Artykuł metodologiczny

Zabieg kraniotomii w przewlekłym obrazowaniu mózgu

DOI:

10.3791/680

⸱

15 lutego 2008

 , 
1Department of Neurology, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten film i protokół pokazują, jak wszczepić gryzoniom szklane okno czaszkowe. Preparaty te mogą być stosowane do przewlekłego dwufotonowego obrazowania kory nowej in vivo w skali miesięcy. Może być również stosowany do innych rodzajów obrazowania, w tym optycznego obrazowania sygnału wewnętrznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Techniki obrazowania stają się coraz ważniejsze w badaniu funkcji mózgu. Wśród nich dwufotonowa laserowa mikroskopia skaningowa okazała się niezwykle przydatną metodą, ponieważ pozwala na badanie żywego, nienaruszonego mózgu. Przy odpowiednim przygotowaniu technika ta pozwala na obserwację tego samego obszaru kory mózgowej przewlekle, od kilku minut do miesięcy. W tym filmie pokazujemy przygotowanie do przewlekłego obrazowania mózgu in vivo za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Technika ta została początkowo zapoczątkowana przez dr Karela Svobody, który obecnie jest badaczem Instytutu Medycznego Howarda Hughesa w Janelia Farm. Preparaty takie jak ten pokazany tutaj mogą być stosowane do obrazowania struktury kory nowej (np. dynamiki dendrytycznej i aksonalnej), do rejestrowania aktywności neuronalnej za pomocą barwników wrażliwych na wapń, do obrazowania dynamiki przepływu krwi w korze mózgowej lub do wewnętrznych badań obrazowania optycznego. Głębokie obrazowanie kory nowej jest możliwe dzięki optymalnym operacjom okien czaszkowych. Działanie w możliwie najbardziej sterylnych warunkach, aby uniknąć infekcji, wraz z zachowaniem szczególnej ostrożności, aby nie uszkodzić opony twardej podczas operacji, zaowocuje udanymi i długotrwałymi oknami czaszki pokrytymi szkłem.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Znieczulenie myszy izofluranem (4% do indukcji, 1,5-2% do operacji) przy użyciu procedur zatwierdzonych przez IACUC. Ważne jest, aby użyć szczypania ogona i/lub palców u nóg, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni uspokojone.
  2. Za pomocą trymera dla gryzoni zgol włosy od karku aż do oczu.
  3. Umieść mysz w stereotaktycznej ramce, nad kocem chirurgicznym z recyrkulacją wody. Mocno zabezpiecz głowę za pomocą nauszników.
  4. Zastosuj maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oka zwierzęcia.
  5. Podawać podskórnie deksametazon (0,2 mg/kg) i karprofen (5 mg/kg), aby zapobiec obrzękowi mózgu i (lub) reakcji zapalnej.
  6. Przed rozpoczęciem zabiegu należy wysterylizować obszar operacyjny, przecierając skórę trzema naprzemiennymi machnięciami 70% alkoholu i betadyny.
  7. Wszystkie narzędzia chirurgiczne zostały wstępnie wysterylizowane za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi. Za pomocą nożyczek, które zostały wysterylizowane etanolem, usuń skórę z górnej części czaszki, zaczynając od poziomego cięcia wzdłuż podstawy głowy, a następnie dwóch cięć w kierunku rostralnym, prawie sięgając powiek, a następnie dwóch ukośnych cięć, które zbiegają się na linii środkowej.
  8. W tym momencie na okostną nakłada się kroplę roztworu lidokainy + epinefryny , aby uniknąć nadmiernego krwawienia lub bólu. Za pomocą skalpela cofnij okostną do krawędzi czaszki.  Lekko cofnij również mięśnie tylnej części szyi.
  9. Delikatnie zeskrob skalpelem cały odsłonięty obszar czaszki, aby uzyskać suchą powierzchnię. Jest to bardzo ważne, ponieważ pozwoli to klejowi lepiej przylegać po późniejszym nałożeniu.
  10. Po wybraniu miejsca obrazowania można przystąpić do tworzenia okna czaszkowego. Najpierw delikatnie "narysuj" okrąg o średnicy około 4 mm za pomocą pneumatycznej wiertarki dentystycznej.
  11. Po lekkim wierceniu ponownie nałóż roztwór lidokainy + epinefryny na powierzchnię czaszki. Przerwij wiercenie, gdy pozostanie bardzo cienka warstwa kości. Delikatnie naciskając na środek kraniotomii, aby poczuć, jak ustępuje, zwykle można wiedzieć, że ten etap został osiągnięty.
  12. Pod kroplą soli fizjologicznej i wykorzystując beleczki kostne - gąbczastą strukturę kości - podnieś kraniotomię z czaszki za pomocą bardzo cienkich kleszczyków z końcówką. Sól fizjologiczna jest ważna, ponieważ pomoże podnieść czaszkę i zapobiegnie krwawieniu opony twardej.
  13. Nałóż piankę żelową, która została wcześniej nasączona solą fizjologiczną, na oponę twardą, aby zatrzymać niewielkie krwawienie, które czasami pojawia się po usunięciu czaszki.
  14. Po wysuszeniu powierzchni opony twardej i upewnieniu się, że nie ma krwawienia, delikatnie połóż sterylną szklaną szkiełko nakrywkowe o grubości 5 mm na oponie twardej. (Uwaga: inne grupy również umieszczają kroplę agarozy o niskiej temperaturze topnienia (1,2%) na oponie twardej i kładą szkiełko nakrywkowe na wierzchu agaru).
  15. Nałóż kroplę kleju na bazie cyjanoakrylanu na przeciwległą półkulę czaszki. Za pomocą igły delikatnie nałóż klej na całe okno, uważając, aby nie umieścić go pod szybą. Klej można teraz nakładać cienką warstwą na całą powierzchnię czaszki.
  16. Po wyschnięciu kleju wymieszaj akryl dentystyczny i nałóż go na całą powierzchnię czaszki, pokrywając również niewielką krawędź szkiełka nakrywkowego, aby go zabezpieczyć.
  17. Po zabezpieczeniu szkiełka nakrywkowego wykonaj małą studzienkę wokół okna z akrylem dentystycznym. Osadź również tytanową sztabkę w akrylu dentystycznym. Ten pasek będzie później używany do bezpiecznego przymocowania myszy do stolika mikroskopu w celu obrazowania. Ważne jest, aby upewnić się, że pręt jest wypoziomowany, tak aby był równoległy do okna czaszki. Umieszczenie kawałka papieru pod drążkiem może pozwolić, aby pręt pozostał wypoziomowany, podczas gdy akryl twardnieje.
  18. Akryl dentystyczny pozostawia się do utwardzenia (stwardnienia) przez 10 minut, po czym tytanowy pręt jest zamocowany na miejscu. Umieść zwierzę w ciepłej klatce, aż wyzdrowieje.
  19. Po wyzdrowieniu ze znieczulenia zwierzę można sfotografować tego samego dnia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak pokazaliśmy na filmie i na rysunkach uzupełniających, przygotowanie okna czaszkowego, w połączeniu z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej, jest bardzo potężnym narzędziem do badania in vivo struktury i funkcji kory nowej. Technika ta wymaga rygorystycznego treningu, aby zapoznać się z odpowiednią anatomią oraz subtelnymi procedurami chirurgicznymi i umiejętnościami, których wymaga to przygotowanie. Tylko nieskazitelne operacje mogą być stosowane do przewlekłego obrazowania. Jeśli opona twarda jest nadmiernie mani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Karprofen (Rimadyl)LekPfizer Pharma GmbH
Isoflurane (Aerrane)SurgeryBaxter Internationl Inc.
Lek deksametazonowyBaxter Internationl Inc.
Odczynnik w proszku Ortho-JetLANGDo zmieszania z akrylowym
odczynnikiem w płynie Jet-AcrylicLANGDo zmieszania z Ortho-Jet Powder
Okrągłe szklane narzędzie do szkiełek nakrywkowychMikroskopia elektronowa Nauki72195-05Gelfoam Surgery o średnicy 5 mm
Pharmacia Corporation (Pfizer)
Sztabki tytanowe są wykonywane na zamówienie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 85, 161-165 (1997).
  2. Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404, 876-881 (2000).
  3. Trachtenberg, J. T., Chen, B., Knott, G. W., Feng, G., Sanes, J. R., Welker, E., Svoboda, K. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
  4. Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., DePaola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3, (2005).
  5. Holtmaat, A., Wilbrecht, L., Knott, G. W., Welker, E., Svoboda, K. Experience-dependent and cell-type-specific spine growth in the neocortex. Nature. 441, 979-983 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cranial Window SurgeryTwo Photon MicroscopyStereotaxic FrameGlass Cover SlipCyanoacrylate GlueDental AcrylicTitanium BarDura Mater ProtectionSomatosensory Cortex Imaging

Powiązane artykuły