Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja DNA prątków za pomocą bicia kulek w niestandardowym buforze, a następnie przepływu pracy NGS

DOI:

10.3791/68037

⸱

13 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Experimental Medicine, University of California, San Francisco, 2DSI-NRF Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, SAMRC for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 3Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Zuckerberg San Francisco General Hospital and Trauma Centre, University of California, San Francisco

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten pokazuje, że bicie koralików w połączeniu z oczyszczaniem kulek wychwytywania DNA zapewnia szybką i spójną metodę ekstrakcji DNA z próbek Mycobacterium tuberculosis , co czyni ją skutecznym wyborem do zastosowań sekwencjonowania nowej generacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gruźlica jest chorobą śmiertelną, a pojawienie się oporności na antybiotyki w czynniku wywołującym bakterię, Mycobacterium tuberculosis, pogarsza wyniki leczenia. Precyzyjna i szybka identyfikacja oporności na leki za pomocą technologii sekwencjonowania jest potrzebna do poprawy wyników leczenia pacjentów z gruźlicą dzięki dostosowanym schematom terapeutycznym. Metoda ekstrakcji DNA ma kluczowe znaczenie dla dalszych testów molekularnych i jest skomplikowana ze względu na twardą ścianę komórkową prątków, niskie obciążenie prątkami wielu próbek klinicznych oraz złożoność macierzy plwociny. Istnieje wiele doniesień o metodach ekstrakcji DNA M. tuberculosis , ale obecnie nie ma złotego standardu. Co więcej, wykazano, że niewiele z tych metod działa konsekwentnie, a wiele z nich nie nadaje się do środowisk o niskich zasobach i dużym obciążeniu gruźlicą. W związku z tym laboratoria często wprowadzają własne modyfikacje procedur, co skutkuje znaczną zmiennością metody. W tym miejscu przedstawiamy opłacalny, szybki i ustandaryzowany protokół ekstrakcji DNA Mycobacterial zarówno z plwociny klinicznej, jak i hodowli, który wytwarza DNA odpowiednie do qPCR i który powinien być rozważony do stosowania w laboratoriach diagnostyki klinicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekstrakcja wysokiej jakości DNA z M. tuberculosis jest niezbędna do wykrywania gruźlicy lekoopornej (TB) przy użyciu ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji (NGS) i sekwencjonowania całego genomu (WGS), ale często jest pomijana. Opracowaliśmy ustandaryzowany protokół, aby zapewnić spójne, wysokiej jakości DNA do zastosowań klinicznych NGS, w tym ukierunkowanych metod NGS, takich jak Deeplex-MycTB (GenoScreen) i sekwencjonowania całego genomu, które są obecnie zalecane przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) do diagnozowania gruźlicy lekoopornej. Warto zauważyć, że chociaż WHO zaleca te strategie diagnostyczne oparte na NGS, nie określa konkretnych p....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało przeprowadzone na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco (UCSF) za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) i jest zgodne z wytycznymi UCSF dotyczącymi etyki badań. Uzyskaliśmy resztki próbek plwociny pobranych przez Discovery Life Sciences w ramach zatwierdzonego przez IRB protokołu zrzeczenia się zgody od osób z chorobami układu oddechowego innymi niż gruźlica.

1. Przygotowanie

  1. Niestandardowy bufor Triton (Tabela 1): Aby przygotować 100 ml niestandardowego buforu Triton, zacznij od połączenia 2 ml 5 M NaCl, 1 ml 1 M ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przetestowaliśmy protokół ekstrakcji DNA zarówno na próbkach plwociny z kolcami M. tuberculosis, jak i M. tuberculosis (n = 3 dla każdego stanu). Używając hodowli M. tuberculosis H37Rv mc² 7901, znormalizowaliśmy dane wejściowe do 8,4 x 106 komórek na 50 μl, co odpowiada 1 ml hodowli MGIT przy 200 GU. W eksperymentach z plwociną pobraliśmy 1 ml plwociny pobranej od osób z chorobami układu oddechowego niezwiązanymi z gruźlicą (uzyskanymi komercyjnie) z dwoma różnymi stężeniami bakteri.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej pracy przedstawiamy solidny, zwalidowany protokół ekstrakcji wysokiej jakości DNA M. tuberculosis za pomocą bicia kulek z magnetycznym czyszczeniem kulek do dalszych zastosowań molekularnych i NGS.

Metoda ta ma kilka zalet w porównaniu z istniejącymi protokołami ekstrakcji DNA M. tuberculosis . Podczas gdy tradycyjna ekstrakcja fenolowo-chloroformowa trwa zwykle kilka dni i wprowadza niebezpieczne chemikalia, ta metoda jest wykonywana w mniej niż 60 minut przy minimalne.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R01AI153213 Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Koraliki cyrkonowo-krzemianowe 0,1 mmProdukty Biospec11079101zKoraliki używane do etapu bicia koralików w celu lizy komórek mykobakteryjnych
Koraliki AMPure XPBeckman CoulterNumer katalogowy A63880Kulki magnetyczne do oczyszczania DNA po lizie
EDTA (0,5 M, pH 8,0) Thermo Fisher NaukowyAM9260GNiestandardowe komponenty buforowe Triton / Low EDTA
Szybkie przygotowanie 24MPbio, Stany Zjednoczone116004500Sprzęt do nawijania ściegu z prędkością 6,5 m/s
Podkład do przoduThermo Fisher NaukowySynteza niestandardowaSekwencja podstawowa: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H2O (woda, klasa biologii molekularnej)Thermo Fisher NaukowyZobacz materiał BP2819-1Niestandardowe komponenty buforowe Triton / Low EDTA
Uniwersalna sonda LunaLaboratoria biologiczne w Nowej AngliiZobacz materiał M3004Odczynnik qPCR do oznaczania DNA prątków
Zestaw MycoPrepBDSKU/REF 240863Trawienie próbki BD MycoPrep do przetwarzania plwociny NALC-NaOH
NaCl (chlorek sodu, roztwór 5M)Thermo Fisher NaukowyZobacz materiał AM9759Niestandardowe komponenty buforowe Triton / Low EDTA
PBSMillipore SigmaZobacz materiał P2272 powiedział:Przetwarzanie plwociny
Podkład odwrotnyThermo Fisher NaukowySynteza niestandardowaSekwencja podstawowa: GTTTACGGCGTGGACTACCA
Sonda TaqManThermo Fisher NaukowySynteza niestandardowaSekwencja sondy: AGGAGGAACACCGGTGGCGA
Tris-HCl (1M, pH 8,0)Thermo Fisher NaukowyAM9855GNiestandardowe komponenty buforowe Triton / Low EDTA
Tryton X-100Thermo Fisher Naukowy28314Niestandardowe komponenty buforowe Triton / Low EDTA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jouet, A., et al. Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs. Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).
  2. George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Diagnostyka gru licywykrywanie lekooporno ciprzetwarzanie pr bek plwocinyoczyszczanie za pomoc kulek magnetycznychilo ciowa PCRsekwencjonowanie nast pnej generacjiliza kom rek

Powiązane artykuły