Skrupulatne i ustrukturyzowane podejście jest stosowane do selekcji odpornych i wrażliwych genów promieniowania poprzez zastosowanie metody przesiewowej CRISPR/Cas9 obejmującej cały genom. Protokół ten ma również potencjał, aby służyć jako wszechstronne ramy dla innych przedsięwzięć badawczych badających mechanizmy oporności na klinicznie podawane leki chemiczne.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie przesiewowe CRISPR obejmujące cały genom do odkrywania genów radiowrażliwych i odpornych na promieniowanie
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
System CRISPR-Cas9 został wykorzystany i przekształcony w potężne narzędzie do edycji genomu. Wykorzystując tę technologię, naukowcy mogą precyzyjnie wycinać, wklejać, a nawet przepisywać sekwencje DNA w żywych komórkach. Niemniej jednak zastosowanie technologii ekranów CRISPR wykracza daleko poza zwykłe eksperymenty. Służy jako kluczowe narzędzie w walce z chorobami genetycznymi, systematycznie analizując złożone krajobrazy genetyczne, umożliwiając naukowcom rozwikłanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zjawisk biologicznych oraz umożliwiając naukowcom identyfikację i celowanie w podstawowe przyczyny chorób, takich jak rak, mukowiscydoza i anemia sierpowatokrwinkowa. Przede wszystkim rak stanowi ogromne wyzwanie dla medycyny, pobudzając wysiłki na rzecz jego wyeliminowania. Radioterapia, jako tradycyjne leczenie, daje efekty, ale ma ograniczenia. Likwiduje komórki rakowe, ale także uszkadza zdrowe tkanki, powodując niekorzystne skutki, które obniżają jakość życia. Ponadto nie wszystkie komórki rakowe reagują na radioterapię, a niektóre mogą rozwinąć oporność, pogarszając stan. Aby rozwiązać ten problem, wprowadzono kompleksową technologię badań przesiewowych CRISPR całego genomu, ponieważ umożliwia ona skuteczną identyfikację genów wrażliwych i odpornych na promieniowanie promieniotwórczych, posuwając się w ten sposób naprzód w dziedzinie badań i leczenia raka. Przeprowadzono badanie przesiewowe CRISPR całego genomu w komórkach gruczolakoraka płuc wystawionych na napromienianie zgodnie z opisanym protokołem, dzięki któremu zidentyfikowano zarówno geny związane z radioopornością, jak i wrażliwością na promieniowanie.
Wprowadzenie
Badanie zjawisk biologicznych jest nierozerwalnie związane z badaniem zachowań komórkowych, a z kolei badanie zachowań komórkowych jest zasadniczo związane z badaniem ich genomu. Wraz z rozwojem nowoczesnej technologii, naukowcy medyczni stopniowo przekierowują swoją uwagę na zmianę zachowań komórkowych poprzez edycję genów w celu poprawy wyników leczenia różnych chorób. W związku z tym technologia CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) stała się rewolucyjnym narzędziem do edycji genomu ze względu na stosunkowo prostą aplikację1. System CRISPR-Cas9 składa się z nukleazy Cas9 i jednoprowadnicowego RNA (sgRNA)....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Wybór odpowiedniej dawki promieniowania
- Przygotowanie i powlekanie komórek adherentnych
- Dostosuj gęstość komórek do 5 x 105 komórek na ml za pomocą kompletnej pożywki do hodowli komórkowych RPMI 1640 zawierającej 10% FBS do pasażu i wzrostu komórek. Rozmieść komórki do 3,5-centymetrowych naczyń hodowlanych w celu napromieniowania w różnych dawkach. Dodać 2 ml (1 x 106 komórek) do każdego naczynia i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- S....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rak płuca, charakteryzujący się najwyższym wskaźnikiem śmiertelności, jest chorobą medyczną o wysokim stopniu agresywności i rozpowszechnienia. Wykorzystując linię komórkową raka płuca A549 jako model do przeprowadzenia genomowego przesiewu CRISPR z promieniowaniem jako warunkiem selekcji, schematyczny przebieg prac przedstawiono na Ryc. 1. W pierwszej kolejności zbadano wrażliwość komórek A549 na różne dawki promieniowania za pomocą testu tworzenia kolonii oraz testu CCK8 (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jako najnowocześniejsza technologia edycji genów, ekran CRISPR zapoczątkował głębokie zmiany w dziedzinie badań naukowych5. Technologia ta, wywodząca się z systemu CRISPR-Cas9, stała się niezbędnym narzędziem do badania funkcji genów ze względu na swoją wysoką wydajność i precyzję9. Zasada inżynierii CRISPR/Cas9 polega na projektowaniu i wprowadzaniu specyficznych sgRNA z około 20 nukleotydami, które kierują nukleazą Cas9 w celu precyzyjnego zlokalizowania i przecięcia doce.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Regionalny Projekt Innowacji Naukowych i Technologicznych Prowincji Hubei (2024EIA001) oraz Projekt Wsparcia Budowy Platformy Innowacji Medycznych i Technologicznych Szpitala Zhongnan Uniwersytetu Wuhan (PTXM2025001). Rysunek 1 został utworzony przy użyciu narzędzia Figdraw.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Naczynie do hodowli komórkowych i tkankowych 150 mm | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 715011 | Naczynie do hodowli komórkowych |
| i tkankowych 35 mm | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 706011 | Hodowla komórkowa |
| Linia komórkowa A549 | ATCC | - | |
| Zestaw do liczenia komórek-8 | Shanghai Beyotime Biotech Inc | C0041 | Do testu żywotności komórek |
| Pożywka niezależna od CO2 | PHCbi | MCO-50AIC | Hodowla komórkowa |
| Countess 3 FL Automatyczny licznik komórek | Themo Scientific | AMQAF2001 | Do liczenia komórek |
| EDTA | Gibco | 25200056 | Hodowla komórkowa |
| Surowica bydlęca | płodu Gibco | 10099141 | Hodowla komórkowa |
| Mikroskopia fluorescencyjna | LEICA | ebq 100-04 | Do mikroskopu fluorescencyjnego |
| Biblioteka lentiwirusowa CRISPR obejmująca cały genom | Shanghai OBiO Technology Co., Ltd. | H5070 | Do infekcji lentiwirusowej |
| MiniAmp plus PCR | Themo Scientific | C37835 | Do amplifikacji PCR |
| Płytki do hodowli komórkowych NEST, 12-dołkowe | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 712002 | Płytki |
| do hodowli komórkowych NEST, 6-dołkowe | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 703002 | Płytki |
| do hodowli komórkowych NEST, 96-dołkowe | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. | 701001 | Hodowla |
| komórkowa PBS | Gibco | C10010500BT | Starter do hodowli komórkowych |
| PCR (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) | Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd. | - | Do amplifikacji PCR |
| Odwrócony starter PCR (GATGTGCCTCTGCCCACTGACGGGCA) | Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd. | - | Do amplifikacji PCR |
| Polybrene | Shanghai Beyotime Biotech Inc | C0351 | Do infekcji lentiwirusowej |
| Puromycin | MCE | HY-K1057 | Do wyboru po zakażeniu lentiwirusowym |
| Pożywka do hodowli komórkowej RPMI 1640 | Gibco | 23400-021 | |
| Zestaw genomowego DNA do hodowli komórkowej TIANGENamp | Pekin TIANGEN Biotech Co., Ltd. | DP304 | Do ekstrakcji genomowego DNA |
| Dyfraktometr rentgenowski w proszku | PerkinElmer | Do radioterapii |
Bibliografia
- Barrangou, R., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas systems: Prokaryotes upgrade to adaptive immunity. Mol Cell. 54 (2), 234-244 (2014).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-8....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
