Artykuł metodologiczny

Wieloskalowe badania przetwarzania kory mózgowej poprzez integrację politrod laminarnych i optogenetyki z mikroelektrokortykografią u gryzoni

DOI:

10.3791/67983

⸱

23 maja 2025

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, UC Berkeley, 2Biological Systems and Engineering Division, Lawrence Berkeley National Lab, 3Helen Wills Neuroscience Institute, UC Berkeley, 4Redwood Center for Theoretical Neuroscience, UC Berkeley, 5Scientific Data Division, Lawrence Berkeley National Lab

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do rejestracji mikro-elektrokortykografii o wysokiej gęstości (μEcoG) u szczurów i myszy, w tym metody chirurgiczne, implantacyjne i rejestracyjne. Zapisy μECoG są wykonywane w połączeniu z zapisem laminarnej politrody w korze słuchowej szczura lub z optogenetycznym manipulowaniem aktywnością neuronalną w korze somatosensorycznej myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrokortykografia (ECoG) jest metodologicznym pomostem między podstawową neuronauką a zrozumieniem funkcji ludzkiego mózgu w zdrowiu i chorobie. ECoG rejestruje sygnały neurofizjologiczne bezpośrednio z powierzchni kory mózgowej w milisekundowej rozdzielczości czasowej i kolumnowej rozdzielczości przestrzennej w dużych obszarach tkanki korowej jednocześnie, dzięki czemu jest wyjątkowo przystosowany do badania zarówno lokalnych, jak i rozproszonych obliczeń korowych. W tym miejscu opisujemy konstrukcję niestandardowych urządzeń mikro-ECoG (μECoG) o dużej gęstości i ich zastosowanie w dwóch procedurach. Siatki te mają 128 elektrod o niskiej impedancji w odstępach 200 μm, wykonanych na przezroczystym podłożu polimerowym z perforacją między elektrodami; cechy te umożliwiają jednoczesny zapis μECoG z zapisem politrody laminarnej i manipulacjami optogenetycznymi. Po pierwsze, przedstawiamy protokół połączonego znieczulenia zewnątrzoponowego μECoG przez korę somatosensoryczną wąsów myszy z optogenetyczną manipulacją określonych genetycznie zdefiniowanych typów komórek korowych. Pozwala to na przyczynową analizę różnych wkładów różnych populacji neuronów w przetwarzanie sensoryczne, przy jednoczesnym monitorowaniu ich specyficznych sygnatur w sygnałach μECoG. Po drugie, przedstawiamy protokół ostrych eksperymentów w celu rejestrowania aktywności neuronalnej z kory słuchowej szczura za pomocą siatek μECoG i politrod laminarnych. Pozwala to na szczegółowe mapowanie topograficzne reakcji neuronalnych wywołanych czuciowo na powierzchni kory mózgowej jednocześnie z nagraniami z wielu jednostek nerwowych rozmieszczonych na głębokości kory mózgowej. Protokoły te umożliwiają eksperymenty, które charakteryzują rozproszoną aktywność kory mózgowej i mogą przyczynić się do zrozumienia i ewentualnych interwencji w przypadku różnych zaburzeń neurologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcje mózgu leżące u podstaw czucia, poznania i działania są zorganizowane i rozmieszczone w rozległych skalach przestrzennych i czasowych, począwszy od skoków pojedynczych neuronów, poprzez pola elektryczne generowane przez populacje neuronów w kolumnie korowej, aż po topograficzną organizację kolumn w obszarach mózgu (np. somatotopia w korze somatosensorycznej, tonotopia w pierwotnej korze słuchowej). Zrozumienie funkcji mózgu wymaga wyczuwania sygnałów elektrycznych w tych skalach przestrzennych1. Neurobiologia ma obecnie wiele szeroko stosowanych metod monitorowania aktywności mózgu. Elektrofizjologicznie politrody laminarne (takie jak Neuropixels) umożliwiają monitorowanie niewielkiej liczby (~300) pojedynczych neuronów, zwykle w obrębie kilku odległych kolumn, z wysoką rozdzielczością czasową (≥1 kHz). Obrazowanie Ca2+ umożliwia monitorowanie od niewielkiej do dużej liczby genetycznie i anatomicznie zidentyfikowanych pojedynczych neuronów w zakresie przestrzennym ~1-2 mm przy niższej (~10 Hz) rozdzielczości czasowej2. fMRI umożliwia monitorowanie stanu metabolicznego dużej liczby neuronów (~1 mln neuronów w objętości 36 mm3) w całym mózgu przy bardzo niskiej (~0,2 Hz) rozdzielczości czasowej. EEG/MEG umożliwia monitorowanie aktywności elektrycznej z całej powierzchni kory mózgowej/mózgu w umiarkowanej rozdzielczości czasowej (<100 Hz) i bardzo niskiej rozdzielczości przestrzennej (centymetry)3. Podczas gdy każda z tych metodologii dostarczyła fundamentalnych, synergicznych informacji na temat funkcji mózgu, metody, które umożliwiają bezpośrednie wykrywanie sygnałów elektrofizjologicznych w wysokiej rozdzielczości czasowej z precyzyjnych lokalizacji anatomicznych w szerokich obszarach przestrzennych kory mózgowej, są dopiero raczkujące. Potrzebę szerokiego pokrycia przestrzennego podkreśla fakt, że w mózgu funkcja neuronów zmienia się znacznie bardziej dramatycznie na powierzchni w porównaniu z głębokością4.

Elektrokortykografia (ECoG) to metoda, w której siatki elektrod o niskiej impedancji są wszczepiane na powierzchnię mózgu i pozwalają na rejestrację lub stymulację kory mózgowej1,5. ECoG jest zwykle stosowany w warunkach neurochirurgicznych u ludzi jako część badań klinicznych w leczeniu farmakologicznie nieuleczalnej padaczki. Dostarcza jednak również unikalnych informacji na temat rozproszonego przetwarzania korowego u ludzi, takiego jak mapowanie topograficzne mowy i sensorycznej6,7. Te możliwości zmotywowały go do zastosowania w modelach zwierzęcych, w tym małpach, szczurach i myszach5,8,9,10,11. U gryzoni wykazano niedawno, że mikro-ECoG (μECoG) umożliwia bezpośrednie monitorowanie elektryczne populacji neuronów w wysokiej rozdzielczości czasowej (~100 Hz) z kolumnową rozdzielczością przestrzenną (~200 μm) i szerokim zasięgiem przestrzennym (wiele milimetrów). μECoG umożliwia naukowcom badanie rozproszonej dynamiki neuronalnej związanej ze złożonym przetwarzaniem sensorycznym, funkcjami poznawczymi i zachowaniami motorycznymi w modelach zwierzęcych12,13. Ostatnie osiągnięcia umożliwiły zintegrowanie μECoG z optogenetyką i zapisami politrod laminarnych14,15,16,17,18,19,20, co pozwala na wieloskalowe badania sieci korowych i wypełnianie luki między aktywnością neuronalną w mikroskali i Dynamika kory mózgowej w skali makro21,22. Krytycznie, ponieważ sygnał μECoG jest bardzo podobny w modelach zwierzęcych ludzi i innych niż ludzie, użycie μECoG sprawia, że translacja wyników i ustaleń z modeli zwierzęcych na ludzi jest znacznie bardziej bezpośrednia23. W związku z tym podejścia integracyjne mają kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat obwodów neuronowych i dają nadzieję na opracowanie nowych interwencji terapeutycznych w zaburzeniach neurologicznych5,24,25.

W związku z tym pojawia się zapotrzebowanie na protokoły, które integrują tablice μECoG o dużej gęstości z zapisami laminarnymi i narzędziami optogenetycznymi, aby umożliwić wszechstronne, wieloskalowe badania przetwarzania korowego8,26. Aby wypełnić tę lukę, opracowaliśmy specjalnie zaprojektowane urządzenia μECoG wyposażone w 128 elektrod o niskiej impedancji o średnicy elektrody 40 μm i odstępach między elektrodami 20 μm na elastycznym, przezroczystym podłożu polimerowym (parylen-C i poliimid) z perforacjami między elektrodami, umożliwiającymi jednoczesny zapis μECoG i politrody laminarnej z manipulacjami optogenetycznymi13,22. Kluczowe aspekty tego eksperymentalnego protokołu obejmują: (i) kolumnową rozdzielczość przestrzenną i wielkoskalowe pokrycie aktywności kory mózgowej za pomocą macierzy μECoG o dużej gęstości; (ii) zdolność do zapisu z wielu warstw kory mózgowej za pomocą politrod laminarnych wprowadzanych przez siatkę μECoG; oraz (iii) włączenie technik optogenetycznych w celu selektywnej aktywacji lub zahamowania określonych populacji neuronów, umożliwiając w ten sposób przyczynową dyssekcję obwodów neuronalnych27,28,29. Konfiguracja o dużej gęstości pozwala na zapisy o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, skutecznie zapewniając "kolumnowy widok" aktywności kory mózgowej, ponieważ poprzednie badania wykazały, że sygnały μECoG mogą rozdzielić aktywność w skali przestrzennej porównywalnej ze średnicą kolumny korowej gryzoni (~20 μm)11. Ta zintegrowana metodologia pozwala na jednoczesne wieloskalowe monitorowanie i manipulowanie aktywnością neuronalną, potencjalnie umożliwiając eksperymenty przyczynowe w celu określenia neuronalnych źródeł sygnałów μECoG, a także rozproszonego przetwarzania korowego. Aby osiągnąć te cele, w niniejszym manuskrypcie przedstawiono szczegółowe protokoły użycia matryc μECoG o dużej gęstości w dwóch kombinacjach.

Po pierwsze, opisujemy μECoG w połączeniu z manipulacją komórek piramidalnych warstwy 5 (L5) w pierwotnej korze somatosensorycznej myszy (S1). U myszy matryca μECoG jest umieszczana nadzębiowo (ze względu na chirurgiczną nieuleczalność durotomii u myszy). Światłowód jest umieszczony nad siatką lub połączony z soczewką w celu skupienia światła optogenetycznego na małym obszarze docelowym powierzchni kory mózgowej. Opisano tutaj strategię optogenetyczną hamowania neuronów pobudzających warstwy 5, ale można ją łatwo dostosować do dowolnej populacji neuronów wyposażonych w odpowiednią, specyficzną dla populacji, linię myszy wykazującą ekspresję Cre. Po drugie, opisujemy połączone zastosowanie μECoG z krzemowymi politrodami laminarnymi do jednoczesnego rejestrowania potencjałów elektrycznych powierzchni kory mózgowej (CSEP) i aktywności impulsowej pojedynczej jednostki z wielu neuronów w warstwach korowych z kory słuchowej szczura (A1). Matryca posiada perforacje między elektrodami, umożliwiające wprowadzanie wielokanałowych politrod laminarnych przez siatkę w celu rejestrowania aktywności neuronalnej w różnych warstwach kory mózgowej. Podczas zabiegu kraniotomii matryca μECoG jest umieszczana podstożkowo nad korą słuchową, a przez perforacje wprowadzana jest politroda laminarna. Sygnały neuronowe z sondy μECoG i sondy laminarnej są rejestrowane jednocześnie, próbkowane odpowiednio z częstotliwością 6 kHz i 24 kHz, przy użyciu systemu wzmacniacza optycznie połączonego z cyfrowym procesorem sygnałowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oba protokoły mają te same kluczowe kroki (znieczulenie, fiksacja, kraniotomia, zapis μECoG), ale mają znaczące różnice. W poniższym opisie udostępnione kroki są scalone, a specyfika każdego protokołu jest opisana. Poniższe kroki odpowiadają zapisowi μECoG za pomocą optogenetyki (Mysz) lub zapisowi μECoG za pomocą sondy laminarnej (Rat). Wszystkie opisane tutaj procedury zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi autorytetami etycznymi lub prawnymi (IACUC lub Komisje Bioetyczne). Stosowane leki mogą się różnić w zależności od zatwierdzonego protokołu etycznego.

1. Przygotowanie i protokół procedur na myszach i szczurach

  1. Znaczące różnice między protokołami myszy i szczurów
    1. Zestawy do operacji a zapisy elektrofizjologiczne
      1. W przypadku szczura należy użyć tej samej konfiguracji zarówno podczas operacji, jak i zapisów elektrofizjologicznych.
      2. W przypadku myszy wykonaj operację w pierwszej konfiguracji, a zapisy elektrofizjologiczne w drugiej konfiguracji.
    2. Mocowanie głowy
      1. W przypadku szczura użyj tego samego zacisku pyska do operacji i rejestracji elektrofizjologicznej.
      2. W przypadku myszy użyj zacisku pyska do operacji i zewnętrznego metalowego pręta na głowę w konfiguracji do elektrofizjologii, aby umożliwić utrwalenie w lekkim znieczuleniu izofluranowym. Wszczepić pałąk z cementem dentystycznym na czaszkę.
    3. Konfiguracja nagrywania: Użyj odrębnej elektroniki akwizycyjnej, oprogramowania do nagrywania i oprogramowania do stymulacji sensorycznej dla tych dwóch gatunków.
      1. W przypadku protokołu myszy wykorzystaj system SpikeGadgets (https://spikegadgets.com) i oprogramowanie Trodes (https://spikegadgets.com/trodes/) o otwartym kodzie źródłowym do pozyskiwania danych.
      2. W przypadku protokołu szczurzego wykorzystaj oprogramowanie do nagrywania Synapse - Neurophysiology Suite (https://www.tdt.com/component/synapse-software/) do pozyskiwania danych.
    4. Wywołać znieczulenie przez wstrzyknięcie (szczur) lub wdychanie (mysz).
    5. Lokalizacja nagrywania
      1. Przeprowadzaj nagrania w korze somatosensorycznej (S1) dla myszy.
      2. Przeprowadzanie nagrań w pierwszorzędowej korze słuchowej (A1) dla szczura.
        UWAGA: Ta różnica w lokalizacji anatomicznej wymaga różnych miejsc kraniotomii dla każdego gatunku.
  2. Przygotowanie i testowanie sieci
    1. Namocz kratkę (bez płytki łączącej) w rozcieńczonym detergencie enzymatycznym (50% detergentu, 50% wody destylowanej) przez co najmniej 1 godzinę.
    2. Przenieś go do kąpieli z czystą wodą destylowaną i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w bezpiecznym, czystym miejscu.
    3. Elektroosadzanie na platynę czarną należy wykonywać w ramach wstępnego przygotowania urządzenia μECoG, a nie przed każdą sesją nagraniową.
      UWAGA: Po nałożeniu powłoka Platinum Black tworzy stabilną warstwę, która pozostaje skuteczna w przypadku wielu nagrań, chociaż jej wydajność powinna być monitorowana poprzez regularne testy impedancji. Elektroosadzanie platynowo-czarne (docelowy zakres 10-20 kΩ przy 1 kHz.) zmniejsza impedancję elektrody i poprawia stosunek sygnału do szumu w nagraniach neuronowych.
    4. Aby wykonać elektroosadzanie, należy przygotować roztwór kwasu chloroplatynowego (zwykle 1-3% kwas chloroplatynowy [H2PtCl6]) zawierający niewielką ilość octanu ołowiu (około 0,005%) jako modyfikator osadzania. Połącz elektrody μECoG, aby służyły jako elektroda robocza w trzyelektrodowym ogniwie elektrochemicznym, z platynową przeciwelektrodą i elektrodą odniesienia Ag/AgCl.
    5. Zastosuj stałą gęstość prądu około -0,5--2 mA/cm² przez 10-30 s, monitorując wartości impedancji.
    6. Zbadaj i zapisz impedancję elektrod sieciowych (np. za pomocą Nano-Z).
    7. Sprawdź siatkę nad źródłem światła i przygotuj siatkę do użycia w nagraniu pooperacyjnym.
  3. referencyjnych
    1. W przypadku myszy koniec srebrnego przewodu (o długości 10 mm, 30 G) do złotego pinu w celu podłączenia do przewodu odniesienia systemu nagrywającego.

2. Chirurgia

  1. Przygotowanie materiałów i ogólny monitoring (opieka nad zwierzętami i rejestracja)
    1. Przygotowanie: Dokładnie oczyścić i zdezynfekować obszar operacyjny odpowiednim środkiem dezynfekującym. Upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne są wysterylizowane, zwykle przy użyciu autoklawu.
    2. Rozmieszczenie narzędzi chirurgicznych: Ułóż narzędzia chirurgiczne na sterylnej podkładce chirurgicznej. Zaopatrz obszar operacyjny w aplikatory z bawełnianą końcówką i chłonne bawełniane trójkąty chirurgiczne. Wszelkie odpady niebezpieczne biologicznie należy wyrzucać do specjalnego worka na odpady.
    3. Regulacja temperatury: Włącz poduszkę grzewczą w miejscu rejestracji chirurgicznej i elektrofizjologicznej. Kontroluj temperaturę poduszki grzewczej przez cały czas trwania operacji i nagrywania.
    4. Podkładka chirurgiczna: Umieść niebieską podkładkę chirurgiczną lub koc na łóżku z regulacją temperatury.
      UWAGA: Ta podkładka powinna mieć miękki bawełniany biały spód, który powinien być skierowany do góry.
    5. Ustawienie mikroskopu: Przygotuj mikroskop i dołączony oświetlacz (np. pierścień LED) po jednej stronie pola operacyjnego. Sprawdź, czy działa prawidłowo.
    6. Wiertło chirurgiczne: Przygotuj wiertło chirurgiczne do zabiegu kraniotomii.
    7. Dopływ tlenu: Ustaw natężenie przepływu w butli tlenu na 1.0 l/min (Szczur) lub 0.5 l/min (mysz) i umieść maskę tlenową w pobliżu podkładki regulacyjnej. Zwierzę będzie potrzebowało ciągłego tlenu po znieczuleniu.
    8. Wymiana płynów: Przez cały czas trwania operacji należy wymienić wszelkie ubytki płynów, dążąc do uzupełnienia co najmniej 1,5% masy ciała zwierzęcia (mysz) lub 1 ml na godzinę (szczur). Odpowiednio przygotuj roztwory izotoniczne.
    9. Zwierzę: Przynieś zwierzę z placówki dla zwierząt do sali operacyjnej zgodnie z zatwierdzonymi procedurami. Użyj myszy w wieku od 8 do 16 tygodni, samców lub samic, o pochodzeniu C57Bl6; podobnie użyj szczurów w wieku 7 tygodni, samców, szczepu Sprague Dawley.
    10. Przygotowanie leków: Zważ zwierzę za pomocą wagi z dokładnością do 0,1 g. Przygotuj odpowiednią ilość leku do zabiegu, używając w razie potrzeby wstępnie rozcieńczonych roztworów.
  2. Indukcja znieczulenia
    1. Indukcja znieczulenia dla myszy
      1. Umieścić zwierzę w komorze indukcyjnej izofluranu (3-5% izofluranu w 0,5 l/minO2).
      2. Po potwierdzeniu głębokiego znieczulenia (brak odruchu w szczypnięciu ogona/palca), umieść zwierzę na poduszce grzewczej chirurgicznej i przymocuj je głową.
      3. Wstrzykiwać podskórnie leki przeciwbólowe ogólne: meloksykam: 5 mg/kg i buprenorfina: 0,1 mg/kg.
      4. Zamocuj mysz głową, wykonując czynności 2.2.1.5-2.2.1.6.
      5. Umieść pysk w masce anestezjologicznej, a głowę luźno w uchwycie na głowę. Aby umieścić mysz w pasku gryzowym, najpierw upewnij się, że język znajduje się poniżej pręta, a nie między prętem a podniebieniem. W razie potrzeby użyj kleszczy, aby przesunąć język.
      6. Włóż siekacze zwierzęcia do otworu w pręcie pręta gryzowego. Zabezpiecz mysią maskę anestezjologiczną (1,5-2% izofluranu w 0,5 l/min O2), delikatnie dokręcając mocującą. Stabilizację głowy podczas operacji zapewnia wyłącznie belka zgryzowa.
      7. Chroń oczy zwierzęcia maścią lub lubrykantem do oczu na bazie ropy naftowej, aby zapobiec wysuszeniu podczas operacji.
      8. Utrzymuj znieczulenie przez cały zabieg z ciągłym przepływem izofluranu przez maskę.
    2. Indukcja znieczulenia dla szczura
      1. Początkowo należy użyć izofluranu w celu uspokojenia zwierzęcia, aby ułatwić wstrzyknięcie znieczulenia indukcyjnego.
      2. Podawać leki do znieczulenia i przeciwbólu:
        Meloksykam: Dawka 5 mg/kg, stężenie 10 mg/ml, 0,4 ml/kg
        Ketamina: Dawka 90 mg/kg, stężenie 100 mg/ml, 0,9 ml/kg
        Ksylazyna: Dawka 10 mg/kg, stężenie 100 mg/mL, 0,1 mL/kg
      3. Pozwól zwierzęciu osiągnąć głębokie znieczulenie w ciągu 15-30 minut, w zależności od wagi i wieku.
    3. Monitorowanie znieczulenia
      1. Stale monitoruj parametry życiowe zwierzęcia (częstość oddechów) przez cały czas trwania zabiegu. Sprawdź częstość oddechów jako szczególnie przydatny znak wczesnych zmian w stanie znieczulenia i dostosuj poziom znieczulenia, jeśli częstość oddechów się zmienia.
      2. Odruch wycofania łapy jest krytycznym objawem stanu znieczulającego. Okresowo testuj ten odruch, ponieważ jego całkowity brak zapewnia wystarczający poziom znieczulenia do operacji.
  3. Stabilizacja głowy i monitorowanie parametrów życiowych
    1. Monitorowanie parametrów życiowych zwierząt
      1. Sprawdź i zapisz parametry życiowe zwierzęcia na arkuszu doświadczalnym. Jeśli odruchy zwierzęcia (np. wycofanie łapy) nie zostaną całkowicie wygaszone, należy podać dodatkową połowę dawki dodatkowej ketaminy (Szczur) lub zwiększyć stężenie izofluranu stopniowo o 0,5% (Mysz).
    2. Fiksacja głowy dla szczura
      1. Gdy szczur jest w pełni znieczulony (bez odruchów łapy lub ogona), włóż siekacze zwierzęcia do otworu w pręcie mocowania głowy.
      2. Ostrożnie włóż punkty ramion montażowych w grzbiet nosa, aby zamocować głowę podczas operacji, upewniając się, że nie styka się z oczami.
      3. Dostosuj kąt ramion, aż podniebienie zwierzęcia zostanie mocno dociśnięte do pręta. Upewnij się, że czaszka pozostaje nieruchoma pod naciskiem.
      4. Zabezpiecz oba ramiona uchwytu, dokręcając kluczem imbusowym.
    3. Konfiguracja tlenu dla szczura
      1. Przymocuj plastikową rurkę ze zbiornika tlenu do pyska i nosa zwierzęcia, przypinając ją taśmą chirurgiczną. Unikaj zagnieceń w rurkach, które mogą utrudniać przepływ powietrza. Ustaw zbiornik tlenu na natężenie przepływu 1 l/min.
        UWAGA: Parametry życiowe zwierząt, w tym tętno i częstość oddechów, należy sprawdzać w odstępach 15-30 minut przez cały czas trwania zabiegu.
  4. Nacięcie skóry głowy
    1. Golenie i przygotowanie
      1. Ogol obszar od górnego pyska do tyłu głowy, rozciągając się od jednego oka do drugiego i wokół uszu. Usuń większość sierści nożyczkami lub maszynką do strzyżenia elektrycznego, a następnie nałóż krem do depilacji.
    2. dezynfekcja
      1. Zdezynfekuj obszar za pomocą bawełnianego wacika nasączonego Betadine, a następnie spłucz bawełnianym wacikiem nasączonym 70% etanolem. Powtórz ten proces trzy razy i zakończ ostatnią aplikacją Betadine, aby upewnić się, że obszar jest sterylny.
    3. Wstrzyknięcie znieczulenia miejscowego
      1. Lidokainę w postaci środka znieczulającego (1%, 0,1 ml dla myszy/0,4 ml na kg u szczura) wstrzyknąć podskórnie w linię środkową skóry głowy zwierzęcia. Delikatnie masuj skórę głowy, aby rozprowadzić lidokainę i odczekaj 5 minut, aby znieczulenie zaczęło działać.
    4. cięcie
      1. W przypadku myszy podnieś punkt na skórze za pomocą pęsety i wyetnij niewielki fragment skóry (o średnicy około 1 cm) za pomocą nożyczek chirurgicznych.
      2. W przypadku szczura wykonaj precyzyjne nacięcie po przedniej stronie skóry głowy, tuż nad nosem, w linii środkowej za pomocą skalpela. Delikatnie odciągnij skórę, tworząc proste nacięcie od spomiędzy oczu do podstawy czaszki. Ostrożnie unieś skórę głowy, odetnij tkankę łączną i całkowicie odsłoń czaszkę.
      3. Odsłonić miejsce kraniotomii, wykonując czynności 2.4.4.4-2.4.4.5.
      4. Za pomocą skrobaka usuń tkankę łączną i okostną na szczycie czaszki. Spłucz sól fizjologiczną i użyj aspiracji lub gąbki chirurgicznej, aby oczyścić miejsce.
      5. Użyj klipsów chirurgicznych na brzegach skóry, aby ułatwić wyraźne odsłonięcie obszaru czaszki, w którym zostanie wykonana kraniotomia.
  5. Kraniotomia
    1. Ogólna procedura wiercenia
      1. Ustaw prędkość wiertła chirurgicznego na niskie ustawienie 5000 obr./min lub 7000 obr./min dla doświadczonych chirurgów. Wykonuj wszystkie ćwiczenia, wizualizując przez mikroskop.
      2. Trzymaj wiertło równolegle do powierzchni czaszki i delikatnie oprzyj się o powierzchnię.
      3. Lekko naciskając pedał, rozpocznij wiercenie w jednym miejscu. Wykonuj wiercenie w krótkich odstępach czasu (5-10 s) z częstymi kontrolami zmian koloru kości.
        UWAGA: Kość zacznie być nieprzezroczysta biała, a gdy otwór stanie się głębszy, stanie się bardziej przezroczysty, odsłaniając różowy odcień.
      4. Kiedy wiercenie zbliży się do mózgu, zwolnij i poszukaj oznak przenikania wilgoci do otworu. Gdy otwór jest ciemnoróżowy i ma lekki połysk, przerwij wiercenie. Za pomocą krótkiej igły o wadze 30 G delikatnie nakłuć pozostałą warstwę kości. Klarowny płyn powinien dobrze wydostać się z nowego otworu.
    2. Procedura wiercenia dla myszy
      1. Aby umieścić elektrodę referencyjną do zapisów fizjologicznych, należy wywiercić otwór w zadziorach w przedniej części półkuli ipsilateralnie do rejestrowanego obszaru.
      2. Określ kontur kraniotomii, wiercąc płytki rów na jej obwodzie. W osi przyśrodkowo-bocznej zacznij od bocznego grzbietu kości jako odniesienia i narysuj okno o średnicy 4 mm.
      3. W osi przednio-tylnej wywierć okienko 3 mm zaczynające się ~ 1 mm przed tylnym grzbietem kości. Ostateczny rozmiar otwartej kraniotomii to około 4 x 3 mm okienko.
    3. Procedura wiercenia dla szczura
      1. Wywierć dwa otwory: jeden w lewym tylnym kwadrancie, drugi w prawym przednim kwadrancie.
      2. Wstrzyknąć mięśniom żwacza drugą dawkę lidokainy (0,4 ml/kg w dawce 10 mg/ml) i równomiernie rozprowadzić w miejscu, w którym ma zostać wykonane cięcie.
      3. Wyciąć tylko minimalny zestaw mięśni potrzebny do odsłonięcia obszaru kraniotomii.
      4. Używając świeżego ostrza skalpela #10, wykonaj poprzeczne nacięcie grzbietowo-brzuszne w wiązce mięśniowej nad szczęką zwierzęcia (prawa strona). Przytrzymaj tylną krawędź cięcia kleszczami chwytającymi i oderwij od czaszki, przecinając wzdłuż kostnego grzbietu kości policzkowej. W ten sposób mięsień może zostać odłączony od kości przy minimalnym krwawieniu.
      5. Wytnij mięsień przedni w podobny sposób, aż ujawni się linia szczeliny w czaszce. Linia ta będzie przednią granicą okna kraniotomii.
      6. Oczyść mięśnie z okolic tylnego grzbietu za pomocą skalpela i kleszczy, używając silnego źródła światła, aby uniknąć cięcia w wysoce unaczynionych obszarach.
      7. Zetrzyj tylny grzbiet za pomocą wiertła, aż przestanie być uniesiony ponad powierzchnię czaszki.
        UWAGA: Ten krok jest niezbędny do ustawienia siatki μECoG, aby nawiązać bezpośredni kontakt z powierzchnią kory.
      8. Wywierć grzbietową krawędź okna tuż nad grzbietem, do którego przyczepiony był wycięty mięsień. Umieść tylną krawędź przed wywierconym tylnym grzbietem. Umieść przednią krawędź z tyłu do linii szczeliny biegnącej w dół w pobliżu oczodołu.
        UWAGA: Podczas oczyszczania mięśnia przedniego należy zachować ostrożność, aby uniknąć oka.
  6. Wiercenie okien kraniotomii
    1. Wiercenie okienka kraniotomii (wskazówki)
      1. Podczas wiercenia upewnij się, że wiertło jest trzymane równolegle do powierzchni czaszki. Stosuj jak najmniejszą siłę, używając wiertła jak szczotki, pozwalając wiertłu na lekki kontakt z czaszką, wykonując krótkie, powtarzalne ruchy wzdłuż zamierzonej linii kraniotomii.
        UWAGA: U szczurów tylna krawędź okna ma najgrubszą kość. Jeśli wierci się zbyt daleko do tyłu, kość może wykazywać łuszczącą się, "chrupiącą" jakość, która komplikuje ocenę postępu wiercenia. Jeśli zostanie umieszczony nieprawidłowo, ten obszar kości może ujawnić żyłkowato czerwone zabarwienie, które daje fałszywe wrażenie bliskości mózgu.
      2. Wywierć każdą stronę okienka kraniotomii, aż kość stanie się bladoróżowa z cienką białą szczeliną lub pęknięciem biegnącym wzdłuż jej długości. Zastosuj lekki nacisk; Kość powinna wytwarzać wyraźne "drganie" po pełnym nawierceniu. Jeśli pęknięcie wydaje się rozłączne, kontynuuj wiercenie lekko, aż do uzyskania ciągłej linii.
    2. Usunięcie przerzedzonej czaszki w okienku kraniotomii
      1. Gdy czaszka zostanie na tyle przerzedzona, że bardzo lekki nacisk powoduje widoczne drganie całego okna, usuń przerzedzoną czaszkę.
      2. Przepłucz miejsce kraniotomii kroplą soli fizjologicznej i odczekaj co najmniej 1 minutę. To osłabia przerzedzoną kość i pomaga kości oderwać się od opony twardej. Odcedź nadmiar soli fizjologicznej za pomocą chłonnego trójkąta bawełnianego lub odkurzacza.
      3. Ostrożnie podnieś przerzedzoną czaszkę za pomocą kleszczy, unikając uszkodzenia tkanki znajdującej się pod spodem.
      4. Użyj gąbki hemostatycznej, aby utrzymać wilgotność mózgu.
      5. Mocno chwyć okno od strony grzbietowej i brzusznej kleszczami zębatymi i odciągnij bezpośrednio od czaszki. Jeśli wystąpią jakiekolwiek trudności z wyciągnięciem okna z miejsca, przerwij i wznów lekkie wiercenie, aż kość będzie wystarczająco osłabiona.
      6. W przypadku nagrań μECoG myszy pozostaw oponę twardą nienaruszoną.
  7. Implant cementu i słupka głowy dla myszy
    1. Włóż i zabezpiecz przewód odniesienia.
      1. Włóż koniec srebrnego drutu ~1 mm do otworu w zadziorach, na tyle, aby zetknął się z powierzchnią mózgu, ale nie spowodował krwawienia.
      2. Nałóż cement dentystyczny na miejsce podczas nakładania pierwszej warstwy.
    2. Przygotowanie cementu dentystycznego
      1. Użyj schłodzonego ceramicznego naczynia do mieszania, aby przygotować mieszankę cementu dentystycznego. Cement ten szybko gęstnieje i wymaga regularnego przygotowywania nowej mieszanki. Wytrzyj naczynie miksujące do czysta przed przygotowaniem nowej mieszanki.
        UWAGA: Cement nigdy nie powinien mieć bezpośredniego kontaktu z mózgiem.
    3. Nakładanie pierwszej warstwy
      1. Nałóż pierwszą warstwę cementu wokół kraniotomii i na całej czaszce za pomocą mikroaplikatorów. Warstwa ta działa jak izolacja elektryczna między czaszką a metalową belką główną.
      2. Całkowicie otocić kraniotomię cementem, w tym pokryciem bocznym, aby zapewnić odpowiednią ochronę otwartej kraniotomii i siatki μECoG.
    4. Ustawianie metalowej belki głównej
      1. Przymocuj dużą część głowicy do jej uchwytu bez całkowitego dokręcania.
      2. Ustaw pałąk zgodnie z potrzebami, układając cienką sekcję wzdłuż linii środkowej czaszki w kontakcie z powierzchnią cementu.
    5. Zabezpieczenie implantu
      1. Przykryj głowicę cementem dentystycznym i połącz ją z powierzchnią cementu.
    6. Wyjmowanie uchwytu
      1. Odczekaj kilka minut, aż cement dentystyczny się wzmocni.
      2. Gdy belka główna jest w pełni zabezpieczona, zdejmij ją, najpierw wykręcając z uchwytu. Następnie cofnij uchwyt do tyłu, upewniając się, że na belkę główną nie jest przyłożona żadna siła.
  8. Durotomia w chirurgii szczurów
    UWAGA: Jest to trudny krok chirurgiczny.
    1. Podnoszenie opony twardej
      1. Używając kleszczy nr 5, trzymanych tak równolegle do powierzchni mózgu, jak to możliwe, podnieś niewielką część opony twardej z mózgu.
      2. Użyj świeżej igły 30 G (tak krótkiej, jak to możliwe), aby ostrożnie rozerwać uniesioną oponę twardą
        UWAGA: Opona twarda to cienka, przezroczysta warstwa tkanki, która leży bezpośrednio na wierzchu mózgu. Jest usuwany w przypadku zapisów μECoG u szczurów. Bardzo ważne jest, aby wykonać durotomię bez naruszania układu naczyniowego na powierzchni mózgu. Zalecane metody wykonywania durotomii obejmują użycie kleszczy i igły strzykawkowej do nakłucia opony twardej przed jej odciągnięciem lub użycie narzędzia duratomowego zakotwiczonego w pobliżu czaszki w celu ostrożnego cofnięcia opony twardej.
    2. Resekcja opony twardej
      1. Kontynuuj chwytanie opony twardej kleszczami i odnoszenie jej od mózgu. Utwórz ukośne rozdarcie igłą podczas podnoszenia.
      2. Użyj kleszczy, aby ostrożnie oderwać oponę twardą w kierunku boków okienka kraniotomii, upewniając się, że powierzchnia mózgu pozostaje nienaruszona.
  9. Przenoszenie myszy do konfiguracji w celu rejestracji elektrofizjologicznej
    1. Usuń zwierzę z zestawu chirurgicznego, delikatnie podnosząc pysk i siekacze z pręta siekacza, a następnie odciągając zwierzę do tyłu. Wstrzyknąć chlorprotiksen (1 mg/kg, dootrzewnowo [IP]), środek uspokajający, który umożliwia utrzymanie ciągłego znieczulenia przy użyciu niższego stężenia izofluranu.
    2. Umieść mysz w konfiguracji zapisu elektrofizjologicznego.
      1. Upewnij się, że poduszka grzewcza jest na swoim miejscu i działa prawidłowo.
      2. Głowa przymocuj zwierzę za pomocą pałąka na uchwycie w ustawieniu elektrofizjologicznym.
      3. Przyłóż maskę izofulanową do siebie, aby całkowicie zakryć pysk zwierzęcia.
    3. Regulacja znieczulenia
      1. Stopniowo zmniejszaj poziom znieczulenia do 0,7-1% izofluranu (maksymalnie w odstępach co 0,5% co 5 minut).
      2. Monitoruj częstość oddechów i ruchy zwierzęcia.
        UWAGA: Częstość oddechów powinna nieznacznie wzrosnąć w porównaniu ze stanem chirurgicznym, ale zwierzę nie powinno się ruszać.
      3. Jeśli zwierzę się porusza, natychmiast zwiększ stężenie izofluranu do 2%, a następnie powoli przywracaj je do niższego poziomu w odstępach co 0,5%.
    4. Wkładanie wąsów w celu stymulacji sensorycznej
      1. Przymocuj wibrysy myszy do urządzenia do stymulacji wąsów. W tym protokole należy umieścić dziewięć wibrysów w krótkich końcówkach do pipet o pojemności 10 μl, które są połączone z siłownikami piezoelektrycznymi, które zapewniają szybkie odchylenie wibrysów.

3. Nagrywanie

  1. Instalowanie siatki
    1. Kroki wstępne
      1. Włącz system nagrywania i wzmacniacz.
      2. Sprawdź parametry życiowe zwierzęcia.
    2. procedura
      1. Aby ustawić zwierzę i narzędzia, wykonaj kroki 3.1.2.2-3.1.2.4.
      2. Umieść zwierzę w urządzeniu do nagrywania i upewnij się, że kraniotomia pozostaje wilgotna, regularnie stosując roztwór soli fizjologicznej.
      3. W przypadku szczura umieść mikromanipulator na poręczy platformy, znajdującej się daleko za miejscem kraniotomii, aby uniknąć zakłóceń.
      4. W przypadku myszy umieść mikromanipulator bokiem do miejsca kraniotomii obok zwierzęcia.
      5. Aby przymocować i ustawić siatkę na myszy, wykonaj kroki 3.1.2.6-3.1.2.12.
      6. Przymocuj siatkę μECoG do sceny czołowej za pomocą złączy ZIF-clip (złącze headstage). Przytrzymaj elektroniczną płytkę sceny głównej na miejscu za pomocą mechanicznego pręta przymocowanego do mikromanipulatora.
      7. Opuścić siatkę μECoG poziomo, aby wyrównać ją płasko nad kraniotomią wzdłuż osi przednio-tylnej.
        UWAGA: Wzdłuż osi boczno-przyśrodkowej krawędź siatki powinna znajdować się w pobliżu przyśrodkowej granicy kraniotomii.
      8. Gdy siatka zostanie umieszczona w pobliżu mózgu, ale nie styka się z nim, przymocuj przewód odniesienia siatki do wszczepionego srebrnego drutu - złotego pinu. W razie potrzeby podłącz przewód uziemiający do zwierzęcia (np. do odsłoniętego mięśnia), aby zmniejszyć szum elektryczny.
      9. Ponadto obniż siatkę, aby skontaktować się z mózgiem.
      10. Przesuń siatkę na boki, aby "ślizgać się" po wilgotnej powierzchni opony twardej. Kontynuuj regulację, aż siatka zostanie wyśrodkowana wzdłuż osi przyśrodkowej bocznej.
      11. Użyj aspiracji lub gąbki chirurgicznej wokół krawędzi kraniotomii, aby usunąć nadmiar roztworu soli fizjologicznej.
      12. Gdy preparat będzie nieco bardziej suchy, upewnij się, że siatka mocniej przylega do opony twardej i nie ślizga się po jej powierzchni. Po wyschnięciu zastosuj ruch boczny do przyśrodkowego do elastycznej siatki, zapewniając kontakt z najbardziej bocznymi elektrodami. Elastyczny siatki w naturalny sposób wygina się, aby dopasować się do konturu mózgu.
      13. Aby ustawić siatkę na szczurze, wykonaj kroki 3.1.2.14-3.1.2.18.
      14. Zamocuj trzpień widełek mocujących w mikromanipulatorze, upewniając się, że płytka łącząca siatki będzie unosić się nad tylną stroną okna kraniotomii po opuszczeniu.
      15. Dostosuj położenie mikromanipulatora na poręczy tak, aby siatka znajdowała się mniej więcej nad miejscem kraniotomii. Opuść siatkę, aż zawiśnie blisko powierzchni mózgu. Zwilż powierzchnię mózgu niewielką kroplą soli fizjologicznej.
      16. Wykonaj te czynności za pomocą mikroskopu. Za pomocą pokręteł mikromanipulatora wyreguluj położenie siatki, aż będzie przylegać płasko do powierzchni mózgu w środku kraniotomii.
      17. Ostrożnie odprowadzaj wilgoć za pomocą chłonnego bawełnianego trójkąta, nie dotykając samej siatki. Upewnij się, że każdy rząd siatki styka się z powierzchnią mózgu.
        UWAGA: Usuwanie wilgoci zapobiega pasywnemu rozprzestrzenianiu się sygnału elektrycznego przez płyn między powierzchnią kory mózgowej a siatką, co przestrzennie rozprasza sygnał wykrywany na elektrodzie.
      18. Używając kleszczyków numer 2 lub numer 5, włóż drut uziemiający siatkę do tego samego otworu zadziorów lub włóż przewód odniesienia do otworu na zadziory, a przewód uziemiający do pobliskiej tkanki mięśniowej.
        UWAGA: Przewody powinny być włożone tylko ~ 1 mm, wystarczająco dużo, aby zetknąć się z mózgiem, ale nie spowodować krwawienia lub urazu mózgu.
  2. Sprawdzanie położenia siatki
    1. Monitorowanie aktywności elektrofizjologicznej
      1. Obserwuj aktywność elektrofizjologiczną za pomocą oprogramowania rejestrującego. W lekkim znieczuleniu sygnały mózgowe są zmienne i mogą wykazywać różne wzorce.
      2. Prawidłowe podłączenie przewodów sieciowych, odniesienia i uziemienia powinno skutkować wysokim stosunkiem sygnału do szumu, przy amplitudach sygnału w zakresie mV. Monitoruj szum w zakresie wysokich częstotliwości za pomocą filtrowania pasmowoprzepustowego za pomocą Trodes (np. 100-6000 Hz) i upewnij się, że nie przekracza on kilkudziesięciu mikrowoltów (μV).
    2. Oceń reakcję sensoryczną za pomocą hałasu (np. klaskania lub pstrykania palcami) w celu wywołania widocznych potencjałów elektrycznych powierzchni korowej związanych ze zdarzeniem (CSEP).
      UWAGA: Stymulacja pojedynczego wąsa powinna wywołać wyraźny, ostry CSEP związany ze zdarzeniem tylko w kilku kanałach (Mysz).
    3. Weryfikacja pozycji siatki
      1. W przypadku szczura upewnij się, że siatka jest prawidłowo umieszczona nad korą słuchową. Pierwszy zarejestrowany blok powinien być zazwyczaj bodźcem białego szumu z lat 60-sekundowych ustawionym w celu sprawdzenia, czy siatka rejestruje właściwą reakcję mózgu. Przeprowadzaj nagrania diagnostyczne białego szumu i tonu tylko za pomocą siatki przed wstawieniem politrody, aby pomóc określić, czy siatka została umieszczona prawidłowo i czy istnieje odpowiedź sygnału.
      2. W przypadku myszy, aby zweryfikować położenie siatki, wykonaj szybką sesję mapowania z odchyleniami wąsów 20-30 w odstępach co 350 ms. Zarejestruj aktywność w paśmie lokalnego potencjału pola (LFP) za pomocą Trodes i przeanalizuj ją w trybie offline za pomocą niestandardowego kodu MATLAB, aby zwizualizować przestrzenny zasięg aktywności wywołanej wąsami.
    4. Położenia
      1. Jeśli siatka wymaga regulacji, zwilż powierzchnię kory kroplami soli fizjologicznej nad siatką.
      2. Pozostaw sól fizjologiczną na 30 s do 1 minuty przed próbą podniesienia siatki.
      3. Ostrożnie i powoli podnieś siatkę.
      4. Zmień jego położenie, wykonując czynności opisane w kroku 3.1.
  3. Politrody laminarne dla szczura
    1. Konfiguracja Polytrode
      1. Najpierw podłącz adapter headstage do tylnej strony polytrody. Przypnij złącze do trzeciego zestawu kanałów na płycie adaptera. Upewnij się, że znak na klipsie jest skierowany w prawą stronę biznesowego końca politrody.
    2. Wstawienie politrody
      1. Włóż politrodę do mózgu, aż ostatnie (najwyższe) elektrody będą widoczne nad powierzchnią kory mózgowej. Powolne opadanie (do 1 μm/s) poprawia jakość sygnału. Odczekaj 15 minut, pozwalając mózgowi przyzwyczaić się do obecności politrody.
      2. Po 15 minutach sprawdź, czy ostatnie elektrody weszły w powierzchnię kory mózgowej. Jeśli nie, opuść nieco bardziej politrodę i odczekaj dodatkowe 10 minut przed kontynuowaniem.
  4. Pozycjonowanie optogenetycznego źródła światła na myszy
    1. Użyj systemu precyzyjnie regulacyjnych w trzech wymiarach, zamontowanego na przegubowym ramieniu, lub mikromanipulatora do montażu uchwytu światłowodu.
    2. Aby poprowadzić źródło światła i pomóc w ustawieniu światłowodu, włącz światło optogenetyczne o niskiej intensywności. Użyj ramienia przegubowego, aby zgrubnie ustawić światło optogenetyczne w kierunku obszaru docelowego.
    3. Ustaw ostrość i dostosuj położenie światłowodu za pomocą mikromanipulatora lub do precyzyjnej regulacji.
  5. Nagrywanie sygnałów
    1. preparat
      1. Odłącz wszystkie niepotrzebne światła, przedłużacze i listwy przeciwprzepięciowe w sprzęcie chirurgicznym, aby zmniejszyć zakłócenia elektryczne. Wyłącz górne światła w platformie.
      2. Przed rozpoczęciem eksperymentu zamknij drzwi do odizolowanej przestrzeni nagraniowej i drzwi do sali operacyjnej.
    2. Rozpoczęcie akwizycji
      1. W przypadku szczura uruchom Synapse na platformie nagrywającej/komputerze i potwierdź, że akwizycja jest funkcjonalna, wyświetlając podgląd i sprawdzając sygnały. Wywołuj duże, ostre stany przejściowe napięcia w sygnale μECoG, prezentując bodźce w pobliżu zwierzęcia, np. klaskanie.
      2. W przypadku myszy rozpocznij sesję nagraniową w Trodes.
    3. Nawilżenie
      1. Wstrzyknąć szczurowi lub myszy podskórnie odpowiednio 1 ml lub 0,1 ml soli fizjologicznej co 1-2 godziny podczas nagrywania, aby zapobiec odwodnieniu. W przypadku szczura odczekaj 5-10 minut po podaniu soli fizjologicznej przed uruchomieniem nowego bloku nagrywania.
    4. Zestawy bodźców
      1. W przypadku szczura, po potwierdzeniu miejsca nagrywania, przystąp do rejestrowania wymaganych zestawów bodźców. Przykładowy zestaw może zawierać
        Biały szum (60 s)
        Diagnostyka tonalna (5 min)
        Czysty ton (23 min)
        Dynamiczne ruchome tętnienie
        Ton 150 (15 min)
        TIMIT (38 min)
      2. W przypadku szczura należy ponownie wprowadzić diagnostykę białego szumu i tonu za każdym razem, gdy siatka jest zmieniana.
      3. Bodźce dotykowe dla myszy: Zapewnij bodźce dotykowe w strukturze próbnej, przy czym każda próba zawiera ciąg losowych odchyleń wąsów co 350 ms. W podanym przykładzie każda próba obejmuje 14 ugięć prezentowanych na przestrzeni 4500 ms.
      4. Bodźce optogenetyczne dla myszy: W niektórych próbach należy zastosować kwadratowy impuls światła optogenetycznego przez cały czas trwania badania (5 s). Określ wymagany poziom światła na podstawie użytej opsyny i głębokości tkanki, która ma zostać osiągnięta, korzystając z oszacowań penetracji światła (https://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php)
  6. Oczyszczania
    1. Podnoszenie i czyszczenie siatki
      1. Po zakończeniu nagrywania zamknij oprogramowanie do nagrywania i ponownie podłącz źródła światła do zestawu.
      2. Jeśli mózg jest suchy, nałóż małą kroplę soli fizjologicznej na powierzchnię mózgu za pomocą strzykawki. Pozostaw sól fizjologiczną na 30 s do 1 minuty przed próbą podniesienia siatki.
      3. Pracując pod mikroskopem, delikatnie podnieś siatkę z powierzchni mózgu za pomocą mikromanipulatorów.
      4. Jeśli podczas podnoszenia siatki potrzebna jest dodatkowa siła, użyj kleszczyków z końcówką węglową (zamkniętych), aby delikatnie podnieść siatkę z mózgu. Upewnij się, że ruch mikromanipulatora jest lekko do przodu, aby delikatnie oderwać siatkę od powierzchni mózgu.
      5. Po całkowitym wyjęciu kratki odłącz ją od widelca chwytającego i wyczyść zgodnie z krokami 3.6.1.6-3.6.1.7.
      6. Namocz ruszt (bez płytki łączącej) w rozcieńczonym detergencie enzymatycznym (50% Enzolu, 50% wody destylowanej) przez co najmniej 1 godzinę. Następnie przenieś go do drugiej kąpieli z czystą wodą destylowaną i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w bezpiecznym, czystym miejscu.
      7. Jeśli na obszarach siatki zdeponowała się krew lub tkanka, użyj bawełnianego trójkąta nasączonego roztworem enzymatycznym, aby delikatnie wytrzeć go do czysta.
      8. Po wyschnięciu włóż siatkę z powrotem do pudełka.
    2. Eutanazja zwierzęcia
      1. W przypadku myszy należy usunąć zwierzę z unieruchomienia głowy i umieścić je w komorze eutanazji. Dodać gazę z 5 ml izofluranu i odczekać 60 s po ustaniu oddychania. Sprawdź brak odruchu wycofania i odetnij głowę ostrymi nożyczkami.
      2. W przypadku szczura wstrzyknij 0,2 ml pentobarbitalu IP. Odczekaj 60 s po ustaniu oddychania, połóż zwierzę na plecach i użyj ostrza #11, aby wykonać podwójną torakotomię.
    3. Czyszczenie sprzętu
      1. Zabierz wszystkie narzędzia chirurgiczne do zlewu laboratoryjnego i połóż je na ręczniku chirurgicznym. Spryskaj narzędzia 10% roztworem wybielacza i dokładnie umyj w zlewie. W przypadku bardziej zabrudzonych narzędzi pozwól im zanurzyć się w roztworze wybielacza przed myciem.
      2. Alternatywnie użyj detergentu w proszku (np. Contrex AP) z wodą, szorując narzędzia szczotką w zlewie.
      3. Po oczyszczeniu i wypłukaniu narzędzi wytrzyj je chusteczkami nasączonymi alkoholem i włóż z powrotem do miejsca przechowywania.
    4. Odkażanie miejsca pracy
      1. Wyrzuć wszystkie zużyte igły i ostrza do pojemnika na ostre przedmioty.
      2. Wyrzuć zanieczyszczone waciki, trójkąty i chusteczki nasączone alkoholem do torby na zagrożenie biologiczne.
      3. Wytrzyj wszystkie powierzchnie robocze w pomieszczeniu platformy alkoholem i wyczyść wszystkie instrumenty przed zamknięciem miejsca pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy protokoły rejestracji sygnałów elektrokortykograficznych w połączeniu z metodami optogenetycznymi i zapisami laminarnymi. Tutaj przedstawiono typowe sygnały uzyskane z kory somatosensorycznej myszy ( Rysunek 1, Rysunek 2 i Rysunek 3) oraz w obrębie kory słuchowej szczurów w odpowiedzi na stymulację sensoryczną (Rysunek 4, Rysunek 5 i Rysunek 6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj protokoły umożliwiają integrację matryc mikroelektrokortykografii o dużej gęstości (μECoG) z sondami laminarnymi i technikami optogenetycznymi. Łatwość użycia tego protokołu w modelach gryzoni sprawia, że jest to potężne narzędzie do badania dynamiki kory mózgowej, a liczbę badanych można łatwo zwiększyć. Siatka μECoG o dużej gęstości pozwala na wydajne, przestrzenne precyzyjne mapowanie topografii kory mózgowej w wielu obszarach u myszy i szczurów, wykorzystując kluczową rolę reprezentacji topograficznych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Lawrence Berkeley National Laboratory LDRD for the Neural Systems and Machine Learning Lab (K.E.B.), NINDSR01 NS118648A (K.E.B.& D.E.F.) oraz NINDS R01 NS092367 (D.E.F.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 jednorazowe ostrze #11Swann Morton303Do zabiegów chirurgicznych
2 jednorazowe ostrza #10Swann Morton3901Do zabiegów chirurgicznych
Pręty klatkowe 30 mmElementy klatkiThorlabsER
Płytka klatki 30 mmThorlabsCP33Ttrzymająca soczewki
70% etanoluDecon LabsV1016Środek czyszczący / dezynfekujący (rozcieńczony do 70%)
Amalgambond PLUS Regulowany precyzyjny pędzel aplikacyjny turkusowy 200/BxHenry Schein1869563precyzyjny aplikator do cementu
Katalizator Amalgambond PLUS 0,7 ml Wzmacniaczkomponentem cementowymHenry Schein1861119
Tucker-Davis Technologies)Tucker-Davis TechnologiesPZ5M-512Służy do stymulacji słuchowej i nagrywania oprogramowanie.
Ramię przeguboweNogaDG60103do przytrzymywania systemu precyzyjnej regulacji
Soczewki asferyczne do zbierania światła (i jedna do skupiania światła)ThorlabsACL25416U-Bdo zbierania światła LED
Sprzęt słuchowyTucker-Davis Technologies, Sony, CorteraRP2.1 Ulepszony procesor czasu rzeczywistego/napęd słuchawkowy HB7Służy do bodźców słuchowych i oprogramowania do nagrywania.
BuprenorfinaSterylne Produkty LLC#42023017905Ogólna analgezja
C& B Cement bazowy Metabond EaHenry Schein1864477składnik cementowy
C& B Metabond L-Powder Cement bezbarwny 3 g Henry Schein1861068składnik cementowy
Chlorowodorek chlorprotiksenu (mysz)Sigma AldrichCat. Nie. C1671Do sedacji należy przygotować tego samego dnia i przechowywać w 4
Specjalnie zaprojektowana 128-kanałowa mikroelektrokortykografia (μ ECoG) siatkiNeuronexusE128-200-8-40-HZ64Do zapisów neurofizjologicznych. Umieszczony na korze mózgowej.
Gąbki żelatynoweDengofoam Dengen dental600034 (SKU)mogą być używane na sucho lub na mokro, nasycone sterylnym roztworem chlorku sodu
Wiertło, rozmiar 5 do 9 (Mysz)Fine Science Tools19007-XXXX to rozmiar wiertła np. 05 lub 09. Do zabiegów na myszach
WiertłoStalowe okrągłe wiertło (5,5 mm/7,5 mm)LZQ ToolsWiertło dentystyczne Wiertło ze stali nierdzewnejDo zabiegów na szczurach
Kleszcze Dumont nr 5Fine Science Tools11251-10Do zabiegów chirurgicznych
Pęseta Dumont #5 wygięta 45°Światowe instrumenty precyzyjne14101do usuwania okna kraniotomii
Odtwarzacz DVD (Sony)SonyCDP-C345System służący do przyjmowania i odtwarzania zestawów bodźców
Głośnik elektrostatycznySonyXS-162ESSłuży do oprogramowania do stymulacji słuchowej i nagrywania. Znajduje się w platformie, odtwarza dźwięk do uspokojonego gryzonia
Detergent enzymatyczny (Enzol)Zaawansowane produkty do sterylizacji2252Środek czyszczący/dezynfekujący
EverEdge 2.0 Skaler Sierp Dwustronny H6/H7 #9 HenrySchein6011862do szorowania czaszki
System precyzyjnej regulacji w 3 wymiarachNarishigeU-3Cdo precyzyjnego pozycjonowania końcówki
światłowoduZłota szpilkaHarwin IncG125-1020005Służy do odniesienia kontaktowego w myszy Przylutowany do srebrnego drutu
Kleszcze chwytająceFine Science Tools00632-11Do zabiegów chirurgicznych
IsofluraneCovetrus11695067772wymagają waporyzatora
Ketamina (wstrzyknięcie chlorowodorku) (szczur)Dechra17033-101-10Dioda LED znieczulająca / przeciwbólowa
Nowa energiaLED XLAMP XPE2 NIEBIESKA PRAWA burtaNiebieskie źródło światła LED
Sterownik LEDThorlabsLEDD1BSterownik LED
LidokainaCovetrusVINB-0024-6800do rozcieńczenia do 1% w soli fizjologicznej
MeloksykamCovetrus6451603845Przeciwzapalny stosowany w ogólnym znieczuleniu
MikromanipulatorNarishige (Stereotaxic Rig)SR-6R + Komponenty SR-10R-HTSłuży do manipulowania ECoG i gryzoniami za pomocą precyzyjnych ruchów
Kleszcze nr 2Narzędzia Fine Science Tools91117-10Do zabiegów chirurgicznych
Kleszcze nr 55Narzędzia do nauki1129551Do zabiegów chirurgicznych
Smar okulistyczny (sztuczne łzy)Akorn17478-062-35Służy do ochrony oczu przed wysuszeniem podczas zabiegów
chirurgicznychŚwiatłowód 200 i mikro; m Średnica rdzeniaThorlabsM133L02Złącze FC/PC o długości 2 m
Pentobarbital (Rat)Covetrus / DechraVINV-C0II-0008Anestezja/Analgezjo-Platyna
Sigma205915-250MGDo zapisów neurofizjologicznych (Służy do galwanizacji styków na μ Siatki ECoG).
Powidon Jod 10%Betadinehttps://betadine.com/medical-professionals/betadine-solution/bez numeru katalogowego ( nie detaliczny )
Detergent w proszku (Contrex AP)Decon Labs5204Środek czyszczący / dezynfekujący
Wstępnie przycięta taśma do rurki tlenowejULINE (różni dostawcy)S-14726Służy do mocowania rurki tlenowej do stożka nosowego zestawu stereotaktycznego gryzonia
Rękojeść skalpela # 3Światowe instrumenty precyzyjne500236-Gdo ostrzy # 10, #11 i #15
SkrobakFine Science Tools1007516Do zabiegów chirurgicznych
Krótkie igły 30 GExelInt26437Do zabiegów chirurgicznych i zastrzyków
Silver WireWarner Instruments63-1319Do zapisów neurofizjologicznych (Używany do uziemienia i jako elektroda odniesienia).
Sterylizowana sól fizjologiczna (0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań)Hospira00409-7101-67 (NDC)Do rozcieńczania wstrzykiwań i wymiany płynów ustrojowych
Stoelting Hopkins BulldogFine Science Tools10-000-481Do zabiegów chirurgicznych
Środek do dezynfekcji powierzchni (Coverage Plus NDP Disinfectant)Steris life science638708Środek czyszczący/dezynfekujący
Złącza TDT ZIF-clip do nabycia.Tucker-Davis TechnologiesZIF-Clip Analogowe stopnieczołowe Łączy ECoG z zewnętrznym sprzętem akwizycyjnym
Dwuzębny widelec trzymającyTucker-Davis TechnologiesZ-ROD128Służy do łączenia zacisków TDT z mikromanipulatorem
Ksylazyna (Rat)Covetrus1XYL006Znieczulenie/Środek przeciwbólowy
z ( pięknej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
  2. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  3. Nunez, P. L., Srinivasan, R. Electric Fields of the Brain: The Neurophysics of EEG. , Oxford University Press, USA. (2006).
  4. Mountcastle, V. B., Powell, T. P. Central nervous mechanisms subserving position sense and kinesthesis. Bull Johns Hopkins Hosp. 105, 173-200 (1959).
  5. Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nat Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).
  6. Lewis, C. M., Bosman, C. A., Womelsdorf, T., Fries, P. Stimulus-induced visual cortical networks are recapitulated by spontaneous local and interareal synchronization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E606-E615 (2016).
  7. Bouchard, K. E., Mesgarani, N., Johnson, K., Chang, E. F. Functional organization of human sensorimotor cortex for speech articulation. Nature. 495 (7441), 327-332 (2013).
  8. Fabrication and testing of a large area, high density, parylene MEMS µECoG array. Ledochowitsch, P., et al. 2011 IEEE 24th International Conference on Micro Electro Mechanical Systems, Cancun, Mexico, , (2011).
  9. Bosman, C. A., et al. Attentional stimulus selection through selective synchronization between monkey visual areas. Neuron. 75 (5), 875-888 (2012).
  10. Rubehn, B., Bosman, C., Oostenveld, R., Fries, P., Stieglitz, T. A MEMS-based flexible multichannel ECoG-electrode array. J Neural Eng. 6 (3), 036003(2009).
  11. Baratham, V. L., et al. Columnar localization and laminar origin of cortical surface electrical potentials. J Neurosci. 42 (18), 3733-3748 (2022).
  12. Kellis, S., et al. Decoding spoken words using local field potentials recorded from the cortical surface. J Neural Eng. 7 (5), 056007(2010).
  13. Viventi, J., et al. Flexible, foldable, actively multiplexed, high-density electrode array for mapping brain activity in vivo. Nat Neurosci. 14 (12), 1599-1605 (2011).
  14. A transparent µECoG array for simultaneous recording and optogenetic stimulation. Ledochowitsch, P., Olivero, E., Blanche, T., Maharbiz, M. M. 2011 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Boston, MA, USA, , (2011).
  15. Ledochowitsch, P., et al. Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits. J Neurosci Methods. 256, 220-231 (2015).
  16. Laminar origin of evoked ECoG highgamma activity. Annu Int Conf IEEE Eng Med Biol Soc. Dougherty, M. E., Nguyen, A. P. Q., Baratham, V. L., Bouchard, K. E. 2019, 4391-4394 (2019).
  17. Tian, H., Xu, K., Zou, L., Fang, Y. Multimodal neural probes for combined optogenetics and electrophysiology. iScience. 25 (1), 103612(2022).
  18. Gonzales, D. L., et al. A translaminar spacetime code supports touchevoked traveling waves. bioRxiv. , (2024).
  19. Leonard, M. K., et al. Largescale singleneuron speech sound encoding across the depth of human cortex. Nature. 626 (7999), 593-602 (2024).
  20. Renz, A. F., et al. OptoEDura: a soft, stretchable ECoG array for multimodal, multiscale neuroscience. Adv Healthc Mater. 9 (17), 2000814(2020).
  21. Buzsáki, G. Rhythms of the brain. , Oxford University Press, USA. (2006).
  22. Yang, W., et al. A fully transparent, flexible PEDOT:PSS-ITO-Ag-ITO based microelectrode array for ECoG recording. Lab Chip. 21 (6), 1096-1108 (2021).
  23. Buzsáki, G. Largescale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
  24. Schalk, G., et al. Realtime detection of eventrelated brain activity. Neuroimage. 43 (2), 245-249 (2008).
  25. Kellis, S., et al. Multiscale analysis of neural activity in humans: implications for microscale electrocorticography. Clin Neurophysiol. 127 (1), 591-601 (2016).
  26. Buzsáki, G., Schomburg, E. W. What does gamma coherence tell us about interregional neural communication. Nat Neurosci. 18 (4), 484-489 (2015).
  27. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecondtimescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  28. Cardin, J. A., et al. Driving fastspiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses. Nature. 459 (7247), 663-667 (2009).
  29. Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. Sensory and decisionrelated activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception. Nat Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).
  30. Petersen, C. C. The functional organization of the barrel cortex. Neuron. 56 (2), 339-355 (2007).
  31. Crone, N. E., Sinai, A., Korzeniewska, A. Highfrequency gamma oscillations and human brain mapping with electrocorticography. Prog Brain Res. 159, 275-295 (2006).
  32. Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC crerecombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
  33. Mountcastle, V. The columnar organization of the neocortex. Brain. 120 (4), 701-722 (1997).
  34. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  35. Muller, L., Chavane, F., Reynolds, J., Sejnowski, T. J. Cortical travelling waves: mechanisms and computational principles. Nat Rev Neurosci. 19 (5), 255-268 (2018).
  36. Sato, T. K., Nauhaus, I., Carandini, M. Traveling waves in visual cortex. Neuron. 75 (2), 218-229 (2012).
  37. Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Columnar specificity of intrinsic horizontal and corticocortical connections in cat visual cortex. J Neurosci. 9 (7), 2432-2442 (1989).
  38. Angelucci, A., et al. Circuits and mechanisms for surround modulation in visual cortex. Annu Rev Neurosci. 40 (1), 425-451 (2017).
  39. Singer, W., Gray, C. M. Visual feature integration and the temporal correlation hypothesis. Annu Rev Neurosci. 18, 555-586 (1995).
  40. Quiroga, R. Q., et al. Invariant visual representation by single neurons in the human brain. Nature. 435 (7045), 1102-1107 (2005).
  41. Fusi, S., Miller, E. K., Rigotti, M. Why neurons mix: high dimensionality for higher cognition. Curr Opin Neurobiol. 37, 66-74 (2016).
  42. Stringer, C., et al. Spontaneous behaviors drive multidimensional, brainwide activity. Science. 364 (6437), eaav7893(2019).
  43. Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using celltypespecific expression of channelrhodopsin2. Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
  44. Mardinly, A. R., et al. Precise multimodal optical control of neural ensemble activity. Nat Neurosci. 21 (6), 881-893 (2018).
  45. Mahn, M., et al. Highefficiency optogenetic silencing with somatargeted anionconducting channelrhodopsins. Nat Commun. 9 (1), 4125(2018).
  46. Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. Creating lowimpedance tetrodes by electroplating with additives. Sens Actuators A Phys. 156 (2), 388-393 (2009).
  47. Halnes, G., et al. Electric Brain Signals: Foundations and Applications of Biophysical Modeling. , Cambridge University Press. (2024).
  48. Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nat Rev Neurosci. 9 (5), 370-386 (2008).
  49. Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G. Consciousness and anesthesia. Science. 322 (5903), 876-880 (2008).
  50. Schalk, G., Leuthardt, E. C. Braincomputer interfaces using electrocorticographic signals. IEEE Rev Biomed Eng. 4, 140-154 (2011).
  51. Chestek, C. A., et al. Longterm stability of neural prosthetic control signals from silicon cortical arrays in rhesus macaque motor cortex. J Neural Eng. 8 (4), 045005(2011).
  52. Branco, M. P., et al. Nine decades of electrocorticography: a comparison between epidural and subdural recordings. Eur J Neurosci. 57 (8), 1260-1288 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Micro ElectrocorticographyLaminar PolytrodesOptogenetic ManipulationCortical ProcessingSensory Evoked ResponsesHigh Gamma ActivityTonotopic MappingRodent Brain RecordingAuditory CortexWhisker Somatosensory Cortex

Powiązane artykuły