Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vitro Model wpływu do generowania subletalnego uszkodzenia chondrocytów w eksplantatach chrząstki bydlęcej

943 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68061

⸱

27 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University, 2Indiana Center for Musculoskeletal Health, Indiana University School of Medicine, 3School of Mechanical Engineering, Purdue University, 4Department of Orthopaedic Surgery, Indiana University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Aby lepiej zrozumieć reakcję chondrocytów na mechaniczne przeciążenie chrząstki, protokół opisuje rozwój modelu wpływu chrząstki ex vivo, który był subletalny przez 24 godziny.

Streszczenie

Pourazowa choroba zwyrodnieniowa stawów (PTOA) jest powszechną, zwyrodnieniową i bolesną postępującą chorobą stawów, która zwykle powstaje po poważnym urazie stawu, dotykając ponad 6 milionów Amerykanów. Uraz chrząstki wywołany uderzeniem powoduje reakcję na uszkodzenie chondrocytów, której kulminacją jest PTOA. Zrozumienie zdarzeń molekularnych związanych z uszkodzeniem chondrocytów jest niezbędne do opracowania terapii zapobiegających PTOA lub spowalniających ich postęp. Aby to ułatwić, opracowano model uderzenia chrząstki ex vivo, który był subletalny przez 24 godziny. Eksplantaty kostno-chrzęstne zebrano ze stawów śródręczno-paliczkowych bydła, a do dostarczania obciążeń udarowych do eksplantatów użyto wieży zrzutowej. Aby zapewnić, że naprężenie i uderzenie zostały przyłożone do chrząstki stawowej w miarę równomiernie, eksplantaty umieszczono z powierzchnią kości skierowaną do góry, a kość została uderzona od góry. Na eksplantaty przyłożono różne obciążenia od wysokości wózka 4,0 cm, 4,5 cm i 5,0 cm, co dało średnie naprężenia szczytowe wynoszące odpowiednio 10,87 ± 1,84 MPa, 11,69 ± 0,67 MPa i 12,98 ± 0,75 MPa. W badaniu przeanalizowano rolę obecności kości podchrzęstnej w chrząstce podczas hodowli po uderzeniu oraz wpływ użycia dopasowanego lub luźnego uchwytu podczas uderzenia, oceniając żywotność komórek i apoptozę. Chrząstka stawowa dotknięta od 4,5 cm, w połączeniu z dopasowanym uchwytem i natychmiastowym usunięciem kości, zapewniła optymalny model do wywołania uszkodzenia chrząstki przy minimalnej śmierci komórek w ciągu 24 godzin po zderzeniu.

Wprowadzenie

Pourazowa choroba zwyrodnieniowa stawów (PTOA) jest wyniszczającą chorobą, która dotyka ponad 5 milionów dorosłych w Stanach Zjednoczonych1. Pojedyncze urazowe uderzenie w chrząstkę może wywołać reakcję na uszkodzenie chondrocytów, prowadząc do wczesnych objawów i trwającej całe życie walki z bólem i dysfunkcją stawów2. Chrząstka ma niewielką lub żadną wewnętrzną zdolność naprawczą, a zatem istnieje niezaspokojona potrzeba opracowania terapii modyfikujących postęp choroby3. Ponieważ PTOA jest skorelowane z pojedynczym, jasno zdefiniowanym zdarzeniem traumatycznym, istnieje możliwość interwencji przed postępem choroby. Jednak rozwój tych metod leczenia jest utrudniony przez lukę w wiedzy na temat sygnalizacji molekularnej, która reguluje reakcję na uszkodzenie chondrocytów i prowadzi do pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów2,3,4. Lepsze zrozumienie zdarzeń molekularnych następujących po uszkodzeniu chondrocytów może pomóc w projektowaniu nowych metod leczenia, które ratują reakcję na uszkodzenie chondrocytów i zapobiegają lub opóźniają rozwój PTOA2,5,6.

Aby lepiej zrozumieć molekularną sygnalizację uszkodzenia chondrocytów, poprzednie badania wykorzystywały wieże zrzutowe lub podobne urządzenia, które mechanicznie wpływają na eksplantaty chrząstki, tak że inicjowana jest reakcja na uraz. Badania te miały na celu scharakteryzowanie wielu aspektów tej reakcji, w tym zmian właściwości mechanicznych i struktury7,8, uszkodzenie matrycy i synteza6,9,10,11, dysfunkcja mitochondriów12,13,14,15, ścieżki transportu jonów16,17,18,19, and gene expression9,11,20,21,22,23. Jednak w wielu z tych badań żywotność komórek albo nie została zgłoszona, albo była zagrożona, a w niektórych przypadkach żywotność komórek wynosiła 50% lub mniej24,25,26. Mylące skutki niskiej żywotności komórek mogą utrudnić badanie reakcji na uraz. Śmierć chondrocytów, która następuje bezpośrednio po urazie stawu, jest nieodwracalna, ale terapie leczące uszkodzenia chondrocytów łagodzą późniejszy PTOA27. Aby zidentyfikować zmiany molekularne, które są związane z uszkodzeniem chondrocytów, a nie z utratą żywotnych komórek, konieczny jest model wpływu chrząstki, który utrzymuje żywotność chondrocytów przez pewien czas. Dodatkowo, uderzenie chrząstki, które generuje reakcję na uszkodzenie chondrocytów, która jest stosunkowo jednolita w całej tkance chrzęstnej, zapewniłoby najbardziej spójne wyniki w analizie zachowania komórek.

Celem badania było opracowanie i scharakteryzowanie opłacalnego modelu uszkodzeń ex vivo dla chrząstki stawowej, który zachowuje zdolność do badania szlaków sygnałowych związanych z reakcją na ostre uszkodzenie chrząstki. Ponadto taki model może być wykorzystany do oceny potencjalnych metod leczenia w celu uratowania reakcji na uraz. Aby to osiągnąć, najpierw opracowaliśmy sterylną technikę pobierania eksplantatów chrząstki ze stawów śródręczno-paliczkowych bydła od dojrzałych szkieletowo zwierząt za pomocą wiertła rdzeniowego z diamentową końcówką zamontowanego na wiertarce. Stawy śródręczno-paliczkowe są odrzucane przez rzeźnię, gdy zwierzęta są przetwarzane na spożycie żywności, co sprawia, że staw ten jest łatwo dostępnym i niedrogim źródłem tkanki. Następnie ustaliliśmy model urazu spowodowanego uderzeniem, w którym próbka kostno-chrzęstna została umieszczona w uchwycie pod urządzeniem typu drop tower. W tym modelu próbki kostno-chrzęstne umieszczono z powierzchnią stawową skierowaną w dół na polerowanej na lustro powierzchni ze stali nierdzewnej #8, a kość poddano uderzeniu od góry, dostarczając stosunkowo równomierne obciążenie do tkanki chrzęstnej. Określono parametry uderzenia, które utrzymują żywotność chondrocytów przez 24 godziny po zderzeniu, jednocześnie wywołując apoptotyczną odpowiedź na uszkodzenie molekularne. Posiadacze, którzy pozwalali na różne ilości ruchu bocznego próbki podczas uderzenia, zostali ocenieni pod kątem ich wpływu na żywotność komórek i apoptozę; Na koniec oceniono efekt usunięcia chrząstki z kości podchrzęstnej po uderzeniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Użycie kończyn bydlęcych uzyskanych z lokalnej rzeźni nie wymagało zgody etycznej, ponieważ tkanki zostały pobrane pośmiertnie od zwierząt przetworzonych do spożycia przez żywność.

1. Zbiór eksplantacji kostno-chrzęstnych

  1. Przed zbiorem eksplantatów wysterylizuj następujące materiały za pomocą autoklawu: sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS; około 1 l na joint), wiertło do rdzeniowania, adapter do krętlika wodnego, jedna autoklawowalna butelka do mycia, jeden uchwyt skalpela, dwa kleszcze i jeden brzeszczot do autopsji.
  2. Ustaw kaptur do hodowli tkankowych za pomocą wiertarki i imadła w misce, aby pomieścić PBS. Zamontuj wiertło rdzeniowe i adapter obrotowy w wiertarce i podłącz dyszę adaptera obrotowego z wężem do gąsiora wypełnionego wysterylizowanym PBS. Zmontuj piłę do autopsji i umieść ją w masce (Rysunek 1A-B).
  3. Rozłóż jednorazowe podkładki w stosie w kapturze do hodowli tkankowych, po jednym na każdy staw.
    UWAGA: Podkładki pochłaniają PBS i płyn maziowy, które mogą kapać podczas otwierania stawu. Ułożenie kilku podkładek pozwala na łatwe usunięcie wierzchniej warstwy, gdy stanie się zbyt mokra, zapewniając czystą i suchą przestrzeń roboczą przez cały czas trwania zabiegu.
  4. Przygotuj jedną probówkę o pojemności 50 ml zawierającą 70% etanolu i drugą probówkę o pojemności 50 ml zawierającą 0,13% v/v betadyny w PBS i umieść je w okapie. Umieść kleszcze i uchwyt skalpela w probówce z etanolem, aby zachować sterylność podczas obchodzenia się z tkanką i umieść sterylną 6-dołkową płytkę do hodowli komórek z tyłu kaptura.
  5. Przygotować 3 ml pożywki do hodowli komórkowych na przewidywaną próbkę. Pożywka hodowlana składa się ze zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) z 0,9 mM pirogronianu sodu, insuliny, transferyny i selenu (ITS), 50 mg/ml kwasu L-askorbinowego, minimalnych aminokwasów egzogennych (MEM), penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny B. Dodaj kwas L-askorbinowy i ITS w dniu użycia28.
  6. Przednie nogi bydlęce od dojrzałych szkieletów należy pozyskać z lokalnej rzeźni w ciągu 6 godzin od złożenia ofiary. Trzymaj chusteczkę na lodzie podczas transportu.
  7. Odizolować staw śródręczno-paliczkowy, usuwając kopyto za pomocą piły taśmowej do mięsa bez otwierania torebki stawowej. Usuń skórę za pomocą ostrzy skalpela #22 bez nakłuwania torebki stawowej.
  8. Dokładnie opłucz każdą nogę na zewnątrz szafki bezpieczeństwa biologicznego zimną wodą, aby usunąć brud i pokryj betadyną w celu dezynfekcji.
  9. Wewnątrz kaptura do hodowli tkankowej otwórz kapsułkę stawową za pomocą nowego ostrza skalpela #22. Odizoluj dystalny staw i utrzymuj nawodnienie chrząstki stawowej PBS z butelki do mycia (Rysunek 1C). Przykryj chrząstkę stawową sterylną gazą nasączoną PBS, aby utrzymać nawilżenie.
  10. Następnie odizoluj dystalny staw śródręczno-paliczkowy, przecinając śródstopie piłą do autopsji (Ryc. 1D). Umieść dystalny staw w imadle z zakrytą chrząstką skierowaną do góry i dokręć, aż będzie bezpieczny. Podczas całego procesu regularnie zwilżaj gazę na chrząstce PBS.
  11. Złóż gazę z jednego kłykcia i dostosuj położenie imadła tak, aby wiertło rdzeniowe znajdowało się powyżej najbardziej płaskiego obszaru powierzchni stawowej (Rysunek 1E).
  12. Otwórz zawór gąsioła, aby PBS mógł przepływać przez wiertło rdzeniowe. Użyj butelki do mycia, aby stale nawilżać tkankę PBS i schładzać próbki podczas wiercenia.
    UWAGA: PBS z gąsiora i butelki do mycia ma efekt chłodzący podczas procesu rdzeniowania.
  13. Powoli wbij rdzeń w kłykcie, wciskając wiertło w powierzchnię kłykcia. Często zmniejszaj ciśnienie i pozwól, aby ciepło się rozproszyło. Kontynuuj, aż głębokość rdzeniowania osiągnie około 2 mm w głąb kości podchrzęstnej. Powtórz dla każdej strony (Rysunek 1E).
    UWAGA: Oznaki przegrzania obejmują szybkie parowanie płynu lub zapach spalenizny.
  14. Użyj piły autopsyjnej, aby uwolnić rdzenie kostno-chrzęstne, przecinając kość równolegle do powierzchni chrząstki stawowej, kontynuując wyciskanie PBS z butelki do mycia do interfejsu piły autopsyjnej i kości chrzęstnej podczas cięcia. Na tym etapie utrzymuj zwilżoną gazę na powierzchni chrząstki stawowej, aby uniknąć odwodnienia.
  15. Przechowuj rdzenie kostno-chrzęstne (Rysunek 1F) w rozcieńczonym roztworze betadyny (patrz krok 1.3) do czasu, aż wszystkie stawy zostaną przetworzone.
  16. Przepłukać rdzenie kostno-chrzęstne w PBS i przenieść próbki do indywidualnych studzienek sterylnej 6-dołkowej płytki zawierającej 3 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej (DMEM z 0,9 mM pirogronianem sodu, insuliną-transferyną-selenem (ITS), 50 mg/ml kwasem L-askorbinowym, aminokwasami endogennymi, penicyliną, streptomycyną i amfoterycyną B)28. Próbki należy utrzymywać w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 do czasu przeprowadzenia procedury uderzeniowej następnego dnia.

2. Wpływ eksplantatu kostno-chrzęstnego

  1. Wykonać uchwyt udarowy ze stali nierdzewnej z polerowaną powierzchnią uderzeniową (rysunek uzupełniający 1 i rysunek uzupełniający 2) i wywierć odpowiednie otwory w płycie podstawy wieży zrzutowej (rysunek uzupełniający 3).
  2. Przed zabiegiem uderzenia wysterylizuj następujące materiały w autoklawie: sferyczna głowica udaru ze stali nierdzewnej o średnicy 15 mm, uchwyt ze stali nierdzewnej z polerowaną powierzchnią uderzenia, 4 6/32, 4 podkładki, kleszcze.
  3. Umieść wieżę zrzutową, która została wcześniej zaprojektowana i wyprodukowana29 w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Do tego badania należy użyć wieży zrzutowej ze sferyczną głowicą udarową o średnicy 15 mm zamontowaną na wózku wyposażonym w ogniwo obciążnikowe i akcelerometr (rysunek 2A), o całkowitej masie wózka 358,4 g.
  4. Przymocuj uchwyt do płyty podstawy wieży zrzutowej za pomocą czterech autoklawowanych (Rysunek 2B). W tym badaniu przetestowano uchwyty z okrągłymi otworami o średnicy 8,7 mm i 9,1 mm.
  5. Umieść rdzeń kostno-chrzęstny w uchwycie (Rysunek Uzupełniający 1, Rysunek Uzupełniający 2, Rysunek Uzupełniający 3) pod głowicą impaktora wieży zrzutowej z kością skierowaną do góry.
    UWAGA: Umieszczenie rdzenia kostno-chrzęstnego z kością skierowaną do góry i powierzchnią stawową skierowaną w dół30 zostało wybrane dla bardziej jednorodnego obciążenia.
  6. Ustaw wózek wieży zrzutowej na żądaną wysokość względem górnej części kości. Określ przybliżoną wysokość wieży zrzutowej na podstawie badań pilotażowych. W tym badaniu oceniano wysokości 4,0, 4,5 i 5,0 cm.
  7. Kliknij przycisk Start w oprogramowaniu do akwizycji danych (Dodatkowy plik kodowania 1) tuż przed zwolnieniem wózka wieży zrzutowej, zwalniając ogranicznik wrzeciona (Rysunek 2A) i pozwalając głowicy impaktora opaść pod ciężarem grawitacji na próbkę. Natychmiast podnieś karetkę i oprzyj ją na ograniczniku wrzeciona.
    UWAGA: Podczas uderzenia dane będą zbierane z częstotliwością 100 kHz za pomocą oprogramowania do akwizycji danych podłączonego do modułu akwizycji danych, który rejestruje sygnały z ogniwa obciążnikowego umieszczonego między głowicą impaktora a wózkiem, a także z akcelerometru. Chociaż podnosimy wózek tak szybko, jak to możliwe po uderzeniu, nie ma on funkcji zapobiegającej odbiciu ani innego mechanizmu zapobiegającego drugiemu uderzeniu.
  8. Umieść plik .txt wygenerowany przez oprogramowanie do akwizycji danych w tym samym folderze, w którym znajduje się kod analizy danych Matlab (Dodatkowy plik kodowania 2, dostępny również pod adresem https://github.com/sogol-younesi/cartilage-impact-analysis) i uruchom kod analizy danych, aby przefiltrować surowe dane i obliczyć parametry wpływu.
    UWAGA: Kod analizy danych wykorzystuje grubość chrząstki 0,563 mm do obliczenia energii uderzenia. Zostało to określone jako średnia grubość chrząstki pobrana z > 50 miejsc na każdej z pięciu próbek w oddzielnym badaniu przy użyciu metody igłowej31 i testera mechanicznego Biomomentum Mach-1. Parametry wpływu są obliczane zgodnie z wcześniejszym opisem32.
  9. Usuń chrząstkę z kości za pomocą ostrza skalpela #11, jeśli to konieczne. Umieścić próbkę z powrotem w pożywce i wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 do czasu obrazowania następnego dnia.
    UWAGA: W tym badaniu oceniano efekt usunięcia chrząstki z kości natychmiast po uderzeniu lub 24 godziny po uderzeniu.

3. Charakterystyka żywotności komórek w próbkach chrząstki

  1. W razie potrzeby usuń chrząstkę z kości. Przeciąć próbkę chrząstki na pół ostrym skalpelem. Unikaj wykonywania wielu cięć; Celuj w pojedyncze nacięcie, aby zapewnić gładką krawędź.
  2. Zanurzyć każdą połówkę próbki będącej przedmiotem zainteresowania w roztworze składającym się z 5 μM homodimeru etydyny i 2,5 μM kalcien AM w PBS. Chronić przed światłem i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby zakończyć barwienie żywymi trupami.
  3. Przepłukać próbki PBS 2x i przechowywać próbki w PBS do czasu obrazowania. Obraz tak szybko, jak to możliwe po zakończeniu barwienia.
  4. Ustawić próbkę chrząstki pionowo na kilku kroplach PBS w naczyniu mikroskopowym, tak aby pełne półkole było widoczne z przodu mikroskopu. Rejestruj obrazy za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego. Lekko zegnij chrząstkę kleszczami, jeśli nie jest w stanie samodzielnie stanąć prosto.
  5. Korzystając z FIJI, dystrybucji ImageJ z dołączonymi wtyczkami33, najpierw przekonwertuj obraz na 8-bitowy, klikając Image > Type > 8-bit. Następnie ustaw próg w obszarze Image > Adjust > Threshold i kliknij Apply (Zastosuj). Następnie wykonaj funkcję Watershed w obszarze Process > Binaryi uruchom polecenie Analizuj cząstki... w obszarze Analizuj zarówno dla kanału zielonego, jak i czerwonego. Analizuj obrazy wykonane przy stałej wysokości z dla każdej próbki, aby uzyskać dokładne porównania między grupami.
  6. Oblicz żywotność komórek, dzieląc liczbę żywych komórek przez całkowitą liczbę komórek w próbce.

4. Charakterystyka apoptozy w próbkach chrząstki

  1. Zanurz każdą połówkę próbki w 8 μM odczynniku do wykrywania kaspazy-3/7 w PBS. Chronić przed światłem i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  2. Przemyć próbki PBS 3x. Utrwalić wybarwione próbki, inkubując je w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 15 minut. Ponownie przemyć PBS i przechowywać w PBS do czasu obrazowania. Obraz w ciągu 24 godzin od barwienia.
  3. Obraz za pomocą mikroskopu konfokalnego (patrz krok 3.4 powyżej). Aby uzyskać prawidłowe porównania intensywności fluorescencji między grupami, należy zachować spójne parametry obrazowania dla wszystkich próbek, w tym soczewkę obiektywu, moc lasera wzbudzenia, wzmocnienie detektora lampy fotopowielacza, rozmiar otworka, grubość warstwy optycznej, prędkość skanowania, uśrednianie linii i rozdzielczość obrazu.
  4. Korzystając z rozszerzenia FIJI ImageJ, wybierz opcję Średnia wartość szarości w menu Analizuj > Ustaw pomiary.
  5. Użyj narzędzia Przekrój wielokąta, aby obrysować cały obszar próbki pokazany na obrazie. Wykonaj funkcję Zmierz w menu Analizuj i zarejestruj średnią wartość szarości, używając tych samych parametrów przetwarzania we wszystkich grupach.
  6. Użyj narzędzia Przekrój wielokąta, aby zaznaczyć obszar obrazu, który nie zawiera próbki, a następnie ponownie wykonaj funkcję Zmierz. Zapisz to jako średnią wartość szarości tła.
  7. Oblicz intensywność fluorescencji, odejmując średnią wartość szarości tła od średniej wartości szarości próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obciążenie mechaniczne udarowe eksplantów osteochondralnych było aplikowane przy użyciu wieży zrzutowej z wysokościami wózka wynoszącymi 4,0 cm, 4,5 cm i 5,0 cm nad tkanką (n = 3 lub 4). Zwiększenie wysokości wózka przed jego zwolnieniem skutkowało wyższymi siłami uderzenia, średnimi naprężeniami szczytowymi, szybkościami obciążania oraz energiami uderzenia (Tabela 1).

Dążyliśmy do opracowania modelu uszkodzenia chrząstki ex vivo, który byłby subletalny przez 24 h po ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Celem tego badania było scharakteryzowanie i optymalizacja modelu wpływu chrząstki, który nie zagraża żywotności komórek do badania zdarzeń molekularnych po uszkodzeniu chondrocytów, z ostatecznym celem opracowania leczenia, które ratuje uszkodzone komórki, aby zapobiec progresji PTOA. Dążąc do tego celu, do części kostnej rdzenia kostno-chrzęstnego dostarczono obciążenie mechaniczne, przenosząc obciążenie na tkankę chrzęstną. Ponadto zbadaliśmy różne wysokości uderzenia, wpływ różnych płytek mocujących podczas uderzenia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez NIH NIAMS Grant R21 AR080255. Autorzy chcieliby podziękować Kevinowi Carrowi za udostępnienie tej wersji swojej wiedzy w zakresie obróbki skrawaniem i produkcji. Autorzy dziękują Mooresville Butcher Shop (Mooresville, IN) za dostarczenie tkanek do tego badania. Autorzy dziękują personelowi Indiana Center for Biological Microscopy za pomoc w mikroskopii konfokalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#11 sterylne ostrze skalpelaThermo Fisher Scientific10-001-823Usuń chrząstkę z kości#
22 sterylne ostrze skalpelaThermo Fisher Scientific10-001-833Usuń skórę z tkanek bydlęcych i otwórz staw poprzez przecięcie więzadeł
10-1000 ul końcówki do pipetThermo Fisher Scientific02-707-411Zmierz i przenieś  PBS, pożywki hodowlane i inne rozwiązania 
200-procentowy etanolThermo Fisher Scientific03-007-647Służy do przygotowania 70% etanolu jako środka sterylizującego do dezynfekcji narzędzi chirurgicznych i utrzymania sterylnego środowiska podczas przygotowywania i przetwarzania tkanek.
Probówka wirówkowa 50 ml (sterylna)Thermo Fisher Scientific339652Służy do przechowywania pożywek i próbek
5-galonowy gąsior ThermoFisher Scientific04-355-233Sterylny pojemnik PBS, który jest podłączony do adaptera obrotowego za pomocą węża.
Płytka 6-dołkowa (sterylna)Thermo Fisher Scientific140685Służy do tymczasowego przechowywania rdzeni kostno-chrzęstnych w sterylnym środowisku z wstępnie podgrzanym podłożem podczas pobierania, inkubacji przed badaniami wpływu i obrazowania
AkcelerometrKistler8743A5Służy do pomiaru przyspieszenia wytwarzanego podczas uderzenia
Zestaw do barwienia apoptozy (CellEvent)Thermo Fisher ScientificC10423Służy do wykrywania i wizualizacji komórek apoptotycznych
Autoklawowalne butelki do myciaNalgene2405-0500Napełnij sterylnym PBS w celu nawilżenia chrząstki podczas pobierania tkanek.
Piła do autopsjiMopecBD 810Usuń nadmiar kości po otwarciu stawu lub wyjęciu rdzenia kostno-chrzęstnego
Brzeszczot do autopsji MopecBD 101Służy do przecinania kości w celu wyizolowania i uwolnienia eksplantatów kostno-chrzęstnych.
BetadineAvrio Health L.P.n/dStosowany do dezynfekcji zewnętrznej części próbek bydlęcych przed przeniesieniem ich do okapu i rozcieńczony w celu dezynfekcji końcowych próbek kostno-chrzęstnych.
Przezroczysty wąż o długości 4 stópniedotyczySłuży do podłączenia 5-litrowego gąsiora zawierającego PBS do adaptera obrotowego wiertarki  do transportu PBS.
Wiertło rdzeniowe UKAM Industrial Superhard Tools3EDCD7160Służy do ekstrakcji eksplantatów kostno-chrzęstnych z kości poprzez wiercenie w chrząstce stawowej i kości podchrzęstnej.-  średnica wiertła: 7/16" (galwanizowane diamentowe wiertła rdzeniowe)
Klucz półksiężycowyMcMaster Carr5362A1Służy do dokręcania zacisku (który utrzymuje połączenie na miejscu) i dokręcania wiertła rdzeniowego   
Jednorazowe pipety serologiczneThermo Fisher Scientific13-678-11Odmierzaj i przenoś PBS i pożywki hodowlane
Jednorazowy podkładThermo Fisher Scientific23-666-062Służy do przykrycia powierzchni blatu w celu wchłonięcia wody i płynów podczas zbioru dla większej wygody i higieny
Jednorazowe filtry próżnioweThermo Fisher ScientificSCGP00525Filter PBS i inne rozwiązania
Wiertarka   WEN433TV 3,25 calaZastosuj siłę do wiercenia próbek kostno-chrzęstnych- WEN 433TV 3,25-calowa wiertarka stołowa o wytrzymałości przemysłowej
imadło kątoweWENTV434Zabezpiecza próbki kostno-chrzęstne w ustalonej pozycji pod żądanym kątem podczas procesu wiercenia.
Wieża zrzutowawykonana na zamówienien/aSłuży do uderzania w próbki
FIJI (ImageJ Extension)n/an/aOprogramowanie używane do przetwarzania i analizy obrazów mikroskopowych, w tym żywotności komórek i kwantyfikacji apoptozy
KleszczeFisherbrand12-000-163Służy do cięcia tkanki w kapturze, otwierania stawu i przenoszenia próbek
Gaza (sterylna)Dukal6412Służy do nawilżania chrząstki stawowej po otwarciu torebki stawowej
Szklana 1 litrowa butelka na mediaSigma AldrichCLS13951LHTCSłuży do przechowywania sterylnych PBS 
RękawiceThermo Fisher Scientific19-130-1597DSłuży do ochrony zespołu zbierającego
Insulina-Transferyna-Selen (ITS)Gibco41400-045Suplement medialny
Oprogramowanie do akwizycji danych LabVIEWNational Instrumentsn/aPrzechwytuje dane z ogniwa obciążnikowego i akcelerometru podczas testów udarności w celu późniejszej analizy.
Kwas L-askorbinowyMerckA4403Suplement prasowy
Laserowy konfokalny mikroskop skaningowyOlympusFV1000DSłuży do przechwytywania trójwymiarowych obrazów o wysokiej rozdzielczości barwionych próbek tkanek.
Zestaw do barwienia żywych i martwychThermo Fisher ScientificL3224Służy do rozróżniania żywych i martwych komórek w próbkach tkanek w celu oceny żywotności komórek
Czujnik wagowyKistler9712B5000Służy do pomiaru siły przyłożonej podczas uderzenia.
MATLAB Firma MathWorks Inc.
danych Piła taśmowa do mięsaSkymsenMSKLEUsuń kopyto nadgarstka z próbek bydła
Mikropipeta 10-100 uLThermo Fisher ScientificFBE00100Pomiar i przenoszenie  PBS i pożywki hodowlane
Minimalny roztwór aminokwasów endogennych (MEM)Gibco11140-050Suplement pożywki
Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM)Gibco10566-016Hodowla eksplantatów kostno-chrzęstnych.
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific15-140-148Suplement prasowy
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiThermo Fischer ScientificBP399-20Służy do płukania, nawilżania i chłodzenia tkanek w celu utrzymania warunków fizjologicznych, zapobiegania odwodnieniu i przygotowywania roztworów barwiących
Uchwyt na próbkę na wieży zrzutowejwykonany na zamówienienie dotyczyZabezpiecza rdzeń kostno-chrzęstny podczas uderzenia.
Rękojeść skalpela Thermo Fisher Scientific16-100-107Służy do precyzyjnego cięcia, rozwarstwiania tkanek i otwierania stawu.
(dodaj do cad)Gwint 6-32 Rozmiar-18-8 z walcowym ze stali nierdzewnej
Pirogronian soduGibco11360-070Dodatek medialny
Sferyczna głowica impaktoraMcMaster Carr9292K52Autoklaw przed zabiegiem uderzenia
Maski chirurgiczneMaska filtrująca375101Służy do ochrony zespołu zbierającego
Adapter obrotowy wody UKAM Industrial Superhard Tools7035812Łączy się z wiertłem rdzeniowym, aby zapewnić ciągły przepływ PBS do chłodzenia podczas procesu wiercenia.
komórek brak

Bibliografia

  1. Thomas, A. C., Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Palmieri-Smith, R. M. Epidemiology of Posttraumatic Osteoarthritis. J Athletic Training. 52 (6), 491(2017).
  2. Dilley, J. E., Bello, M. A., Natoli, R. M., McKinley, T. O., Sankar, u Post-traumatic Osteoarthritis: A Review of Pathogenic Mechanisms and Novel Targets for Mitigation. Bone Rep. 18, 101658(2023).
  3. Grande, D. A., Schwartz, J. A., Brandel, E., Chahine, N. O., Sgaglione, N. Articular Cartilage Repair: Where We Have Been, Where We Are Now, and Where We Are Headed. Cartilage. 4 (4), 281(2013).
  4. Punzi, L., et al. Post-traumatic Arthritis: Overview On Pathogenic Mechanisms and Role of Inflammation. RMD Open. 2 (2), e000279(2016).
  5. Chubinskaya, S., Wimmer, M. A. Key Pathways to Prevent Posttraumatic Arthritis for Future Molecule-Based Therapy. Cartilage. 4 (3 Suppl), 13S(2013).
  6. Ding, L., et al. Mechanical Impact Induces Cartilage Degradation via Mitogen Activated Protein Kinases. Osteoarthritis Cartilage. 18 (11), 1509(2010).
  7. Bonnevie, E. D., et al. Characterization of Tissue Response to Impact Loads Delivered Using a Hand-Held Instrument for Studying Articular Cartilage Injury. Cartilage. 6 (4), 226(2015).
  8. Nishimuta, J. F., Levenston, M. E. Response of Cartilage and Meniscus Tissue Explants to In Vitro Compressive Overload. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (5), 422(2012).
  9. Liu, Q., et al. Effects of Mechanical Stress on Chondrocyte Phenotype and Chondrocyte Extracellular Matrix Expression. Sci Rep. 6 (1), 1-8 (2016).
  10. Martin, J. A., McCabe, D., Walter, M., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O. N-Acetylcysteine Inhibits Post-Impact Chondrocyte Death in Osteochondral Explants. Bone Joint Surg Am. 91 (8), 1890(2009).
  11. Natoli, M. R., Scott, C. C., Athanasiou, A. K. Temporal Effects of Impact on Articular Cartilage Cell Death, Gene Expression, Matrix Biochemistry, and Biomechanics. Ann Biomed Eng. 36 (5), 780-792 (2008).
  12. Huser, C. A. M., Davies, M. E. Calcium Signaling Leads to Mitochondrial Depolarization in Impact-Induced Chondrocyte Death in Equine Articular Cartilage Explants. Arthritis Rheumatism. 56 (7), 2322-2334 (2007).
  13. Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial Dysfunction is An Acute Response of Articular Chondrocytes to Mechanical Injury. J Ortho Res. 36 (2), 739-750 (2018).
  14. Goodwin, W., et al. Rotenone Prevents Impact Induced Chondrocyte Death. J Ortho Res. 28 (8), 1057(2010).
  15. Bartell, L. R., et al. Mitoprotective Therapy Prevents Rapid, Strain-Dependent Mitochondrial Dysfunction After Articular Cartilage Injury. Ortho Res. 38 (6), 1257-1267 (2020).
  16. Zhang, K., et al. Mechanosensory and Mechanotransductive Processes Mediated by Ion Channels in Articular Chondrocytes: Potential Therapeutic Targets for Osteoarthritis. Channels. 15 (1), 339(2021).
  17. Xu, B. Y., et al. The Potential Role of Mechanically Sensitive Ion Channels in the Physiology, Injury, and Repair of Articular Cartilage. J Ortho Surg. 28 (3), 2309499020950262(2020).
  18. Lee, W., et al. Synergy Between Piezo1 and Piezo2 Channels Confers High-strain Mechanosensitivity to Articular Cartilage. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
  19. Jia, Y. Double-Edged Role of Mechanical Stimuli and Underlying Mechanisms in Cartilage Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1271762(2023).
  20. Chan, P. S., et al. Gene Expression Profile of Mechanically Impacted Bovine Articular Cartilage Explants. J Ortho Res. 23 (5), 1146-1151 (2005).
  21. Burton-Wurster, N., et al. Genes in Canine Articular Cartilage that Respond to Mechanical Injury: Gene Expression Studies with Affymetrix Canine GeneChip. J Heredity. 96 (7), 821-828 (2005).
  22. Ashwell, M. S., et al. Changes in Chondrocyte Gene Expression Following In Vitro Impaction of Porcine Articular Cartilage in an Impact Injury Model. J Ortho Res. 31 (3), 385-391 (2013).
  23. Karnik, S., et al. Decreased SIRT1 Activity Is Involved in the Acute Injury Response of Chondrocytes to Ex Vivo Injurious Mechanical Overload. Int J Mol Sci. 24 (7), 6521(2023).
  24. Martin, J. A., McCabe, D., Walter, M., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O. N-Acetylcysteine Inhibits Post-Impact Chondrocyte Death in Osteochondral Explants. J Bone Joint Surg Am. 91 (8), 1890(2009).
  25. Argote, P. F., et al. Chondrocyte Viability is Lost During High-Rate Impact Loading by Transfer of Amplified Strain, But not Stress, to Pericellular and Cellular Regions. Osteoarth Cartil. 27 (12), 1822(2019).
  26. Bush, P. G., Hodkinson, P. D., Hamilton, G. L., Hall, A. C. Viability and Volume of In Situ Bovine Articular Chondrocytes-Changes Following a Single Impact and Effects of Medium Osmolarity. Osteoarth Cartil. 13 (1), 54-65 (2005).
  27. Coleman, M. C., et al. Targeting Mitochondrial Responses to Intra-Articular Fracture to Prevent Posttraumatic Osteoarthritis. Sci Transl Med. 10 (427), 5372(2018).
  28. Garrity, J. T., Stoker, A. M., Sims, H. J., Cook, J. L. Improved Osteochondral Allograft Preservation Using Serum-Free Media at Body Temperature. Am J Sports Med. 40 (11), 2542-2548 (2012).
  29. Bonitsky, C. M., et al. Genipin Crosslinking Decreases the Mechanical Wear and Biochemical Degradation of Impacted Cartilage In Vitro. J Ortho Res. 35 (3), 558-565 (2017).
  30. Henson, F. M. D., Vincent, T. Chondrocyte Outgrowth Into a Gelatin scaffold in a Single Impact Load model of Damage/RepairEffect of BMP-2. BMC Musculoskel Disorders. 8, 120(2007).
  31. Jurvelin, J. S., Räsänen, T., Kolmonens, P., Lyyra, T. Comparison of Optical, Needle Probe and Ultrasonic Techniques for the Measurement of Articular Cartilage Thickness. J Biomech. 28 (2), 231-235 (1995).
  32. Dilley, J., et al. A Reproducible Cartilage Impact Model to Generate Post-Traumatic Osteoarthritis in the Rabbit. J Vis Exp. (201), e64450(2023).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an Open-Source Platform for Biological-Image Analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Buckwalter, J. A., Brown, T. D. Joint injury, repair, and remodelling: Roles in post-traumatic osteoarthritis. Clin Ortho Related Res. 423, 7-16 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model uderzenia w chrząstkępourazowa choroba zwyrodnieniowa stawówaplikacja obciążenia mechanicznegoeksplanty osteochondralnetest żywotności komóreksygnalizacja apoptycznatechnika wieży spadkowejkość podchrzęstna
In vitro Model wpływu do generowania subletalnego uszkodzenia chondrocytów w eksplantatach chrząstki bydlęcej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.