Niniejszy film i protokół demonstrują sposób implantacji pokrytego szkłem okna czaszkowego u gryzoni. Preparaty te mogą być wykorzystywane do przewlekłego obrazowania dwufotonowego neocortex in vivo w skalach czasowych obejmujących wiele miesięcy. Mogą one być również stosowane w innych rodzajach obrazowania, w tym w obrazowaniu sygnałów optycznie immanentnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Procedura kraniotomii w celu przewlekłego obrazowania mózgu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Techniki obrazowania stają się coraz ważniejsze w badaniach nad funkcjami mózgu. Wśród nich mikroskopia laserowa dwufotonowa stała się niezwykle użyteczną metodą, ponieważ umożliwia badanie żywego, nienaruszonego mózgu. Przy odpowiednim przygotowaniu technika ta pozwala na chroniczną obserwację tego samego obszaru kory, od kilku minut do wielu miesięcy. W tym filmie przedstawiamy metodę przygotowania do chronicznego obrazowania mózgu in vivo z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej. Technika ta została zapoczątkowana przez dr. Karela Svobodę, obecnie badacza w Howard Hughes Medical Institute w Janelia Farm. Preparaty, takie jak ten pokazany tutaj, mogą być wykorzystywane do obrazowania struktury neocortex (np. dynamiki dendrytów i aksonów), rejestracji aktywności neuronalnej przy użyciu barwników wrażliwych na wapń, obrazowania dynamiki przepływu krwi w korze mózgowej lub do badań z zakresu wewnątrzpochodnego obrazowania optycznego. Głębokie obrazowanie neocortex jest możliwe dzięki optymalnemu przeprowadzeniu operacji okna czaszkowego. Praca w możliwie najbardziej sterylnych warunkach w celu uniknięcia infekcji, wraz z zachowaniem szczególnej ostrożności, aby nie uszkodzić opony twardej podczas operacji, pozwoli na uzyskanie trwałych i skutecznych okien czaszkowych przykrytych szkłem.
Protokół
- Zanurz myszy w narkozie izofluranem (4% do indukcji, 1,5-2% podczas operacji), stosując procedury zatwierdzone przez IACUC. Należy ucisnąć ogon i/lub palce stopy, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni zsedowane.
- Za pomocą trymera do gryzoni ogolić sierść od karku aż do oczu.
- Umieścić mysz w aparacie stereotaktycznym na podgrzewanym kocu z recyrkulacją wody. Głowę należy mocno unieruchomić za pomocą prętów usznych.
- Nanieść maść do oczu, aby zapobiec wysychaniu gałek ocznych zwierzęcia.
- Podać podskórnie deksametazon (0,2 mg/Kg) i karprofen (5 mg/Kg), aby odpowiednio zapobiec obrzękowi mózgu i/lub reakcji zapalnej.
- Przed rozpoczęciem operacji zdezynfekować pole operacyjne, przecierając skórę naprzemiennie trzy razy 70% alkoholem oraz betadyną.
- Wszystkie instrumenty chirurgiczne zostały uprzednio wysterylizowane w sterylizatorze koralikowym. Używając nożyczek wysterylizowanych etanolem, usunąć skórę z górnej części czaszki, zaczynając od cięcia poziomego wzdłuż podstawy głowy, a następnie wykonać dwa cięcia w kierunku rostralnym, niemal do powiek, a na koniec dwa cięcia ukośne zbiegające się w linii środkowej.
- W tym momencie na okostną nanosi się kroplę roztworu lidokainy z epinefryną , aby uniknąć nadmiernego krwawienia lub bólu. Za pomocą skalpela odsunąć okostną do krawędzi czaszki. Należy również delikatnie odsunąć mięśnie karku.
- Delikatnie zeskrobać skalpelem cały odsłonięty obszar czaszki, aby stworzyć suchą powierzchnię. Jest to bardzo ważne, ponieważ pozwoli to na lepsze przyleganie kleju naniesionego w późniejszym etapie.
- Po wyborze miejsca obrazowania można przystąpić do wykonania okna czaszkowego. Najpierw pneumatycznym wiertłem stomatologicznym delikatnie „wyrysować” okrąg o średnicy około 4 mm.
- Po lekkim nawierceniu ponownie nanieść roztwór lidokainy z epinefryną na powierzchnię czaszki. Wirowanie należy przerwać, gdy pozostanie bardzo cienka warstwa kości. Zazwyczaj można rozpoznać ten etap, delikatnie naciskając środek kraniotomii i wyczuwając jego ugięcie.
- Podając kroplę soli fizjologicznej i wykorzystując beleczki kostne – gąbczastą strukturę kości – usunąć fragment kraniotomii z czaszki za pomocą pęsety z bardzo cienkimi końcówkami. Sól fizjologiczna jest istotna, ponieważ ułatwia uniesienie fragmentu czaszki i zapobiega krwawieniu z opony twardej.
- Na oponę twardą nałożyć Gelfoam uprzednio nasączony solą fizjologiczną, aby zatamować niewielkie krwawienia, które zdarzają się okazjonalnie podczas usuwania fragmentu czaszki.
- Po osuszeniu powierzchni opony twardej i upewnieniu się, że nie występuje krwawienie, delikatnie położyć sterylne szkiełko nakrywkowe o grubości 5 mm na oponie twardej. (Uwaga: inne grupy nakładają również kroplę agarozy o niskiej temperaturze topnienia (1,2%) na oponę twardą, a następnie kładą szkiełko na agarozie).
- Nanieść kroplę kleju na bazie cyjanoakrylanu na przeciwległą półkulę czaszki. Za pomocą igły delikatnie rozprowadzić klej wokół okna, uważając, aby nie dostał się on pod szkiełko. Następnie można nałożyć cienką warstwę kleju na całą powierzchnię czaszki.
- Po wyschnięciu kleju wymieszać akryl stomatologiczny i nałożyć go na całą powierzchnię czaszki, zakrywając również niewielki brzeg szkiełka nakrywkowego, aby je zabezpieczyć.
- Po zabezpieczeniu szkiełka nakrywkowego utworzyć z akrylu stomatologicznego mały wałek wokół okna. W akrylu należy również osadzić pręt tytanowy. Pręt ten posłuży później do stabilnego przymocowania myszy do stolika mikroskopu podczas obrazowania. Ważne jest, aby pręt był wypoziomowany, czyli równoległy do okna czaszkowego. Umieszczenie kawałka papieru pod prętem może pomóc w utrzymaniu poziomu podczas twardnienia akrylu.
- Akryl stomatologiczny pozostawia się do utwardzenia przez 10 minut, po czym pręt tytanowy zostaje utrwalony na miejscu. Umieścić zwierzę w ciepłej klatce do czasu wybudzenia.
- Po wybudzeniu z narkozy zwierzę może zostać poddane obrazowaniu tego samego dnia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jak pokazano w materiale wideo oraz na rysunkach uzupełniających, przygotowanie okna czaszkowego w połączeniu z zastosowaniem mikroskopii dwufotonowej stanowi bardzo potężne narzędzie do badania in vivo struktury i funkcji neocortex. Technika ta wymaga rygorystycznego przeszkolenia w celu zapoznania się z odpowiednią anatomią oraz precyzyjnymi procedurami i umiejętnościami chirurgicznymi, których wymaga ta metoda przygotowania. Do obrazowania chronicznego można wykorzystywać wyłącznie preparaty po nienagannie przeprowadz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Karprofen (Rimadyl) | Lek | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Izofluran (Aerrane) | Chirurgia | Baxter Internationl Inc. | ||
| Deksametazon | Lek | Baxter Internationl Inc. | ||
| Proszek Ortho-Jet | Odczynnik | LANG | Do zmieszania z akrylem | |
| Płyn Jet-Acrylic | Odczynnik | LANG | Do zmieszania z proszkiem Ortho-Jet | |
| Okrągłe szkiełko podstawowe | Narzędzie | Electron Microscopy Sciences | 72195-05 | średnica 5 mm |
| Gelfoam | Chirurgia | Pharmacia Corporation (Pfizer) | ||
| Pręty tytanowe są wykonane na zamówienie |
Bibliografia
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 85, 161-165 (1997).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404, 876-881 (2000).
- Trachtenberg, J. T., Chen, B., Knott, G. W., Feng, G., Sanes, J. R., Welker, E., Svoboda, K. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., DePaola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3, (2005).
- Holtmaat, A., Wilbrecht, L., Knott, G. W., Welker, E., Svoboda, K. Experience-dependent and cell-type-specific spine growth in the neocortex. Nature. 441, 979-983 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
