Artykuł metodologiczny

Badanie przesiewowe CRISPR obejmujące cały genom do odkrywania genów radiowrażliwych i odpornych na promieniowanie

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67982

⸱

23 maja 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pulmonary Oncology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Tumor Precision Diagnosis and Treatment Technology and Translational Medicine, Hubei Engineering Research Center, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 3Hubei Key Laboratory of Tumor Biological Behaviors, Zhongnan Hospital of Wuhan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Skrupulatne i ustrukturyzowane podejście jest stosowane do selekcji odpornych i wrażliwych genów promieniowania poprzez zastosowanie metody przesiewowej CRISPR/Cas9 obejmującej cały genom. Protokół ten ma również potencjał, aby służyć jako wszechstronne ramy dla innych przedsięwzięć badawczych badających mechanizmy oporności na klinicznie podawane leki chemiczne.

Streszczenie

System CRISPR-Cas9 został wykorzystany i przekształcony w potężne narzędzie do edycji genomu. Wykorzystując tę technologię, naukowcy mogą precyzyjnie wycinać, wklejać, a nawet przepisywać sekwencje DNA w żywych komórkach. Niemniej jednak zastosowanie technologii ekranów CRISPR wykracza daleko poza zwykłe eksperymenty. Służy jako kluczowe narzędzie w walce z chorobami genetycznymi, systematycznie analizując złożone krajobrazy genetyczne, umożliwiając naukowcom rozwikłanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zjawisk biologicznych oraz umożliwiając naukowcom identyfikację i celowanie w podstawowe przyczyny chorób, takich jak rak, mukowiscydoza i anemia sierpowatokrwinkowa. Przede wszystkim rak stanowi ogromne wyzwanie dla medycyny, pobudzając wysiłki na rzecz jego wyeliminowania. Radioterapia, jako tradycyjne leczenie, daje efekty, ale ma ograniczenia. Likwiduje komórki rakowe, ale także uszkadza zdrowe tkanki, powodując niekorzystne skutki, które obniżają jakość życia. Ponadto nie wszystkie komórki rakowe reagują na radioterapię, a niektóre mogą rozwinąć oporność, pogarszając stan. Aby rozwiązać ten problem, wprowadzono kompleksową technologię badań przesiewowych CRISPR całego genomu, ponieważ umożliwia ona skuteczną identyfikację genów wrażliwych i odpornych na promieniowanie promieniotwórczych, posuwając się w ten sposób naprzód w dziedzinie badań i leczenia raka. Przeprowadzono badanie przesiewowe CRISPR całego genomu w komórkach gruczolakoraka płuc wystawionych na napromienianie zgodnie z opisanym protokołem, dzięki któremu zidentyfikowano zarówno geny związane z radioopornością, jak i wrażliwością na promieniowanie.

Wprowadzenie

Badanie zjawisk biologicznych jest nierozerwalnie związane z badaniem zachowań komórkowych, a z kolei badanie zachowań komórkowych jest zasadniczo związane z badaniem ich genomu. Wraz z rozwojem nowoczesnej technologii, naukowcy medyczni stopniowo przekierowują swoją uwagę na zmianę zachowań komórkowych poprzez edycję genów w celu poprawy wyników leczenia różnych chorób. W związku z tym technologia CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) stała się rewolucyjnym narzędziem do edycji genomu ze względu na stosunkowo prostą aplikację1. System CRISPR-Cas9 składa się z nukleazy Cas9 i jednoprowadnicowego RNA (sgRNA), który specyficznie rozpoznaje i wiąże się z docelową sekwencją DNA, kierując nukleazę Cas9 do cięcia w tym miejscu, powodując pęknięcie podwójnej nici (DSB) w genomie DNA2,3,4. Ponadto wprowadzenie innych substancji może prowadzić do określonych insercji, delecji lub mutacji w genomie, umożliwiając ukierunkowaną edycję genów.

W badaniach genomiki funkcjonalnej, badanie interferencyjne RNA (RNAi) było kiedyś powszechnie stosowaną metodą przeprowadzania eksperymentów na dużą skalę dotyczących utraty funkcji w celu zbadania roli genów w raku. Technologia RNAi bada funkcję genów poprzez specyficzne wyciszanie genów docelowych, pomagając naukowcom zidentyfikować krytyczne czynniki onkogenne. Jest jednak ograniczony przez efekty niezamierzone i niepełną skuteczność knockdownu genu. Efekty niezgodne z celem mogą prowadzić do wyciszenia innych genów niebędących celem, co negatywnie wpływa na dokładność i wiarygodność wyników eksperymentalnych1,2. Ponadto RNAi wykazuje niską skuteczność knockdown dla niektórych genów, potencjalnie nie hamując w pełni ekspresji genów docelowych. W przeciwieństwie do tradycyjnych ekranów RNAi, ekran CRISPR wykazuje wyższą specyficzność i wydajność3. Technologia ta nie tylko umożliwia precyzyjną edycję określonych genów, ale także pozwala na badania przesiewowe na dużą skalę całego genomu, zapewniając solidne wsparcie dla badań nad funkcjami genów. Technologia ekranowania CRISPR, potężne narzędzie do edycji genów oparte na systemie CRISPR-Cas9, służy do efektywnego badania przesiewowego i odkrywania nieznanych funkcji określonych genów w komórkach5,6,7,8. Naukowcy projektują sgRNA w partiach dla określonych genów lub regionów genów i przygotowują odpowiednie biblioteki sgRNA z precyzją i rygorem, zapewniając ich integralność i funkcjonalność9. Te biblioteki sgRNA są następnie zamykane w cząsteczkach lentiwirusa, które są wykorzystywane do skutecznego infekowania komórek gospodarza. Po udanej infekcji zakażone komórki są hodowane w indywidualnie określonych warunkach przesiewowych. Podczas badań przesiewowych genomowe DNA z przebadanych komórek jest ekstrahowane, przy zachowaniu wysokich standardów czystości i ilości. Następnie docelowe regiony zainteresowania sgRNA są poddawane amplifikacji PCR, procesowi, który dokładnie replikuje pożądane segmenty kwasów nukleinowych3,9. Wreszcie, na amplifikowanych fragmentach DNA przeprowadza się sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości, co umożliwia kompleksową i wydajną analizę docelowych regionów, dostarczając w ten sposób cennych informacji na temat funkcji i zachowania badanych genów4.

Rak stanowi ogromne zagrożenie dla ludzkiego zdrowia jako złożona choroba. Na całym świecie naukowcy i klinicyści podejmują wspólne wysiłki, aby rozwikłać molekularne mechanizmy kancerogenezy i opracować nowe strategie terapeutyczne. Współpraca międzynarodowa została nawiązana w celu przyspieszenia przekładania wyników badań podstawowych na zastosowania kliniczne, a ostatecznym celem jest poprawa wyników leczenia pacjentów. Sasmal i in. zaproponowali strategię bioortogonalnego składania opartą na syntetycznym układzie gospodarz-gość do precyzyjnego celowania w przerzutowe komórki rakowe, co znacząco pomogło dziesiątkom naukowców w rozwoju technologii medycznych. Ich wybitna praca badawcza charakteryzuje się wysoką innowacyjnością i unikalnymi spostrzeżeniami, wnosząc znaczący wkład w społeczność naukową10. Rak charakteryzuje się burzliwym stanem niestabilności genomu, wynikającym z niekonsekwentnej regulacji odpowiedzi na uszkodzenia DNA11,12,13,14. Uszkodzenia DNA obejmują defekty pojedynczych nukleotydów, pęknięcia pojedynczej nici i DSB. Rekombinacja homologiczna (HR) i niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) uczestniczą w naprawie DSB na różnych etapach15,16,17. Na tej podstawie radioterapia stała się realną opcją leczenia, która wykorzystuje promienie o wysokiej energii (takie jak promienie rentgenowskie i promienie γ) do napromieniania tkanki nowotworowej, powodując uszkodzenie DNA w komórkach nowotworowych, zakłócając w ten sposób ich wzrost i proliferację18. Jednak radioterapia nie zawsze przynosi pożądane efekty u znacznej części pacjentów z nowotworami, co może wynikać z uszkodzeń tkanek przynowotworowych i ograniczeń wynikających z nieodłącznych cech nowotworu, takich jak niska wrażliwość na radioterapię19,20,21.

Teoretycznie, każdy typ komórki może być użyty do ekranu CRISPR. Jednak utrzymanie wystarczającej reprezentacji w zmutowanych populacjach wymaga dużej liczby komórek wyjściowych. Typy komórek o niskiej liczebności nie są szczególnie odpowiednie do badań przesiewowych całego genomu. Jeśli chodzi o wybór biblioteki, większość bibliotek zawiera 3-6 gRNA na gen docelowy, a utrzymanie dystrybucji każdego gRNA w populacji jest krytyczne18. Utrata reprezentacji spowodowana wzbogaceniem lub wyczerpaniem określonych gRNA może prowadzić do nierównomiernego rozkładu wyników. Aby rozwiązać ten problem, preferowanym wyborem może być wybór dostępnych na rynku bibliotek CRISPR, które zostały przetestowane na rynku20. Metody in vitro Badania przesiewowe CRISPR z wykorzystaniem jednorodnych linii komórek nowotworowych mogą nie uchwycić w pełni genetycznej i epigenetycznej heterogeniczności nowotworów in vivo. Podczas gdy badania przesiewowe in vitro ujawniły kluczowe geny zaangażowane w naprawę uszkodzeń DNA i sygnalizację autokrynną indukowaną promieniowaniem, nie replikowały w pełni mikrośrodowiska guza, w tym oporności na promieniowanie wywołanej niedotlenieniem (poprzez ROS, adaptację metaboliczną i autofagię), efektów parakrynnych za pośrednictwem układu immunologicznego i modulacji cytokin zależnej od ECM. Przed zastosowaniem badania przesiewowego CRISPR do zbadania genów związanych z wrażliwością na promieniowanie lub odpornością na promieniowanie, czynniki te należy dokładnie rozważyć. W świetle obecnego krajobrazu leczenia pilne jest zidentyfikowanie i dogłębne zbadanie czynników związanych z radioopornością i wrażliwością na radioterapię, aby skutecznie zwiększyć skuteczność radioterapii22. Biorąc pod uwagę kluczową zaletę ekranu CRISPR w badaniu funkcji nieznanych genów, zapewniono systematycznie szczegółową technologię badań przesiewowych CRISPR całego genomu, aby skutecznie identyfikować geny wrażliwe na promieniowanie i odporne na promieniowanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Wybór odpowiedniej dawki promieniowania

  1. Przygotowanie i powlekanie komórek adherentnych
    1. Dostosuj gęstość komórek do 5 x 105 komórek na ml za pomocą kompletnej pożywki do hodowli komórkowych RPMI 1640 zawierającej 10% FBS do pasażu i wzrostu komórek. Rozmieść komórki do 3,5-centymetrowych naczyń hodowlanych w celu napromieniowania w różnych dawkach. Dodać 2 ml (1 x 106 komórek) do każdego naczynia i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Stosowanie różnych dawek promieniowania
    1. Ponumeruj 3,5-centymetrowe naczynia hodowlane od 1 do 5. Wykorzystaj grupę #1 jako grupę kontrolną, a pozostałe 4 grupy wyznaczone jako grupy terapeutyczne.
    2. Uszczelnij krawędzie płytek 6-dołkowych membraną uszczelniającą dla grup poddanych działaniu substancji i podaj dawki promieniowania odpowiednio 2, 4, 6 i 8 Gy. Po zabiegu włóż naczynia z powrotem do inkubatora.
  3. Posiewanie linii komórkowych po napromieniowaniu
    1. Przygotuj płytki 6-dołkowe i 96-dołkowe. Umyj komórki w 3,5-centymetrowych szalkach hodowlanych raz PBS, strawij logarytmicznie rosnące komórki 0,25% trypsyny i dostosuj gęstość komórek do 1 x 105 komórek na ml za pomocą kompletnej pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS.
    2. Zasiać 10 μl/basenik (1,000 komórek/100 μl) do płytek 6-dołkowych w 3 powtórzeniach dla każdej dawki promieniowania. Dodaj 2 ml kompletnej pożywki do każdej studzienki i policz po 14 dniach (gdy każda grupa klonów ma około 50 komórek).
    3. Seed 30 μL/basenik (3,000 komórek/100 μL) do 96-dołkowych płytek po 5 powtórzeniach dla każdej dawki promieniowania. Dodać 70 μl kompletnej pożywki do każdego dołka i zmierzyć żywotność komórek po 72 godzinach.
  4. Pomiar żywotności komórek
    UWAGA: Wskaźnik inhibicji klonogennej = 1 - (liczba klonów w grupie leczonej/liczba klonów w grupie kontrolnej) x 100%. Test CCK-8 wykorzystuje rozpuszczalną w wodzie sól tetrazolową (WST-8), która może być redukowana przez dehydrogenazy komórkowe w celu wytworzenia wysoce rozpuszczalnego w wodzie żółtego produktu formazanu11. Ilość wytwarzanego formazanu jest wprost proporcjonalna do liczby żywotnych komórek, a jego gęstość optyczna (mierzona przy długości fali 450 nm) dokładnie odzwierciedla komórkową aktywność metaboliczną i status proliferacyjny11,13. Opierając się na tej ugruntowanej zasadzie, test CCK-8 został szeroko przyjęty do różnych zastosowań, w tym do testów proliferacji komórek i testów wrażliwości na leki nowotworowe. W tym protokole test CCK-8 jest stosowany do systematycznej oceny żywotności komórek przy różnych dawkach promieniowania.
    1. Wymieszaj odczynnik CCK8 z podłożem RPMI 1640 bez FBS w stosunku 1:9. Odrzucić pożywkę z 96-dołkowych płytek i dodać 100 μl pożywki zawierającej CCK8 do każdej studzienki.
    2. Inkubować w ciemności przez 1 godzinę i zmierzyć wartość OD przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
      UWAGA: Wskaźnik przeżycia komórek = [(wartość OD grupy poddanej działaniu ślepej próby - wartość OD studzienki ślepej) / (wartość OD grupy kontrolnej - wartość OD studzienki ślepej)] x 100%
  5. Dobór dawki promieniowania
    1. Zintegruj szybkość inhibicji klonogennej ze współczynnikiem przeżycia komórek, aby wybrać odpowiednią dawkę promieniowania w oparciu o potrzeby badawcze. Wybierz dawkę promieniowania o współczynniku inhibicji wynoszącym 50% do badań przesiewowych zarówno genów opornych na promieniowanie, jak i wrażliwych na promieniowanie.

2. Wybór odpowiedniego stężenia MOI i puromycyny

  1. Posiewanie komórek przylegających
    1. Dostosuj gęstość komórek do 3 x 105 komórek na ml i zaszczepij 1 ml (3 x 105 komórek) na studzienkę na płytkę 12-dołkową. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Infekcja lentiwirusowa
    1. Za pomocą pipety zassać pożywkę z płytki 12-dołkowej i zastąpić ją 1 ml kompletnej pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS. Przygotuj sprawdzoną jakościowo, całogenomową bibliotekę lentiwirusową CRISPR (zalecane są biblioteki dostępne na rynku) i ustaw logarytmiczny gradient stężeń (np. 0-10-50-100-200-400-800)4,5,6,7,8.
    2. Dodać odpowiednią ilość lentiwirusa do 2 μl/naczynie polibrenu i równoważyć w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Mieszaninę lentiwirusa i polibrenu powoli wlać do każdej studzienki, dobrze wymieszać i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  3. Oznaczanie minimalnego stężenia puromycyny do zabijania komórek
    1. Dostosuj gęstość komórek rodzicielskich do 3 x 105 komórek/ml i zaszczepij 1 ml (3 x 105 komórek) na studzienkę do płytki 12-dołkowej. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    2. Dodaj puromycynę do każdego dołka 12-dołkowej płytki w gradieniu stężeń 0-0,1-0,2-0,5-1-2-4-8 μM. Policz komórki po 72 godzinach. Minimalne stężenie, które zabija wszystkie komórki w studzience, to minimalne stężenie puromycyny do zabijania komórek, które zostanie wykorzystane do późniejszych badań przesiewowych komórek zakażonych wirusem.
  4. Selekcja puromycyny po zakażeniu
    1. Na drugi dzień po zakażeniu odessać pożywkę z każdej studzienki i zastąpić ją 1 ml kompletnej pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS. Kontynuuj hodowlę przez 48 godzin.
    2. Po 72 godzinach od zakażenia należy zastąpić dotychczasową pożywkę kompletną pożywką zawierającą minimalne stężenie puromycyny do zabijania komórek. Ustawić 2 dołki na 12-dołkowej płytce bez infekcji lentiwirusowej jako kontrole negatywne i pozytywne. Kontrolę ujemną należy potraktować puromycyną, a kontrolę pozytywną pozostawić nieleczoną. Kontynuuj hodowlę przez 72 godziny.
    3. Po 72 godzinach selekcji puromycyny wszystkie komórki rodzicielskie w kontroli ujemnej będą martwe, podczas gdy komórki rodzicielskie w kontroli pozytywnej wykazują minimalną śmierć. Oblicz MOI dla każdego dołka.
      UWAGA: MOI = (Liczba komórek w grupie zakażonej wirusem / Liczba komórek w grupie kontroli pozytywnej) x 100%. Użyj stężenia wirusa o MOI ~0,3 do późniejszych badań przesiewowych.

3. Zakażenie biblioteki lentiwirusowej CRISPR w całym genomie

  1. Wysiew przylegających linii komórkowych
    1. Dostosuj gęstość komórek do 1 x 107 komórek na ml w kompletnym pożywce RPMI 1640 zawierającej 10% FBS do pasażowania i wzrostu komórek. Zaszczepić 1 ml komórek (1 x 107 komórek) w każdej 15-centymetrowej naczyniu hodowlanej w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 8 godzin. Gdy komórki przylegały i osiągnęły konfluencję 70%-80%, były gotowe do infekcji wirusowej (co daje liczbę kopii około 500).
  2. Infekcja lentiwirusowa
    1. Odessać pożywkę z 15-centymetrowych szalek hodowlanych i zastąpić ją 15 ml kompletnej pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS. Przygotuj sprawdzoną pod kątem jakości bibliotekę lentiwirusową CRISPR całego genomu.
    2. Dodać odpowiednią ilość lentiwirusa o MOI = 0,3 do 30 μl/naczynie polibrenu i równoważyć w temperaturze pokojowej przez 5 minut, powoli wlać mieszaninę lentiwirusa i polibrenu do 15-centymetrowych szalek hodowlanych, dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez noc. Jednocześnie przygotuj 15-centymetrowe naczynie hodowlane z komórką rodzicielską jako kontrastem.
  3. Selekcja puromycyny po zakażeniu
    1. Na drugi dzień po infekcji wirusowej odessać pożywkę z 15-centymetrowych szalek hodowlanych i zastąpić ją 15 ml kompletnej pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS. Kontynuuj hodowlę przez 48 godzin.
    2. Po 72 godzinach od zakażenia należy zastąpić pożywkę kompletną pożywką zawierającą minimalne stężenie śmiertelne puromycyny. W ten sam sposób należy traktować niezakażone komórki rodzicielskie jako kontrolę ujemną i kontynuować hodowlę przez 72 godziny. Po 72 godzinach selekcji puromycyny wszystkie komórki rodzicielskie w grupie kontroli ujemnej zostaną zabite, a komórki, które przeżyły z infekcji lentiwirusowej, uważa się za pomyślnie zakażone.
  4. Ekstrakcja genomu dnia 0
    1. Strawić komórki z jednej 15-centymetrowej płytki hodowlanej przy użyciu 0,25% trypsyny, ponownie zawiesić w kompletnej pożywce RPMI 1640 zawierającej 10% FBS i policzyć liczbę komórek. Oznacz tę próbkę jako Dzień 0.
    2. Wirować przy 300 x g przez 5 minut (w temperaturze pokojowej) i wyrzucić supernatant. Zawiesić ponownie w 1 ml PBS, odwirować przy 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Wyodrębnij genomowe DNA dnia 0, zmierz stężenie i czystość DNA za pomocą spektrofotometru UV nanokropli.
    3. Do wykrywania integralności sgRNA użyj elektroforezy w żelu agarozowym do analizy amplifikowanej biblioteki sgRNA, upewniając się, że pasma są czyste i nie ulegają znaczącej degradacji, zachowując w ten sposób integralność biblioteki23. W celu oceny zasięgu biblioteki lentiwirusowej zastosuj technologię głębokiego sekwencjonowania, aby przeprowadzić analizę sekwencjonowania sgRNA w bibliotece24,25.
    4. W badaniu przesiewowym CRISPR amplifikacja PCR służy jako wstępna weryfikacja integralności fragmentu sgRNA i jakości biblioteki6. Aby bardziej kompleksowo przeanalizować pokrycie biblioteki i wzorce dystrybucji sgRNA oraz zapewnić odpowiednią reprezentację sgRNA dla każdego genu docelowego podczas badań przesiewowych, wykonaj NGS, aby uzyskać dogłębny wgląd w solidność screen9.
      UWAGA: Wykrywając zmiany w obfitości sgRNA przed i po badaniu przesiewowym oraz identyfikując potencjalną integrację sgRNA poza celem lub zanieczyszczenie biblioteki, dokładność i niezawodność badania przesiewowego CRISPR można jeszcze bardziej poprawić. Te próbki z dnia 0 służą jako kluczowe kontrole ujemne i przechodzą kompleksową ocenę jakości poprzez amplifikację PCR i NGS, aby osiągnąć 2 kluczowe cele: (1) potwierdzenie wyczerpania niezbędnych genów (wskazując na odpowiednią reprezentację biblioteki) oraz (2) wykazanie stabilnej ekspresji w nieistotnych genach (ustalenie eksperymentalnych warunków wyjściowych)9.
    5. Należy zapewnić, aby zakres osiągnął oczekiwany poziom, aby zapewnić różnorodność i reprezentatywność biblioteki oraz uniknąć stronniczości w procesie selekcji. Do pomiaru skuteczności infekcji należy użyć obrazowania fluorescencyjnego, aby ocenić skuteczność infekcji, upewniając się, że spełnia ona wymagania eksperymentu.

4. Zastosowanie promieniowania jako warunek przesiewowy

  1. grupowanie
    1. Dostosuj gęstość komórek zakażonych CRISPR do 1 x 107 komórek na ml i zaszczepij 1 ml na każdą 15-centymetrową szalkę Petriego. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Radioterapia
    1. Losowo podziel komórki na 2 grupy: grupę leczoną i grupę kontrolną, po 6 potraw na grupę. Podaj odpowiednią dawkę promieniowania do komórek w grupie leczonej, pozostawiając komórki grupy kontrolnej nieleczone, aby rozmnażały się normalnie. Po napromieniowaniu kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 7 dni.
    2. W drugim tygodniu powtórz podawanie odpowiedniej dawki promieniowania komórkom grupy leczonej, pozostawiając komórki grupy kontrolnej nieleczone i pozwalając im normalnie się rozmnażać. Po radioterapii kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez kolejne 7 dni.

5. Ekstrakcja i sekwencjonowanie genomu

  1. Ekstrakcja z dnia 14
    1. Po 14 dniach leczenia należy strawić komórki w grupie leczonej i kontrolnej 0,25% trypsyny, zawiesić je ponownie za pomocą kompletnej pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS i oznaczyć jako Dzień 14-RT lub Dzień 14-NC.
    2. Odwirować komórki o sile 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić ponownie w 1 ml PBS, odwirować przy 300 x g przez 5 minut i ponownie odrzucić supernatant. Wyekstrahuj genomowe DNA z dnia 14 i wykryj stężenie i czystość DNA za pomocą spektroskopii absorbancji UV nanokropli.
  2. Amplifikacja PCR
    1. Przygotować odpowiednie startery sekwencji (patrz tabela materiałów) i rozcieńczyć je do 10 μM. Ustawić system reakcyjny o objętości 20 μl, dodając odczynniki do sterylnej probówki do mikrowirówki, wirować przez 5 s przy 300 x g i dobrze wymieszać. Ustaw parametry instrumentu do PCR zgodnie z warunkami amplifikacji, aby uzyskać produkty PCR.
  3. Wykrywanie elektroforezy w żelu agarozowym
    1. Przygotować żelową płytkę odlewniczą, uszczelnić krawędzie formy agarozą, włożyć grzebień i przygotować żel agarozowy o odpowiednim stężeniu w zależności od długości DNA próbki.
    2. Dokładnie zważ pewną ilość proszku agarozy, dodaj odpowiednią ilość buforu do elektroforezy, dobrze wymieszaj i podgrzej w kuchence mikrofalowej, aby się rozpuściła. Po lekkim schłodzeniu dodać odpowiednią ilość barwnika kwasu nukleinowego, delikatnie wymieszać i powoli wlać do formy do odlewania żelu. Pozostaw żel do zastygnięcia na 30 minut.
    3. Wyjmij grzebień i dodaj odpowiednią ilość buforu do elektroforezy do zbiornika elektroforezy, aż pokryje żel. Dodaj odpowiednią ilość buforu ładującego do próbki DNA, dobrze wymieszaj i za pomocą pipety powoli dodaj mieszaninę do dołka próbki.
    4. Ustaw odpowiednie napięcie w zależności od wielkości fragmentu DNA i stężenia żelu agarozowego. Po elektroforezie ostrożnie usuń żel i umieść go w obrazie żelowym, aby obserwować wyniki i sprawdzić, czy amplifikacja PCR się powiodła.
  4. Sekwencjonowanie Illumina
    1. Zbierz genomowe DNA z trzech grup (grupa dnia 0, grupa kontrolna i grupa leczona) i wyślij je do firmy w celu budowy biblioteki i sekwencjonowania Illumina. Wykonaj analizę bioinformatyczną i wizualizację wyników sekwencjonowania w celu uzyskania genów wrażliwych na radioterapię i opornych na radioterapię26.
    2. Skonfiguruj wiele powtarzających się eksperymentów do analizy danych i przeprowadź analizę statystyczną wyników eksperymentów, aby zapewnić spójność i odtwarzalność danych27,28.
  5. Ocena jakości danych sekwencjonowania
    1. Poddaj surowe dane rygorystycznym mechanizmom filtrowania i kontroli jakości, aby zagwarantować precyzję sekwencjonowania informacji5. Oblicz wynik Phred (Qphred) dla każdego nukleotydu na podstawie współczynnika błędów sekwencjonowania, używając określonego algorytmu konwersji i modelu, który ocenia prawdopodobieństwo wystąpienia błędu podczas wywoływania bazy28.
    2. Utrzymuj poziom błędu sekwencjonowania dla każdej pozycji bazowej poniżej 1% (co odpowiada progowi Q30) i upewnij się, że co najmniej 80% danych sekwencjonowania osiąga ten standard Q30 w celu wsparcia kolejnych procedur analitycznych.
  6. Przetwarzanie danych i kontrola jakości na poziomie próbki
    UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje, zapoznaj się z poprzednio opublikowanymi raportami29,30.
    1. Dopasuj przefiltrowane odczyty z danych sekwencjonowania do sekwencji biblioteki sgRNA. Raportuj statystyki, w tym liczbę sgRNA w bibliotece z idealnym dopasowaniem, średnią obfitość sgRNA, liczbę niewykrytych sgRNA oraz proporcję odczytów z poszczególnych próbek pomyślnie zmapowanych do biblioteki sgRNA. Użyj wyższego współczynnika mapowania, aby wskazać większy zasięg.
    2. Policz wzbogacenie odczytów dla każdego genu (docelowego dla różnych sgRNA) w każdej próbce. Znormalizuj odczyty pomocnicze dla każdego sgRNA w próbkach przy użyciu metody normalizacji "mediany" MAGeCK. Przeprowadź kontrolę jakości na poziomie próbki, oceniając rozkład liczby odczytów sgRNA, generując wykresy pudełkowe, przeprowadzając analizę głównych składowych (PCA) i konstruując korelacyjne mapy cieplne.
    3. Załóżmy, że liczba odczytów sgRNA jest zgodna z rozkładem Poissona. Przedstaw znormalizowane liczby sgRNA z różnych grup na wykresach pudełkowych, aby zobrazować ogólny rozkład danych w próbkach i porównać rozkłady między grupami.
    4. Wykorzystanie PCA do uproszczenia analizy danych poprzez odzwierciedlenie różnic między głównymi składnikami i szybkością zmienności w obrębie każdego składnika, ułatwiając obserwację zmian wewnątrz i między grupami. Użyj mapy cieplnej korelacji, aby zilustrować relacje między próbkami.
  7. Podstawowa analiza
    1. Wykonaj różnicową analizę sgRNA między grupami i zidentyfikuj niezbędne geny po kontroli jakości i wstępnym przetworzeniu danych. Przeprowadź analizę wzbogacenia funkcjonalnego odpowiednich genów30. Uszereguj niezbędne geny na podstawie solidnego wyniku agregacji rang (RRA) obliczonego przez MAGeCK lub inne metody statystyczne, takie jak MLE, przy czym niższy wynik RRA wskazuje na większe znaczenie.
    2. Użyj języka R lub innych języków programowania, aby przeprowadzić analizę bioinformatyczną na uszeregowanych wynikach i wizualizować wyniki za pomocą diagramów analizy GO i KEGG30. Połącz geny lub białka z odpowiednimi terminami GO (funkcja molekularna, proces biologiczny i składnik komórkowy) poprzez mapowanie ID lub adnotację sekwencji.
    3. Użyj KEGG jako bazy danych, aby zrozumieć funkcje wysokiego poziomu i systemy biologiczne, łącząc zidentyfikowany katalog genów z funkcjami systemowymi na poziomie komórek, gatunków i ekosystemów. Wybierz 10 lub 20 najlepszych ścieżek z analiz GO i KEGG, aby intuicyjnie wyświetlić kierunki ścieżek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rak płuc, z wiodącą śmiertelnością, reprezentuje wysoce agresywną i rozpowszechnioną chorobę medyczną. Używając linii komórkowej raka płuc A549 jako przykładu do przeprowadzenia badania przesiewowego CRISPR obejmującego cały genom z promieniowaniem jako warunkiem przesiewowym, schematyczny przepływ pracy jest pokazany w Rysunek 1. Po pierwsze, zbadaj wrażliwość komórek A549 na różne dawki promieniowania poprzez tworzenie klonów i eksperymenty CCK8 (Rysunek 2). W teście klonogennym ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jako najnowocześniejsza technologia edycji genów, ekran CRISPR zapoczątkował głębokie zmiany w dziedzinie badań naukowych5. Technologia ta, wywodząca się z systemu CRISPR-Cas9, stała się niezbędnym narzędziem do badania funkcji genów ze względu na swoją wysoką wydajność i precyzję9. Zasada inżynierii CRISPR/Cas9 polega na projektowaniu i wprowadzaniu specyficznych sgRNA z około 20 nukleotydami, które kierują nukleazą Cas9 w celu precyzyjnego zlokalizowania i przecięcia doce...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Regionalny Projekt Innowacji Naukowych i Technologicznych Prowincji Hubei (2024EIA001) oraz Projekt Wsparcia Budowy Platformy Innowacji Medycznych i Technologicznych Szpitala Zhongnan Uniwersytetu Wuhan (PTXM2025001). Rysunek 1 został utworzony przy użyciu narzędzia Figdraw.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie do hodowli komórkowych i tkankowych 150 mmWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.715011Naczynie do hodowli komórkowych
i tkankowych 35 mmWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.706011Hodowla komórkowa
Linia komórkowa A549ATCC-
Zestaw do liczenia komórek-8Shanghai Beyotime Biotech IncC0041Do testu żywotności komórek
Pożywka niezależna od CO2PHCbiMCO-50AICHodowla komórkowa
Countess 3 FL Automatyczny licznik komórekThemo ScientificAMQAF2001Do liczenia komórek
EDTAGibco25200056Hodowla komórkowa
Surowica bydlęcapłodu Gibco10099141Hodowla komórkowa
Mikroskopia fluorescencyjnaLEICAebq 100-04Do mikroskopu fluorescencyjnego
Biblioteka lentiwirusowa CRISPR obejmująca cały genomShanghai OBiO Technology Co., Ltd.H5070Do infekcji lentiwirusowej
MiniAmp plus PCRThemo ScientificC37835Do amplifikacji PCR
Płytki do hodowli komórkowych NEST, 12-dołkoweWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.712002Płytki
do hodowli komórkowych NEST, 6-dołkoweWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.703002Płytki
do hodowli komórkowych NEST, 96-dołkoweWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.701001Hodowla
komórkowa PBSGibcoC10010500BTStarter do hodowli komórkowych
PCR (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG)Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd.-Do amplifikacji PCR
Odwrócony starter PCR (GATGTGCCTCTGCCCACTGACGGGCA)Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd.-Do amplifikacji PCR
PolybreneShanghai Beyotime Biotech IncC0351Do infekcji lentiwirusowej
PuromycinMCEHY-K1057Do wyboru po zakażeniu lentiwirusowym
Pożywka do hodowli komórkowej RPMI 1640Gibco23400-021
Zestaw genomowego DNA do hodowli komórkowej TIANGENampPekin TIANGEN Biotech Co., Ltd.DP304Do ekstrakcji genomowego DNA
Dyfraktometr rentgenowski w proszkuPerkinElmerDo radioterapii

Bibliografia

  1. Barrangou, R., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas systems: Prokaryotes upgrade to adaptive immunity. Mol Cell. 54 (2), 234-244 (2014).
  2. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
  3. Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
  4. Arroyo, J. D., et al. A Genome-wide CRISPR death screen identifies genes essential for oxidative phosphorylation. Cell Metab. 24 (6), 875-885 (2016).
  5. Sidik, S. M., et al. A genome-wide CRISPR screen in toxoplasma identifies essential apicomplexan genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
  6. Jing, Y., et al. Genome-wide CRISPR activation screening in senescent cells reveals SOX5 as a driver and therapeutic target of rejuvenation. Cell Stem Cell. 30 (11), 1452-1471 (2023).
  7. Shifrut, E., et al. Genome-wide CRISPR screens in primary human t cells reveal key regulators of immune function. Cell. 175 (7), 1958-1971 (2018).
  8. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  9. Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer biology and therapy. Nat Rev Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).
  10. Sasmal, R., et al. Synthetic host-guest assembly in cells and tissues: Fast, stable, and selective bioorthogonal imaging via molecular recognition. Anal Chem. 90 (19), 11305-11314 (2018).
  11. Roos, W. P., Thomas, A. D., Kaina, B. DNA damage and the balance between survival and death in cancer biology. Nat Rev Cancer. 16 (1), 20-33 (2016).
  12. Huang, R., Zhou, P. K. DNA damage repair: Historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).
  13. O'Connor, M. J. Targeting the DNA damage response in cancer. Mol Cell. 60 (4), 547-560 (2015).
  14. Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481 (7381), 287-294 (2012).
  15. Carusillo, A., Mussolino, C. DNA Damage: From threat to treatment. Cells. 9 (7), 1665(2020).
  16. Li, X., Heyer, W. D. Homologous recombination in DNA repair and DNA damage tolerance. Cell Res. 18 (1), 99-113 (2008).
  17. Chang, H., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 495-506 (2017).
  18. Andratschke, N., et al. European society for radiotherapy and oncology and European organization for research and treatment of cancer consensus on re-irradiation: Definition, reporting, and clinical decision making. Lancet Oncol. 23 (10), e469-e478 (2022).
  19. Olivares-Urbano, M. A., Grinan-Lison, C., Marchal, J. A., Nunez, M. I. CSC radioresistance: A therapeutic challenge to improve radiotherapy effectiveness in cancer. Cells. 9 (7), 1651(2020).
  20. Schaue, D., McBride, W. H. Opportunities and challenges of radiotherapy for treating cancer. Nat Rev Clin Oncol. 12 (9), 527-540 (2015).
  21. Allen, C., Her, S., Jaffray, D. A. Radiotherapy for cancer: Present and future. Adv Drug Deliv Rev. 109, 1-2 (2017).
  22. Xue, C., Greene, E. C. DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-Mediated genome editing. Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).
  23. Tzelepis, K., et al. A CRISPR dropout screen identifies genetic vulnerabilities and therapeutic targets in acute myeloid leukemia. Cell Rep. 17 (4), 1193-1205 (2016).
  24. Rottner, A. K., et al. A genome-wide CRISPR screen identifies CALCOCO2 as a regulator of beta cell function influencing type 2 diabetes risk. Nat Genet. 55 (1), 54-65 (2023).
  25. Chen, M., et al. CRISPR-Cas9 for cancer therapy: Opportunities and challenges. Cancer Lett. 447, 48-55 (2019).
  26. Gupta, D., et al. CRISPR-Cas9 system: A new-fangled dawn in gene editing. Life Sci. 232, 116636(2019).
  27. Li, B., et al. Genome-wide CRISPR screen identifies host dependency factors for influenza A virus infection. Nat Commun. 11 (1), 164(2020).
  28. Hung, K. L., et al. Targeted profiling of human extrachromosomal DNA by CRISPR-CATCH. Nat Genet. 54 (11), 1746-1754 (2022).
  29. Bhattacharya, D., Van Meir, E. G. A simple genotyping method to detect small CRISPR-Cas9 induced indels by agarose gel electrophoresis. Sci Rep. 9 (1), 4437(2019).
  30. Razavi, Z., Soltani, M., Souri, M., Van Wijnen, A. J. CRISPR innovations in tissue engineering and gene editing. Life Sci. 358, 123120(2024).
  31. Wang, W., et al. A genome-wide CRISPR-based screen identifies KAT7 as a driver of cellular senescence. Sci Transl Med. 13 (575), eabd2655(2021).
  32. Xu, X., et al. Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing. Mol Cell. 81 (20), 4333-4345 (2021).
  33. Huang, M., et al. FACS-based genome-wide CRISPR screens define key regulators of DNA damage signaling pathways. Mol Cell. 83 (15), 2810-2828 (2023).
  34. Feng, J., et al. Genome-wide CRISPR screen identifies synthetic lethality between DOCK1 inhibition and metformin in liver cancer. Protein Cell. 13 (11), 825-841 (2022).
  35. Saurat, N., et al. Genome-wide CRISPR screen identifies neddylation as a regulator of neuronal aging and AD neurodegeneration. Cell Stem Cell. 31 (8), 1162-1174 (2024).
  36. Du, Y., Liu, Y., Hu, J., Peng, X., Liu, Z. CRISPR/Cas9 systems: Delivery technologies and biomedical applications. Asian J Pharm Sci. 18 (6), 100854(2023).
  37. Shi, J., et al. A genome-wide CRISPR screen identifies WDFY3 as a regulator of macrophage efferocytosis. Nat Commun. 13 (1), 7929(2022).
  38. Liu, N., Olson, E. N. CRISPR modeling and correction of cardiovascular disease. Circ Res. 130, (2022).
  39. Feng, X., et al. Genome-wide CRISPR screens using isogenic cells reveal vulnerabilities conferred by loss of tumor suppressors. Sci Adv. 8 (19), 6638(2022).
  40. Ghaemi, A., et al. CRISPR-Cas9 genome editing delivery systems for targeted cancer therapy. Life Sci. 267, 118969(2021).
  41. Derry, W. B. CRISPR: Development of a technology and its applications. FEBS J. 288 (2), 358-359 (2021).
  42. Sharma, G., Sharma, A. R., Bhattacharya, M., Lee, S. S., Chakraborty, C. CRISPR-Cas9: A preclinical and clinical perspective for the treatment of human diseases. Mol Ther. 29 (2), 571-586 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

geny radiowra liwekom rki raka p ucaoporno na radioterapiodpowied na uszkodzenia DNAinfekcja lentiwirusowatest tworzenia koloniiselekcja puromycynanaliza ontologii gen w

Powiązane artykuły