Method Article

Wizualizacja fluorescencji pojedynczej cząsteczki dynamiki polimerazy DNA w G-kwadrupleksach

DOI:

10.3791/68080

⸱

April 4th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Horizons and School of Science, University of Wollongong, 2Howard Hughes Medical Institute, Rockefeller University, 3Laboratory of DNA Replication, Rockefeller University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje test replikacji pojedynczej cząsteczki DNA oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym interakcji między polimerazami DNA a przeszkodami, takimi jak struktury G-quadruplex.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność białek biorących udział w replikacji eukariotycznego DNA do pokonywania przeszkód - takich jak 'blokady' białek i DNA - jest kluczowa dla zapewnienia wiernej duplikacji genomu. G-kwadrupleksy to struktury kwasów nukleinowych wyższego rzędu, które tworzą się w bogatych w guaninę regionach DNA i wykazano, że działają jako przeszkody, zakłócając szlaki utrzymania genomu. Badanie to wprowadza metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej w czasie rzeczywistym do obserwacji interakcji polimerazy DNA ze strukturami G-quadruplex. Krótkie, zagruntowane oligonukleotydy DNA zawierające G-quadruplex unieruchomiono na funkcjonalizowanych szklanych szkiełkach nakrywkowych w mikroprzepływowej komórce przepływowej. Wprowadzono fluorescencyjnie znakowane polimerazy DNA, co pozwoliło na monitorowanie ich zachowania i stechiometrii w czasie. Takie podejście umożliwiło obserwację zachowania polimerazy, gdy była ona zatrzymywana przez G-quadruplex. W szczególności, przy użyciu znakowanej fluorescencyjnie polimerazy drożdżowej δ, stwierdzono, że po napotkaniu G-quadruplex polimeraza przechodzi ciągły cykl wiązania i rozwiązywania. Ten test jednocząsteczkowy można dostosować do badania interakcji między różnymi białkami podtrzymującymi DNA i przeszkodami na podłożu DNA.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polimerazy DNA to enzymy, które katalizują inkorporację trifosforanów nukleozydów w celu duplikacji DNA1,2,3,4,5. W związku z tym odgrywają kluczową rolę w podstawowych procesach utrzymania DNA, w tym w replikacji DNA6,7,8 i repair9,10,11,12. Polimerazy DNA muszą replikować genom dokładnie i wydajnie, aby zapewnić integralność genomu, zapobiegając akumulacji mutacji w genomie. Podczas syntezy polimerazy często napotykają "przeszkody", takie jak białka związane z DNA lub drugorzędowe struktury DNA13. Te przeszkody mogą spowolnić lub nawet zablokować postęp polimerazy14. Pokonanie tych przeszkód jest ważne dla zapewnienia wiernej duplikacji genomu, ponieważ niewykonanie tego może prowadzić do niestabilności genomu15,16.

Jedną z głównych przeszkód są G-quadruplexes (G4), niekanoniczne drugorzędowe struktury DNA, które, jak wykazano, tworzą się w sekwencjach bogatych w guaninę w ludzkim genomie17. W ludzkim genomie znajduje się ponad 700 000 różnych sekwencji zdolnych do tworzenia G4, w tym regiony w telomerach i promotorach onkogenów18. Te struktury DNA przyjmują różne konformacje w zależności od sekwencji nukleotydów, długości i związanego kationu metalu19,20,21. Ta różnorodność oznacza, że polimerazy muszą pokonywać szereg różnych topologii G4, potencjalnie z różnym stopniem wydajności. Wykazano, że niepowodzenie polimeraz w pokonaniu lub ominięciu struktury G4 utrudnia postęp widełek replikacyjnych in vivo, prowadząc do niestabilności genomu22. Badania in vitro wykazały, że struktury G4 mogą blokować lub całkowicie blokować polimerazy drożdży23,24,25,26,27. Zdolność struktur G4 do zatrzymywania lub blokowania polimeraz DNA jest całkowicie zależna od ich stabilności kinetycznej i termodynamicznej, przy czym niektóre polimerazy są w stanie rozwinąć pewne G4's28. Chociaż badania te dostarczają informacji na temat zdolności polimeraz do pokonywania przeszkód G-quadruplex, brakuje im możliwości bezpośredniej wizualizacji zachowania polimerazy po napotkaniu G4. Los polimeraz - czy pozostają związane, odpadają, czy dynamicznie się wymieniają - określają, jakie dalsze procesy są dostępne w celu rozwiązania G4.

W tym badaniu opracowano test mikroskopii pojedynczej cząsteczki oparty na fluorescencji, aby bezpośrednio wizualizować i monitorować wiązanie polimerazy DNA ze strukturami G4 w czasie rzeczywistym. Test ten polega na przywiązaniu matryc DNA tworzących G4 do biotynylowanego szkiełka nakrywkowego w mikroprzepływowej komórce przepływowej, gdzie można wprowadzić fluorescencyjnie znakowane polimerazy DNA w celu zainicjowania syntezy DNA. Mierząc fluorescencję polimeraz w czasie, można bezpośrednio zaobserwować ich zachowanie po napotkaniu struktury G4. Struktura G4 znajdująca się w onkogenie raka c-MYC została wybrana do tego testu ze względu na jej wysoki poziom stabilności. Protokół ten można teraz dostosować do katalogowania zachowania różnych polimeraz we wszystkich dziedzinach życia związanych z różnymi topologiami i stabilnościami G4. Test ten oferuje innowacyjne i wysokoprzepustowe podejście do wyjaśnienia mechanizmów, za pomocą których polimerazy DNA pokonują przeszkody DNA, zapewniając potężne narzędzie do pogłębienia wiedzy na temat dynamiki polimerazy.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegóły dotyczące używanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Spektroskopia dichroizmu kołowego

UWAGA: Przed opracowaniem testu, konieczne było przeprowadzenie spektroskopii dichroizmu kołowego (CD) na wybranej sekwencji G4, aby zapewnić prawidłowe fałdowanie. Sekwencja 22 nt (5′-TGAGGGTGGAGGGGGGGGGGAAA-3′) tworzy strukturę G4 pochodzącą z onkogenu raka c-MYC. Spektroskopię CD przeprowadzono również na sekwencji kontrolnej (5′- TGAGTGTGAAGACGATGTAGAA -3), która ma zmienione kluczowe nukleotydy, które zapobiegają tworzeniu się G4.

  1. Aby przygotować matryce DNA do spektroskopii CD, dodać 40 μL ze 100 μM z 22 nt matryc do 360 μL buforu Tris-HCl (pH 8,0), kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (TE) uzupełnionego 200 mM chlorku potasu (KCl). Do eksperymentów ze spektroskopią CD pożądane jest 10 μM końcowego stężenia DNA.
    UWAGA: Obecność jonów K+ jest niezbędna do stabilizacji struktury G4 w szablonie.
  2. Podgrzewać roztwory DNA do temperatury 95 °C w cyfrowej suchej łaźni przez 15 minut. Po zakończeniu roztwory należy powoli schłodzić przez noc, umieszczając blok grzewczy w styropianie. Ten powolny proces chłodzenia jest odpowiedzialny za składanie G4.
  3. Przenieść 400 μl roztworów sekwencji formującej i kontrolnej G4 do kuwety kwarcowej o długości 0,1 cm za pomocą gazoszczelnej strzykawki. Napełniaj kuwetę powoli, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.
  4. Zmierzyć widmo CD w zakresie od 200 nm do 400 nm za pomocą spektropolarymetru w temperaturze 25 °C. Parametry i warunki tego pomiaru zostały opisane wcześniej29. Wyniki można znaleźć na rysunku uzupełniającym 1.
    UWAGA: Upewnij się, że nagrywasz widmo CD, aby sam bufor działał jako półfabrykat.

2. Przygotowanie matryc DNA

UWAGA: Szablony, które mogą być replikowane, to krótkie, liniowe szablony o długości 100 nt, przygotowane przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej. Szablon formujący G4 (5′-GAATTACATTTAAATTTTACACAGATACAGTCAATGAGAA
CTTCCAGGCGTAACGAGAGCACGGGGGGGGGGGGGGGGT
GGGACCTTAGCTTCGAGTTCCGAT-3′) zawiera sekwencję zdolną do utworzenia G-kwadrupleksu pochodzącego z MYC (od kroku 1) w swoim środku. Szablon kontrolny (5′-GAATTACATTTAAATTTTACACAGATACAGTCAATGAGA
ACTTCCAGGCGTAACGAGAGCACGATGTAGCAGAACT
GTGACCTTAGCTTCGAGTTCCGAT-3′) ma ten sam region kontrolny (z kroku 1) również w swoim środku.

  1. Aby wyżarzyć starter do matryc DNA tworzących G4 i kontrolnych, wymieszaj 20 μM startera (5′-Biotin-AF647-TCTTAATGTAATTTAAAATGTGTC-3′) z 20 μM z 100 nt matryc w buforze TE uzupełnionym 200 mM KCl.
  2. Podgrzewać roztwory matryc DNA do temperatury 95 °C w cyfrowej suchej kąpieli przez 15 minut. Po zakończeniu powoli schładzaj roztwory przez noc, umieszczając blok grzewczy w polistyrenie, aby umożliwić składanie G4 i wyżarzanie dwóch pasm.

3. Znakowanie polimerazy DNA za pomocą AF647

  1. Znakowanie polimerazy barwnikiem
    UWAGA: Drożdże Pol δ zostały wyrażone i oczyszczone zgodnie z wcześniejszym opisem30. Polimeraza musiała następnie zostać znakowana monoreaktywnym barwnikiem estrowym Alexa Fluor NHS (AF647), aby umożliwić wizualizację na poziomie pojedynczej cząsteczki. Zostało to wykonane zgodnie z wcześniejszym opisem5.
    1. Aby oznaczyć N-koniec, inkubuj 3-krotny nadmiar barwnika AF647 z 320 μl 58,5 μM Pol δ w buforze zawierającym 30 mM Tris-HCl (pH 7,6), 2 mM ditiotreitolu (DTT), 300 mM chlorku sodu (NaCl), 50 mM glutaminianu potasu i 10% (v/v) glicerolu przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Delikatnie obróć roztwór, aby zapewnić dokładne wymieszanie i poprawić wydajność etykietowania.
      UWAGA: Sekwencja białkowa może zawierać dodatkowe aminy pierwszorzędowe w aminokwasach lizyny. Dostosowując warunki reakcji, takie jak pH, etykieta może być preferencyjnie przymocowana do N-końca, a nie do reszt lizyny. Może to wymagać dalszej optymalizacji w celu zwiększenia wydajności etykietowania.
    2. Aby przygotować wirowe kolumny odsalające o pojemności 0,5 ml (odcięte 7 K masy cząsteczkowej), najpierw odwiruj kolumny przy 1500 x g przez 1 minutę w celu usunięcia roztworu do przechowywania. Wyrzucić roztwory zdeponowane w probówce zbiorczej po odwirowaniu.
      UWAGA: Upewnij się, że nasadka kolumn wirujących została poluzowana podczas etapów wirowania. Zapewni to, że kolumny są prawidłowo eluowane.
    3. Zrównoważyć kolumny w buforze zawierającym 30 mM Tris-HCl (pH 7,6), 300 mM NaCl, 3 mM DTT, 50 mM glutaminianu potasu i 5% (v/v) glicerolu, dodając 300 μl buforu do górnej części kolumny. Odwirować kolumnę przy 1500 x g przez 1 minutę i odrzucić przepływ. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy.
    4. Nanieść 200 μl każdej próbki Pol δ na kolumnę. Odwirować kolumny o sile 1500 x g przez 2 minuty i zebrać oczyszczony Pol δ w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    5. Odmrozić oczyszczone frakcje w cieczyN2 i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C, aby zapobiec degradacji białek w miarę upływu czasu.
  2. Określanie wydajności etykietowania
    1. Załaduj 2 μl próbki Pol δ z oznaczeniem AF647 do spektrofotometru UV-vis31.
      UWAGA: Upewnij się, że najpierw mierzona jest ślepa próba bufora Pol δ.
    2. Zmierz długości fal wzbudzenia 650 nm dla barwnika AF647 i 280 nm dla Pol δ za pomocą spektrofotometru.
    3. Korzystając z prawa Beera-Lamberta i współczynników ekstynkcji molowej wynoszących 270 000 cm-1 M-1 dla barwnika AF647 i 195 960 cm-1 M-1 dla polimerazy, oblicz skuteczność znakowania.
      UWAGA: Obliczono, że skuteczność znakowania określona dla drożdży Pol δ znakowanych AF647 w tym teście wynosi około 67%.

4. Test rozszerzenia startera zespołowego

UWAGA: Przed przeprowadzeniem eksperymentów z replikacją pojedynczych cząsteczek, konieczne jest potwierdzenie, że polimeraza DNA jest blokowana przez G-quadruplex za pomocą masowych testów replikacji.

  1. Ustaw temperaturę bloku grzewczego w cyfrowej suchej kąpieli na 30 °C. Zapewni to maksymalną aktywność drożdży Pol δ.
  2. Przygotować "mieszanki wzorcowe" dla matryc tworzących G4 i kontrolnych w buforze replikacyjnym (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM octanu magnezu, 50 mM glutaminianu potasu, 40 μg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT i 0,0025% (v/v) Tween-20). Uzupełnij każdą mieszaninę 1 mM DTT, po 250 μM dTTP, dCTP, dATP, dGTP (dNTPs) i 10 nM odpowiedniej matrycy DNA (tworzącej G4 lub kontrolnej). Umieść je w bloku grzewczym, aby upewnić się, że osiągną 30 °C.
  3. Ugasić 12 μl każdej mieszanki głównej za pomocą 12 μl buforu ładującego formamid (80% (w/v) formamidu, 10 mM EDTA), aby działał jako kontrola T = 0 min.
  4. Aby zainicjować syntezę DNA, dodaj drożdże Pol δ znakowane AF647 do każdej mieszanki głównej (stężenie końcowe 20 nM). Dokładnie wymieszaj, aby upewnić się, że polimerazy DNA replikują matryce z maksymalną wydajnością.
    UWAGA: Podczas użytkowania drożdże Pol δ należy przechowywać na lodzie, aby zachować aktywność enzymów.
  5. Po 30 s, 60 s i 180 s usunąć 12 μl każdej mieszanki głównej i zalać 12 μl buforu ładującego formamid. Stosunek mieszanki głównej do bufora ładującego formamid w stosunku 1:1 zapewnia, że reakcja replikacji nie może być kontynuowana po schłodzeniu.
  6. Usunąć teraz stłumione roztwory z bloku grzewczego o temperaturze 30 °C i umieścić je w bloku grzewczym o temperaturze 98 °C w celu denaturacji dsDNA do ssDNA. Po upływie 10 minut przynieś cały blok grzewczy do zbiornika żelu w celu załadowania roztworów do denaturującego żelu poliakryloamidu 15% tris-boran-EDTA (TBE)-mocznikowego (PAGE)32.
    UWAGA: Żel PAGE należy podgrzać przed załadowaniem próbek, uruchamiając elektroforezę żelu pod napięciem 180 V przez 30 minut w buforze 1x TBE. Po zakończeniu wypłucz każdą studzienkę, aby usunąć mocznik.
  7. Załaduj 15 μl każdej próbki na żel wraz z drabinką zawierającą 0,02 μM oligonukleotydów znakowanych 20 nt, 60 nt i 100 nt w buforze ładującym formamid.
  8. Uruchom żel na 60 minut przy napięciu 180 V w 1x buforze TBE, aby zapewnić całkowitą separację.
  9. Zobrazuj żel w kanale Cy5 obrazowania biomolekularnego. Umożliwi to zmierzenie zreplikowanej nici DNA zawierającej znacznik AF-647.

5. Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek

  1. Funkcjonalizacja szkiełek nakrywkowych
    UWAGA: Aby przymocować matryce DNA do szklanego szkiełka nakrywkowego, należy je najpierw funkcjonalizować aminozlanem, a następnie wiązać biotynylowane cząsteczki PEG. Proces ten minimalizuje niespecyficzne interakcje między DNA i/lub białkami a powierzchnią.
    1. Wyczyść szkiełka nakrywkowe (24 x 24 mm), wkładając je do słoików do barwienia i wlewając etanol. Sonikuj słoiki przez 30 minut, a następnie spłucz szkiełka nakrywkowe czystą wodą. Powtórzyć ten proces z 1 M wodorotlenkiem potasu (KOH) przed ponownym spłukaniem. Powtórz te kroki czyszczenia jeszcze raz.
    2. Opłucz i napełnij nowy słoik acetonem i umieść w nim szkiełka nakrywkowe. Rozprowadzić 3-aminopropylotrietoksysilan do słoika, aby utworzyć 2% roztwór v/v. Mieszaj słoik przez 3 minuty przed wygaszeniem reakcji dużym nadmiarem wody.
    3. Osuszyć szkiełka nakrywkowe za pomocą N2 i umieścić je pojedynczo w wilgotnym pojemniku wypełnionym wodą. Zapobiegnie to wysychaniu szkiełek nakrywkowych.
    4. Przygotować ester biotyny-PEG-SVA:mPEG-SVA w 1:25 w 100 mM NaHCO3 (pH 8,2). Wiruj tę mieszaninę przez 20 sekund, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
    5. Pobrać pipetą 40 μl roztworu PEG na suche szkiełko nakrywkowe. Umieść kolejne szkiełko nakrywkowe na wierzchu, aby "umieścić" roztwór między dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Spowoduje to funkcjonalizację powierzchni szkiełka nakrywkowego od wewnątrz. Powtórz tę czynność dla wszystkich szkiełek nakrywkowych.
    6. Inkubować szkiełka nakrywkowe w ciemności przez 3 godziny. Po inkubacji oddzielić pary szkiełek nakrywkowych, spłukać je nadmiarem wody i wysuszyć sprężonym gazemN2.
    7. Powtórz kroki 4.1.4-4.1.5, aby nałożyć drugą warstwę PEG na szkiełka nakrywkowe. Upewnij się, że wcześniej funkcjonalizowane boki są ze sobą ułożone, więc uważaj, aby nie przewrócić ich przypadkowo podczas etapów prania. Roztwory należy inkubować w ciemności przez noc przed ich spłukaniem i wysuszeniem.
    8. Przechowuj szkiełka nakrywkowe w próżni, aby zachować ich funkcjonalność. Funkcjonalizowane szkiełka nakrywkowe są stabilne przez miesiąc, jeśli są prawidłowo przechowywane.
  2. Przygotowanie mikroprzepływowych komór przepływowych
    UWAGA: Mikroprzepływowa komórka przepływowa33 jest skonstruowana do eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami (patrz rysunek uzupełniający 2). Umożliwi to, matrycom DNA i białkom kontakt z funkcjonalizowanym szkiełkiem nakrywkowym (patrz krok 5.1).
    1. Wyjmij funkcjonalizowane szkiełko nakrywkowe z odkurzacza i umieść je na stojaku na mikroprobówki częściowo wypełnionym wodą (wilgotne pudełko). Zmieszać 100 μl buforu blokującego (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 50 mM KCl, 2% (v/v) Tween-20) z 25 μl 1 mg/ml roztworu neutrAwidyny (10% PBS) i rozprowadzić na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Pozostaw to do inkubacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnym pudełku.
    2. Umyć szkiełko nakrywkowe w wodzie i wysuszyć w punkcie N2. Pamiętaj, że tylko jedna strona szkiełka nakrywkowego jest funkcjonalna, więc pamiętaj, która to strona.
    3. Umieść wykonany na zamówienie blok polidimetylosiloksanu (PDMS)34 na szkiełku nakrywkowym w uchwycie komory przepływowej. W ten sposób powstanie kanał przepływowy o wysokości 100 μm i szerokości 1 mm. Rurki polietylenowe (PE-60: średnica wlotowa 0,76 mm i średnica zewnętrzna 1,22 mm) można następnie włożyć do otworów w komorze przepływowej, aby zapewnić dostęp do i substratów.
  3. Obrazowanie fluorescencyjne pojedynczej cząsteczki
    UWAGA: Eksperymenty te należy przeprowadzać zarówno z szablonami formującymi G4, jak i kontrolnymi. Pozwoli to na wizualizację obu stanów (blokowanie δ Pol przez strukturę G4 i brak blokowania) na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF).
    1. Ogrzewać 1 ml podwielokrotności buforu blokującego Tween (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 50 mM KCl, 2% (v/v) Tween-20) i 500 μL podwielokrotności buforu płuczącego (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM octanu magnezu, 250 mM glutaminianu potasu, 40 μg/ml BSA, 0,1 mM EDTA, 5 mM naziemnej telewizji cyfrowej, 0,0025% (v/v) Tween-20) i bufor replikacyjny do 40 °C przez 15 min. To uwolni gazy z roztworów. Roztwory należy odgazowywać w komorze próżniowej przez kolejne 15 minut pod ciśnieniem 800 mbar poniżej ciśnienia atmosferycznego.
    2. Weź skonstruowaną komorę przepływową (patrz krok 4.2) i umieść ją na stoliku mikroskopu. Po umieszczeniu kropli oleju na celu, podnieś cel, aby spotkał się ze szkiełkiem nakrywkowym.
      UWAGA: Upewnij się, że obiektyw i komora przepływowa mają czas, aby osiągnąć 31 °C. Zwiększy to aktywność drożdży Pol δ i pomoże zapewnić powtarzalne dane.
    3. Włóż rurkę wlotową do odgazowanego bufora blokującego Tween i podłącz wylot do pompy strzykawkowej. Pociągnij strzykawkę do tyłu, aby wciągnąć bufor blokujący animację przez rurkę do kanału. Pozwól temu buforowi inkubować przez co najmniej 30 minut, aby zminimalizować niespecyficzne interakcje.
    4. Przepływ 200 μl odgazowanego buforu płuczącego do kanału z prędkością 100 μl/min. Spowoduje to wyczyszczenie bufora blokującego animacje.
    5. Rozcieńczyć roztwory matryc DNA do 0,5 pM w 500 μl buforu replikacyjnego. Wlać 150 μl do kanału z szybkością 10 μl/min. Oświetl próbkę za pomocą lasera 647 nm o temperaturze około 900 mWcm-2 na płaszczyźnie próbki, aby uwidocznić poszczególne matryce DNA.
      UWAGA: Jeśli pole widzenia (FOV) próbki nie jest całkowicie ostre, szkiełko nakrywkowe może nie przylegać równo do dna zbudowanej celi przepływowej. W takim przypadku należy skonstruować nową komórkę przepływową, używając świeżego szkiełka nakrywkowego.
    6. Gdy widoczna jest wystarczająca gęstość plamek (około 1 plamka na 10μm2), należy wprowadzić świeży roztwór buforu replikacyjnego (uzupełniony 1 mM naziemnej telewizji cyfrowej) do kanału, aby wypłukać nadmiar DNA. Objętość 250 μl jest wystarczająca do całkowitego usunięcia całego niezwiązanego DNA.
    7. Przejdź do nowego pola widzenia i uchwyć obraz DNA, aby określić stopień kolokalizacji między znakowaną polimerazą a substratem DNA. Po zakończeniu zwiększ moc lasera, aby fotowybielać pozostałe plamy.
    8. Przygotować roztwór polimerazy zawierający 1 mM DTT, 250 μM dNTP i 20 nM Pol δ znakowanego AF647 w 200 μl buforu replikacyjnego. Wlać do kanału 100 μl roztworu polimerazy z szybkością 5 μl/min.
    9. Gdy próbka jest już ostra, a kąt TIRF został wyregulowany, ustaw moc lasera 647 nm na około 900 mWcm-2 na płaszczyźnie próbki. Następnie rozpocznij obrazowanie pola widzenia przez żądany okres czasu. Rejestruj od 1 do 5 klatek/s przez 10-20 minut, aby przechwycić wszystkie zdarzenia replikacji.
  4. Analiza danych
    UWAGA: Wszystkie analizy zostały przeprowadzone przy użyciu języka Python (v. 3.11.7). Niestandardowy kod używany do analizy danych jest dostępny tutaj: https://github.com/Single-molecule-Biophysics-UOW/G-quadruplex_binding_analysis.
    1. Najpierw kolokalizuj plamki matrycy DNA z fluorescencyjnymi plamkami znakowanych drożdży Pol δ. Dwa piki uznano za kolokalizowane, jeśli ich odległość po korekcie dryfu wynosiła ≤ 3 piksele. Tylko plamki Pol δ, które kolokalizują matryce DNA, są analizowane pod kątem kinetyki wiązania i ogólnych trendów behawioralnych.
    2. Aby określić dane dotyczące zdarzenia wiążącego, zmierz intensywność w czasie każdego punktu, gdy wykazują one zachowanie "włączania/wyłączania" w całym filmie. Umożliwia to określenie, ile razy wiązanie Pol δ występuje na pojedynczej matrycy DNA.
      UWAGA: Ta analiza jest wykonywana zarówno dla eksperymentów z szablonem formującym G4, jak i kontrolnym, w celu porównania dynamiki wiązania.
      UWAGA: Przeprowadzono eksperymenty kontrolne, które zapewniają, że niespecyficzne zdarzenia wiązania z G-quadruplex lub samym szablonem (23,2 s ± 4,9 s) nie są uwzględniane w analizie zdarzeń wiązania.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla tego testu zaprojektowano dwa substraty DNA z fluorescencyjnie znakowanym starterem 20-nt: jeden zawierający sekwencję tworzącą G4 (Rysunek 1A, po lewej) i jeden bez tej sekwencji (Rysunek 1A, po prawej). Aby potwierdzić, że G-quadruplex jest skuteczną przeszkodą w aktywności polimerazy, monitorowano syntezę DNA przez Pol δ na denaturującym żelu PAGE. Aktywność oczyszczonego znakowanego Pol δ na substratach DNA badano za pomocą elektroforezy żelowej. Rysunek 1B (po lewej) pokazuje, że fluorescencyjnie znakowany Pol δ nie jest w stanie zsyntetyzować poza G-quadruplex. Przed rozpoczęciem syntezy (t = 0 min) występuje prążek odpowiadający 20 nt, reprezentujący znakowany starter, który został zdenaturowany z nici matrycowej. Po 3 minutach to 20-ntowe pasmo zostało przekształcone w pasmo 60-nt, co wskazuje, że synteza zaszła na całym DNA i potwierdza, że polimeraza została całkowicie zablokowana przez strukturę G-quadruplex. To blokowanie oznacza, że polimeraza nie może się ani rozłożyć, ani ominąć struktury. W przeciwieństwie do tego, synteza szablonu kontrolnego, który nie zawiera sekwencji tworzącej G-quadruplex (Rysunek 1A, po prawej) wytworzyła pasmo 100-nt po 3 minutach (Rysunek 1B, po prawej).

Po potwierdzeniu syntezy na matrycach i skutecznym blokowaniu przez G-quadruplex, pomiary te zostały powtórzone na mikroskopie fluorescencyjnym pojedynczej cząsteczki w celu monitorowania zachowania polimerazy. Matryce DNA przywiązano do funkcjonalizowanych szkiełek nakrywkowych (Rysunek 2A) w komórce przepływu mikroprzepływowego, a położenie każdego substratu określono poprzez wizualizację znakowanego fluorescencyjnie startera. Następnie znakowany Pol δ załadowano w obecności dNTP w celu zainicjowania syntezy. W ramach typowego pola widzenia śledzone są poszczególne plamki w celu ilościowego określenia, jak często Pol δ wiąże się i dysocjuje od DNA (Rysunek 2B, C). Mierząc intensywność w funkcji czasu na każdym substracie DNA, można wygenerować trajektorie pojedynczych cząsteczek (Rysunek 2C, Rysunek uzupełniający 3). Można zmierzyć charakterystyczny "czas przebywania", czyli średni czas, w którym Pol δ pozostaje związany z szablonem. Dla substratu G4 czas przebywania określono na 6 s ± 2 s, podczas gdy dla substratu kontrolnego wynosił on 10 s ± 3 s (Rysunek 2D, Rysunek uzupełniający 4). Dodatkowo, dla każdej trajektorii, można określić ilościowo, ile razy Pol δ wiąże się z szablonem. Liczba zdarzeń wiązania z substratem G4 jest znacznie wyższa w porównaniu z szablonem kontrolnym (Rysunek 2E). Chociaż istnieją przypadki więcej niż jednego zdarzenia powiązania w szablonie kontrolnym ze względu na scholastyczne wiązanie i rozwiązywanie powiązania, istnieje wyraźny wzrost liczby zdarzeń powiązania średnio dla szablonu tworzącego G4. Sugeruje to, że po zatrzymaniu syntezy przez G-kwadrupleks, związana polimeraza dysocjuje od DNA, zanim nowe polimerazy z roztworu zaangażują się w ciągły cykl wiązania i rozwiązywania. W związku z tym ten test pojedynczej cząsteczki zapewnia niezrównany wgląd w to, jak polimerazy DNA reagują na przeszkody DNA.

figure-results-1
Rysunek 1: Test rozszerzenia startera zespołowego. (A) Schematyczne przedstawienie substratów DNA. Substrat G4 (po lewej) zawiera sekwencję tworzącą G-quadruplex, podczas gdy substrat kontrolny (po prawej) nie. (B) Test rozszerzenia prymazy DNA zespołu substratów G4 i kontrolnych DNA wykazujący, że znakowane fluorescencyjnie drożdże Pol δ są całkowicie zablokowane przez G-kwadrupleks. Żel PAGE pokazuje replikację matryc DNA w czasie, co skutkuje przesunięciem znakowanego startera 20 nt do produktu 60 nt dla substratu G4 (po lewej) i produktu 100-nt dla matrycy kontrolnej (po prawej). M reprezentuje drabinę zawierającą oznaczone oligonukleotydami 20 nt, 60 nt i 100 nt. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek. (A) Schematyczne przedstawienie testu przedłużania starterów jednocząsteczkowych przy użyciu drożdży znakowanych AF647 Pol δ. (B) Typowe pole widzenia uzyskane z testu jednocząsteczkowego. Każda plamka reprezentuje znakowaną fluorescencyjnie δ Pol wiążącą się z matrycą DNA. Pasek skali: 10 μm. (C) (Góra) Przykładowa cząsteczka z testu pojedynczej cząsteczki pokazująca wiązanie wł./wył. podczas wymiany Pol δ. (Na dole) Trajektoria pojedynczej cząsteczki tej samej cząsteczki pokazująca intensywność w czasie trwania eksperymentu. linia reprezentuje ukryty model Markowa (HMM) dopasowany do danych. (D) Czas przebywania Pol δ na podłożu G4 (fioletowy) i podłożu kontrolnym (szary). Linie reprezentują pasowania wykładnicze, co daje czas życia 6 s ± 2 s na podłożu G4 i 10 s ± 3 s na podłożu kontrolnym. (E) Liczba zdarzeń wiązania Pol δ z pojedynczymi substratami DNA. Mediana liczby zdarzeń wiązania na substracie G4 (fioletowy) wynosi 3,5, w porównaniu z substratem kontrolnym 1 (szary). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1:Spektroskopia CD. Widma CD sekwencji tworzącej G4 (fioletowe) i kontrolnej (szare) w buforze TE zawierającym 200 mM KCl w temperaturze 25 °C. Charakterystyczny pik przy 260 nm, po którym następuje ujemny pik przy 240 nm, jest charakterystyczny dla równoległego, wewnątrzcząsteczkowego GQ. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Budowa komory przepływowej. (A) Schemat poszczególnych części komory przepływowej. Kwadratowy blok PDMS znajduje się na wierzchu szkiełka nakrywkowego mikroskopu. Kawałki te są następnie dopasowywane do siebie w pokrywie i na dole uchwytu komory przepływowej. (B) Kompletna komora przepływowa. Rurki mogą być wkładane z każdej strony bloku PDMS, aby utworzyć kanały, przez które mogą być przepływane przez urządzenie za pomocą mikrofluidyki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Trajektorie pojedynczych cząsteczek. (A) Przykładowa trajektoria cząsteczki przechodzącej pojedyncze zdarzenie wiązania w ciągu 10 minut trwania eksperymentu. (B) Przykładowa trajektoria cząsteczki, w której nie ma żadnych zdarzeń wiązania w ciągu 10 minut trwania eksperymentu. linia w punktach (A) i (B) reprezentuje ukryty model Markowa (HMM) dopasowany do danych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Czasy przebywania. (A) Czas przebywania Pol δ na podłożu G4. Linia reprezentuje pasowanie wykładnicze, dając czas życia 6 s ± 2 s. (B) Czas przebywania Pol δ na podłożu kontrolnym. Dopasowanie wykładnicze daje czas życia 10 s ± 3 s. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 5: Kontrola fotowybielania. Wykres przedstawia średni czas, w którym pojedynczy enzym Pol δ drożdży znakowany AF647 jest fotowybielany laserem 647 nm. Linia reprezentuje dopasowanie wykładnicze, dając czas życia 39 ± 6 s. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisano test oparty na fluorescencji pojedynczej cząsteczki, który zapewnia wgląd w zachowanie polimerazy DNA, gdy napotyka G-kwadrupleks. Podczas gdy protokoły generowania matryc DNA, znakowania Pol δ i masowej replikacji DNA są proste, wykonywanie testów mikroskopowych pojedynczych cząsteczek jest trudniejsze technicznie. Ze względu na charakter technik jednocząsteczkowych należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć wprowadzania kurzu, zanieczyszczeń lub pęcherzyków powietrza, ponieważ zasłaniają one pole widzenia i utrudniają gromadzenie danych.

Ograniczeniem eksperymentów mikroskopowych z użyciem pojedynczych cząsteczek TIRF jest fotowybielanie fluoroforów, które są kowalencyjnie sprzężone z interesującymi biomolekułami. Fotowybielanie jest nieodwracalnym procesem prowadzącym do trwałej utraty fluorescencji35. Aby złagodzić ten problem podczas eksperymentów, konieczne jest ograniczenie czasu ekspozycji lasera, dostosowanie intensywności lasera i optymalizacja czasu obrazowania. Strategie te pomagają zachować sygnały fluorescencji, zapewniając bardziej wiarygodne i wydłużone okresy obserwacji. Dzięki precyzyjnemu dostrojeniu tych parametrów, sygnał Pol δ pozostaje przez cały czas trwania pomiaru. Aby zoptymalizować moc lasera w testach syntezy mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki, zaleca się pomiar szybkości fotowybielania poprzez obrazowanie znakowanej polimerazy na czystym szklanym szkiełku nakrywkowym. Poprzez systematyczną zmianę mocy lasera i ocenę szybkości fotowybielania w całym polu widzenia, można określić optymalną intensywność lasera, która równoważy siłę sygnału fluoroforu z odpornością na fotowybielanie (patrz rysunek uzupełniający 5).

Kluczową przewagą tego podejścia opartego na pojedynczej cząsteczce w porównaniu z tradycyjnymi metodami opartymi na zespołach jest jego zdolność do bezpośredniej wizualizacji, kiedy pojedyncza polimeraza DNA napotyka strukturę G4 i wchodzi z nią w interakcję. Tradycyjne metody oparte na zespołach (takie jak elektroforeza żelowa) wykazały zdolność struktur G4 do blokowania polimeraz DNA 23,36,37. Techniki te nie są jednak w stanie dostarczyć w czasie rzeczywistym informacji kinetycznych i mechanistycznych o tej interakcji, które są niezbędne do rozwikłania różnych molekularnych etapów kinetycznych i wyników. Techniki jednocząsteczkowe oferują niezrównany wgląd w kinetykę, mechanizmy i zachowania biomolekuł, często ukryte przez średnią zespołową38. Teraz można zobaczyć, jak polimerazy DNA zachowują się w czasie rzeczywistym - czy wymieniają się, zatrzymują, dysocjują, czy omijają blokady DNA39. Po ustanowieniu tego protokołu, tożsamość G4 może być łatwo zmieniona z wybranej równoległej struktury c-MYC na dowolną topologię równoległą, antyrównoległą lub hybrydową. Zastosowanie tego testu pojedynczej cząsteczki ujawni, czy te same polimerazy DNA zachowują się inaczej w przypadku napotkania alternatywnych topologii G4. W związku z tym metody jednocząsteczkowe są niezbędne do udzielenia odpowiedzi na konkretne pytania dotyczące interakcji białek i DNA w organizmie.

Dzięki bezpośredniej wizualizacji interakcji polimerazy DNA z G-kwadrupleksami zidentyfikowano wcześniej niescharakteryzowany szlak wymiany drożdży Pol δ. Odkrycie to sugeruje, że polimeraza odłącza się po napotkaniu G-quadruplex, czekając na interwencję innego białka w celu rozwiązania struktury przed ponownym zainicjowaniem syntezy DNA. Protokół ten można dostosować do badania interakcji między różnymi białkami podtrzymującymi genom a przeszkodami DNA, oferując niezrównany wgląd w to, jak enzymy komórkowe radzą sobie z przeszkodami genomowymi. Na przykład blokada tego testu może zostać zmieniona ze struktury G4 na wiązanie krzyżowe białko-DNA, rodzaj uszkodzenia DNA, w którym białko jest nieodwracalnie kowalencyjnie związane z DNA, działając jako przeszkoda dla replikacji DNA40. Takie badania mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia podstawowych procesów replikacji, naprawy i rekombinacji DNA. Umożliwiając badanie dynamiki DNA-białka na poziomie molekularnym, test ten stanowi potężne narzędzie do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw integralności genomu.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N.K.-A. dziękuje za stypendium Australijskiego Rządowego Programu Szkolenia Badawczego. L.M.S. jest wdzięczna za fundusze, które otrzymała od Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (Investigator Grant 2007778). J.S.L jest wdzięczny za to, że został laureatem nagrody Discovery Early Career Award (DE240100780) oraz NHMRC Investigator EL1 (2025412) ufundowanych przez rząd australijski. S.H.M jest wdzięczny, że jest laureatem stypendium zawodowego Bruce Warren Molecular Horizons Ealy.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 nt kontrolna matryca DNAZintegrowane technologiePierwotna matryca kontrolna w testach przedłużania starterów
100 nt Matryca DNA tworząca G4Zintegrowane technologie DNA Pierwotnamatryca tworząca G4 w testach przedłużania startera
15% Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel, 12-dołkowa, 20 i mikro; LBio-Rad4566055Elektroforeza żelowa
20 nt znakowany/biotynylowany oligonukleotyd starteraZintegrowane technologieWymagane do rozszerzenia startera matryc 100 nt Matryca
kontrolna DNA 22 ntZintegrowane technologiePierwotna matryca kontrolna w eksperymentach spektroskopii dichroizmu kołowego
22 nt Matryca DNA tworząca G4Zintegrowane DNA TechnologiePodstawowy szablon formujący G4 w eksperymentach spektroskopii dichroizmu kołowego
24 x 24 mm szkiełko nakrywkoweMarienfeld Superior100062Wymagane do mikroskopii TIRF
3-aminopropylotrietoksysilanThermo Fisher ScientificA10668.22Funkcjonalizacja szkiełka nakrywkowego
647 nm LaserKoherentny1196627Wybierz długość fali, która odpowiada barwieniu/barwnikowi wybór
Filtr emisyjny 670 nmChroma Technology CorpET655lpZapewnia, że do detektora przepuszczane są tylko odpowiednie długości fal
Obrazowanie biomolekularne Amersham Typhoon 5Cytiva29187191Analiza żelowa
Biotyna-PEG-SVA (MW 5000)Laysan BioBIO-PEG-SVA-5K-100MGFunkcjonalizacja szkiełek nakrywkowych
Deoksynukleotydy mieszanina roztworówtrifosforanówJena BioscienceNU-1005LBloki konstrukcyjne replikacji
Cyfrowa sucha kąpiel (115 V)Bio-Rad1660571Rozwiązania grzewcze
DitiothreitolSigma-Aldrich 646563Redukcja wiązań dwusiarczkowych
Kamera EM-CCDAndoriXon 897Przechwytywanie filmów z pojedynczymi cząsteczkami
FormamidSigma-AldrichF9037Denaturyzacja DNA podczas Zespołowe testy replikacji DNA
Gazoszczelna strzykawka, 1 mlSGE21964Kuweta napełniająca do spektroskopii dichroizmu kołowego
Mikroskop odwrócony z obiektywem CFI Apo TIRF 100x do zanurzania w olejuNikon Eclipse Ti-EUłatwia mikroskopię TIRF pojedynczych cząsteczek
Spektrofotometr J-810JascoJ-810Pomiar spektroskopii dichroizmu kołowego
MPEG-SVA (MW 5000)Laysan BioMPEG-SVA-5K-100MGFunkcjonalizacja szkiełek nakrywkowych
Spektrofotometr NanoDrop OneThermofisher ScientificND-ONEPomiar stężenia białka i znacznika
NeutrAvidinThermo Fisher Scientific31000Wiązanie matryc DNA do funkcjonalizowanych szkiełek nakrywkowych podczas eksperymentów jednocząsteczkowych
Rurka polietylenowaInstechBTPE-60Potrzebna do budowy komory przepływowej
Kuweta kwarcowa, 10 mmStarna Scientific1/Q/10/CDMieści próbkę do spektroskopii dichroizmu kołowego
Pompa strzykawkowaAdelab ScientificNE-1002XSłuży do przepływu i substratów przez mikroprzepływową komórkę przepływową:
Bufor Tris-EDTA,Thermofisher Scientific93283Bufor roztworu DNA,
Polimeraza drożdżowa δMichael O'Donnell LabReplikacja matryc DNA
Kolumna odsalania wirowego Zeba, 7 K MWCO, 0,5 mlThermo Fisher Scientific89882Oczyszczanie polimerazy
DNA DNA DNA ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sutton, M. D., Walker, G. C. Managing DNA polymerases: Coordinating DNA replication, DNA repair, and DNA recombination. Proc Natl Acad Sci. 98 (15), 8342-8349 (2001).
  2. Burgers Garg, P., J, P. M. DNA polymerases that propagate the eukaryotic DNA replication fork. Crit Rev Biochem Mol Biol. 40 (2), 115-128 (2005).
  3. Burgers, P. M. J. Eukaryotic DNA polymerases in DNA replication and DNA repair. Chromosoma. 107 (4), 218-227 (1998).
  4. Tsai, M. -D. How DNA polymerases catalyze DNA replication, repair, and mutation. Biochem. 53 (17), 2749-2751 (2014).
  5. Lewis, J. S., et al. Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication. Mol Cell. 77 (1), 17-25 (2020).
  6. Chilkova, O., et al. The eukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA. Nucleic Acids Res. 35 (19), 6588-6597 (2007).
  7. Sugino Kawasaki, Y., A, Yeast replicative DNA polymerases and their role at the replication fork. Mol Cells. 12 (3), 277-285 (2001).
  8. Stillman, B. DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes. Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).
  9. Shivji Wood, R. D., K, M. Which DNA polymerases are used for DNA repair in eukaryotes. Carcinogenesis. 18 (4), 605-610 (1997).
  10. Campbell Budd, M. E., L, J. The roles of the eukaryotic DNA polymerases in DNA repair synthesis. Mutat Res DNA Repair. 384 (3), 157-167 (1997).
  11. Gao Yang, W., Y, Translesion and repair DNA polymerases: Diverse structure and mechanism. Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).
  12. Bridges, B. A. DNA repair: Polymerases for passing lesions. Curr Biol. 9 (13), 475-477 (1999).
  13. Wilkinson, E. M., Spenkelink, L. M., Van Oijen, A. M. Observing protein dynamics during DNA-lesion bypass by the replisome. Front Mol Biosci. 9. 968424, (2022).
  14. Mueller, S. H., Spenkelink, L. M., Van Oijen, A. M. When proteins play tag: The dynamic nature of the replisome. Biophys Rev. 11 (4), 641-651 (2019).
  15. Zybailov, B. L., Sherpa, M. D., Glazko, G. V., Raney, K. D., Glazko, V. I. G4-quadruplexes, and genome instability. Mol Biol. 47 (2), 197-204 (2013).
  16. Monnat Loeb, L. A., J, R. DNA polymerases and human disease. Nat Rev Genet. 9 (8), 594-604 (2008).
  17. Bryan Oganesian, L., M, T. Physiological relevance of telomeric G-quadruplex formation: A potential drug target. Bioessays. 29 (2), 155-165 (2007).
  18. Chambers, V. S., et al. High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome. Nat Biotechnol. 33 (8), 877-881 (2015).
  19. Cheng, Y., Zhang, Y., You, H. Characterization of G-quadruplexes folding/unfolding dynamics and interactions with proteins from single-molecule force spectroscopy. Biomol. 11 (11), (2021).
  20. Tippana, R., Xiao, W., Myong, S. G-quadruplex conformation and dynamics are determined by loop length and sequence. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8106-8114 (2014).
  21. Kusi-Appauh, N., Ralph, S. F., Van Oijen, A. M., Spenkelink, L. M. Understanding G-quadruplex biology and stability using single-molecule techniques. J Phys Chem B. 127 (25), 5521-5540 (2023).
  22. Obi, I., et al. Stabilization of G-quadruplex DNA structures in Schizosaccharomyces pombe causes single-strand DNA lesions and impedes DNA replication. Nucleic Acids Res. 48 (19), 10998-11015 (2020).
  23. Kamath-Loeb, A. S., Loeb, L. A., Johansson, E., Burgers, P. M., Fry, M. Interactions between the Werner syndrome helicase and DNA polymerase delta specifically facilitate copying of tetraplex and hairpin structures of the d(CGG)n trinucleotide repeat sequence. J Biol Chem. 276 (19), 16439-16446 (2001).
  24. Clayton Kaguni, L. S., A, D. Template-directed pausing in in vitro DNA synthesis by DNA polymerase a from Drosophila melanogaster embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (4), 983-987 (1982).
  25. Sato, K., Martin-Pintado, N., Post, H., Altelaar, M., Knipscheer, P. Multistep mechanism of G-quadruplex resolution during DNA replication. Sci Adv. 7 (39), (2021).
  26. Castillo Bosch,, P,, et al. FANCJ promotes DNA synthesis through G-quadruplex structures. EMBO J. 33 (21), 2521-2533 (2014).
  27. Paeschke, K., Capra, J. ohnA., Zakian, V. irginiaA. DNA replication through G-quadruplex motifs is promoted by the Saccharomyces cerevisiae Pif1 DNA helicase. Cell. 145 (5), 678-691 (2011).
  28. Guo, L., et al. Joint efforts of replicative helicase and SSB ensure inherent replicative tolerance of G-quadruplex. Adv Sci. (Weinh. 11 (9), (2024).
  29. Pham, S. Q. T., et al. A new class of quadruplex DNA-binding nickel Schiff base complexes). Dalton Trans. 49 (15), 4843-4860 (2020).
  30. Georgescu, R. E., et al. Mechanism of asymmetric polymerase assembly at the eukaryotic replication fork. Nat Struct Mol Biol. 21 (8), 664-670 (2014).
  31. Hansen, J. B., Au, Microvolume protein concentration determination using the NanoDrop 2000c spectrophotometer. J Vis Exp. 33, (2009).
  32. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. 32, (2009).
  33. Geertsema, H. J., Duderstadt, K. E., Van Oijen, A. M. in DNA Replication: Methods and Protocols., eds Vengrova, S., Dalgaard, J. , Springer. New York, New York, NY. 219-238 (2015).
  34. Lewis, J. S., et al. Single-molecule visualization of fast polymerase turnover in the bacterial replisome. eLife. 6, 23932(2017).
  35. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Curr Protoc Cytom. 12, 12-18 (2009).
  36. Sommers, J. A., Estep, K. N., Maul, R. W., Brosh, R. M. Biochemical analysis of DNA synthesis blockage by G-quadruplex structure and bypass facilitated by a G4-resolving helicase. Methods. , 207-214 (2022).
  37. Edwards, D. N., Machwe, A., Wang, Z., Orren, D. K. Intramolecular telomeric G-quadruplexes dramatically inhibit DNA synthesis by replicative and translesion polymerases, revealing their potential to lead to genetic change. PLoS One. 9 (1), 80664(2014).
  38. Mueller, S. H., et al. Rapid single-molecule characterization of enzymes involved in nucleic-acid metabolism. Nucleic Acids Res. 51 (1), 5(2022).
  39. Lewis, J. S., Van Oijen, A. M., Spenkelink, L. M. Embracing heterogeneity: Challenging the paradigm of replisomes as deterministic machines. Chem Rev. 123 (23), 13419-13440 (2023).
  40. Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. Mechanisms of DNA-protein crosslink repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (9), 563-573 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule FluorescenceDNA Polymerase DynamicsG Quadruplex StructuresFluorescence MicroscopyPolymerase BindingDNA Replication ObstaclesPolymerase DeltaFlow Cell AssayDNA RoadblocksReal Time Visualization

Related Articles