Wpływ Shikoniny na szlak sygnałowy HIF-1α / VEGF u myszy z ostrym uszkodzeniem płuc spowodowanym posocznicą

Podsumowanie

Protokół ma na celu ocenę skuteczności shikoninu w łagodzeniu ostrych uszkodzeń płuc spowodowanych sepsą u myszy. Koncentrując się na szlaku HIF-1α/VEGF, badanie bada, w jaki sposób różne dawki shikoniny wpływają na wskaźniki przeżycia, patologię płuc i ekspresję markerów stanu zapalnego, podkreślając jej potencjalne korzyści terapeutyczne.

Streszczenie

Sepsa często powoduje ostre uszkodzenie płuc (ALI), powikłanie o wysokiej śmiertelności. Szlak HIF-1α/VEGF odgrywa kluczową rolę w sepsie, a shikonina, naturalny związek o właściwościach przeciwzapalnych, może łagodzić uszkodzenie płuc poprzez celowanie w ten szlak. Myszy Balb/c zostały losowo podzielone na cztery grupy: grupę pozorowaną, grupę modelową, grupę leczoną niską dawką i grupę leczoną wysoką dawką. Grupa pozorowana przeszła laparotomię bez podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP), podczas gdy grupa modelowa przeszła CLP w celu wywołania ostrego uszkodzenia płuc związanego z sepsą. Po modelowaniu, grupy leczone małą i wysoką dawką otrzymywały shikoninę przez zgłębnik w dawkach 12,5 mg/kg i 50 mg/kg, odpowiednio, raz na dobę przez 14 dni. Monitorowano 7-dniowe przeżycie myszy. Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE) zastosowano do oceny patologii tkanki płucnej, zmierzono stosunek masy płuc mokrych / suchych (W / D) i wykonano Western blot w celu wykrycia ekspresji HIF-1α, VEGF, TNF-α i IL-6 w tkance płucnej. Shikonin znacząco poprawił przeżywalność myszy septycznych z największym efektem zaobserwowano w grupie otrzymującej wysokie dawki (p < 0,05). W porównaniu z grupą modelową, stosunek W/D w płucach i uszkodzenie tkanek w grupach leczonych shikoniną były znacznie zmniejszone w sposób zależny od dawki. Dodatkowo, shikonin znacznie obniżył ekspresję HIF-1α, VEGF, TNF-α i IL-6, przy czym grupa otrzymująca wysokie dawki wykazała najbardziej wyraźną redukcję (p < 0,05). Shikonin łagodzi ostre uszkodzenie płuc u myszy septycznej, potencjalnie poprzez hamowanie ekspresji HIF-1α i zmniejszanie produkcji powiązanych czynników zapalnych.

Wprowadzenie

Sepsa to ciężka ogólnoustrojowa reakcja zapalna wywołana przez infekcję. ¹ Często prowadzi do dysfunkcji wielonarządowej i może zagrażać życiu w miarę postępu choroby. ² Pomimo stosowania terapii takich jak wentylacja mechaniczna i leczenie wspomagające, śmiertelność z powodu ALI związanej z sepsą utrzymuje się na wysokim poziomie, osiągając 30%-40%³. Terapie te koncentrują się głównie na objawach, a nie na przyczynach leżących u ich podstaw, co ogranicza ich ogólną skuteczność. W związku z tym zidentyfikowanie nowych podejść terapeutycznych, które są ukierunkowane na przyczyny uszkodzenia płuc, może znacznie poprawić wyniki leczenia sepsy.

Ostatnie badania zidentyfikowały czynnik indukowany hipoksją-1α (HIF-1α) jako krytyczny regulator w progresji wywołanej sepsą ALI^4,5. HIF-1α gromadzi się w tkance płucnej podczas sepsy, napędzając ekspresję genów, które nasilają stan zapalny i uszkodzenia tkanek⁶. Proces ten w znacznym stopniu przyczynia się do pogorszenia uszkodzenia płuc. Dlatego celowanie w szlak sygnałowy HIF-1α stanowi obiecujące podejście do łagodzenia odpowiedzi zapalnych i niedotlenieniowych obserwowanych w ALI wywołanym sepsą.

W poszukiwaniu skuteczniejszych metod leczenia, Tradycyjna Medycyna Chińska (TCM) dostarczyła cennych informacji^7,8. Szukina jest związkiem antrachinonu ekstrahowanym z Lithospermum erythrorhizon⁷. Wykazuje godne uwagi działanie przeciwzapalne⁹, antibacterial¹⁰ i przeciwnowotworowe¹¹. Shikonin może łagodzić uszkodzenia płuc wywołane przez lipopolisacharyd (LPS), co sugeruje jego potencjalną rolę terapeutyczną w chorobach płuc¹². Jednocześnie niektóre badania sugerują również, że shikonin może łagodzić uszkodzenia oksydacyjne spowodowane sepsą poprzez regulację jednojądrzastego układu makrofagów, równoważąc odpowiedzi prozapalne i przeciwzapalne. Jednak mechanizmy stojące za ochronnym działaniem shikoniny w ALI wywołanym sepsą nie są w pełni poznane. Stanowi to krytyczną lukę w obecnych badaniach.

W tym badaniu staramy się zbadać ochronne działanie shikoniny w mysim modelu ALI wywołanego sepsą za pomocą podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP). Technologia CLP odgrywa ważną rolę w badaniach nad sepsą, ponieważ może symulować złożone ogólnoustrojowe reakcje zapalne i dysfunkcję wielonarządową, dzięki czemu nadaje się do oceny skuteczności nowych strategii leczenia. Technologia CLP ma stosunkowo większe znaczenie kliniczne w porównaniu z tradycyjnymi metodami iniekcji LPS: symuluje ogólnoustrojową reakcję zapalną wywołaną translokacją mikrobioty jelitowej, która jest bliższa patologicznemu procesowi klinicznej sepsy. Można go stopniować i kontrolować: dostosowując długość podwiązania i rozmiar perforacji, można kontrolować nasilenie choroby i nadaje się do całego badania sepsy. Ponadto może symulować podobne dynamiczne zmiany w dysfunkcji wielonarządowej i odpowiedzi cytokinowej. Badając rolę szikoniny w modulowaniu szlaku sygnałowego HIF-1α/VEGF, mamy nadzieję zapewnić wgląd w nowe strategie terapeutyczne, które dotyczą mechanizmów leżących u podstaw uszkodzenia płuc związanego z sepsą, potencjalnie poprawiając wyniki kliniczne.

Protokół

Protokół uzyskał zgodę Centrum Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Medycznego w Wenzhou. W obecnym badaniu wykorzystano samce myszy C57Bl/6 (w wieku 5-6 miesięcy; 20-25 g). Szczegółowe informacje na temat głównych odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie mysiego modelu sepsy

1. Myszy domowe w stałej temperaturze 25 °C, wilgotności 50% i 12-godzinnym cyklu światło/ciemność.
2. Po 7-dniowym okresie aklimatyzacji losowo podziel myszy na cztery grupy: grupę pozorowaną, grupę modelową, grupę leczoną niską dawką i grupę leczoną wysoką dawką, po 20 myszy w każdej grupie.
3. Opierając się na odniesieniach z poprzedniego badania¹³, należy leczyć grupę otrzymującą niską dawkę stężeniem 12,5 mg/kg purpuryny przez 14 dni, a grupę otrzymującą wysoką dawkę stężeniem 50 mg/kg przez 14 dni. W grupie operacji pozorowanej należy wykonać laparotomię, trakcję jelita ślepego, redukcję i zamknięcie bez podwiązania lub nakłucia i leczyć tą samą dawką soli fizjologicznej przez 14 dni. Kroki eksperymentalne dla grupy z sepsą są następujące.
4. Po całonocnym poście (dozwolona była woda) znieczulenie myszy pentobarbitalem sodu (40-80 mg / kg) w sterylnych warunkach przez cały proces. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
5. Sprawdź prawidłowe znieczulenie, takie jak spowolnienie częstości oddechów, zmniejszenie napięcia mięśniowego i brak wyraźnej reakcji na stres podczas lekkiego zaciskania kończyn dolnych kleszczami hemostatycznymi.
6. Wykonaj dezynfekcję 75% etanolem, 3x. Wykonaj podłużne nacięcie około 1 cm w środkowej lewej pozycji brzucha myszy i rozetnij warstwami skórę, powięź i mięśnie, aby odsłonić jamę brzuszną.
7. Używając tępo zakończonych kleszczyków okulistycznych w obu dłoniach, delikatnie zbadaj jamę brzuszną, zlokalizuj i uwolnij jelito ślepe myszy, a następnie podwiąż je w odległości około 1 cm od końca jelita ślepego.
8. Za pomocą igły 21G nakłuć i podwiązać koniec jelita ślepego, delikatnie wycisnąć niewielką ilość treści jelitowej z miejsca nakłucia za pomocą kleszczy okulistycznych, a następnie pobrać ją do jelita ślepego.
9. Wykonać resuscytację płynem podskórnym za pomocą 1 ml 0,9% roztworu chlorku sodu. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą w mostku. Zwracamy uwagę, że zwierzę, które przeszło operację, nie wraca do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie zostanie w pełni wyleczone.
10. Po 7 dniach modelowania CLP należy podać nadmierne znieczulenie do eutanazji.
    UWAGA: Ze względu na możliwe drażniące działanie purpuryny na skórę, drogi oddechowe i przewód pokarmowy, a także jej wysoką toksyczność dla organizmów wodnych, zanieczyszczenie środowiska, podczas eksperymentu należy stosować środki ochrony osobistej.

2. Ocena modeli zwierzęcych

1. Obserwacja przeżywalności myszy
   1. Obchodzić się ze zwierzętami w sposób opisany powyżej. Rejestruj wskaźnik śmiertelności w ciągu 1 tygodnia po modelowaniu do analizy statystycznej. Niektóre myszy umierają bez sepsy przed eutanazją, podczas gdy myszy modelowe CLP mają pewien wskaźnik śmiertelności (Tabela 1).
   2. Pomiar stosunku masy płuc mokrych do suchych
      1. Po 24 godzinach modelowania ponownie znieczulij myszy zgodnie z krokami 1,4-1,5.
      2. Wykonaj podłużne nacięcie o długości około 1 cm po lewej stronie linii środkowej obojczyka myszy i usuń warstwę skóry, powięzi i mięśni, aby odsłonić jamę klatki piersiowej za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy.
      3. Usuń lewe płuco i odprowadź płyn powierzchniowy. Zmierzyć mokrą masę, a następnie wysuszyć ją w suszarce o temperaturze 80 °C przez 72 godziny do stałej masy, aby uzyskać suchą masę.
      4. Oblicz zawartość wody w płucach jako:
         Zawartość wody w płucach = (Mokry masa - Sucha masa) / Mokra masa x 100%.
   3. Porównanie histopatologiczne tkanek płuc
      1. W określonych punktach czasowych zbierz lewe płuco, jak opisano powyżej w kroku 2.2. Utrwal płuca w 10% obojętnym formaldehydzie, zanurz je w parafinie i pokrój na kawałki o grubości 5 μm.
      2. Odparafinować płuca w ksylenie, 2x, przez 5-10 minut za każdym razem. Wykonuj serie nawodnienia etanolu ze 100%, 95%, 85% i 75% przez 3 minuty na gradient. Moczyć w wodzie destylowanej przez 2 minuty.
      3. Plamić około 100 ml roztworu hematoksyliny przez 10 minut, a następnie spłukać wodą destylowaną, aby usunąć unoszący się kolor.
      4. Dodać około 70 ml roztworu różnicującego i moczyć przez 30 s. Następnie moczyć w wodzie z kranu 2x, za każdym razem przez 3-5 min.
      5. Dodawać kroplami około 100 ml roztworu barwnika eozyny przez 2 minuty. Wylej nadmiar roztworu barwnika i szybko odwodnij, jak opisano poniżej.
      6. Wykonaj odwodnienie, przezroczystość i uszczelnienie zgodnie z poniższym opisem.
         1. Próbki moczyć w gradientowym etanolu: 75%, 85%, 95% i 100% etanolu (I) przez 2-3 sekundy każda. Moczyć w 100% etanolu (II) przez 1 minutę i moczyć w ksylenie 2x przez 1 minutę za każdym razem. Za pomocą słomki lub zakraplacza nanieś neutralną gumę na powierzchnię plastrów chusteczki i rozprowadź ją równomiernie tak bardzo, jak to możliwe, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Uszczelnij i obserwuj pod mikroskopem przy 400x.
      7. Wybierz 10 losowych pól na sekcję płuca. Poproś patologa o ocenę zmian patologicznych, takich jak obrzęk pęcherzyków płucnych, krwotok i naciek neutrofili, od 0 (normalny) do 4 (poważne uszkodzenie). Użyj łącznego wyniku do oceny.
   4. Western blotting (zachodnia plama)
      1. Wyekstrahuj białka jądrowe z tkanki płucnej zgodnie z instrukcjami zestawu do ekstrakcji białek jądrowych i zmierz stężenie białka metodą BCA zgodnie z instrukcjami producenta.
      2. Przygotować próbki ładujące białko zawierające 50 μg białka załadowanego na próbkę. Przygotuj żel separujący SDS-PAGE (10%) i żel do układania w stos (3%). Przeprowadzić elektroforezę przy napięciu 80 V przez 45 minut, a następnie przenieść białko do membrany PVDF pod napięciem 110 V przez 60 minut po wprowadzeniu próbek do żelu rozdzielającego.
      3. Przenieść białka do błony i blokować przez 60 minut. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi (patrz tabela materiałów, 1:1000) przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie inkubować przeciwciała drugorzędowe (patrz tabela materiałów, 1:1000) w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
      4. Umyj membranę TBST i użyj ECL do wizualizacji. W ciemnym pomieszczeniu dodaj przygotowane odczynniki na membranę PVDF i wykonaj wstrząsanie oraz obrazowanie fluorescencyjne. Odczynniki ECL oddziałują z biomolekułami na membranie, wywołując silne reakcje chemiluminescencyjne, które są rejestrowane przez przyrządy do obrazowania fluorescencyjnego.
      5. Analizuj wartość pasm białka w skali szarości za pomocą systemu analizy obrazu, metody kwantyfikacji pasma (aby uzyskać szczegółowe informacje na temat systemu używanego do analizy densytometrii pasmowej, patrz Obraz NIH).
   5. analiza statystyczna
      1. Do analizy statystycznej należy używać programu SPSS 26.0. Użyj jednoczynnikowej ANOVA do porównania średnich wielu grup i testów LSD-t do porównań parami. Uznaj, że wartość p < 0,05 jest statystycznie istotna.

Wyniki

Aby ocenić potencjał terapeutyczny shikoninu, najpierw zbadaliśmy jego wpływ na przeżywalność myszy z sepsą w okresie 7 dni. Leczenie shikoninem poprawiło wskaźniki przeżywalności w sposób zależny od dawki (Rycina 1).

Biorąc pod uwagę powszechną występowalność uszkodzeń płuc w sepsie, oceniono również obrzęk płuc u myszy. Obrzęk płuc oceniano poprzez pomiar stosunku masy mokrej do suchej (W/D) płuc. Stosunek W/D był istotnie podwyższony w grupie m...

Dyskusja

Model CLP, jako złoty standard w badaniach nad sepsą, jest kluczowym krokiem w tym eksperymencie, ponieważ CLP naśladuje złożoność sepsy u ludzi lepiej niż wiele innych modeli. ALI związana z sepsą pozostaje krytycznym wyzwaniem klinicznym ze względu na wysoką śmiertelność i ograniczoną skuteczność obecnych metod leczenia^14,15. Nasze badanie pokazuje po raz pierwszy, że shikonina znacznie poprawia przeżywalność u myszy septycznych poprzez modulację zarówno HIF-1α...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
H& Zestaw do barwienia E zestaw do barwienia	Technologia Solaibao	G1120HE
Wirówka niskotemperaturowa	Sigma	3K15
Czytnik mikropłytek	Bio-Rad	Model 680
królik monoklonalny receptor VEGF-receptor1	przeciwciało Abcam	ab238632
królik poliklonalny HIF-1 i alfa	Abcam ab51608
SDS-PAGE system do elektroforezy	Bio-Rad	MINI Protean2
Shikonin	MedChemExpress	HY-N0822

przeciwciało