Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test wymiany lipidów w żywych komórkach

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68008

⸱

21 marca 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Stony Brook University, 2Program in Cellular and Molecular Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Biochemistry and Cell Biology, Stony Brook University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę użycia cyklodekstryny do pośredniczenia w wymianie między lipidami błony komórkowej a lipidami egzogennymi. Technikę tę można połączyć z eksperymentami badającymi białka transbłonowe, które zachowują się inaczej w środowiskach podobnych do tratw lipidowych niż w środowiskach niepodobnych do tratwy.

Streszczenie

Tratwy lipidowe to dynamiczne, uporządkowane domeny w błonie plazmatycznej, często powstające podczas grupowania i sygnalizacji białek błonowych. Tożsamość lipidowa płatka zewnętrznego napędza skłonność błony do tworzenia tratw lipidowych. Przejściowy charakter tratw lipidowych utrudnia badanie w żywych komórkach. Dlatego metody, które dodają lub usuwają lipidy tworzące tratwę na zewnętrznym płatku żywych komórek, ułatwiają badanie cech tratwy, takich jak ich wpływ na białka błonowe. Eksperymenty z wymianą lipidów opracowane w naszym laboratorium wykorzystują cyklodekstryny obciążone lipidami do usuwania i dodawania egzogennych fosfolipidów w celu zmiany składu lipidów błony komórkowej. Zastąpienie błony lipidem tratwy lub lipidem nietworzącym tratwy może pomóc w badaniu wpływu na aktywność białek transbłonowych. W tym miejscu opisujemy metodę wymiany lipidów na zewnętrznej płatku błony komórkowej za pomocą cyklodekstryny obciążonej lipidami. Demonstrujemy przygotowanie pożywki wymiennej i późniejszą obróbkę przyłączonych komórek ssaków. Pokazujemy również, jak mierzyć efektywność wymiany za pomocą HP-TLC. Protokół ten zapewnia prawie całkowite zastąpienie zewnętrznej ulotki egzogennymi lipidami bez zmiany żywotności komórek, co pozwala na dalsze eksperymenty na zmodyfikowanych nienaruszonych błonach plazmatycznych.

Wprowadzenie

Błona plazmatyczna składa się z dwuwarstwy lipidowej wzbogaconej o różne białka błonowe, w tym receptory transbłonowe i kanały jonowe. Domeny lipidowe w błonie zostały wyjaśnione za pomocą rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych w detergentach regionów zidentyfikowanych w eksperymentach frakcjonowania membran odpornych na detergenty (DRM)1. Frakcje nierozpuszczalne charakteryzowały się wzbogaceniem w cholesterol, ciasno upakowanymi sfingomielinami i nasyconymi fosfolipidami, wykazującymi wyższą temperaturę topnienia, w przeciwieństwie do frakcji rozpuszczalnych, które składają się głównie z niższej temperatury topnienia i luźno upakowanych fosfolipidów nienasyconych. Ciasno upakowane regiony są określane jako domeny lipidowe uporządkowane cieczą (Lo) lub tratwy lipidowe, podczas gdy luźniej zorganizowane domeny lipidowe nieuporządkowane cieczą (Ld) są regionami błony plazmatycznej2,3. Wiadomo, że regiony tratwy lipidowej ułatwiają procesy sygnalizacyjne, z dowodami wskazującymi, że aktywny receptor insuliny wiąże się z tymi tratwami4,5. Jednak ze względu na dynamiczną naturę błony komórkowej i ogólnie mały rozmiar domen, bezpośrednia wizualizacja obecności tratw w żywych komórkach stanowi poważne wyzwanie. W tym kontekście przedstawiamy metodę badania wpływu tratw lipidowych na receptor insuliny za pomocą technik wymiany lipidów.

Cyklodekstryny (CD) są tworzone przez połączone monomery glukozy, które tworzą strukturę podobną do pierścienia z centralną jamą. Wielkość tej jamy zależy od liczby jednostek glukozy: sześć jednostek tworzy alfa-cyklodekstrynę (α-CD), podczas gdy siedem jednostek tworzy beta-cyklodekstryny (β-CD). CD to wysoce rozpuszczalne w wodzie cząsteczki, zdolne do zamykania lipidów w swojej jamie, ułatwiając w ten sposób ich transport do błony komórkowej6. Beta-cyklodekstryny są szeroko stosowane do dodawania i usuwania lipidów z błon7; Jednak jego większa jama nie jest specyficzna dla cholesterolu lub fosfolipidów8. Natomiast alfa-cyklodekstryny, ze swoją mniejszą jamą, wykazują większą selektywność w wiązaniu cząsteczek lipidów nad sterolami. W szczególności metylo-α-cyklodekstryna (metylo-α-CD) nie wchodzi w interakcje ze sterolami i jest skutecznie stosowana do wymiany fosfolipidów i sfingomielin bez zmiany składu cholesterolu błony komórkowej8,9.

W tym manuskrypcie przedstawiamy szczegółowy protokół użycia metylo-α-CD (MαCD) do wymiany lipidów w zewnętrznej warstwie błony komórkowej na egzogenne lipidy, które mają właściwości wspomagające lub zakłócające tworzenie się tratw lipidowych. Wymiana ta służy do badania wpływu tratw lipidowych na aktywność receptora insuliny. Demonstracja skupi się na wprowadzeniu fosfolipidu i sfingomieliny wpływających na tworzenie domen uporządkowanych cieczowo (Lo) w błonie komórkowej linii komórkowych jajnika chomika chińskiego (CHO) stabilnie nadeksprymujących receptor insuliny (IR)10. Zakres wymiany lipidów w komórkach CHO IR zostanie oceniony za pomocą wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (HP-TLC), podczas gdy zmiany w aktywności receptora insuliny zostaną określone ilościowo za pomocą analizy western blot po stymulacji insuliną po wymianie lipidów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu metylo-α-CD

  1. Dodaj 20 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do ~10 g proszku MαCD w szklanej butelce. Inkubować w ciepłej łaźni wodnej (45 °C) do rozpuszczenia, mieszając od czasu do czasu, aż do rozpuszczenia.
    UWAGA: Roztwór może być nadal mętny z powodu nierozpuszczalnych gatunków CD.
  2. Przepuścić roztwór przez filtr strzykawkowy 0,22 μm. Rozwiązanie stanie się jasne.
  3. Użyj refraktometru, aby określić dokładne stężenie MαCD.
    1. Umieścić 10 μl próbki na powierzchni próbki refraktometru, oświetlić ją za pomocą białej żarówki i zapisać współczynnik załamania światła roztworu.
    2. Obliczyć stężenie MαCD za pomocą równania
      RI = (1,49 x 10 x C) + 1,33
      gdzie RI = współczynnik załamania światła, C = stężenie MαCD (mM). Równanie uzyskano poprzez analizę grawimetryczną, czyli pomiar współczynnika załamania światła znanej masy MαCD rozpuszczonego w znanej objętości.
  4. Zamknij szklaną butelkę pokrywką i zawiń pokrywkę w przezroczystą folię, aby zapobiec parowaniu. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie pęcherzyków wielopłytkowych (MLV)

  1. Roztwory podstawowe pożądanych lipidów egzogennych należy utrzymywać rozpuszczone w chloroformie w stężeniach od 20 mM do 50 mM i przechowywać w temperaturze -20 °C lub niższej, aby zminimalizować parowanie rozpuszczalnika.
    UWAGA: Wszystkie lipidy w Tabeli 1 mogą być całkowicie rozpuszczone w roztworze chloroformu. Możliwe jest jednak, że alternatywne lipidy mogą wymagać chloroformu: metanolu w stosunku 1:1 do całkowitego rozpuszczenia.
  2. Podwielokrotność lipidów przelać do probówek borokrzemianowych za pomocą pipety wyporowej ze szklaną końcówką. Alternatywnie można użyć szklanej mikrostrzykawki.
  3. Wysuszyć podwielokrotność lipidów na bloku grzewczym w niskiej temperaturze około 50 °C pod strumieniem gazuN2 aż do odparowania całego widocznego chloroformu.
  4. Usunąć pozostały rozpuszczalnik z wysuszonego lipidu, umieszczając probówkę w komorze próżniowej i wystawiając ją na działanie wysokiej próżni (poniżej 200 mTorr) przez 1 godzinę.
  5. Dodaj bezsurowicową pożywkę F-12 firmy Ham's do suchego filmu lipidowego, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 mM. Przykryj pokrywką lub taśmą teflonową i podgrzewaj w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C przez 5 minut.
  6. Wir w celu zawieszenia lipidów i utworzenia MLV. Nośnik powinien być teraz pochmurny.
    UWAGA: Niektóre nasycone lipidy mogą nie być w pełni zawieszone przez samo wirowanie i mogą wymagać zawieszenia przez pipetowanie w górę iw dół, aż film przestanie być widoczny.
    1. Przenieś całą objętość do probówki mikrowirówkowej. MLV można przechowywać do 3 dni w temperaturze 4 °C.

3. Przygotowanie pożywki do wymiany lipidów

  1. Dodać materiał MαCD do końcowego stężenia 40 mM, wraz z przygotowanymi MLV do końcowego stężenia lipidów znajdującego się w tabeli 1.
    UWAGA: W przypadku używania MLV przechowywanych w temperaturze 4 °C, zostaną one osadzone na dnie probówki. Rozgrzej się do temperatury pokojowej i upewnij się, że zostały ponownie zawieszone przez trzepanie lub mieszanie probówki.
    1. Załadować lipidy do MαCD przez inkubację przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C lub 55 °C zgodnie z tabelą 1. Wybrana temperatura powinna być wyższa od temperatury topnienia fazy żel-ciecz wybranego lipidu. Podłoże powinno zmienić kolor z mętnego na klarowny.
    2. Pozostaw pożywkę lipidową do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez 30-60 minut.

4. Leczenie komórek metodą wymiany lipidów

  1. Hoduj komórki CHO IR w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Dulbecco (DMEM, 4,5 g / l glukozy) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 300 μg / ml L-glutaminy, 100 μg / ml aminokwasów endogennych, 50 μg / ml G418, 2 μM metotreksatu i 1x antybiotykiem przeciwgrzybiczym.
    1. Wysiewaj 1,5 x 106 komórek na płytkach 60 mm i rosj, aż będą zlewać się w 80%-90%.
    2. Umyj komórki 3x, dodając 1 ml PBS, a następnie odsysając. Zagłodź komórki przez noc w 2 ml pożywki F12 bez surowicy.
  2. Umyj komórki 3x 1 ml PBS. Dodać 1 ml przygotowanej pożywki wymiennej lub pożywki bez surowicy jako kontroli do komórek i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (25 °C -27 °C). Obracaj komórki co 15 minut, aby zapewnić równomierną ekspozycję na media wymienne.
    1. Umyj komórki 3x 1 ml PBS. Każda płytka może być następnie przetworzona w celu ekstrakcji lipidów w kroku 5 lub w celu autofosforylacji IR w kroku 7.

5. Ekstrakcja lipidów na płytce do hodowli komórkowej

  1. Całkowicie usuń PBS i ustaw płytkę pod kątem 45° na 10 minut lub do całkowitego wyschnięcia, usuwając bufor, który może gromadzić się wzdłuż dna.
  2. Dodać 1 ml roztworu heksanu: izopropanolu w proporcji 3:2 (v:v) do wysuszonych komórek i inkubować przez 10 minut na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
  3. Przenieś roztwór do probówki borokrzemianowej. Przykryj taśmą teflonową i przechowuj w temperaturze -20 °C.
  4. Rozpuść pozostałe resztki komórek, dodając 500 μl 1N NaOH i wytrząsając przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    1. Użyj tego roztworu w teście ilościowym białka, takim jak test Bradforda, aby określić stężenie białka w każdej próbce. Te wartości stężeń można wykorzystać do normalizacji objętości ładowania ekstraktów lipidowych na płytkach HP-TLC w celu równomiernego obciążenia lipidami we wszystkich próbkach.

6. Sprawdzanie wydajności wymiany za pomocą HP-TLC

  1. Przygotuj 100 ml wodorotlenku amonu w proporcji 65:25:5 (v:v:v) chloroform:metanol:30% (v/v) i wlej go do szklanego zbiornika TLC. Przykryj szczelnie i pozwól parze zrównoważyć się przez co najmniej 1 godzinę.
  2. Suchą próbkę ekstraktu lipidowego umieścić na bloku grzewczym przy niskim ustawieniu pod strumieniem gazuN2, aż do odparowania całego widocznego rozpuszczalnika organicznego.
  3. Rozpuścić film lipidowy w 50 μl chloroformy 1:1 (v:v): metanolu.
  4. Za pomocą strzykawki Hamilton o pojemności 10 μl załadować 1-10 μl próbki w pasmach o średnicy 1 cm na płytkę HP-TLC z krzemionki. Załaduj maksymalnie 10 taśm na talerz o średnicy 20 cm. Użyj znormalizowanych wartości, aby określić objętości potrzebne do załadowania równych ilości lipidów we wszystkich próbkach.
    UWAGA: Przed załadowaniem każdej próbki należy aktywować płytkę, umieszczając ją na płycie grzejnej na średnio-wysokim ustawieniu.
  5. Umieścić płytkę pionowo w zbiorniku TLC i pozwolić, aby czoło rozpuszczalnika przesunęło się o 8 cm, aby zapewnić oddzielenie form fosfolipidów.
  6. Pozostaw płytkę do wyschnięcia na 10 minut. Spryskaj ją wodnym roztworem 3% (m/v) octanu miedzi i 8% (v/v) kwasu fosforowego.
    1. Pozostaw talerz do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej lub za pomocą opalarki. Talerz powinien zmienić kolor z półprzezroczystego niebieskiego na nieprzezroczysty biały.
  7. Zwęglić płytkę w piekarniku o temperaturze 180 °C-200 °C przez 5-10 minut lub do momentu, gdy czarne pasma lipidowe staną się wykrywalne.

7. Sprawdzanie aktywacji receptora za pomocą testu autofosforylacji i western blot

  1. Inkubować komórki z 500 μl insuliny 100 nM w pożywce bez surowicy w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  2. Umyj komórki lodowatym PBS i umieść komórki na lodzie, aby zatrzymać stymulację. Natychmiast dodaj 1 ml lodowatego PBS do komórek i zbierz za pomocą skrobaka do komórek. Komórki osadu w temperaturze 3000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Dodaj 100-200 μl kompletnego buforu do lizy RIPA (50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, 1% (w/v) deoksycholanu sodu, 1 mM aktywowany ortowananian sodu, 10 μg/ml aprotyniny, 10 μg/ml leupeptyny) do osadu komórkowego na lodzie. Pipetuj w górę i w dół 30x-40x, aby lizować.
  4. Inkubować lizat na lodzie przez 10 minut. Usunąć lizat z resztek komórkowych, wirując z prędkością 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zbierając supernatant. Zarezerwuj około 20 μl lizatu do określenia stężenia białka za pomocą testu Bradforda.
  5. Połączyć lizat z 5x buforem Laemmli (350 mM Tris HCl pH 6,8, 30% v/v glicerolu, 10% w/v SDS, 25% v/v β-merkaptoetanolu, 0,002 g błękitu bromofenolowego) i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 min. Objętość dodanego buforu powinna być wystarczająca do osiągnięcia końcowego stężenia 1x bufor Laemmli.
  6. Przepuścić lizaty przez elektroforezę w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu (SDS-PAGE).
    1. Załadować równą masę białka dla wszystkich próbek wraz ze znacznikiem masy cząsteczkowej na żel SDS-PAGE. Pracować pod napięciem 100 V-150 V w buforze roboczym (2,5 mM Tris pH 8, 19,2 mM glicyny, 0,01% (w/v) SDS) do uzyskania dobrej rozdzielczości w zakresie 100-250 kDa.
  7. Przenieść na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) w buforze transferowym (2,5 mM Tris pH 8, 19,2 mM glicyny) przez 1 godzinę przy napięciu 100 V i temperaturze 4 °C.
  8. Zablokuj membranę PVDF przez 30 minut w temperaturze pokojowej w 5% roztworze BSA w TBST (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween 20).
  9. Inkubować z przeciwciałem pYpY IR lub przeciwciałem IR-β w stężeniu 1:1000 w 5% roztworze BSA w TBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Przeciwciało pYpY IR specyficznie rozpoznaje fosforylowane tyrozyny 1162 i 1163 i służy do wskazania autofosforylacji receptora. Przeciwciało IR-β rozpoznaje podjednostkę beta receptora bezkrytycznie, niezależnie od stanu fosforylacji i służy do wskazania globalnych poziomów receptora.
  10. Umyć 3x łyżką stołową w temperaturze pokojowej. Inkubować z przeciwciałem α Rabbit-HRP w stężeniu 1:3000 w 1% roztworze BSA w TBST przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Umyć 3x łyżką stołową w temperaturze pokojowej. Inkubować z substratem o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) przez 1 minutę i obrazować film.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zademonstrować obserwowalną zmianę w komórkowym składzie lipidów po wymianie, przeprowadzono HP-TLC komórek CHO IR po wymianie na SM mózgową (bSM) oraz 1,2-dioleojlo-sn-glycero-3-fosfocholinę (DOPC) (Rycina 1). W przypadkach, gdy do wymiany stosowane są sfingomieliny, takie jak bSM, widoczny jest wzrost intensywności prążka SM oraz spadek intensywności prążka PC w stosunku do niepoddanej działaniu kontroli. I odwrotnie, podczas wymiany na fosfatydylocholiny, takie jak DOPC, prążek PC sta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Od czasu konceptualizacji istnienia tratw lipidowych w błonie komórkowej podjęto liczne próby ich wizualizacji w komórkach i zbadania związku lipidów i receptorów. W eksperymentach z użyciem mikroskopii11 w komórkach wykorzystano fluorescencyjnie znakowane biomarkery, zwykle białka i lipidy, o których wiadomo, że wiążą się z tratwy, do wizualnego zbadania lokalizacji uporządkowanych domen lipidowych w komórce12. Jednak błona komórkowa jest pełna fałdów

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Finansowanie zostało zapewnione przez grant NIH GM 122493. Ogniwa CHO IR były miłym prezentem od dr Jonathana Whittakera (Case Western Reserve University).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-dilauroilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DLPC)Avanti Polar Lipids850335
1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DMPC)Avanti Polar Lipids850345
1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-fosfocholina (DOPC)Avanti Polar Lipids850375
1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DPPC)Avanti Polar Lipids
1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DSPC)Avanti Polar Lipids850365
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycerol-3-fosfocholina (POPC)Avanti Polar Lipids850457
Receptor antyinsulinowy i betaTechnologia sygnalizacji komórkowejprzeciwciał CST3025
Przeciwciało anty-pYpY1162/1163 R& D Systems Inc.AF2507
Anty-królicza IgG, technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciał sprzężona z HRP7074
Probówki ze szkła borokrzemianowego (12 x 75 mm)Thermo Fisher Scientific14-961-26
Sfingomielina mózgu (bSM)Avanti Polar Lipids860062
Sfingomielina jaja (eSM)Avanti Polar Lipids860061
Surowica bydlęca płodu ( FBS)Corning35-016-CV
G418 sól dwusiarczanowaSigma AldrichA1720
Gibco Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100x)Thermo Fisher Scientific15240062
Gibco Dulbecco' s zmodyfikowana pożywka orła (DMEM, 4,5 g/L glukozy, L-glutamina, pirogronian sodu)Thermo Fisher Scientific11965092
Szynka Gibco" s F12 mediaThermo Fisher Scientific11765054
Gibco L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030032
Gibco MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)Thermo Fisher Scientific11140050
Gibco sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) bez wapnia i magnezu (0,144 g/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 0,795 g/L Na2- HPO4 (bezwodny))Thermo Fisher Scientific
Gibco Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaThermo Fisher Scientific25300054
Wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa (HP-TLC)MerckHP-TLC Żel krzemionkowy 60 płytek Membrana
PVDF Immobilon-PMiliporIPVH00010
MetotreksatSigma Aldrich454126
Metylo-&alfa;- cyklodekstryna (Mα CD)AraChemCDexA076/BR
Pierce ECL Western BlottingSubstrate Thermo Fisher Scientific32106
Ortowanadan sodu, aktywowanySigma Aldrich5.08605
85035510010023

Bibliografia

  1. Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 111-136 (1998).
  2. Brown, D. A. Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals. Physiology. 21, 430-439 (2006).
  3. Schroeder, R., London, E., Brown, D. Interactions between saturated acyl chains confer detergent resistance on lipids and glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins: GPI-anchored proteins in liposomes and cells show similar behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (25), 12130-12134 (1994).
  4. Suresh, P., Miller, W. T., London, E. Phospholipid exchange shows insulin receptor activity is supported by both the propensity to form wide bilayers and ordered raft domains. J Biol Chem. 297 (3), 101010(2021).
  5. Delle Bovi, R. J., Kim, J., Suresh, P., London, E., Miller, W. T. Sterol structure dependence of insulin receptor and insulin-like growth factor 1 receptor activation. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1861 (4), 819-826 (2019).
  6. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochim Biophys Acta. 1768 (6), 1311-1324 (2007).
  7. Ohtani, Y., Irie, T., Uekama, K., Fukunaga, K., Pitha, J. Differential effects of α-, β- and γ-cyclodextrins on human erythrocytes. Eur J Biochem. 186 (1-2), 17-22 (1989).
  8. Suresh, P., London, E. Using cyclodextrin-induced lipid substitution to study membrane lipid and ordered membrane domain (raft) function in cells. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1864 (1), 183774(2022).
  9. Li, G., et al. Efficient replacement of plasma membrane outer leaflet phospholipids and sphingolipids in cells with exogenous lipids. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14025-14030 (2016).
  10. Yoshimasa, Y., Paul, J. I., Whittaker, J., Steiner, D. F. Effects of amino acid replacements within the tetrabasic cleavage site on the processing of the human insulin receptor precursor expressed in Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 265 (28), 17230-17237 (1990).
  11. Gaus, K., et al. Visualizing lipid structure and raft domains in living cells with two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15554-15559 (2003).
  12. Klymchenko, S., Kreder, R. Fluorescent probes for lipid rafts: From model membranes to living cells. Chem Biol. 21 (1), 97-113 (2014).
  13. Pike, L. J. Growth factor receptors, lipid rafts and caveolae: An evolving story. Biochim Biophys ActaMol Cell Res. 1746 (3), 260-273 (2005).
  14. Brown, D. A., London, E. Structure of detergent-resistant membrane domains: does phase separation occur in biological membranes. Biochem Biophys Res Commun. 240 (1), 1-7 (1997).
  15. Lin, Q., London, E. Preparation of artificial plasma membrane mimicking vesicles with lipid asymmetry. PLoS One. 9 (1), e87903(2014).
  16. Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
  17. Deveaux, P. F., Hermann, A., Ohlwein, N., Kozlov, M. M. How lipid flippases can modulate membrane structure. Biochimica et Biophysica Acta Biomembr. 1778 (7), 1591-1600 (2008).
  18. Balasubramaniam, K., Mirnikjoo, B., Schroit, A. J. Regulated externalization of phosphatidylserine at the cell surface: implications for apoptosis. J Biol Chem. 282 (25), 18357-18364 (2007).
  19. Li, G., et al. Replacing plasma membrane outer leaflet lipids with exogenous lipid without damaging membrane integrity. PLoS One. 14 (10), e0223572(2019).
  20. Contreras, F. X., Sanchez-Magraner, L., Alonso, A., Goni, F. M. Transbilayer (flip-flop) lipid motion and lipid scrambling in membranes. FEBS Letters. 584 (9), 1779-1786 (2010).
  21. Suresh, P., London, E. MαCD-based plasma membrane outer leaflet lipid exchange in mammalian cells to study insulin receptor activity. Biophys Approach Study Memb Struct A Exp. 700, 485-507 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rafty lipidoweb ona plazmatycznawymiana zapo redniczona przez cyklodekstrynlipidy zewn trznej warstwywysokosprawna cienkowarstwowa chromatografia HPTLCreceptorowa kinaza tyrozynowawymiana sfingomielinywymiana fosfatydylocholinysygnalizacja receptora insulinowego
Test wymiany lipidów w żywych komórkach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.