Niniejszy film i protokół demonstrują sposób implantacji pokrytego szkłem okna czaszkowego u gryzoni. Preparaty te mogą być wykorzystywane do przewlekłego obrazowania dwufotonowego neocortex in vivo w skalach czasowych obejmujących wiele miesięcy. Mogą one być również stosowane w innych rodzajach obrazowania, w tym w obrazowaniu sygnałów optycznie immanentnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Procedura kraniotomii w celu przewlekłego obrazowania mózgu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Techniki obrazowania stają się coraz ważniejsze w badaniach nad funkcjami mózgu. Wśród nich mikroskopia laserowa dwufotonowa stała się niezwykle użyteczną metodą, ponieważ umożliwia badanie żywego, nienaruszonego mózgu. Przy odpowiednim przygotowaniu technika ta pozwala na chroniczną obserwację tego samego obszaru kory, od kilku minut do wielu miesięcy. W tym filmie przedstawiamy metodę przygotowania do chronicznego obrazowania mózgu in vivo z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej. Technika ta została zapoczątkowana przez dr. Karela Svobodę, obecnie badacza w Howard Hughes Medical Institute w Janelia Farm. Preparaty, takie jak ten pokazany tutaj, mogą być wykorzystywane do obrazowania struktury neocortex (np. dynamiki dendrytów i aksonów), rejestracji aktywności neuronalnej przy użyciu barwników wrażliwych na wapń, obrazowania dynamiki przepływu krwi w korze mózgowej lub do badań z zakresu wewnątrzpochodnego obrazowania optycznego. Głębokie obrazowanie neocortex jest możliwe dzięki optymalnemu przeprowadzeniu operacji okna czaszkowego. Praca w możliwie najbardziej sterylnych warunkach w celu uniknięcia infekcji, wraz z zachowaniem szczególnej ostrożności, aby nie uszkodzić opony twardej podczas operacji, pozwoli na uzyskanie trwałych i skutecznych okien czaszkowych przykrytych szkłem.
Protokół
- Zanurz myszy w narkozie izofluranem (4% do indukcji, 1,5-2% podczas operacji), stosując procedury zatwierdzone przez IACUC. Należy ucisnąć ogon i/lub palce stopy, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni zsedowane.
- Za pomocą trymera do gryzoni ogolić sierść od karku aż do oczu.
- Umieścić mysz w aparacie stereotaktycznym na podgrzewanym kocu z recyrkulacją wody. Głowę należy mocno unieruchomić za pomocą prętów usznych.
- Nanieść maść do oczu, aby zapobiec wysychaniu gałek ocznych zwierzęcia.
- Podać podskórnie deksametazon (0,2 mg/Kg) i karprofen (5 mg/Kg), aby odpowiednio zapobiec obrzękowi mózgu i/lub reakcji zapalnej.
- Przed rozpocz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jak pokazano w materiale wideo oraz na rysunkach uzupełniających, przygotowanie okna czaszkowego w połączeniu z zastosowaniem mikroskopii dwufotonowej stanowi bardzo potężne narzędzie do badania in vivo struktury i funkcji neocortex. Technika ta wymaga rygorystycznego przeszkolenia w celu zapoznania się z odpowiednią anatomią oraz precyzyjnymi procedurami i umiejętnościami chirurgicznymi, których wymaga ta metoda przygotowania. Do obrazowania chronicznego można wykorzystywać wyłącznie preparaty po nienagannie przeprowadz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Karprofen (Rimadyl) | Lek | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Izofluran (Aerrane) | Chirurgia | Baxter Internationl Inc. | ||
| Deksametazon | Lek | Baxter Internationl Inc. | ||
| Proszek Ortho-Jet | Odczynnik | LANG | Do zmieszania z akrylem | |
| Płyn Jet-Acrylic | Odczynnik | LANG | Do zmieszania z proszkiem Ortho-Jet | |
| Okrągłe szkiełko podstawowe | Narzędzie | Electron Microscopy Sciences | 72195-05 | średnica 5 mm |
| Gelfoam | Chirurgia | Pharmacia Corporation (Pfizer) | ||
| Pręty tytanowe są wykonane na zamówienie |
Bibliografia
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 85, 161-165 (1997).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
