Ekstrakcja DNA prątków za pomocą bicia kulek w niestandardowym buforze, a następnie przepływu pracy NGS

Summary

Protokół ten pokazuje, że bicie koralików w połączeniu z oczyszczaniem kulek wychwytywania DNA zapewnia szybką i spójną metodę ekstrakcji DNA z próbek Mycobacterium tuberculosis , co czyni ją skutecznym wyborem do zastosowań sekwencjonowania nowej generacji.

Abstract

Gruźlica jest chorobą śmiertelną, a pojawienie się oporności na antybiotyki w czynniku wywołującym bakterię, Mycobacterium tuberculosis, pogarsza wyniki leczenia. Precyzyjna i szybka identyfikacja oporności na leki za pomocą technologii sekwencjonowania jest potrzebna do poprawy wyników leczenia pacjentów z gruźlicą dzięki dostosowanym schematom terapeutycznym. Metoda ekstrakcji DNA ma kluczowe znaczenie dla dalszych testów molekularnych i jest skomplikowana ze względu na twardą ścianę komórkową prątków, niskie obciążenie prątkami wielu próbek klinicznych oraz złożoność macierzy plwociny. Istnieje wiele doniesień o metodach ekstrakcji DNA M. tuberculosis , ale obecnie nie ma złotego standardu. Co więcej, wykazano, że niewiele z tych metod działa konsekwentnie, a wiele z nich nie nadaje się do środowisk o niskich zasobach i dużym obciążeniu gruźlicą. W związku z tym laboratoria często wprowadzają własne modyfikacje procedur, co skutkuje znaczną zmiennością metody. W tym miejscu przedstawiamy opłacalny, szybki i ustandaryzowany protokół ekstrakcji DNA Mycobacterial zarówno z plwociny klinicznej, jak i hodowli, który wytwarza DNA odpowiednie do qPCR i który powinien być rozważony do stosowania w laboratoriach diagnostyki klinicznej.

Introduction

Ekstrakcja wysokiej jakości DNA z M. tuberculosis jest niezbędna do wykrywania gruźlicy lekoopornej (TB) przy użyciu ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji (NGS) i sekwencjonowania całego genomu (WGS), ale często jest pomijana. Opracowaliśmy ustandaryzowany protokół, aby zapewnić spójne, wysokiej jakości DNA do zastosowań klinicznych NGS, w tym ukierunkowanych metod NGS, takich jak Deeplex-MycTB (GenoScreen) i sekwencjonowania całego genomu, które są obecnie zalecane przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) do diagnozowania gruźlicy lekoopornej. Warto zauważyć, że chociaż WHO zaleca te strategie diagnostyczne oparte na NGS, nie określa konkretnych protokołów ekstrakcji DNA, które je wspierają. Nasza metoda może być stosowana w testach zatwierdzonych przez WHO, a także w nowych technologiach, które wymagają wysokiej jakości DNA prątków.

Wyzwanie związane z ekstrakcją wynika z unikalnej ściany komórkowej M. tuberculosis, składającej się z kwasów mykolowych i lipidów, które sprawiają, że wyjątkowo trudno jest ją rozbić. Obecnie opublikowane roztwory ekstrakcyjne mają znaczne różnice w metodach lizy (np. Sonikacja, chemikalia, ciepło i bicie perełek) oraz metodach ekstrakcji DNA (np. ekstrakcja fenolowo-chloroformowa, wytrącanie etanolu, metody oparte na CTAB oraz na bazie kolumn i kulek), co skutkuje różnicami w wydajności, czystości i jakości DNA 1,2,3,4,5,6,7,8 ^,9,10,11,12,13,14,15,16. Ponadto grupy badawcze rzadko stosują tę samą metodę ekstrakcji DNA i często mierzą sukces w różny sposób. To sprawia, że określenie, która metoda działa najlepiej, jest trudne, ponieważ optymalne podejście zależy od rodzaju zastosowania molekularnego. Na przykład rozpoznanie wariantów strukturalnych M. tuberculosis w plwocinie za pomocą sekwencjonowania z długim odczytem wymaga wyższej jakości DNA i dokładniejszej polimerazy niż uruchomienie płatnego narzędzia diagnostycznego, które celuje tylko w niewielki region rpoB. Kilka czynników dodatkowo komplikuje sukces ekstrakcji DNA. Ilość DNA, którą możemy wyekstrahować, różni się w zależności od rodzaju próbki, liczby obecnych bakterii i tego, czy istnieją substancje (współekstrahowane nieprątkowe DNA i inhibitory PCR), które zakłócają proces. Nawet aspekty techniczne, takie jak precyzja pipetowania przez technika laboratoryjnego, mogą mieć wpływ na wyniki. Obecne metody często zawodzą w przypadku przetwarzania próbek o niskim obciążeniu bakteryjnym lub wysokim poziomie zanieczyszczenia DNA, które są powszechnie spotykane w warunkach klinicznych 17,18,19.

Ubijanie koralików w niestandardowym buforze, a następnie protokół czyszczenia koralików, oferuje kluczowe zalety w porównaniu z innymi metodami. Jest to prosty i szybki przepływ pracy, który zmniejsza możliwość zmienności zależnej od operatora i utrzymuje integralność DNA w dalszych zastosowaniach NGS. To ustandaryzowane podejście jest szczególnie przydatne w laboratoriach klinicznych poszukujących wiarygodnych, powtarzalnych wyników przy użyciu zalecanych przez WHO testów oporności na leki NGS i wszystkich zastosowań WGS.

Protocol

Badanie to zostało przeprowadzone na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco (UCSF) za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) i jest zgodne z wytycznymi UCSF dotyczącymi etyki badań. Uzyskaliśmy resztki próbek plwociny pobranych przez Discovery Life Sciences w ramach zatwierdzonego przez IRB protokołu zrzeczenia się zgody od osób z chorobami układu oddechowego innymi niż gruźlica.

1. Przygotowanie

1. Niestandardowy bufor Triton (Tabela 1): Aby przygotować 100 ml niestandardowego buforu Triton, zacznij od połączenia 2 ml 5 M NaCl, 1 ml 1 M Tris-HCl (pH 8), 1 ml Triton X-100 i 0,2 ml 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Dodaj ultraczystą wodę, aby uzyskać całkowitą objętość do 100 ml. Filtr wysterylizuj przed użyciem. Końcowy bufor zawiera 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA i 1% Triton X-100.
2. Niski poziom EDTA TE (Tabela 2): Aby przygotować 100 ml buforu o niskiej zawartości EDTA TE, połącz 1 ml 1M Tris-HCl (pH 8) i 0,02 ml 0,5 M EDTA. Dodaj ultraczystą wodę, aby uzyskać całkowitą objętość do 100 ml. Końcowy bufor zawiera 10 mM Tris-HCl i 0,1 mM EDTA.

2. Przygotowanie probówek do lizy

1. Za pomocą ostrza skalpela ostrożnie odetnij spód zakrętki o pojemności 1,5 ml tuż poniżej punktu przegięcia.
2. Odetnij końcówkę końcówki P1000, wytnij klin w kształcie litery V w pobliżu końca i zaklinuj w nim przygotowane dno rurki z nakrętką. Patrz rysunek 1 , aby zapoznać się ze schematem czerpaka.
3. Napełnij sterylny pojemnik (np. zbiornik lub szalkę Petriego) 0,1 mm kulkami cyrkonowo-krzemianowymi i za pomocą przygotowanej miarki rozprowadź jedną miarkę kulek (~200 mg) w probówkach z nakrętką o pojemności 1,5 ml.

Rysunek 1: Wewnętrzna miarka do dystrybucji ściegów. Szufelka została zaprojektowana z myślą o łatwym przenoszeniu ~200 mg kulek cyrkonowych o średnicy 0,1 mm do probówek przetwórczych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Przygotowanie danych wejściowych

UWAGA: Całe przygotowanie próbki powinno być przeprowadzone zgodnie z protokołami bezpieczeństwa biologicznego obowiązującymi w zakładzie. Zdecydowanie zalecamy obchodzenie się z materiałami zakaźnymi wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II (BSC), aby zminimalizować ryzyko narażenia na aerozol.

1. Hodowla komórek bakteryjnych
   1. Odwirować ~ 5 ml kultury M. tuberculosis (MGIT lub mętnej płynnej hodowli) w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml z maksymalną prędkością (≥ 3 000 x g) przez 10 min.
   2. Używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml, ostrożnie usunąć całość z wyjątkiem ~ 500 μl supernatantu, nie naruszając osadu. Usunąć pozostały supernatant za pomocą pipety P1000 bez naruszania osadu.
   3. Zawiesić osad w 350 μl niestandardowego buforu Triton, pipetując w górę iw dół. W razie potrzeby (tj. w celu usunięcia próbek do przetwarzania poza BSL-3), należy dezaktywować próbkę zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi.
2. Przygotowanie plwociny
   1. Przenieś 1-5 ml próbki plwociny (spontanicznej lub indukowanej) do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
3. Upłynnianie naziemnej telewizji cyfrowej (DTT)
   1. Dodać cztery objętości 100 mM ditiotreitolu do próbki plwociny (objętość może się różnić). W przypadku korzystania z komercyjnego odczynnika należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi rozcieńczania.
   2. Dokładnie wirować przez 30 s. Inkubować w temperaturze pokojowej (20-25 °C) przez 7 minut. Wiruj ponownie przez 30 s.
   3. Powtórz kroki 3.3.1. oraz 3.3.2. 1x, dla bardzo lepkich próbek, wykonaj do 5 cykli inkubacyjno-wirowych.
   4. Wirować z maksymalną prędkością (≥ 3 000 x g) przez 10 min. Używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml, ostrożnie wyrzucić wszystkie oprócz ~ 500 μl supernatantu. Usunąć pozostały supernatant za pomocą pipety P1000 bez naruszania osadu.
   5. Zawiesić granulat w 350 μl niestandardowego bufora Triton.
4. Upłynnianie NALC-NaOH
   1. Aby przygotować roztwór NALC-NaOH, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania i rozcieńczania.
   2. Dodać cztery objętości roztworu NALC-NaOH do próbki plwociny (spontanicznej lub indukowanej, objętość może się różnić).
   3. Wir przez 30 s. Inkubować w temperaturze pokojowej (20-25 °C) przez 7 minut. Powtórz kroki 3.4.1 i 3.4.2. 1x. W przypadku bardzo lepkich próbek należy wykonać do 5 cykli inkubacji i wiru.
   4. Dodaj PBS do oznaczenia 50 ml. Krótko zmieszaj, aby wymieszać. Wirować z maksymalną prędkością (≥ 3 000 x g) przez 10 min.
   5. Używając pipety serologicznej o pojemności 50 ml, ostrożnie wyrzucić wszystkie oprócz ~ 500 μl supernatantu. Usunąć pozostały supernatant za pomocą pipety P1000 bez naruszania osadu.
   6. Zawiesić granulat w 350 μl niestandardowego bufora Triton. W razie potrzeby (tj. w celu usunięcia próbek do przetwarzania poza BSL-3), należy dezaktywować próbkę zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi.

4. Ekstrakcja DNA

1. Przenieś inaktywowaną zawiesinę bakteryjną (350 μl z kroku 3) do nowej, dobrze oznakowanej probówki z nakrętką o pojemności 1,5 ml zawierającej ~250 μl kulek cyrkonowo-krzemianowych o średnicy 0,1 mm.
2. Ścieg pokonywał lizat z prędkością 6,5 m/s przez 45 s z 2-minutowym odpoczynkiem między przejazdami. Powtórz w sumie trzy cykle ubijania koralików.
3. Wirować z maksymalną prędkością (≥ 12 000 x g) przez 2 minuty i przenieść 150 μl supernatantu do nowej, dobrze oznakowanej probówki. Uważaj, aby nie przenosić koralików ani resztek komórek.
4. Pozwól, aby kulki magnetyczne czyszczące zrównoważyły się do temperatury pokojowej przez 30 minut i dokładnie zwiruj, aby zapewnić całkowite ponowne zawieszenie przed użyciem.
5. Dodaj 180 μl (1,2x objętość) kulek magnetycznych cleanup i mieszaj, pipetując w górę i w dół 10x. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
6. Umieść na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż roztwór się klaruje przez ~ 2 min. Za pomocą pipety P200 ostrożnie wyrzuć supernatant, nie naruszając kulek magnetycznych.
7. Trzymając probówkę nadal na stojaku magnetycznym, dodać 500 μl świeżo przygotowanego 70 % (v/v) etanolu, dozując wzdłuż przeciwległej ścianki rurki do kulek magnetycznych. Poczekaj 30 sekund.
8. Powtórz kroki 4.5. - 4.7. w sumie dwa prania. Pod koniec ostatniego prania usuń resztki etanolu za pomocą pipety P10. Suszyć koraliki krótko przez ~ 2 min.
9. Natychmiast po tym, jak granulka stanie się nieprzezroczysta, wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zanurz w 20 μl buforu Tris o niskiej zawartości EDTA. Nie pozwól, aby koraliki wyschły i popękały.
10. Wymieszać przez pipetowanie lub wirowanie, aby upewnić się, że wszystkie kulki są w roztworze. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
11. Umieść na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż roztwór stanie się klarowny przez ~ 2 min. Przenieś wymyte DNA do nowej, dobrze oznakowanej probówki w celu dalszej analizy. Odessać <20 μl wyekstrahowanego DNA, aby uniknąć przeniesienia kulek magnetycznych.

5. Oznaczanie liczby prątków DNA metodą qPCR

1. Aby określić ilościowo DNA prątków przy użyciu ilościowej reakcji PCR ukierunkowanej na 99 nukleotydów prątków atpE (Rv1305), należy zebrać 10 μl mieszaniny reakcyjnej na próbkę na lodzie zawierającej 5 μl uniwersalnej mieszanki głównej sondy (2x), po 0,4 μl startera do przodu (5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3', 10 μM) i startera odwrotnego (5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3', 10 μM), 0,2 μL sondy TaqMan (5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3', 10 μM), 2 μL matrycy DNA i 2 μL wody wolnej od nukleaz (Tabela 3).
2. Przeprowadzić reakcję, stosując następujące warunki cyklicznych przewidywań termicznych: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 60 s, a następnie 35 cykli w temperaturze 95 °C przez 10 s i 60 °C przez 30 s (z wychwytywaniem w tym miejscu, przy zastosowaniu szybkości narastania 2,11 °C/s; Tabela 4).
   UWAGA: W tym przypadku qPCR przeprowadzono przy użyciu testu TaqMan z sondą znakowaną VIC w systemie QuantStudio 3 Real-Time PCR,
3. Uruchom wszystkie próbki, standardy i kontrolki w trzech egzemplarzach technicznych. Wygeneruj krzywe wzorcowe przy użyciu seryjnych rozcieńczeń oczyszczonego DNA M. tuberculosis . Wykonaj względną analizę ilościową za pomocą oprogramowania do analizy.
4. Wyeksportuj wynikowe względne wartości kwantyfikacji do formatu CSV i wizualizuj za pomocą programu R Studio (wersja 2024.09.1+394), aby wygenerować wykresy pudełkowe porównujące wydajność DNA w różnych metodach ekstrakcji.

Results

Przetestowaliśmy protokół ekstrakcji DNA zarówno na próbkach plwociny z kolcami M. tuberculosis, jak i M. tuberculosis (n = 3 dla każdego stanu). Używając hodowli M. tuberculosis H37Rv mc² 7901, znormalizowaliśmy dane wejściowe do 8,4 x 10⁶ komórek na 50 μl, co odpowiada 1 ml hodowli MGIT przy 200 GU. W eksperymentach z plwociną pobraliśmy 1 ml plwociny pobranej od osób z chorobami układu oddechowego niezwiązanymi z gruźlicą (uzyskanymi komercyjnie) z dwoma różnymi stężeniami bakteri...

Discussion

W tej pracy przedstawiamy solidny, zwalidowany protokół ekstrakcji wysokiej jakości DNA M. tuberculosis za pomocą bicia kulek z magnetycznym czyszczeniem kulek do dalszych zastosowań molekularnych i NGS.

Metoda ta ma kilka zalet w porównaniu z istniejącymi protokołami ekstrakcji DNA M. tuberculosis . Podczas gdy tradycyjna ekstrakcja fenolowo-chloroformowa trwa zwykle kilka dni i wprowadza niebezpieczne chemikalia, ta metoda jest wykonywana w mniej niż 60 minut przy minimalne...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Koraliki cyrkonowo-krzemianowe 0,1 mm	Produkty Biospec	11079101z	Koraliki używane do etapu bicia koralików w celu lizy komórek mykobakteryjnych
Koraliki AMPure XP	Beckman Coulter	Numer katalogowy A63880	Kulki magnetyczne do oczyszczania DNA po lizie
EDTA (0,5 M, pH 8,0)	Thermo Fisher Naukowy	AM9260G	Niestandardowe komponenty buforowe Triton / Low EDTA
Szybkie przygotowanie 24	MPbio, Stany Zjednoczone	116004500	Sprzęt do nawijania ściegu z prędkością 6,5 m/s
Podkład do przodu	Thermo Fisher Naukowy	Synteza niestandardowa	Sekwencja podstawowa: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H2O (woda, klasa biologii molekularnej)	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP2819-1	Niestandardowe komponenty buforowe Triton / Low EDTA
Uniwersalna sonda Luna	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Zobacz materiał M3004	Odczynnik qPCR do oznaczania DNA prątków
Zestaw MycoPrep	BD	SKU/REF 240863	Trawienie próbki BD MycoPrep do przetwarzania plwociny NALC-NaOH
NaCl (chlorek sodu, roztwór 5M)	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał AM9759	Niestandardowe komponenty buforowe Triton / Low EDTA
PBS	Millipore Sigma	Zobacz materiał P2272 powiedział:	Przetwarzanie plwociny
Podkład odwrotny	Thermo Fisher Naukowy	Synteza niestandardowa	Sekwencja podstawowa: GTTTACGGCGTGGACTACCA
Sonda TaqMan	Thermo Fisher Naukowy	Synteza niestandardowa	Sekwencja sondy: AGGAGGAACACCGGTGGCGA
Tris-HCl (1M, pH 8,0)	Thermo Fisher Naukowy	AM9855G	Niestandardowe komponenty buforowe Triton / Low EDTA
Tryton X-100	Thermo Fisher Naukowy	28314	Niestandardowe komponenty buforowe Triton / Low EDTA