myszy Mist1-CreERT2. Zarówno mysie modele MT-TGFα, jak i Doxi-TGFα oferują modele in vivo MD i są przydatne do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw patogenezy MD i możliwości leczenia choroby. Myszy Doxi-TGFα będą również użytecznym modelem do badania skutków nadekspresji TGFα w innych tkankach.

Wprowadzenie

Choroba Ménétriera (MD), znana również jako gastropatia przerostowa powodująca utratę białka, jest rzadkim stanem przednowotworowym żołądka. Żołądki pacjentów z MD wykazują masywny przerost dołków, który prowadzi do zwiększonego wydzielania śluzu żołądkowego i zmniejszenia liczby komórek okładzinowych, co prowadzi do zmniejszenia wydzielania kwasu żołądkowego. Ponadto białko jest selektywnie tracone przez błonę śluzową żołądka, co prowadzi do hipoalbuminemii i obrzęku obwodowego1,2,3. Patogeneza MD nie była znana, dopóki nie zgłoszono, że transgeniczne myszy z nadekspresją TGFα pod kontrolą wzmacniacza/promotora genu metalotioneiny (MT) podsumowały fenotypy MD w żołądku4,5. Żołądki pacjentów z MD wykazywały również zwiększoną ekspresję TGFα, liganda receptora EGF (EGFR). Cetuximab, przeciwciało anty-EGFR, został uznany za pierwsze skuteczne leczenie MD, co potwierdziło, że aktywacja EGFR przez nadekspresję TGFα przyczynia się do patogenezy MD6,7.

Od tego czasu linia myszy MT-TGFα jest używana jako model myszy dla MD. Ponieważ ekspresja TGFα jest regulowana przez gen odpowiedzi na metale ciężkie, wzmacniacz/promotor metalotioneiny, siarczan (ZnSO4) w wodzie pitnej lub dootrzewnowe wstrzyknięcia siarczanu kadmu (CdSO4) zostały użyte do indukowania ekspresji TGFα5,8. Mysi model MT-TGFα został dodatkowo scharakteryzowany pod kątem fenotypów MD. Korzystając z tego modelu mysiego, wykazano, że TGFα indukuje różnicowanie komórek dołka powierzchniowego wydzielającego mucynę, jednocześnie hamując różnicowanie w komórki okładzinowe wydzielające kwas i wydzielające pepsynogen główne linie komórkowe9,10. Wykazano również, że ciało żołądka / błona śluzowa dna ulega antralizacji i że komórki dodatnie czynnika koniczyny 2 (TFF2) są obecne u podstawy gruczołów żołądkowych, co sugeruje, że spazmolityczne metaplazja wyrażająca polipeptydy (SPEM) występuje w MD8,11.

W obecnym badaniu pokazujemy, że myszy MT-TGFα rozwijają cechy MD bez leczenia metalami ciężkimi. Te fenotypy obejmują utratę ekspresji Mist1, czynnika transkrypcyjnego, który jest niezbędny do różnicowania głównych komórek i jest tracony w SPEM. Ze względu na utratę Mist1, linia myszy Mist1-CreERT212 nie mogła być wykorzystana razem z linią myszy MT-TGFα do zbadania, czy SPEM w MD powstaje z głównych komórek poprzez śledzenie linii. Mając na celu przezwyciężenie nieszczelności modelu myszy MT-TGFα, opracowaliśmy nowy model myszy MD (CMV-rtTA13; TetO-TGFα14), gdzie TGFα jest indukowany przez leczenie doksycykliną (Doxi-TGFα). Potwierdziliśmy, że ten model myszy ma również cechy MD. Korzystając z mysiego modelu Doxi-TGFα, pokazujemy, że SPEM powstaje z głównych komórek poprzez śledzenie linii prostej za pomocą linii myszy Mist1-CreERT2. W niniejszym badaniu wprowadzamy dwa modele myszy MD. Oba modele mogą być wykorzystywane do badania patogenezy i poszukiwania potencjalnych celów terapeutycznych. Nowa mysz Doxi-TGFα będzie szczególnie cenna, gdy inicjacja fenotypów MD musi być precyzyjnie kontrolowana lub gdy wymagana jest modyfikacja genetyczna w głównych komórkach przy użyciu linii myszy Mist1-CreERT2.

Protokół

Wszystkie procedury hodowli i użytkowania zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Yale oraz zgodnie z Zasadami Rządu Stanów Zjednoczonych dotyczącymi Wykorzystania i Opieki nad Zwierzętami Wykorzystywanymi w Badaniach, Nauczaniu i Testowaniu.

1. Eksperymenty na myszach

  1. Zabiegi na myszach
    1. Leczyć myszy MT-TGFα (zarówno samce, jak i samice w wieku 2-4 miesięcy) 25 mM ZnSO4 w wodzie pitnej przez 2 tygodnie, aby wywołać nadekspresję TGFα.
    2. Leczenie CMV-rtTA/+; Myszy TetO-TGFα/+ (Doxi-TGFα) (zarówno samce, jak i samice w wieku 2-4 miesięcy) z 2 mg / ml doksycykliny w wodzie pitnej przez 2 tygodnie w celu wywołania nadekspresji TGFα.
    3. Dodaj jedną Mist1-CreERT2/+; R26-LSL-mTmG/+ samica myszy i dodać jedną mysz Doxi-TGFα płci przeciwnej do klatki hodowlanej w celu śledzenia linii głównych komórek w modelach myszy MD.
    4. Wstrzyknąć mgłę1-CreERT2/+; R26-LSL-mTmG/+; CMV-rtTA/+; Myszy TetO-TGFα/+ (zarówno samce, jak i samice w wieku 2-4 miesięcy) z tamoksyfenem (37,5 mg / kg) dootrzewnowo. Wstrzykiwać przez 7 kolejnych dni, na przemian w prawy i lewy dolny kwadrant brzucha, unikając uderzania w narządy wewnętrzne. Indukuj ekspresję TGFα przez leczenie doksycykliną (2 mg / ml) w wodzie pitnej przez 2 tygodnie.
      UWAGA: Sprawdź, czy w żołądku nie ma uszkodzeń spowodowanych tamoksyfenem15,16, jak to zrobiono tutaj, licząc komórki okładzinowe u myszy typu dzikiego z leczeniem tamoksyfenem i bez niego (Rysunek uzupełniający 1).
  2. Utrwalenie tkanki żołądka
    1. Eutanazja myszy przez przedawkowanie izofluranu po 2 tygodniach nadekspresji TGFα. Używając słoika z eksykatorem w chemicznym okapie oparowym, umieść myszy na perforowanej platformie, która zapobiega bezpośredniemu kontaktowi z płynnym środkiem znieczulającym. Zamknij pokrywę i monitoruj myszy, aż przestaną oddychać przez ponad 60 sekund, po czym nastąpi zwichnięcie szyjki macicy.
    2. Wypreparuj żołądek, przecinając połączenie żołądkowo-przełykowe, przecinając dwunastnicę z 5 mm dwunastnicą przymocowaną do żołądka i usuwając wszystkie więzadła otrzewnowe wokół żołądka za pomocą nożyczek i kleszczy (Ryc. 1A).
    3. Wkraplać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z końcówką pipety przymocowaną do strony dwunastnicy. Ściśnij go palcami, aby usunąć zawartość luminalną. Powtórz 3x (Rysunek 1B).
    4. Napompuj żołądek 2 ml 10% formaliny za pomocą kolejnej strzykawki o pojemności 10 ml z dołączoną końcówką do pipety. Zacisnąć mocno kleszczami na złączu żołądkowo-dwunastniczym przez 5-10 s, jednocześnie wyjmując końcówkę z żołądka (Rysunek 1C).
    5. Zanurz napompowany żołądek w 10% formalinie na noc w temperaturze 4 °C z potrząsaniem (Rysunek 1D).
      UWAGA: Podczas pracy z substancjami toksycznymi, takimi jak formalina, należy używać odpowiedniego sprzętu ochronnego.
  3. Przygotowanie żołądka do zatapiania w parafinie
    1. Wytnij dwunastnicę i przedni żołądek za pomocą żyletki (Ryc. 1E). Płukać tkankę żołądka PBS przez 5 minut, 3x wstrząsając.
    2. Pokrój żołądek na 3-4 krążki o tej samej grubości (3-5 mm) za pomocą żyletki. Osadź pierścienie żołądkowe w 2% agarozie, aby zachować orientację. Umieść pierścienie żołądkowe sekwencyjnie od bliższych do dystalnych, ustawiając stronę o mniejszej krzywiźnie w tym samym kierunku (Rysunek 1F).
    3. Umieść pierścienie żołądkowe osadzone w agarozach w kasecie na tkanki ( Rysunek 1G) i prześlij próbki do głównego zakładu histologicznego w celu zatopienia parafiny < sup class = "xref">17.

2. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Przygotowanie preparatów
    1. Szkiełka podstawowe z sekcjami parafiny podgrzewać w suchym piecu lub na bloku grzewczym ustawionym na 60 °C przez co najmniej 1 godzinę do nocy. Ostudzić do temperatury pokojowej i umieścić w stojaku na slajdy.
  2. Deparafinowanie, nawadnianie i pobieranie antygenu
    1. Oznacz dwa słoiki szkiełkowe, A i B, i napełnij każdy z nich wystarczającą ilością roztworu Trilogy, aby całkowicie zanurzyć tkankę.
    2. Umieść ruszt do przesuwania w słoiku A i włóż oba słoiki do szybkowaru. Ustaw szybkowar na wysokie ciśnienie na 15 minut. Poczekaj, aż szybkowar ostygnie przed otwarciem i wyjęciem szkiełek.
    3. Natychmiast umieść stojak na szkiełka ze słoika A w słoiku B na 2 minuty, aby upewnić się, że parafina została usunięta ze szkiełek. Wyjmij szkiełka z słoika B i umieść je w wodzie dejonizowanej (DI).
      UWAGA: Słoik A może być wypełniony raz używaną Trylogią. Nowa Trylogia powinna być zawsze używana w Jar B.
    4. Umieść szkiełka w soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) na 5 minut przed przystąpieniem do blokowania.
  3. Blokowanie niespecyficznego barwienia tła
    1. Wyjmij slajdy ze stojaka na slajdy i postukaj nimi na boki, aby usunąć nadmiar TBS.
    2. Narysuj pudełko wokół tkanki za pomocą markera hydrofobowego. Nałożyć bufor blokujący, aby całkowicie pokryć tkankę i inkubować przez 30-60 minut w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.
  4. Inkubacja z przeciwciałami pierwszorzędowymi
    1. Wybrać pierwszorzędowe przeciwciała białek docelowych wyhodowanych u różnych gatunków gospodarzy i rozcieńczyć w rozcieńczalniku przeciwciał zgodnie z zaleceniami producenta. W tym badaniu wykorzystano następujące przeciwciała: H+/K+-ATPaza, GIF, Mist118,19 oraz CD44v920,21. Szczegółowe informacje na temat przeciwciał pierwszorzędowych można znaleźć w Tabeli Materiałów.
    2. Usunąć bufor blokujący, nałożyć rozcieńczone przeciwciała i umieścić szkiełka z powrotem w wilgotnej komorze. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Usuń przeciwciała pierwszorzędowe i przemyj szkiełka 3x w TBS przez 5 minut na każde mycie.
  5. Przeciwciała drugorzędowe i lektyny
    1. Wybierz przeciwciała drugorzędowe zgodnie z gatunkiem gospodarza przeciwciał pierwszorzędowych. Lektyny można mieszać z przeciwciałami drugorzędowymi i stosować w tym samym czasie.
    2. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe i lektyny zgodnie z zaleceniami producenta w rozcieńczalniku do przeciwciał. Szczegółowe informacje na temat przeciwciał drugorzędowych i lektyn stosowanych w tym badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów.
    3. Zastosuj przeciwciała drugorzędowe, lektyny i DAPI (1 μg/ml) i umieść szkiełka z powrotem w wilgotnej komorze. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z dala od światła.
    4. Wyjmij szkiełka z nawilżonej komory i spłucz 3x TBS przez 5 minut na każde pranie.
  6. Montaż i przygotowanie mikroskopowe
    1. Wyjmij szkiełko z TBS i usuń nadmiar płynu, stukając suwakiem w bok o ręcznik papierowy.
    2. Dodać 15-20 μl podłoża montażowego. Trzymaj czyste szkiełko nakrywkowe za krawędzie i umieść jedną krawędź naprzeciwko chusteczki z podłożem montażowym pomiędzy nimi.
    3. Powoli opuść szkiełko nakrywkowe, tak aby podłoże było równomiernie rozprowadzone na tkance, uważając, aby nie uwięzić pęcherzyków.
    4. Użyj chusteczki do zadań, aby wchłonąć nadmiar nośnika montażowego wokół krawędzi. Wysuszyć gotowe szkiełko w ciemności w temperaturze pokojowej przed przystąpieniem do mikroskopii. Powtórz ten proces dla pozostałych slajdów.

Wyniki

Dorosłe myszy typu dzikiego (WT) oraz myszy MT-TGFα otrzymywały siarczan cynku (25 mM ZnSO4) w wodzie pitnej przez 2 tygodnie przed uśmierceniem. Żołądki myszy WT wyglądały prawidłowo, zarówno makroskopowo, jak i histologicznie. W wyraźnym kontraście żołądki myszy MT-TGFα były makroskopowo pogrubione (Rysunek 2A). Mikroskopowo żołądki te wykazywały masywną hiperplazję dołeczkową z utratą zarówno komórek okładzinowych, jak i głównych (Rysunek 2B-D), co odzwierciedlało cechy histologiczne choroby Ménétriera (MD). Utrata komórek głównych może zachodzić na dwa różne sposoby: poprzez śmierć komórek głównych lub metaplazję z ekspresją polipeptydu spazmolitycznego (SPEM) powstającą z komórek głównych. Aby rozróżnić te dwie możliwości, przeprowadziliśmy śledzenie linii komórek głównych poprzez krzyżowanie myszy Mist1-CreERT2; R26-LSL-mTmG z myszami MT-TGFα. Myszy te były najpierw leczone niską dawką tamoksyfenu (37,5 mg/kg domięśniowo przez 7 kolejnych dni) w celu znakowania komórek głównych białkiem GFP, a następnie otrzymywały ZnSO4 w wodzie pitnej w celu indukcji nadekspresji TGFα. Zaobserwowaliśmy nieliczne komórki znakowane GFP u myszy MT-TGFα (dane nie pokazano). Ponadto nie stwierdzono różnic makroskopowych i histologicznych u myszy MT-TGFα w obecności lub w przypadku braku ZnSO4 (Rysunek 3A-C). Jednym z możliwych wyjaśnień tego znaleziska było to, że TGFα mógł zmniejszyć ekspresję Mist1, niezbędnego czynnika transkrypcyjnego dla komórek głównych18, co zniosło użyteczność allelu Mist1-CreERT2. W rzeczywistości barwienie immunohistochemiczne na Mist1 zanikło u myszy MT-TGFα bez leczenia ZnSO4 (Rysunek 3D).

Aby wyeliminować problem nieszczelności modelu mysiego MT-TGFα, zastosowaliśmy indukowalny doksycykliną transgeniczny model Doxi-TGFa. Osiągnięto to poprzez krzyżowanie myszy TetO-TGFα14 z linią myszy CMV-rtTA13; wcześniej zgłoszono, że rtTA jest ekspresowane w żołądku. Potwierdziliśmy, że 2 tygodnie leczenia doksycykliną indukują hiperplazję dołeczkową oraz zmniejszają liczbę komórek okładzinowych i głównych w tym nowym modelu mysim MD (Rycyna 4A-C). W porównaniu z cechami histomorfologicznymi u myszy MT-TGFα, myszy Doxi-TGFα wykazały mniej nasiloną grubość błony śluzowej i hiperplazję dołeczkową, a także mniejszy spadek liczby komórek okładzinowych (Rycina uzupełniająca 2). Niemniej jednak, dzięki zastosowaniu linii mysiej Mist1-CreERT2, udało nam się przeprowadzić śledzenie linii komórek głównych i potwierdzić, że linie komórek głównych są również znakowane GSII i CD44v920,21, co potwierdza, że nadekspresja TGFα indukuje SPEM z komórek głównych (Rycina 4D).

Niniejsze badanie wykazuje, że MT-TGFα model mysi naśladuje cechy histopatologiczne MD bez zastosowania leczenia metalami ciężkimi, co prawdopodobnie wynika z wewnętrznej nieszczelności promotora/enhancera i/lub niemożności uniknięcia ekspozycji na metale ciężkie (Rysunek 3 i Rycina uzupełniająca 2). Ponieważ TGFα tłumi ekspresję Mist1, linia myszy Mist1-CreERT2 nie może być wykorzystana w MT-TGFα model mysi. Stworzyliśmy nowy model mysi MD, w którym TGFα ekspresję można indukować poprzez traktowanie doksycykliną. Wykorzystując ten nowy układ Doxi-TGFα model myszy z MD, mogliśmy potwierdzić, że TGFα nadekspresja indukuje SPEM pochodzącą z komórek głównych. Doxi-TGFα Model mysi MD będzie użyteczny w przypadku konieczności precyzyjnej kontroli TGFα ekspresja jest niezbędna, a także w przypadku, gdy wymagana jest modyfikacja genetyczna w komórkach głównych z wykorzystaniem linii myszy Mist1-CreERT2.

Dostępność danych:

Wszystkie surowe dane są dostępne jako pliki uzupełniające.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat procesu fiksacji i przygotowania do zatopienia tkanek żołądka. (A) Wypreparuj żołądek wraz z krótkim odcinkiem (3-5 mm) dwunastnicy. (B) Usuń zawartość światła, wstrzykując PBS do dwunastnicy za pomocą strzykawki z końcówką do pipety i uciskając żołądek palcami 3 razy. (C) Wypełnij żołądek formaliną, wprowadzając ją przez dwunastnicę za pomocą strzykawki, a następnie zaciśnij miejsce połączenia żołądka z dwunastnicą, aby zatrzymać formalinę wewnątrz. (D) Zanurz żołądek w formalinie i utrwalaj przez noc w temperaturze 4 °C przy jednoczesnym wstrząsaniu. (E) Usuń żołądek przedni oraz dwunastnicę za pomocą żyletki i wypłucz w PBS. (F) Przetnij trzon i przedżołądek na 3-4 pierścienie w przekroju poprzecznym, a następnie zatop je w 2% agarozie, aby zachować orientację pierścieni tkanki żołądka. (G) Umieść tkankę zatopioną w agarozie w kasetkach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Fenotypy makroskopowe i mikroskopowe myszy MT-TGFα traktowanych ciężkim metalem ZnSO4. (A) Ściana żołądka jest grubsza u myszy MT-TGFα (prawa) w porównaniu do myszy kontrolnych (lewa). (B) Żołądek myszy MT-TGFα (prawa) wykazuje masywną hiperplazję dołkową i utratę komórek okładzinowych. Żółte groty strzałek wskazują komórki okładzinowe, a zielone groty strzałek wskazują komórki dołkowe. Paski skali reprezentują 100 µm. (C) Barwienie immunofluorescencyjne potwierdza, że żołądek myszy MT-TGFα (prawa) wykazuje zwiększoną liczbę komórek dołkowych (dodatnich dla UEA1) i komórek SPEM (podwójnie dodatnich dla GIF i GSII) oraz zmniejszoną liczbę komórek okładzinowych (dodatnich dla H+/K+-ATPase) i komórek głównych (pojedynczo dodatnich dla GIF) w porównaniu do żołądka myszy kontrolnej (lewa). Paski skali reprezentują 100 µm. (D) Ilościowe oznaczenie różnych typów komórek nabłonkowych i grubości błony śluzowej u myszy typu dzikiego (WT) traktowanych ZnSO4 (n = 5) oraz myszy MT-TGFα traktowanych ZnSO4 (n = 3). Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe (**p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Myszy MT-TGFα wykazują fenotypy żołądkowe bez leczenia metalami ciężkimi. (A) Żołądek myszy MT-TGFα (po prawej) wykazuje masywną hiperplazję dołkową i utratę komórek okładzinowych bez leczenia metalami ciężkimi. Żółte groty strzałek wskazują komórki okładzinowe, a zielone groty strzałek wskazują komórki dołkowe. Paski skali reprezentują 100 µm. (B) Barwienie immunofluorescencyjne potwierdza, że żołądek myszy MT-TGFα (po prawej) bez leczenia metalami ciężkimi wykazuje zwiększoną liczbę komórek dołkowych (dodatnich dla UEA1) i komórek SPEM (podwójnie dodatnich dla GIF i GSII) oraz zmniejszoną liczbę komórek okładzinowych (dodatnich dla H+/K+-ATPase) i komórek głównych (pojedynczo dodatnich dla GIF) w porównaniu z żołądkiem myszy kontrolnej (po lewej). Paski skali reprezentują 100 µm. (C) Ilościowe oznaczenie różnych typów komórek nabłonkowych i grubości błony śluzowej u myszy WT bez ZnSO4 (n = 5) oraz myszy MT-TGFα z ZnSO4 (n = 3). Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe (***p < 0.001, ****p < 0.0001). (D) Żołądek myszy MT-TGFα (po prawej) wykazuje utratę ekspresji Mist1, która jest normalnie wyrażana w komórkach głównych (po lewej). GSII jest markerem komórek śluzowych szyjki. Paski skali reprezentują 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rycina 4: Indukowany doksycykliną model myszy TGFα (Doxi-TGFα) odtwarza fenotypy choroby Ménétriera, a tworzenie SPEM zostaje potwierdzone w tym modelu mysim. (A) Żołądek myszy CMV-rtTA; TetO-TGFα (Doxi-TGFα; po prawej) wykazuje masywną hiperplazję dołkową i zmniejszoną liczbę komórek okładzinowych. Żółte groty strzałek wskazują komórki okładzinowe, a zielone groty strzałek wskazują komórki dołkowe. Paski skali reprezentują 100 µm. (B) Barwienie immunofluorescencyjne potwierdza, że w żołądku myszy Doxi-TGFα (po prawej) występuje zwiększona liczba komórek dołkowych (dodatnich dla UEA1) i komórek SPEM (podwójnie dodatnich dla GIF i GSII) oraz zmniejszona liczba komórek okładzinowych (dodatnich dla H+/K+-ATPase) i komórek głównych (pojedynczo dodatnich dla GIF) w porównaniu z żołądkiem myszy kontrolnej (po lewej). Paski skali reprezentują 100 µm. (C) Ilościowe oznaczenie różnych typów komórek nabłonkowych i grubości błony śluzowej w myszach WT (n = 5) i myszach Doxi-TGFα (n = 5). Słupki błędu wskazują odchylenie standardowe (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). (D) Śledzenie linii komórek głównych (dodatnich dla GFP) przy użyciu linii mysiej Mist1-CreERT2; R26-LSL-mTmG wykazuje, że komórki dodatnie dla GFP są również dodatnie dla GSII i CD44v9 w żołądku myszy Doxi-TGFα, co potwierdza tworzenie SPEM pochodzących z komórek głównych, podczas gdy żołądek kontrolny (po lewej) wykazuje niemal całkowity brak komórek dodatnich dla GFP, które byłyby jednocześnie dodatnie dla GSII lub CD44v9. Paski skali reprezentują 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca 1: Leczenie niską dawką tamoksyfenu (TMX) nie wywołuje uszkodzenia błony śluzowej żołądka. Siedmiodniowe, ciągłe leczenie niską dawką TMX (37,5 mg/kg) nie wywołuje uszkodzenia błony śluzowej żołądka, co obrazuje utrzymanie liczby komórek okalających. (A) Reprezentatywne obrazy H&E bez leczenia TMX (panel lewy) i z leczeniem TMX (panel prawy). Paski skali odpowiadają 100 µm. (B) Ilościowe oznaczenie liczby komórek okalających na jednostkę żołądka w myszach WT (n = 5) oraz w myszach WT leczonych TMX (n = 5). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Porównanie fenotypów w różnych modelach mysich choroby Ménétriera (MD). (A) Modele mysie MD: MT-TGFα z leczeniem ZnSO4 , MT-TGFα bez leczenia ZnSO4  oraz Doxi-TGFα wykazują hiperplazję dołeczkową, zanik komórek okładzinowych i głównych, zwiększoną liczbę komórek metaplazji z ekspresją polipeptydu spazmolitycznego (SPEM) (komórki z ko-lokalizacją GIF i GSII) oraz pogrubienie błony śluzowej. Nie stwierdzono różnic fenotypowych między grupami MT-TGFα z leczeniem ZnSO4  a grupami bez takiego leczenia. Model mysi Doxi-TGFα wykazuje mniej nasilone zmiany fenotypowe niż model MT-TGFα. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Choroba Ménétriera (MD) jest rzadką przednowotworową chorobą żołądka spowodowaną nadekspresją TGFα 1,2,3. Transgeniczne myszy z nadekspresją TGFα pod kontrolą wzmacniacza/promotora genu metalotioneiny (MT-TGFα) były do tej pory jedynym mysim modelem MD 4,5. Ponieważ gen metalotioneiny reaguje na metale ciężkie, siarczan dodaje się do wody pitnej lub wstrzykuje się siarczan kadmu w celu indukcji TGFα w tym mysim modelu 5,8. Jednym z charakterystycznych fenotypów w MD jest zastąpienie głównych komórek w podstawie gruczołów żołądkowych komórkami śluzowymi, które są dodatnie dla markerów obecnych zarówno w komórkach śluzówki szyjki, jak i komórkach antralnej mucyny. Może to nastąpić albo przez śmierć głównych komórek, albo przeprogramowanie głównych komórek do spazmolitycznej metaplazji wyrażającej polipeptyd (SPEM)8,11. Można to przetestować poprzez śledzenie linii głównych komórek w modelu myszy MD. Próbowaliśmy prześledzić linię głównych komórek za pomocą Mist1-CreERT2; Myszy R26-LSL-mTmG, w których komórki główne z dodatnim wynikiem Mist1 są znakowane GFP ukierunkowanym na błonę. Jednak zaobserwowaliśmy tylko ograniczoną liczbę komórek znakowanych GFP u myszy MT-TGFα. Sugeruje to, że albo większość głównych komórek znakowanych GFP zmarła z powodu nadekspresji TGFα, albo skuteczność znakowania GFP w głównych komórkach była zbyt niska. Ponieważ doniesiono, że nie było wzrostu śmierci komórek przez nadekspresję TGFα8, zbadaliśmy możliwość utraty ekspresji Mist1, oceniając MT-TGFα myszy bez leczenia metalami ciężkimi. Byliśmy zaskoczeni pełnymi fenotypami u myszy MT-TGFα bez leczenia metalami ciężkimi, w tym przerost dołka i utrata komórek ciemieniowych i głównych. Potwierdziliśmy również, że ekspresja Mist1 jest tracona u myszy MT-TGFα nawet bez leczenia metalami ciężkimi. Wcześniej donoszono, że ekspresja TGFα nie była ściśle kontrolowana u myszy MT-TGFα z powodu niezdolności do wyeliminowania ekspozycji na metale ciężkie; jednak ekspresja TGFα została znacznie zwiększona przez obróbkę metalami ciężkimi8. Kompleksowa ocena fenotypowa nie została wcześniej przeprowadzona u myszy MT-TGFα bez leczenia metalami ciężkimi. Obecne badanie pokazuje, że myszy MT-TGFα rozwijają pełną manifestację fenotypową bez leczenia metalami ciężkimi.

Ponieważ ekspresja Mist1 została utracona u myszy MT-TGFα jeszcze przed traktowaniem metalami ciężkimi, pozostała potrzeba innego modelu mysiego, w którym ekspresja TGFα jest specyficznie kontrolowana, aby fenotypy nie rozwijały się bez indukcji TGFα nadekspresja. Stworzyliśmy nowy mysi model MD, w którym ekspresja TGFα jest indukowana przez leczenie doksycykliną (Doxi-TGFα). Potwierdziliśmy, że ten model mysi indukuje przerost dołka i utratę komórek ciemieniowych i głównych, które są głównymi fenotypami MD. Udało nam się ustalić linię śledzenia głównych komórek za pomocą Mist1-CreERT2; Myszy R26-LSL-mTmG w tym modelu mysim i odkryły, że niektóre komórki znakowane GFP były również znakowane GSII i CD44v9, co potwierdza, że SPEM występuje w tym nowym modelu myszy MD. Jest to pierwsze doniesienie potwierdzające, że SPEM rozwija się w żołądku z nadekspresją TGFα. SPEM jest bardziej powszechnym stanem przednowotworowym żołądka, który może być przyczyną zwiększonego zachorowań na raka żołądka u pacjentów z MD22,23.

Jednym z zastrzeżeń związanych z używaniem linii myszy Mist1-CreERT2 jest to, że doniesiono, że Mist1 może również ulegać ekspresji w komórkach macierzystych żołądka24. Stwierdziliśmy, że niska dawka (37,5 mg / kg) leczenia tamoksyfenem indukuje aktywację Cre, bardziej szczegółowo w głównych komórkach, z minimalną aktywacją w regionie przesmyku nawet we wcześniejszych punktach czasowych przed leczeniem doksycykliną. Podobne wyniki odnotowano już wcześniej25 rok. Śledzenie pochodzenia za pomocą Mist1-CreERT2; Myszy R26-LSL-mTmG wykazują komórki GFP dodatnie w pobliżu GFP i markera SPEM (GSII i CD44v9), podwójnie dodatnie komórki są zlokalizowane głównie w podstawie, w której znajdują się główne komórki (Figura 4C). Jeśli podwójnie dodatnie komórki markera GFP i SPEM są śledzone z komórek macierzystych, powinno być więcej komórek GFP-dodatnich w kierunku przesmyku, w którym znajdują się komórki macierzyste. Alternatywnie, indukowana doksycykliną mysz GIF-rtTA linii26 lub GPR30-rtTA mysia linia27 może być używana wraz z myszami MT-TGFα do modyfikacji genetycznych lub śledzenia linii głównych komórek. Jednak komórki GIF-dodatnie są zmniejszone u myszy MT-TGFα bez leczenia ZnSO4 (Figura 3B, C), a komórki GPR30-dodatnie są tracone w SPEM, co występuje u myszy MT-TGFα bez leczenia ZnSO4. W związku z tym będą one mniej wydajne w porównaniu z myszami Doxi-TGFα skrzyżowanymi z linią myszy Mist1-CreERT2.

Obecne badanie pokazuje, że myszy MT-TGFα rozwijają pełne zmiany fenotypowe w żołądku bez leczenia metalami ciężkimi. Pokazujemy również, że jednym z fenotypów jest utrata ekspresji Mist1, co wyklucza użycie Mist1-CreERT2; Linia myszy R26-LSL-mTmG do głównych komórek śladowych linii. Stworzyliśmy nowy model myszy MD, Doxi-TGFα, i po raz pierwszy potwierdziliśmy, że SPEM rozwija się w MD przy użyciu tego modelu mysiego. Ten nowatorski model myszy MD będzie przydatny, gdy konieczna jest precyzyjna kontrola rozwoju fenotypów MD oraz gdy potrzebne są modyfikacje genetyczne w głównych komórkach przy użyciu linii myszy Mist1-CreERT2. Fenotypy MD są indukowane przez aktywację sygnalizacji EGFR przez nadekspresję TGFα. Nie wiadomo jednak, jaka jest aktywacja EGFR, w której typie komórek są odpowiedzialne za obserwowane fenotypy. Korzystając z mysiego modelu Doxi-TGFα, badamy obecnie rolę sygnalizacji EGFR w różnych typach komórek, w tym w głównych komórkach wykorzystujących linię myszy Mist1-CreERT2.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodowy Instytut Cukrzycy i Chorób Trawiennych i Nerek (K08 DK124686 do WJH). Dziękujemy Ginie Della Porta i Sarah E. Glass za redakcję rękopisu.

Wkład autora:
TTG przeprowadzało eksperymenty, generowało figury, pisało rękopis i redagowało rękopis. JDP przeprowadzało eksperymenty, generowało figury, pisało rękopis i redagowało rękopis. SKM dostarczyła linię myszy TetO-TGFα i zredagowała manuskrypt. RJC wymyślił eksperymenty i zredagował rękopis. WJH opracowywał eksperymenty, przeprowadzał eksperymenty, interpretował dane, przeszukiwał literaturę, pisał rękopis i redagował rękopis.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mysie przeciwciało anty H+/K+-ATPazaPrezent od dr Eunyoung ChoiNie dotyczyRozcieńczenie: 1:10000 Rozcieńczalnik
przeciwciał Abcam559148
Anty-królik GFPLife Technologies CorporationA11122Rozcieńczenie: 1:500
Naładowane szkiełkaFisher22-178-277
Okładka SlipsGlobe Scientific1411-10
Osioł anty-mysz 594InvitrogenA12102Rozcieńczenie: 1:500
Osioł anty-królik 488InvitrogenA21206Rozcieńczenie: 1:500
Osioł anty-królik 594InvitrogenA21207Rozcieńczenie: 1:500
Osioł anty-szczur 594InvitrogenA21209Rozcieńczenie: 1:500
Hydrykulat doksyklicynyTCID4116
Flouromount-GThermo fischer00-4958-02
GSII 488InvitrogenL21415Rozcieńczenie: 1:500
Marker hydrofobowyMikroskopia elektronowa Sciences71312
InkubatorLabnetI 5110
MIST1/bHLHa15 (D7N4B) XP  Sygnalizacja komórkowa mAb królika14896SRozcieńczenie: 1:200
Szybkowar (6QT)CuisinartCPC-600N1
Blok białkowyAbcamAB64226
Królicze przeciwciało anty-GIFMyBioSourceMBS2028736Rozcieńczenie: 1:200
Szczur anty CD44v9 mAbCosmo BioLKG-M002Rozcieńczenie: 1:20000
Słoiki ślizgoweSimportM906-12AS
TamoxifenSigma-AldrichT5648
TrilogySigma922P-10-RUO
UEA1 Dylight 649Vector LaboratoriesDL-1068Rozcieńczenie: 1:500

Bibliografia

  1. Huh, W. J., Coffey, R. J., Washington, M. K. Menetrier's disease: Its mimickers and pathogenesis. J Pathol Transl Med. 50 (1), 10-16 (2016).
  2. Tanksley, J. Jr, Tanksley, J. Pierre menetrier and his disease. Trans Am Clin Climatol Assoc. 123, discussion 133-124 126-133 (2012).
  3. Rich, A., et al. Distinguishing menetrier's disease from its mimics. Gut. 59 (12), 1617-1624 (2010).
  4. Takagi, H., Jhappan, C., Sharp, R., Merlino, G. Hypertrophic gastropathy resembling menetrier's disease in transgenic mice overexpressing transforming growth factor alpha in the stomach. J Clin Invest. 90 (3), 1161-1167 (1992).
  5. Dempsey, P. J., et al. Possible role of transforming growth factor alpha in the pathogenesis of menetrier's disease: Supportive evidence form humans and transgenic mice. Gastroenterology. 103 (6), 1950-1963 (1992).
  6. Fiske, W. H., et al. Efficacy of cetuximab in the treatment of menetrier's disease. Sci Transl Med. 1 (8), 8ra18(2009).
  7. Burdick, J. S., et al. Treatment of menetrier's disease with a monoclonal antibody against the epidermal growth factor receptor. N Engl J Med. 343 (23), 1697-1701 (2000).
  8. Goldenring, J. R., et al. Overexpression of transforming growth factor-alpha alters differentiation of gastric cell lineages. Dig Dis Sci. 41 (4), 773-784 (1996).
  9. Sharp, R., et al. Transforming growth factor alpha disrupts the normal program of cellular differentiation in the gastric mucosa of transgenic mice. Development. 121 (1), 149-161 (1995).
  10. Bockman, D. E., Sharp, R., Merlino, G. Regulation of terminal differentiation of zymogenic cells by transforming growth factor alpha in transgenic mice. Gastroenterology. 108 (2), 447-454 (1995).
  11. Nomura, S., et al. Evidence for repatterning of the gastric fundic epithelium associated with menetrier's disease and tgfalpha overexpression. Gastroenterology. 128 (5), 1292-1305 (2005).
  12. Shi, G., et al. Loss of the acinar-restricted transcription factor mist1 accelerates kras-induced pancreatic intraepithelial neoplasia. Gastroenterology. 136 (4), 1368-1378 (2009).
  13. Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10933-10938 (1996).
  14. Hardie, W. D., et al. Conditional expression of transforming growth factor-alpha in adult mouse lung causes pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (4), L741-L749 (2004).
  15. Keeley, T. M., Horita, N., Samuelson, L. C. Tamoxifen-induced gastric injury: Effects of dose and method of administration. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (3), 365-367 (2019).
  16. Huh, W. J., et al. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24.e7 (2012).
  17. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
  18. Ramsey, V. G., et al. The maturation of mucus-secreting gastric epithelial progenitors into digestive-enzyme secreting zymogenic cells requires mist1. Development. 134 (1), 211-222 (2007).
  19. Huh, W. J., et al. Xbp1 controls maturation of gastric zymogenic cells by induction of mist1 and expansion of the rough endoplasmic reticulum. Gastroenterology. 139 (6), 2038-2049 (2010).
  20. Engevik, A. C., et al. The development of spasmolytic polypeptide/tff2-expressing metaplasia (spem) during gastric repair is absent in the aged stomach. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (5), 605-624 (2016).
  21. Wada, T., et al. Functional role of cd44v-xct system in the development of spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia. Cancer Sci. 104 (10), 1323-1329 (2013).
  22. Halldorsdottir, A. M., et al. Spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia (spem) associated with gastric cancer in iceland. Dig Dis Sci. 48 (3), 431-441 (2003).
  23. Yamaguchi, H., Goldenring, J. R., Kaminishi, M., Lee, J. R. Identification of spasmolytic polypeptide expressing metaplasia (spem) in remnant gastric cancer and surveillance postgastrectomy biopsies. Dig Dis Sci. 47 (3), 573-578 (2002).
  24. Hayakawa, Y., et al. Mist1 expressing gastric stem cells maintain the normal and neoplastic gastric epithelium and are supported by a perivascular stem cell niche. Cancer Cell. 28 (6), 800-814 (2015).
  25. Saenz, J. B., Vargas, N., Cho, C. J., Mills, J. C. Regulation of the double-stranded rna response through adar1 licenses metaplastic reprogramming in gastric epithelium. JCI Insight. 7 (3), e153511(2022).
  26. Caldwell, B., Meyer, A. R., Weis, J. A., Engevik, A. C., Choi, E. Chief cell plasticity is the origin of metaplasia following acute injury in the stomach mucosa. Gut. 71 (6), 1068-1077 (2022).
  27. Hata, M., et al. Gpr30-expressing gastric chief cells do not dedifferentiate but are eliminated via pdk-dependent cell competition during development of metaplasia. Gastroenterology. 158 (6), 1650-1666.e15 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Choroba Menetrieranadekspresja TGF alfasygnalizacja EGFRhiperplazja do eczkowautrata kom rek ok adzinowychmyszy Mist1 CreERT2indukcja doksycyklinmetaplazja spodglajkowar nicowanie kom rek g wnych
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły