Artykuł metodologiczny

Metody in vitro Narażenie komórek nabłonka płuc na działanie konopi indyjskich na granicy faz powietrze-ciecz

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68102

⸱

20 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 2Research Institute of the McGill University Heath Centre, 3SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment Inc., 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Department of Medicine, McGill University

W tym artykule

Podsumowanie

Ustanawiamy ustandaryzowany model in vitro do badania ekspozycji na opary konopi na granicy powietrza i cieczy. Model ten zapewnia systematyczne podejście do badania wpływu waporyzowanej marihuany, odpowiadając na rosnące zainteresowanie waporyzatorami z konopi indyjskich jako alternatywą dla palenia.

Streszczenie

Konopie indyjskie są używane przez około 192 miliony ludzi na całym świecie. Większość ludzi używa konopi indyjskich poprzez wdychanie dymu z konopi indyjskich, który zawiera produkty uboczne spalania, które mogą negatywnie wpływać na zdrowie płuc. Wiedza o tych zagrożeniach doprowadziła do rosnącego zainteresowania waporyzatorami do konopi, które podgrzewają susz konopi bez przypalania. Waporyzacja marihuany nadal uwalnia kannabinoidy do inhalacji, ale podgrzewa materiał roślinny w niższej temperaturze. Obecnie nie ma ustandaryzowanego modelu in vitro do oceny skutków suchej pary z konopi. Dlatego ustaliliśmy model ekspozycji kultur komórek płuc na granicy faz powietrze-ciecz (ALI), w której komórki są wierzchołkowo wystawione na działanie odparowanej marihuany, co dokładniej symuluje fizjologię komórek nabłonka płuc. Protokół ten zapewnia stałe i powtarzalne dostarczanie pary z konopi indyjskich na powierzchnię komórki, zapewniając niezawodną platformę do badania komórkowego i molekularnego wpływu waporyzowanej marihuany. Praca ta jest pierwszą, która standaryzuje metodę dostarczania pary z konopi indyjskich in vitro, która może służyć jako punkt odniesienia dla przyszłych przedklinicznych badań nad konopiami indyjskimi.

Wprowadzenie

Konopie indyjskie są zazwyczaj używane poprzez wdychanie dymu ze spalania kwiatu rośliny w formie jointa, czy to rekreacyjnie, czy w celach leczniczych. Główna aktywność biologiczna konopi indyjskich wynika z kannabinoidów, takich jak Δ 9-tetrahydrokannabinol (Δ9-THC) i kannabidiol (CBD), które są uwalniane do organizmu podczas wdychania. Dym z konopi indyjskich zawiera również związki pirogenne, w tym substancje rakotwórcze, mutageny i teratogeny, które mogą powodować niekorzystne skutki zdrowotne1. Biorąc pod uwagę te obawy, istnieje zainteresowanie zwróceniem się do waporyzatorów do konopi, które podgrzewają kwiat konopi bez spalania, w nadziei, że pozwoli to na uwolnienie kannabinoidów do późniejszej inhalacji, ale bez produktów spalania. Wykonano pewne prace w celu scharakteryzowania składników chemicznych oparów konopi, wykazując obecność kannabinoidów, ale także różnych substancji toksycznych dla układu oddechowego, kwestionując pogląd, że te urządzenia są bezpieczne2,3. Istnieją znaczne luki w wiedzy na temat tego, jak waporyzowana marihuana wpływa na płuca i inne narządy.

Badania nad hodowlą komórek są niezbędne w toksykologii, aby wyizolować i zrozumieć specyficzne skutki wdychanych substancji na poziomie komórkowym, umożliwiając wysokoprzepustowe, opłacalne i mechanistyczne wglądy, które są istotne dla biologii człowieka. Sposób hodowli komórek jest również ważnym wyznacznikiem ogólnych wyników uzyskanych w eksperymencie in vitro. Większość badań nad hodowlami komórkowymi przeprowadza się w warunkach zanurzonych, w których komórki są hodowane na plastiku i wystawiane wierzchołkowo na działanie pożywek wodnych. Komórki nabłonka dróg oddechowych stanowią jednak wyjątkowe wyzwanie pod tym względem. W całym układzie oddechowym wierzchołkowa powierzchnia komórek nabłonka styka się z powietrzem. W pęcherzykach płucnych komórki nabłonkowe wytwarzają środek powierzchniowo czynny, podczas gdy inne komórki nabłonka dróg oddechowych wytwarzają śluz; Łącznie chroni to i utrzymuje czynność płuc. Zanurzone kultury nie są w stanie odtworzyć wierzchołkowej ekspozycji na powietrze, co ogranicza ich zdolność do dokładnego modelowania środowiska in vivo. Alternatywą dla zanurzonych modeli hodowli jest hodowla na granicy faz powietrze-ciecz (ALI), w której komórki nabłonka oddechowego są hodowane na membranie pokrytej kolagenem z pożywką po stronie podstawno-bocznej, podczas gdy są one wierzchołkowo wystawione na działanie powietrza. Komórki nabłonkowe hodowane w ALI są dokładniejszymi modelami nabłonka oddechowego ze względu na ich zdolność do polaryzacji, wytwarzania środka powierzchniowo czynnego lub śluzu oraz tworzenia połączeń w tym środowisku4.

Dodatkowym problemem, z którym spotykają się tradycyjne metody hodowli komórkowych w zanurzeniu, jest to, że związki hydrofobowe, takie jak kannabinoidy, słabo rozpuszczają się w środowisku wodnym5. Ekstrakty etanolowe są powszechnym rozpuszczalnikiem do badania związków hydrofobowych w zanurzonych kulturach6,7,8,9,10,11,12. Ekstrakty te pozwalają na rozpuszczenie w środowisku wodnym zarówno związków hydrofobowych, jak i hydrofilowych. Ograniczeniem jest jednak możliwość aglomeracji związków, a także związków wchodzących w interakcje z pożywką, które mogą zmieniać biodostępność13,14. Ostatnio pojawiły się rozwiązania pozwalające na dostarczanie związków w fazie aerozolowej do komórek przy braku rozpuszczalnika lub pożywki przy użyciu zaawansowanych systemów naświetlania, takich jak expoCube15 (system ekspozycji ALI/Transwell in vitro/ex vivo), a także innych. Bezpośrednie osadzanie aerozoli i zawiesin cząstek przy użyciu zaawansowanego systemu ekspozycji eliminuje proces zbierania i ponownego zawieszania, który jest znany z tego, że znacząco zmienia właściwości fizykochemiczne cząstek16. W tym miejscu opisujemy znormalizowany protokół ekspozycji linii komórek nabłonka pęcherzyków płucnych w ALI.

Protokół

1. Hodowla komórek nabłonka płuc w ALI

UWAGA: Tutaj opisany jest protokół hodowli komórek A549 w ALI. Należy zapoznać się z literaturą dotyczącą typu komórek, które mają być użyte w badaniu. Różne linie komórkowe potrzebują różnej ilości czasu w ALI, aby się różnicować, tworzyć ścisłe połączenia i wytwarzać środek powierzchniowo czynny/śluz.

  1. Hodowla komórkowa
    1. Przygotuj pożywkę, dodając 50 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml Glutamaxu, 5 ml antybiotyku przeciwgrzybiczego i 500 μl gentamycyny do 500 ml butelki DMEM.
    2. Umieść przygotowane podłoża w łaźni wodnej na 10-15 minut, aby ogrzały się do 37 °C.
    3. Spryskaj szafkę bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem i wytrzyj ją. Po podgrzaniu pożywki umieść ją pod wysterylizowaną szafką bezpieczeństwa biologicznego.
    4. Pod kapturem hodowlanym odpipetować około 10 ml pożywki do probówki o pojemności 15 ml.
    5. Odzyskaj komórki z ciekłego azotu i rozmroź, delikatnie mieszając w łaźni wodnej.
    6. Pod kapturem hodowlanym odpipetować rozmrożone komórki kriowialu do probówki o pojemności 15 ml.
    7. Odwirować probówkę o pojemności 15 ml o masie 300 g przez 5 minut.
    8. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu.
    9. Wymieszać osad z podłożem i przenieść go do kolby T75.
    10. Sprawdzić kolbę T75 pod mikroskopem.
    11. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przy wilgotności nasyconej.
    12. Odświeżaj pożywkę do hodowli komórkowych co 2-3 dni.
    13. Przejdź i hoduj komórki, aż zostanie osiągnięta pożądana liczba komórek. Do wysiewu jednej płytki 12-dołkowej potrzebne są 3 × 106 komórek.
  2. Powłoka kolagenowa transwelli
    1. Przygotowanie roztworu kolagenu
      1. Rozpuść 10 mg kolagenu typu IV w 20 ml ddH2O w 50 μl lodowatego kwasu octowego.
      2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, od czasu do czasu mieszając, aż do całkowitego rozpuszczenia.
      3. Wysterylizuj roztwór, filtrując przez filtr 0,22 μm.
      4. Podwielokrotność roztworu rozlać na 15 ml probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Powlekanie filtrów transwell kolagenem typu IV
      1. Rozmrozić jedną tubkę kolagenu typu IV (50 μg/ml) w temperaturze -20 °C.
      2. Dodaj 150 μl kolagenu do każdego filtra Transwell.
        UWAGA: Tylko płytki 12-dołkowe są kompatybilne z systemem naświetlania.
      3. Pozostaw płytki z otwartymi pokrywkami w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) na 18 godzin do wyschnięcia.
      4. Sterylizować, wystawiając na działanie światła ultrafioletowego (UV) przez 30 minut.
    3. Płytki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, owinięte w parafolię, do 30 dni.
    4. Przed posiewem komórek przepłukać obie strony filtrów sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
  3. Wysiewanie komórek we wkładkach i przejście do ALI
    1. Przygotowanie zawiesiny płytek i komórek
      1. Odpipetować 1,5 ml wstępnie podgrzanego przygotowanego podłoża do każdego dołka 12-dołkowej płytki.
      2. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
      3. Przygotować zawiesinę komórkową o stężeniu 5 × 105 komórek/ml w przygotowanym podłożu.
    2. Komórki wysiewające we wkładkach
      1. Wyjąć przygotowaną płytkę do hodowli komórkowej z inkubatora i umieścić ją pod wysterylizowaną szafką bezpieczeństwa biologicznego.
      2. Odpipetować 0,5 ml zawiesiny komórek (2,5 × 105 komórek/wkładkę) na górną część membrany we wkładce.
      3. Przykryć płytkę pokrywą płytki i umieścić ją z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    3. Ustanowienie ALI
      1. Usuń pożywkę wierzchołkową 24 godziny po wysianiu komórek.
      2. Zastąp podłoże podstawno-boczne 0,6 ml przygotowanej pożywki. W tym momencie komórki są wierzchołkowo wystawione na działanie powietrza, ustanawiając ALI.
      3. Hoduj komórki A549 w ALI przez okres do 2 tygodni, zmieniając pożywkę co 2 dni, aby umożliwić komórkom różnicowanie się, jak to zostało scharakteryzowane wcześniej4.

2. Ocena dozymetryczna ekspozycji na opary konopi za pomocą LC/MS

UWAGA: W tej części protokołu, metody bezkomórkowe zostały użyte do scharakteryzowania dawki oparów konopi zdeponowanych w każdym dołku poprzez analizę stężeń Δ9-THC. Δ9-THC przylega do tworzyw sztucznych, więc do pobierania próbek powinny być używane tylko szklane fiolki. Ta metoda wymaga, aby wybrana odmiana konopi zawierała Δ9-THC.

  1. Przygotowanie i konfiguracja systemu naświetlania
    1. Ustaw rurki dla systemu naświetlania zgodnie z określoną ścieżką przepływu (Rysunek 1A, B): ENDS Jednostka > skraplacz > pompa > izometryczny zespół do pobierania próbek z pompą Aeroneb > ekspoCube > czujnik wilgotności z filtrem > eksponuj port przepływu ekspozycji na ekspozycję EXPOCUBE.
    2. Włącz regulatory temperatury, aby podgrzać system do 35 °C i 50 °C.
    3. Wykonaj testy przepływu, aby upewnić się, że system jest szczelny, a ciśnienie jest prawidłowo ustawione (patrz SCIREQ Notéte: Przewodnik po rozwiązywaniu problemów z nierównymi przepływami w expoCube).
    4. Uruchom pompy Aeroneb, aby osiągnąć wilgotność względną większą niż 75%.
  2. Badania dozymetryczne i przygotowanie waporyzatora
    1. Przygotowanie do waporyzatora do marihuany
      1. Zmiel kwiat konopi za pomocą młynka do ziół.
      2. Odważyć porcje 0,25 g, używając separatora tabletek do uporządkowania każdej porcji.
      3. Umieść wkładki ze stali nierdzewnej w rzędzie ekspozycyjnym 12-dołkowej płytki transwell w systemie naświetlania.
  3. Narażenie wkładek ze stali nierdzewnej na opary konopi indyjskich
    1. Rozpocznij ekspozycję
      1. Zapakuj do piekarnika parownik 0,25 g konopi.
      2. Przymocuj waporyzator do marihuany do jednostki ENDS systemu ekspozycji za pomocą bezpiecznej uszczelki i rozpocznij żądany schemat zaciągania się. Ustaw waporyzator na ustawienie temperatury Smart Path Level 2.
        UWAGA: System ekspozycji zastosowany w tym badaniu ma cztery poziomy inteligentnej ścieżki do wyboru, w tym Poziom 1 (176-188°C), Poziom 2 (188-199 °C), Poziom 3 (199-210 °C) i Poziom 4 (210-221 °C).
      3. Utwórz profil puff w oprogramowaniu flexiWare (oprogramowanie do akwizycji danych; patrz SCIREQ Technote: Przewodnik po tworzeniu profili dla flexiWare 8). W przypadku tego protokołu należy użyć objętości zaciągnięcia o pojemności 70 ml z częstotliwością 4 zaciągnięć/min.
      4. Uruchom waporyzator do suszu ziołowego na 5 minut przed zmianą konopi, wyjmując susz konopi z piekarnika waporyzatora i dodając do niego świeże 0,25 g konopi. Przełączaj się między dwoma waporyzatorami, aby uzyskać ciągłą ekspozycję.
      5. Kontynuuj kroki 2.3.1.1-2.3.1.4, aż do osiągnięcia żądanego czasu ekspozycji.
    2. Po każdej ekspozycji ostrożnie wyjmij wkładki z systemu naświetlania za pomocą pęsety i przygotuj je do pobrania próbki zgodnie z poniższym opisem.
  4. Pobieranie i przygotowanie próbek do analizy LC/MS
    1. Za pomocą pęsety umieść filtry odpowiadające każdej ekspozycji w oznakowanej szklanej fiolce zawierającej 10 ml metanolu klasy LC/MS (np. Ekspozycja 1, Ekspozycja 2, Ekspozycja 3).
    2. Umyj wkład.
      1. Umieść każdą odsłoniętą wkładkę ze stali nierdzewnej w oznakowanej szklanej fiolce zawierającej 10 ml metanolu klasy LC/MS.
      2. Oznaczyć fiolki zgodnie z ekspozycją (np. Ekspozycja 1 Studzienka 1-4).
    3. Ekstrakt Δ9-THC
      1. Użyj kąpieli sonikatora, aby sonikować fiolki z wkładkami przez 10 minut, aby wyekstrahować Δ9-THC.
      2. Przenieść wkładki do drugiego zestawu szklanych fiolek z 10 ml świeżego metanolu i poddać sonikacji przez dodatkowe 10 minut.
    4. Prześlij wszystkie przygotowane próbki (studzienki, płukanie i filtr) do analizy LC/MS w celu ilościowego określenia poziomów Δ9-THC.
  5. Obliczenia dozymetryczne
    1. Korzystając z wyników analizy LC/MS, obliczyć ilość zdeponowanego Δ9-THC w celu określenia dozymetrii przepływu ekspozycji (ilość zdeponowana w filtrze) i dozymetrii w studzience.
    2. Obliczyć stosunek między filtrem przepływowym ekspozycyjnym a osadzaniem się w studni dla Δ9-THC.
    3. Użyj tego stosunku, aby określić dawkę, która zostanie dostarczona do komórek podczas ekspozycji.

3. Ocena dozymetryczna ekspozycji na opary konopi przy użyciu mikrowagi kryształu kwarcu

UWAGA: Ta metoda szczegółowo opisuje konfigurację i kalibrację mikrowagi kwarcowej (QCM) do oceny masy cząsteczek oparów konopi osadzonych podczas ekspozycji. Każdy QCM zapewnia pomiary w czasie rzeczywistym, umożliwiając precyzyjną dozymetrię ekspozycji na opary konopi

.
  1. Przygotowanie i konfiguracja QCM w systemie ekspozycji
    1. Skonfiguruj system ekspozycji zgodnie z wcześniejszym opisem.
    2. Podłącz każdy QCM do jego modułu elektronicznego za pomocą złącza zaciskowego i podłącz moduł do wejść jednostki inExpose (platforma ekspozycji inhalacyjnej) za pomocą 7-pinowego złącza.
    3. Umieścić wkładkę (wkładki) QCM w płytce studzienkowej po stronie ekspozycji systemu naświetlania, upewniając się, że QCM jest dobrze wyrównany.
    4. Rozgrzej wstępnie system naświetlania z dołączonymi QCM, aż system ustabilizuje się w temperaturach docelowych 35 °C i 50 °C.
    5. Aktywuj mikroprzepływy i przepływy ekspozycji zgodnie z ustawieniami eksperymentalnymi.
  2. Kalibracja systemu kontroli jakości
    1. Użyj kreatora kalibracji oprogramowania do akwizycji danych, aby skalibrować QCM przed każdym cyklem ekspozycji.
    2. Poczekaj, aż niebieski pasek kalibracji ustabilizuje się, a następnie wybierz przycisk Dalej, aby zarejestrować częstotliwość rezonansową QCM w celu uzyskania dokładnych obliczeń masy.
      UWAGA: Oczekiwany zakres kalibracji wynosi od -15% do 15%. Odchylenia mogą wskazywać na problemy, takie jak brudny QCM lub odłączone złącze LEMO.
  3. Monitorowanie sygnałów QCM w czasie rzeczywistym
    1. Monitoruj wyjścia QCM; system wyprowadza nagromadzoną zdeponowaną masę. Wartość jest wyświetlana w oprogramowaniu do akwizycji danych zarówno jako część wykresu, jak i rzeczywista wartość bieżąca.
      UWAGA: Dla każdej serii eksperymentalnej w oprogramowaniu podawane jest również maksymalne i minimalne osadzanie.
  4. Czyszczenie QCM
    1. Aby zachować dokładność, wyczyść QCM po każdym eksperymencie.
    2. Dodaj 1 ml 70% alkoholu izopropylowego do każdej wkładki QCM.
    3. Odpipetować roztwór alkoholu w górę i w dół 2-3 razy, aby rozpuścić pozostałości.
    4. Usuń roztwór alkoholu i pozwól QCM całkowicie wyschnąć na powietrzu w środowisku wolnym od kurzu przed następnym użyciem.

4. Wyniki wystawienia komórek na działanie oparów konopi

UWAGA: Ten protokół ma na celu ocenę wpływu oparów konopi na komórki oddechowe hodowane w ALI za pomocą systemu expoCube. Testy poekspozycyjne, w tym bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolium (MTT) i dehydrogenaza mleczanowa (LDH), dostarczają informacji na temat cytotoksyczności i aktywności metabolicznej zależnej od dawki.

  1. Dostarczanie pary z konopi indyjskich
    1. Skonfiguruj system ekspozycji zgodnie z powyższym opisem: Upewnij się, że system osiągnął temperaturę 35 °C i 50 °C oraz poziom wilgotności względnej powyżej 75%.
    2. Jeśli używasz QCM, podłącz urządzenie do modułu elektronicznego za pomocą złącza zaciskowego i podłącz moduł do wejść jednostki ekspozycji inhalacyjnej za pomocą 7-pinowego złącza. Umieść pojedynczą wkładkę QCM w płytce studzienkowej po stronie ekspozycyjnej expoCube, upewniając się, że QCM jest dobrze wyrównany.
    3. Otwórz system naświetlania i umieść w nim płytkę do hodowli komórkowej.
    4. Rozpocznij schemat zaciągania się przez żądany czas w oparciu o sekcję 2. Korzystanie z QCM pozwoli na śledzenie w czasie rzeczywistym całkowitej ilości osadzonej pary.
    5. Po ekspozycji należy zwrócić komórki do inkubatora do pożądanego punktu czasowego testu.
    6. W razie potrzeby pobrać próbki z różnych kompór, w tym z przedziału podstawno-bocznego, przemywania komory wierzchołkowej (dla środka powierzchniowo czynnego lub śluzu) oraz lizatu komórkowego.
    7. Testy doboru dawki: Użyj testów LDH i MTT, aby pomóc określić optymalną dawkę i potencjalną cytotoksyczność.
  2. Test LDH dla komórek w ALI
    1. Zbierz pożywkę: W żądanym punkcie czasowym po ekspozycji zbierz pożywkę z komory podstawno-bocznej.
    2. Przenieść 100 μl zebranej pożywki na przezroczystą 96-dołkową mikropłytkę.
    3. Do każdego dołka dodać 100 μl świeżo przygotowanej mieszaniny reakcyjnej LDH.
    4. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej (15-25 °C) przez 30 minut, chroniąc ją przed światłem.
    5. Zmierzyć absorbancję przy 490–492 nm, używając referencyjnej długości fali powyżej 600 nm.
    6. Obliczyć cytotoksyczność, korzystając z następującego wzoru:
      Cytotoksyczność (%) = (wartość doświadczalna-kontrola ujemna)/(kontrola dodatnia-kontrola ujemna) x 100
  3. Test MTT dla komórek w ALI
    1. Hodowla komórek A549 w ALI, jak wcześniej ustalono.
    2. Po dostarczeniu ekspozycji do systemu naświetlania, należy zwrócić komórki do inkubatora do pożądanego punktu czasowego testu.
    3. Rozpuścić 1 mg MTT w 1 ml PBS, aby uzyskać roztwór MTT.
    4. Dodać 500 μl roztworu MTT do wierzchołkowej strony komórek i 500 μl roztworu MTT do przedziału podstawno-bocznego.
    5. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
    6. Ostrożnie wyjmij wszystkie nośniki.
    7. Dodać 500 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) po stronie wierzchołkowej i 1 000 μl DMSO po stronie podstawno-bocznej.
    8. Inkubować przez 1 godzinę w celu rozpuszczenia kryształów formazanu.
    9. Zbierz i połącz roztwór zarówno od strony wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej.
    10. Zmierzyć absorbancję przy 540 nm (OD540) z odniesieniem przy 690 nm (OD690).
    11. Oblicz żywotność komórek za pomocą następującego wzoru:
      Żywotność komórek (%) = 100 × (średnia OD_exposure/średnia OD_negative kontrolna)

Wyniki

Podczas eksperymentów z systemem expoCube cztery studzienki są poddawane działaniu oparów konopi, cztery studzienki są narażone na powietrze kondycjonowane jako kontrole nośnika, a pozostałe cztery studzienki są całkowicie zamknięte jako kontrole negatywne (Rysunek 1C)17Taki układ umożliwia precyzyjne porównanie warunków z zastosowaniem preparatu, nośnika oraz kontroli negatywnej. System jest nawilżany w celu stworzenia środowiska odpowiedniego dla hodowli komórkowych (Rycina 2), a regulacja temperatury wewnątrz układu zwiększa depozycję cząstek poprzez termoforezę, co umożliwia efektywne dostarczanie odparowanych związków do komórek18Aby ilościowo określić stopień ekspozycji, mierzymy ilość Δ9-THC jako marker osadzania się par konopi w miejscu ekspozycji komórek. Ilościowe oznaczenie to jest kluczowe dla optymalizacji czasu i dawek ekspozycji, co pozwala badaczom na dostosowanie aktywnych okresów ekspozycji w celu osiągnięcia pożądanych dawek w eksperymentach na kulturach komórkowych (Rysunek 3). Poprzez obliczenie stosunku Δ9-THC zebranego w filtrze przepływowym ekspozycji do ilości osadzonej w poszczególnych studzienkach, możemy oszacować rzeczywistą dawkę dostarczoną do komórek (Tabela 1). Obliczona dawka wyznacza pożądany zakres ekspozycji, co pomaga w określeniu optymalnych parametrów badania reakcji komórkowych na opary konabi w sposób spójny i mierzalny. Procedurę tę można przeprowadzić dla innych kannabinoidów, w zależności od profilu kannabinoidowego wybranej odmiany konabi. Dodatkowo można przeprowadzić analizę QCM w celu pomiaru depozycji oparów konabi w czasie rzeczywistym. Rycina 4 przedstawia depozycję par konopi w czasie 30 min, podczas której waporyzator i materiał konopny były wymieniane co 5 min. W każdym dołku odnotowano stały wzrost masy w czasie, co wskazuje na efektywną i ciągłą depozycję cząstek par całej konopi.

Ustawienie do waporyzacji konopi z urządzeniem ENDS; schemat eksperymentu, sprzęt laboratoryjny, analiza ekspozycji.
Rysunek 1: Schemat systemu ekspozycji ALI/Transwell in vitro/ex vivo dla ekspozycji na opary konopi na poziomie ALI. (A) Do generowania oparów konopi użyto waporyzatora DaVinci MIQRO. Próbka ta jest nawilżana i przesyłana przez próbnik izokinetyczny do miejsca ekspozycji. Jednostka sterująca umożliwia regulację przepływu powietrza i gradientów temperatury. (B) Zdjęcia ustawienia systemu ekspozycji. (C) Wnętrze expoCube jest podzielone na trzy rzędy: rząd badawczy do ekspozycji na opary konopi, rząd kontrolny z uwarunkowanym powietrzem oraz zamknięty rząd kontrolny negatywny, który nie jest poddany żadnemu przepływowi powietrza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres wilgotności przepływu ekspozycji, czas w funkcji wilgotności względnej pokazujący wzorzec oscylacji w eksperymencie.
Rycina 2: Profil wilgotności względnej (%) zarejestrowany w czasie. Dane te przedstawiają poziomy wilgotności względnej po aktywacji urządzeń Aeronebs, osiągając i utrzymując średnią wilgotność na poziomie 75%. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy stężenia Δ⁹-THC, studzienki 1-4, ekspozycje 1-3, porównanie analityczne.
Rycina 3: Ilościowe oznaczenie depozycji Δ9-THC za pomocą analizy LC/MS po 30-minutowej ekspozycji na opary konopi. (A-C) Depozycję Δ9-THC mierzono w każdej studzience po trzech niezależnych 30-minutowych ekspozycjach na opary, przy użyciu 1,5 g odmiany konopi o wysokiej zawartości THC. Poziomy Δ9-THC określono ilościowo za pomocą LC/MS. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Wykres zależności czasu od depozycji masy dla czterech studzienek, przedstawiający przyrost masy w czasie (0-2000 s).
Rycina 4: Pomiary QCM depozycji oparów konopi w systemie ekspozycji ALI/Transwell in vitro/ex vivo podczas 30-minutowego cyklu ekspozycji. (A-D) Każdy wykres przedstawia skumulowaną depozycję cząstek oparów konopi w studzienkach 1-4, z masą mierzoną w mikrogramach (µg) w funkcji czasu. Szybkość depozycji wskazuje na stałą akumulację we wszystkich studzienkach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Osadzanie na głównym filtrze przepływowym (μg)Nanoszenie do studzienek (μg)Procent pierwotnego przepływu osadzonego w studni (%)
Ekspozycja 12142.34.70.22
4.40.2
4.60.22
4.40.21
Ekspozycja 22726.54.10.15
3.90.14
4.40.16
4.60.17
Ekspozycja 324003.60.15
3.80.16
50.21
40.17
Średnia2422.94.30.18
Odchylenie standardowe292.80.40.03

Tabela 1. Porównanie depozycji Δ9-THC w systemie ekspozycji ALI/Transwell in vitro/ex vivo pomiędzy filtrem przepływu ekspozycyjnego a miejscem ekspozycji komórek.

Dyskusja

Hodowla komórek w ALI jest ważną metodą w badaniach układu oddechowego ze względu na jej zdolność do dokładniejszego odwzorowania warunków prowadzenia dróg oddechowych in vivo w porównaniu z tradycyjnymi kulturami zanurzonymi19. Hodowla w ALI pozwala komórkom nabłonka płuc na bezpośrednie działanie powietrza na ich wierzchołkowej powierzchni przy jednoczesnym zachowaniu niezbędnych składników odżywczych z pożywki hodowlanej po stronie podstawno-bocznej. Taka konfiguracja umożliwia komórkom wytwarzanie środka powierzchniowo czynnego lub śluzu, kluczowych elementów mechanizmu obronnego układu oddechowego, które mają kluczowe znaczenie dla wychwytywania i usuwania wdychanych cząstek i patogenów 20,21,22. Komórki A549 są powszechnie stosowane w badaniach in vitro, ale są tylko jedną z wielu kultur komórek nabłonka oddechowego, które można wykorzystać do ALI. Silva i wsp. dokonali przeglądu linii komórkowych i pierwotnych kultur nabłonka oddechowego pod kątem ALI od jamy nosowej do pęcherzyków płucnych22. Elastyczność prezentowanego systemu naświetlania ALI pozwala na jego dostosowanie do różnych linii komórkowych i komórek pierwotnych.

Hodowle ALI są coraz częściej uważane za "złoty standard" w badaniach inhalacyjnych in vitro , w szczególności w badaniach nad zanieczyszczeniami powietrza, cząstkami stałymi i innymi czynnikami wziewnymi23. Główną zaletą modeli ALI jest ich zdolność do dostarczania spostrzeżeń, które są bardziej przekładalne na efekty in vivo u ludzi. Jednak godną uwagi wadą jest brak ustandaryzowanych protokołów dotyczących ekspozycji na ALI, co wpływa na odtwarzalność i porównywalność między badaniami. Jedną z luk jest ustandaryzowany przepływ pracy z ekspozycją. Wystawiając komórki na działanie oparów konopi indyjskich w ALI, można ocenić wpływ konopi indyjskich na funkcję komórkową, żywotność i cytotoksyczność. Ekspozycje te pozwalają na szczegółową ocenę wyników biologicznych, w tym markerów cytotoksyczności, stanu zapalnego i stresu oksydacyjnego. Precyzyjna kwantyfikacja zdeponowanych kannabinoidów umożliwia powtarzalne badania nad wpływem komórkowym oparów z konopi indyjskich (i innych form produktów z konopi indyjskich), pogłębiając naszą wiedzę na temat ich potencjalnego wpływu na zdrowie w kontrolowanym środowisku laboratoryjnym.

Zaawansowane systemy ekspozycji eliminują ograniczenia w tradycyjnych kulturach zanurzonych, umożliwiając bezpośrednie osadzanie cząstek na powierzchni komórki, zapewniając w ten sposób bardziej fizjologicznie istotne ekspozycje. Zmniejsza to również potencjalne działanie rozpuszczalników lub nośników. Umożliwiając bezpośrednie osadzanie cząstek bez konieczności stosowania tych rozpuszczalników, systemy ekspozycji pomagają zminimalizować skutki związane z nośnikiem. Niemniej jednak nadal istnieją pewne względy związane z pojazdem. Na przykład niekontrolowany poziom wilgotności może powodować niepożądany stres komórkowy24, potencjalnie wpływając na wyniki eksperymentów. Zapewnienie, że wilgotność jest dokładnie regulowana w celu osiągnięcia optymalnego poziomu, jest niezbędne do utrzymania stabilności komórek i dokładności wyników. Ponadto każda cząstka, aerozol lub mieszanina gazów ma swoje unikalne właściwości fizykochemiczne, które mogą zmieniać osadzanie się na powierzchni komórki25. Dlatego ważne jest, aby scharakteryzować schemat narażenia dla każdego unikalnego produktu. Czynniki, które mogą wpływać na osadzanie się cząstek, obejmują termoforezę, czyli przemieszczanie się cząstek z obszaru o wyższej do niższej temperatury26. Termoforeza pomaga w kierowaniu cząstek w kierunku komórek i zwiększa wydajność osadzania.

Spójność i precyzja dozowania to dodatkowe wyzwania podczas pracy z systemami naświetlania w ALI, zwłaszcza gdy w grę wchodzą aerozole lub cząstki. Osadzanie się cząstek in vivo w płucach jest złożonym procesem, na który wpływ ma wielkość, kształt, gęstość i rozpuszczalność cząstek, a także konkretny obszar płuc, na który są narażone27. Czynniki te skutkują różnymi szybkościami osadzania, które mogą być trudne do odtworzenia in vitro. Modele matematyczne, takie jak wielościeżkowa dozymetria cząstek (MPPD), są użytecznymi narzędziami do szacowania szybkości osadzania in vivo i kierowania translacją dawek in vitro 28. Wyzwaniem pozostaje jednak dopasowanie dawkowania in vitro do scenariuszy narażenia in vivo , szczególnie w przypadku aerozoli złożonych o niejednorodnym składzie.

W celu scharakteryzowania dawki bezkomórkowej ważne jest, aby pamiętać, że mycie wkładek ze stali nierdzewnej ma tendencję do zawyżania depozycji, ponieważ związki mogą przylegać zarówno do ścianek wkładki, jak i do podstawy, w której zwykle znajdują się komórki. QCM oferuje tutaj przewagę, ponieważ mierzy tylko masę zdeponowaną bezpośrednio w miejscu hodowli komórkowej, zapewniając dokładniejszą ocenę osadzania, szczególnie istotną dla ekspozycji komórek.

W miarę jak toksykologia zmierza w kierunku bardziej fizjologicznie istotnych modeli, przyjęcie ujednoliconych protokołów narażenia ALI będzie miało zasadnicze znaczenie dla wypełnienia luki między wynikami in vitro a reakcjami in vivo u ludzi, ostatecznie wspierając bardziej wiarygodne oceny substancji toksycznych dla układu oddechowego i ich wpływu na zdrowie.

Oświadczenia

PG i BU są zatrudnieni w SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. ETW odbył staż w SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. w ramach programu Mitacs Accelerate. Pozostali autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem (CIHR) Project Grant 162273. CJB był wspierany przez Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS). Badanie to było również wspierane przez grant Mitacs #IT34076 dla ETW.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15 ml probówka wirówkowa, stojak (stojak polistyrenowy), sterylneMontreal Biotech Inc.
30 ml szklane fiolkiThomas Scientific1755F32
A549 komórkiATCCCCL-185
Antybiotyk-antybiotyk (100x)Żubr450-115-EL
Młynek do ziół konopi Genchihttps://www.amazon.ca/Genchi-Grinder-Crystal-Threads-Premium/dp/B094WX443Y/ref=sr_1_10?crid=A1EV93N8PW1V&dib=eyJ2Ijo
iMSJ9.WX_vMBLeAHzc6JplZiba8i
w7k_cGpHrEm0VunfiDZqO0U1mT
NA0Tr8j5nGMqrGq1BW75hAV8Fr3
SDCGH7O7zwsmmCWOxvdAEN4
97Npj07w0FHMuNDtuKZ3hKv9d8
vauHRtueWaDqYEPOCIAy956bGf
PwXu2Gp9nCWVhFCo1gHqgeh1N
nrWwD3lJ_r_wx2GoauoNdVw9eH
A2QYc1tx3XKMidd2YkVRF_ABYL
ZJd0EIDxi22hBnzaM4KklLO6Ep0v
OGb1QifhM062KUvTTY9PAOUn8F
-O1V0qNYQiRk6SQo2WId2wOHS
Mz_zo4YCbkDQf2rNGy81iXhuBzV
qu9LhvOcI1xnPUd-JPLx_4rZdSC92
Q_QZODiSxBhH-ellca78LW2iV4XXU
vIr-fVWIKdhrS49MD7KV1lCjdBcT_
K3l4bT0mBgZB1_Qpgf_5tmrj-kf.-ctY
GDLXKn-ovr6On-5g1G0_oK5mrHdj
CN3LXumyu8Q& dib_tag=se&
słowa kluczowe=herb%2Bgrinder& qid=1736346511&
sprefix=herb%2Bgrinder%2Caps%
2C168& sr=8-10& th=1
Kolagen z łożyska ludzkiego, typ IVSigma-AldrichC7521
Costar 12 mm transwell, 0,4 &mikro; Membrana poliestrowa m por WkładyStemcell Technologies38023
Zestaw do wykrywania cytotoksyczności (LDH)Roche11644793001
Waporyzator do suszu ziołowego Davinci MIQRO-CDAVINCIhttps://davincivaporizer.com/products/davinci-miqro-c
DimetylosulfotlenekSigma-Aldrich34869
DMEM MediumŻubr319-005-CL
Suszony kwiat konopiSocié t&eaostry; qué bé coise du cannabishttps://www.sqdc.ca/en-CA/dried-cannabis?&fn1=CannabinoidBalanceLookup
Wartość&fv1=THC		Zawartość kannabinoidów: 17– 23% THC < 0,1% CBD 
Płodowa surowica bydlęcaŻubr080-150FBS
flexiWare SCIREQhttps://www.scireq.com/downloads/Wersja 8.4.1
GentamycynaŻubr450-134-XL
Lodowcowy kwas octowySigma-Aldrich100063 
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
inExpose expoCube   SCIREQIX-XCP 
Infinite 200 PROTECAN30125944
Metanol klasy LC/MSSigma-Aldrich106035
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiThermoFisher Scientific10010-023
T175 EasYFlask - TC Powierzchnia, Nasadka filtraThermoFisher Scientific159910
T75 EasYFlask - TC Powierzchnia, Nasadka filtraThermoFisher Scientific
Bromek tetrazolowy błękitu tiazolilowegoSigma-AldrichM 2128MTT
Triton X-100Sigma-Aldrich108603
Myjka ultradźwiękowa do kąpieliVWR18303Sonicator Bath
Tygodniowy organizer na pigułkiHealthSmart640-8223-0000
MBI601051C Pakiet do ekspozycji in vitro 156499

Bibliografia

  1. Graves, B. M., et al. Comprehensive characterization of mainstream marijuana and tobacco smoke. Sci Rep. 10 (1), 7160(2020).
  2. Lanz, C., Mattsson, J., Soydaner, U., Brenneisen, R. Medicinal cannabis: in vitro validation of vaporizers for the smokefree inhalation of cannabis. PLoS One. 11 (1), e0147286(2016).
  3. Arlen, M., et al. Cannabis vaping elicits transcriptomic and metabolomic changes in inflammatory, oxidative stress and cancer pathways in human bronchial epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. , (2025).
  4. Wu, J., et al. Characterization of airliquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Braz J Med Biol Res. 51 (2), e6950(2017).
  5. Kaur, K., et al. Comparison of biological responses between submerged, pseudoairliquid interface, and airliquid interface exposure of A549 and differentiated THP1 cocultures to combustionderived particles. J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng. 57 (7), 540-551 (2022).
  6. Adekola, M. B., et al. Invitro antioxidant and antiinflammatory activities of ethanol stembark extract of Blighia sapida K.D. Koenig. J Pharm Anal. 12 (2), 350-354 (2022).
  7. Final report on the safety assessment of capsicum annuum extract, capsicum annuum fruit extract, capsicum annuum resin, capsicum annuum fruit powder, capsicum frutescens fruit, capsicum frutescens fruit extract, capsicum frutescens resin, and capsaicin. Int J Toxicol. 26 (Suppl 1), 3-106 (2007).
  8. Daltro, S. R. T., et al. In vitro and in vivo immunomodulatory activity of Physalis angulata concentrated ethanolic extract. Planta Med. 87 (1-02), 160-168 (2021).
  9. Araujo, J., et al. Antioxidant and in vitro cytogenotoxic properties of Amburana cearensis (Allemão) A.C.Sm. leaf extract. Drug Chem Toxicol. 46 (1), 104-112 (2023).
  10. Spósito, L., et al. In vitro and in vivo antihelicobacter pylori activity of Casearia sylvestris leaf derivatives. J Ethnopharmacol. 233, 1-12 (2019).
  11. Ngulde, S. I., et al. Ethanol extract of Securidaca longipedunculata induces apoptosis in brain tumor (U87) cells. Biomed Res Int. 2019, 9826590(2019).
  12. Phuwajaroanpong, A., et al. In vitro and in vivo antimalarial activities and toxicological assessment of Pogostemon cablin (Blanco) Benth. J Evid Based Integr Med. 25, (2020).
  13. Upadhyay, S., Palmberg, L. Airliquid interface: relevant in vitro models for investigating air pollutantinduced pulmonary toxicity. Toxicol Sci. 164 (1), 21-30 (2018).
  14. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and oxidative stress responses of an alveolar epithelial cell line to airborne zinc oxide nanoparticles at the airliquid interface: a comparison with conventional, submerged cellculture conditions. Biomed Res Int. 2013, 652632(2013).
  15. Ritter, D., et al. In vitro inhalation cytotoxicity testing of therapeutic nanosystems for pulmonary infection. Toxicol In Vitro. 63, 104714(2020).
  16. Loret, T., et al. Airliquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions. Part Fibre Toxicol. 13 (1), 58(2016).
  17. Detlef, R., et al. In vitro inhalation cytotoxicity testing of therapeutic nanosystems for pulmonary infection. Toxicol In Vitro. 63, 104714(2020).
  18. Ritter, D., et al. Development and evaluation of an in vitro test system for toxicity screening of aerosols released from consumer products and first ap-plication to aerosols from a hair straightening process. Appl In Vitro Toxicol. 4 (2), 180-192 (2018).
  19. Silva, S., Bicker, J., Falcão, A., Fortuna, A. Airliquid interface (ALI) impact on different respiratory cell cultures. Eur J Pharm Biopharm. 184, 62-82 (2023).
  20. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
  21. Kingma, P. S., Whitsett, J. A. In defense of the lung: surfactant protein A and surfactant protein D. Curr Opin Pharmacol. 6 (3), 277-283 (2006).
  22. Soraia, S., Joana, B., Amílcar, F., Ana, F. Airliquid interface (ALI) impact on different respiratory cell cultures. Eur J Pharm Biopharm. 184, 62-82 (2023).
  23. Graf, J., TrautmannRodriguez, M., Sabnis, S., Kloxin, A. M., Fromen, C. A. On the path to predicting immune responses in the lung: modeling the pulmonary innate immune system at the airliquid interface (ALI). Eur J Pharm Sci. 191, 106596(2023).
  24. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in airliquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicol Res (Camb). 6 (4), 448-459 (2017).
  25. Speen, A. M., et al. Benchmark dose modeling approaches for volatile organic chemicals using a novel airliquid interface in vitro exposure system. Toxicol Sci. 188 (1), 88-107 (2022).
  26. Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
  27. Morawska, L., Buonanno, G., Mikszewski, A., Stabile, L. The physics of respiratory particle generation, fate in the air, and inhalation. Nat Rev Phys. 4 (11), 723-734 (2022).
  28. Kuempel, E. D., Sweeney, L. M., Morris, J. B., Jarabek, A. M. Advances in inhalation dosimetry models and methods for occupational risk assessment and exposure limit derivation. J Occup Environ Hyg. 12 (Suppl 1), S18-S40 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspozycja na opary konopitoksykologia inhalacyjnasystem ekspozycji na oparymikrowaga kwarcowahodowla komórek układu oddechowegodozymetria w czasie rzeczywistympomiar osadzania się oparówprzedkliniczny model płuc
Metody in vitro Narażenie komórek nabłonka płuc na działanie konopi indyjskich na granicy faz powietrze-ciecz
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.