Standaryzowany modułowy montaż operonów policistronnych z klonowaniem modularnym (MoClo) z wykorzystaniem zestawu narzędzi In-Cloning

Summary

Niniejszy artykuł przedstawia krok po kroku protokół demonstrujący, jak klonowanie modułowe (MoClo) można dostosować do klonowania operonów policistronnych.

Abstract

Zestawy narzędzi klonowania modularnego (MoClo) umożliwiają szybkie składanie konstrukcji wielogenowych. Opierają się na klonowaniu Golden Gate, które wykorzystuje enzymy restrykcyjne typu IIS, które wykraczają poza miejsce rozpoznania. Ponieważ rozpoznawanie i sekwencja cięcia są rozdzielone, można celowo wybierać zwisy utworzone przez enzymy restrykcyjne typu IIS, a strategie klonowania zazwyczaj uniemożliwiają cięcie prawidłowo połączonych fragmentów DNA. Pozwala to na bardzo efektywne złożenie wielu fragmentów DNA w jednej reakcji. W MoClo indywidualne funkcjonalne części DNA, takie jak promotory, miejsca wiązania rybosomów, sekwencje kodujące i terminatory, a także zespoły wyższego rzędu, otrzymują standaryzowane zwisy, dzięki czemu można tworzyć wielokrotnego użytku biblioteki części. Większość bakteryjnych zestawów narzędzi MoClo jest zaprojektowana do klonowania monocistronnych jednostek transkrypcyjnych i nie zapewnia uporządkowanej ścieżki do składania operonów policistronnych. Protokół ten demonstruje montaż jednostek transkrypcji policistronnych za pomocą zestawu narzędzi In- & Out-Cloning . To samo podejście można przenieść na inne zestawy narzędzi MoClo.

Introduction

Klonowanie molekularne, czyli wprowadzenie rekombinowanego DNA do replikonu, takiego jak plazmid, jest podstawową metodologią w biologii molekularnej. Metody konstrukcyjne i montażowe DNA stały się w ostatnich dekadach coraz bardziej zaawansowane. Obecnie naukowcy potrafią zbudować całe syntetyczne chromosomy, a nawet genomy z syntetyzowanego DNA¹. Tradycyjne klonowanie molekularne często opiera się na strategiach ad hoc klonowania i może być żmudne oraz kosztowne dla dużych, wielogenowych konstrukcji². W ostatnich latach klonowanie Golden Gate (GG) oraz wyprowadzone hierarchiczne zestawy klonowania modułowego (^MoClo) ^2,3 stały się popularnymi rozwiązaniami umożliwiającymi efektywne i czasowo oszczędne składanie DNA.

Enzymy restrykcyjne typu IIS to endonukleazy, które rozpoznają sekwencję kierunkową (niepalindromiczną) i rozcinają ją poza sekwencją rozpoznawczą⁴. W rezultacie sekwencje przesahu utworzone przez rozszczepienie nie zależą od miejsca rozpoznania, ale mogą być wybrane⁴. Ponadto funkcjonalne fragmenty DNA, tutaj nazywane "częściami", mogą być zaprojektowane tak, aby cięcie usuwało miejsce rozpoznania z końców części^{do łączenia 2}. Strategie klonowania GG wykorzystują to, umożliwiając efektywne wieloczęściowe zespoły DNA w reakcjach jednogarniczkowych⁵. Zestawy narzędzi MoClo opierają się na klonowaniu GG i mają na celu zapewnienie modułowego i hierarchicznego sposobu składania wielogenowych konstrukcji. Nawisy używane do montażu części są standaryzowane, co pozwala na tworzenie bibliotek wielokrotnego użytku i wymiennych części. Zestawy narzędzi MoClo opierają się na plazmidach akceptorowych, które są zaprojektowane tak, aby przyjmować wiele sekwencji DNA i uwalniać złożony produkt. Każdy plazmid akceptorowy zawiera dwa miejsca rozpoznania dwóch różnych enzymów typu IIS, z których jedno służy do przyjmowania ładunku DNA, a drugie do uwalniania złożonego DNA ^3,6. Ilustrację tej zasady pokazano na Rysunku 1 dla klonowania pojedynczej części, terminatora, do plazmidu akceptora MoClo (poziom 0). Zarówno plazmid akceptorowy, jak i wkładka są przecięte przez enzym restrykcyjny BbsI, w taki sposób, że pozostawia kompatybilne zwisy i usuwa miejsca rozpoznawcze BbsI. Prawidłowo ligowane plazmidy nie są już przecięte przez BbsI. Przecięcie powstałego plazmidu enzymem typu IIS SapI uwalnia wcześniej włożony fragment w kolejnym etapie montażu (poziom 1).

W tym protokole używany jest zestaw narzędzi MoClo do klonowania i wejścia ⁷. Tutaj plazmidy poziomu 0 zawierają zdefiniowane fundamentalne części genetyczne, takie jak promotory z 5' nieprzetłumaczonymi regionami (UTR), sekwencje kodujące oraz terminatory z 3' UTR. Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd poziomu 0. Na poziomie 1 wiele części jest składanych w jednostkę transkrypcyjną (TU), a Rysunek 2 przedstawia schemat części poziomu 1 oraz klonowania. Klonowanie wewnętrzne i zewnętrzne MoClo został zaprojektowany do bezbliznowatego montażu jednostek transkrypcji na poziomie 1 poprzez wykorzystość enzymu typu IIS, który tworzy przewisy 3-nukleotydowe. Pozwala to na pełne umieszczenie przepustów w rasterze kodon sekwencji kodującej, wykorzystując startowe kodony ATG i TGA stop do montażu. Poziomy M i P służą do składania wielu jednostek transkrypcyjnych uwalnianych z plazmidów poziomu 1 ^3,8. Rysunek 3 przedstawia schematyczny przegląd części przeznaczonych do klonowania na poziom M i P oraz montaż operonu bizystronicznego na poziomie M (operon bizystronizowy to jednostka transkrypcyjna, która wyraża wiele sekwencji kodujących (CDS)). Poziom P i M zostały zaprojektowane tak, aby umożliwiać iteracyjne przechodzenie od jednego do drugiego, tak że nie ma teoretycznego ograniczenia liczby części, które można złożyć, jednak nie jest to opisane w tym protokole, ponieważ głównym celem protokołu jest pokazanie montażu operonu bizystronicznego. Chociaż nie ma ograniczenia liczby części, które można złożyć, istnieje ograniczenie rozmiaru konstrukcji, którą można złożyć; do 100 000 bp zostało zmontowanych przy użyciu zestawu^{MoClo 9}. Ponadto duże konstrukty lub konstrukcje zawierające toksyczne geny mogą stanowić obciążenie dla komórki; dla tych przypadków opublikowano zmodyfikowane protokoły¹⁰.

In- and Out-Cloning początkowo nie opisywał schematu składania jednostek transkrypcji policistronnych. Operony policystroniczne są bardzo powszechnym trybem organizacji genów u^{bakterii 11,12,13}, dlatego budzi duże zainteresowanie ich modułowym układem oddolnym¹⁴. Tutaj opisano strukturalny schemat składania operonów policistronnych z użyciem klonowania wejścia i wyjścia. Przedstawiony schemat umożliwia łatwą zamianę pozycji sekwencji kodujących w jednostkach transkrypcji policistronnej, a także zespołów składających się zarówno z transkrypcji mono- jak i policistronnej.

Poniższy protokół krok po kroku pokazuje projektowanie i klonowanie operonu policistronnego za pomocą klonowania wejścia i wyjścia. Przedstawioną strategię klonowania jednostek transkrypcji policistronnych można łatwo dostosować do innych zestawów narzędzi MoClo.

Protocol

UWAGA: Protokół ten opisuje projektowanie i montaż operonu policistronowego poprzez trzy poziomy standardu In-Cloning (0, 1 i M). Operon policistronny złożony tutaj zaczyna się od promotora, następnie do miejsca wiązania rybosomu (RBS), sekwencji kodującej (CDS), drugiego RBS, drugiego CDS, a na końcu terminatora (rysunek S1). Zdecydowanie zaleca się stosowanie oprogramowania do klonowania molekularnego do symulacji klonowania in silico, aby upewnić się, że zaprojektowana strategia klonowania jest poprawna. Przykładem złożenia promotora jako części poziomu 0, złożenia RBS z sekwencją kodującą i terminatorem w jednostkę transkrypcyjną poziomu 1 oraz montażu operonu bizystronicznego na poziomie M opisano tutaj, a schematyczny przegląd całego zespołu przedstawiono na rysunku S1.

1. Poziom 0: Udomowienie części

UWAGA: Termin "udomowienie" oznacza, że cząsteczka została zintegrowana z biblioteką części MoClo i może być składana na wszystkich poziomach zestawu MoClo. Zazwyczaj wszystkie miejsca rozpoznania enzymów restrykcyjnych typu II użytych w zestawie są usuwane z części przeznaczonej do udomowienia, np. poprzez ponowne kodowanie synonimowy.

1. Projekt wkładki
   1. Wybierz części molekularne, takie jak promotor, CDS i terminator, które zostaną złożone razem w operonie.
      UWAGA: W tym protokole operon inicjuje się od promotora_P-LuxB, który może być aktywowany przez białko LuxR w obecności związku indukcyjnego N-(β-ketokaproyl)-L-homoseriny laktonu (OC6)¹⁷. GFP jest pierwszym CDS operonu; jego RBS to iGEM BBa_B0064. GFP następuje łącznik nieterminalny, zwany "mostkiem terminatora". Drugi CDS to mTurquoise. Jego RBS został zaprojektowany przez kalkulator RBS¹⁸. Na koniec operon kończy się terminatorem L3S2P21¹⁹.
   2. Wybierz pozycję, w której część powinna być złożona, a przegląd przedstawiony jest na Rysunku 1. Na podstawie pozycji wybierz plazmid akceptorowy do użycia w GG.
      UWAGA: Części można udomowić do późniejszego wykorzystania w różnych pozycjach. Na przykład promotor może być złożony jako pojedyncza część później, łącząc się z częścią 5'UTR (pSL252), lub może być udomowiony z już zawartym 5'UTR (pSL099). CDS może być złożony w czterech plazmidach akceptorowych, który należy złożyć bez tagu (pSL102), z tagiem N-terminalowym (pSL104), z tagiem C-terminal (pSL101) lub z tagiem N-terminalowym i C-terminalem (pSL103). W danym przykładzie promotor zostaje udomowiony do pSL252, pierwszy RBS do pSL253, pierwszy CDS do pSL102, mostek terminatora do pSL106, drugi RBS do pSL099, drugi CDS do pSL102, a terminator do pSL106.
   3. Dodaj rozszerzenia do zaprojektowanej wkładki na podstawie wybranego plazmidu akceptorowego. Tabela 1 przedstawia przegląd rozszerzenia wymaganego do montażu GG na plazmid akceptorowy. Te rozszerzenia powinny być dodawane podczas projektowania starterów do PCR, projektowania oligosów w przypadku wyżarzania dwóch oligometrów w celu budowy części lub podczas syntezy genów.
      UWAGA: Aby część mogła zostać udomowiona, konieczne jest zapewnienie, że sama część nie zawiera miejsc rozpoznania enzymów typu IIS używanych w zestawie: SapI (5'-GCTCTTC-3'), BbsI (5'-GAAGAC-3') oraz BsaI (5'-GGTCTC-3'). Obecność miejsc rozpoznawczych w częściach znacznie obniża efektywność prawidłowego montażu, ponieważ produkt końcowy może być cięty przez użyty enzym typu IIS (patrz rysunek 1).
2. Reakcja GG
   1. Do reakcji GG dodaj 50 fmol pożądanej inwenty, 50 fmol plazmidu akceptorowego, 1 μL buforu ligazy DNA 10x T4, 1 μL ligazy T4 oraz 1 μL BbsI. Dodaj wodę wolną od nukleazy do objętości 10 μL. Dodatkowo uwzględnij negatywną kontrolę z tą samą reakcją bez pożądanej inwentury.
   2. Uruchom następujący program w termocyklerze: 25 cykli po 37 °C przez 3 minuty (37 °C to optimalna temperatura enzymu restrykcyjnego) i 16 °C przez 4 minuty (16 °C to temperatura optymalna dla ligazy T4), po czym następuje końcowe trawienie w 50 °C przez 20 minut (w 50 °C), Ligaza T4 wykazuje bardzo niewielką lub żadną aktywność, podczas gdy enzym restrykcyjny nadal działa, co ogranicza ilość nieprzeciętego plazmidu akceptorowego w produkcie końcowym) oraz inaktywację cieplną enzymów w temperaturze 80 °C przez 20 minut (przy 80 °C wszystkie enzymy są inaktywowane ciepło i reakcja zostaje przerwana)^6.
   3. Przekształcić reakcję GG, dodając 5 μL reakcji GG do 50 μL chemicznie kompetentnych komórek E. coli i przeprowadzić transformację szokową z etapem odzyskiwania opisanym w wcześniej opublikowanym protokole¹⁵.
   4. Rozłóż 100 μL wyrostu transformacyjnego na płycie agarowej Luria-Bertani (LB) z 100 μg/mL spektromycyny. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.
   5. Porównaj efektywność transformacji kontroli ujemnej z całą grupą, licząc liczbę białych kolonii na obu płytach. Przechodź do kolejnego kroku, jeśli zgromadzenie ma około 10 razy (lub więcej) białych kolonii niż w kontroli ujemnej.
      UWAGA: Większość powstałych kolonii powinna być biała, z tylko niewielką częścią kolonii czerwonych. Plazmidy akceptorowe w zestawie narzędzi In-Cloning mają kasetę podwójnego wyboru, zawierającą albo mCherry (poziom 0 i poziom 1), albo LacZα (poziom M i poziom P), oraz gen ccdB kodujący inhibitor gyrazy. Transformacja reakcji GG odbywa się w komórkach E. coli wrażliwych na ccdB, dlatego mogą rosnąć tylko komórki z złożonym plazmidem, podczas gdy oryginalny plazmid akceptorowy nie może być propagowany. Przykładami szczepów wrażliwych na ccdB są DH5α i TOP10. mCherry/LacZα umożliwia wizualną identyfikację komórek uciekających z mechanizmu ccdB ¹⁶.
   6. Dla każdego zespołu uprawiaj dwie białe kolonie, zbierając część materiału z kolonii za pomocą pipety i zawieszając ją w 5 mL medium LB z 100 μg/mL spektromycyny każda, a następnie inkubuj przez noc w 37 °C w inkubatorze potrząsającym przy 250 obr./min. Wykonaj ekstrakcję plazmidową kolumną zgodnie z instrukcjami producenta. Zweryfikowaj, czy wyodrębniony plazmid ma oczekiwaną sekwencję za pomocą sekwencjonowania Sangera.

2. Poziom 1: Ustalanie pozycji

UWAGA: Poziom 1 to poziom pomiędzy udomowieniem części a złożeniem operonu policistronnego (Rysunek 2). Tutaj określa się pozycje zespołów pośrednich w końcowej konstrukcji. Pozycję zespołu poziomu 1 w operonie można zmienić, stosując inny plazmid akceptorowy poziomu 1. Przykład opisany opisuje montaż jednostki bistyktronicznej, ale dany schemat można łatwo dostosować do montażu do sześciu sekwencji kodujących (z każdym RBS). Składanie większej liczby sekwencji kodujących wymaga dodatkowo przełączania się między poziomem P a M. Podczas iteracyjnego cyklicznego cyklu między poziomem P a M nie ma stałego górnego limitu liczby sekwencji kodujących, które można złożyć w jeden operon.

1. Wybór części i plazmidów akceptorowych
   1. Wybierz części poziomu 0, które zostaną złożone w jednostkę transkrypcyjną. Co najmniej muszą one obejmować promotora, CDS i terminatora.
   2. Wybierz pozycję, w której jednostka transkrypcji powinna być złożona w operonie. Na podstawie tej pozycji wybierz odpowiedni plazmid akceptorowy. Przegląd przedstawiono na rysunku 2.
      UWAGA: 7 fragmentów DNA przeznaczonych do konstrukcji operonu bizystronicznego, pokazanych jako przykład, zostało złożonych w dwa konstrukty poziomu 1. Promotor, pierwszy RBS, pierwszy CDS oraz mostek terminatora są montowane w pSL68; drugi RBS, drugi CDS oraz terminator są składane w pSL69.
2. Reakcja GG
   1. Do reakcji GG dodaj 50 fmol każdej z pożądanych wstawek, 50 fmol plazmidu akceptorowego, 1 μL buforu ligazy DNA 10x T4, 1 μL ligazy T4 oraz 1 μL SapI. Dodaj wodę wolną od nukleazy do całkowitej objętości 10 μL.
   2. Uruchom następujący program w termocyklerze: 25 cykli 37 °C przez 3 minuty i 16 °C przez 4 minuty, następnie końcowe trawienie w 50 °C przez 20 minut oraz inaktywacja cieplna enzymów w 80 °C przez^{20 minut 6} minut.
   3. Opcjonalnie: Dodaj 0,5 μL SapI do reakcji GG i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
      UWAGA: SapI nie jest tak stabilny jak inne stosowane enzymy restrykcyjne typu IIS. Stwierdzono, że etap trawienia z użyciem SapI po reakcji GG zmniejsza liczbę kolonii przenoszących ponownie ligowany plazmid akceptorowy. SapI zawiera izoschizomer, BspQI, który może nie wymagać tego ostatniego etapu trawienia.
   4. Przekształcić 5 μL reakcji GG w 50 μL chemicznie kompetentnych komórek E. coli i przeprowadzić transformację termiczną, najlepiej z etapem odzyskiwania, jak w kroku 1.2.3.
   5. Płyta 100 μL wychodu przemiany na płytce agarowej LB z ampicyliną 100 μg/mL. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.
   6. Dla każdej z nich należy uprawiać dwie białe kolonie, zbierając część materiału z kolonii końcówką pipety i zawieszając ją ponownie w 5 mL podłoża LB z 100 μg/mL ampicyliny każda. Inkubuj przez noc w 37 °C w inkubatorze potrząsającym o 250 obr./min. Wykonaj ekstrakcję plazmidową kolumną zgodnie z instrukcjami producenta.
   7. Potwierdź poprawność montażu za pomocą digestu restrykcyjnego z BbsI, sprawdzając, czy rozmiar wycięcia odpowiada oczekiwanemu rozmiarowi wkładki. Trawić 1000 ng DNA plazmidowego, dodając 1 μL odpowiedniego buforu trawienia 10x oraz 1 μL BbsI. Dodaj wodę wolną od nukleazy do całkowitej objętości 10 μL. Inkubuj reakcję w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
   8. Wykonaj elektroforezę żelową, ładując strawiony plazmid na żel agarozowy o stężeniu 1%, a następnie uruchom żel na napięciu 100 V przez 35 minut.
      UWAGA: Można przeprowadzić in silico trawienie oczekiwanego plazmidu w celu symulacji żelu agarozowego i przewidzenia wyniku.

3. Poziom M: Montaż operonu policistronicznego

UWAGA: W tym etapie składany jest operon policistronny. W przedstawionym przypadku operonu bizystronicznego, dwa wkłady poziomu 1 są montowane na pozycjach 1 i 2. W związku z tym wybiera się akceptorowy plazmid pMA60. Ponadto wymagany jest link końcowy. Wszystkie plazmidy akceptorowe poziomu M i P mają nawis GGGA jako drugi przewis. Końcowe łączniki łączą wstawkę i plazmid akceptora oraz umożliwiają montaż konstrukcji poziomu P w poziomie M i odwrotnie. Dla zespołu poziomu P składającego się z dwóch wstawek poziomu 1 używany jest łącznik końcowy pMA668, który zajmuje trzecią i ostatnią pozycję. Przegląd poziomów M i P oraz wizualizacja etapu klonowania przedstawiono na Rysunku 3. Przy montażu wyłącznie na poziomie M (lub P) można sklonować operony do 6 sekwencji kodujących (pozycje 1-6). Pozycja 7 jest zajmowana przez końcowego łącznika. Możliwe jest złożenie większej liczby sekwencji kodujących w operonie, ale wymaga cyklicznego przejścia do poziomu M (lub P), który nie jest opisany w tym protokole.

1. Do reakcji GG dodaj 50 fmol każdej pożądanej insetki, 50 fmol plazmidu akceptorowego, 1 μL buforu ligazy DNA 10x T4, 1 μL ligazy T4 oraz 1 μL BbsI. Dodaj wodę wolną od nukleazy do całkowitej objętości 10 μL.
2. Uruchom następujący program w termocyklerze: 50 cykli 37 °C przez 3 minuty i 16 °C przez 4 minuty, następnie końcowe trawienie w 50 °C przez 20 minut i inaktywacja enzymów termiczną w 80 °C przez 20 minut⁶ minut.
3. Przekształcić 5 μL reakcji GG w 50 μL chemicznie kompetentnych komórek E. coli i przeprowadzić transformację szokową z etapem odzyskiwania, jak w kroku 1.2.3.
4. Rozproszyć 100 μL wyrastku transformacyjnego na płytkę agarową LB z 100 μg/mL spektromycyny. Inkubuj płytkę przez noc w 37 °C lub w 30 °C, jeśli spodziewasz się obciążenia metabolicznego lub toksyczności zespołu.
5. Dla każdego zgromadzenia stwórz kulturę z dwóch białych kolonii. W tym celu zanurz końcówkę pipety w kolonii i użyj jej do inokulacji 5 mL LB 100 μg/mL spektrinomycyny. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C lub 30 °C w inkubatorze potrząsającym przy 250 obr./min. Wykonaj ekstrakcję plazmidową kolumną zgodnie z instrukcjami producenta.
6. Potwierdź poprawne składanie za pomocą digestu restrykcyjnego z BsaI, sprawdzając, czy rozmiar wycięcia odpowiada oczekiwanemu rozmiarowi wkładki, jak wykonano w kroku 2.2.7.
   UWAGA: Konstrukcja może być zbyt długa, by potwierdzić ją sekwencjonowanie Sangera. Można to następnie potwierdzić za pomocą sekwencjonowania całego plazmidu, które jest dostępne jako komercyjna usługa od kilku dostawców usług sekwencjonowania.

Results

Tutaj przedstawiono wyniki oddolnego zespołu operonu policistronnego od poziomu 0 do poziomu M (rysunek S1). Operon inicjuje się od promotora_P-LuxB, który może być aktywowany przez białko LuxR w obecności związku induktorowego N-(β-ketokaproyl)-L-homoserynowego laktonu (OC6)¹⁷. GFP jest pierwszym CDS operonu, jego RBS to iGEM BBa_B0064. GFP następuje łącznik nieterminalny, zwany "mostkiem terminatora". Drugi RBS jest zaprojektowany przez kalkulator RBS^...

Discussion

Klonowanie molekularne może być czasochłonne i uciążliwe, zwłaszcza przy strategiach ad hoc klonowania. Zestawy narzędzi MoClo mogą poprawić klonowanie molekularne dzięki swojej modułowości, hierarchicznemu montażowi oraz wysoce wydajnym reakcjom w jednym garnku. Polegają na montażu DNA poprzez reakcje Golden Gate. Dzięki standaryzowanym zwisom biblioteki części molekularnych mogą być ponownie wykorzystywane i udostępniane innym ^3,6. Wielokrotne używanie...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicylina	Merck Life Science	A9518
Agar bakteryjny	Fisher Scientific	P0011B
BbsI-HF	New England Biolabs	R3539
BsaI-HF V2	New England Biolabs	R3733
E. coli DH5α Komórki kompetentne
Eppendorf  Mastercycler  Nexus Thermal Cyclers	Eppendorf	6333000014
Spektrofotometr mikroobjętościowy EzDrop 1000	Blue-Ray Biotech	BRED-1000
Miniprep GeneJET Plazmid Miniprep	Thermo Scientific	K0503
In- & Out- Zestaw narzędzi do klonowania
Bufor ligazowy	New England Biolabs	B0216
NaCl	Fisher Scientific	BP358
New Brunswick Innova®   42/42R - Układany inkubator shaker	Eppendorf	M1335-0080
PhenoBooth+	Instrumenty śpiewane	PHB-007
SapI	New England Biolabs	R0569
Spektromycyna	Merck Life Science	S4014
Standardowe naczynia laboratoryjne
Ligaza DNA T4	New England Biolabs	M0202
Thermomix MM	B. Braun Biotech International
Trypton	Fisher Scientific	LP0042B
Ekstrakt drożdżowy	Fisher Scientific	LP0021B