Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kompleksowa analiza płytek krwi prokoagulantów wykazujących cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68116

⸱

23 maja 2025

 , 
1Department of Cardiovascular and Metabolic Sciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Taussig Cancer Institute, Cleveland Clinic

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół dostarcza obszerny zestaw procedur niezbędnych do analizy prokoagulacyjnych płytek krwi, które wykazują nakładające się cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi.

Streszczenie

Płytki krwi krążące w krwiobiegu są względnie spokojne, ale stają się "aktywowane" po napotkaniu stymulantów lub "agonistów" w miejscu uszkodzenia naczynia krwionośnego. Proagregacyjne i prokoagulacyjne płytki krwi reprezentują dwie odrębne populacje aktywowanych płytek krwi. Podczas gdy proagregacyjne płytki krwi ułatwiają zatrzymanie krwawienia lub "hemostazy", tworząc czop płytek krwi zlepionych ze sobą za pomocą mostków fibrynogenu, płytki krwi prokoagulacyjne dramatycznie przyspieszają kaskadę krzepnięcia, której kulminacją jest tworzenie się skrzepów fibryny. Interesującym aspektem prokoagulacyjnych płytek krwi jest to, że ich morfologia wykazuje pewne cechy "martwicy" i "apoptozy". Mogą zatem stanowić formę śmierci komórek w płytkach krwi, aczkolwiek odgrywają ważną rolę w zakrzepicy i hemostazie. W artykule przedstawiono pojęcie prokoagulacyjnych płytek krwi, ich znaczenie dla zdrowia i choroby oraz porównanie istniejących metod ich analizy. Następnie dostarcza kompleksowych protokołów do analizy prokoagulacyjnych płytek krwi, badania mechanizmów ich powstawania i oceny ich prozakrzepowej roli w ułatwianiu krzepnięcia. Artykuł kończy się omówieniem kluczowych kroków, ograniczeń i zasad rozwiązywania problemów dla opisanych metod.

Wprowadzenie

Istnieją co najmniej dwie odrębne populacje aktywowanych płytek krwi1,2. Proagregacyjne płytki krwi charakteryzują się wysoką aktywacją integryn i niską, jeśli w ogóle, ekspozycją na PS. Z drugiej strony, płytki krwi prokoagulacyjne charakteryzują się niską aktywnością integryny i wysoką ekspozycją na PS1,2, zapewniając powierzchnię do składania kompleksów tenazy i protrombinazy3, która jest odpowiednio 105-10 6-krotnie i 300000-krotnie bardziej aktywna niż indywidualny rozpuszczalny czynnik fazowy IXa i Xa4. W ten sposób prokoagulanty znacznie przyspieszają krzepliwość. Interesującym aspektem prokoagulacyjnych płytek krwi jest to, że ich morfologia przypomina pewne cechy "martwicy", takie jak mikropęcherzyki, balonowanie komórki z rozerwaniem cytoszkieletu i utrata integralności błony, a także cechy "apoptozy", takie jak utrata asymetrii fosfolipidów błonowych z ekspozycją na fosfatydyloserynę w ulotce zewnętrznej5, 6. Innymi słowy, prokoagulacyjne tworzenie się płytek krwi może reprezentować formę śmierci komórki w płytkach krwi, aczkolwiek z ważną funkcją fizjologiczną w hemostazie.

Płytki krwi prokoagulacyjne są znacząco związane z zaburzeniami zakrzepowymi. Podczas gdy większość zdrowych osób nie ma krążących prokoagulacyjnych płytek krwi, ~ 30% normalnych płytek krwi dawcy przyjmuje fenotyp prokoagulacyjny ex vivo po ekspozycji na silnych agonistów, takich jak trombina i kolagen7. Krążące prokoagulacyjne płytki krwi były zgłaszane w urazach, gdzie ich tworzenie może odzwierciedlać aktywację przez histon H48,9. Jednak w większości zaburzeń prozakrzepowych zwiększone poziomy prokoagulacyjnych płytek krwi są wykrywane dopiero po stymulacji ex vivo10. Na przykład pacjenci z ostrym udarem mózgu, u których >51,1% płytek krwi zostało przekształconych w płytki krwi proagulacyjne (znane również jako płytki krwi COATed) przez kolagen i trombinę, mieli współczynnik ryzyka nawrotu udaru wynoszący 10,72 w ciągu 30 dni w porównaniu z pacjentami z mniejszym tworzeniem się płytek krwi prokoagulant11. Podobne wyniki uzyskano u pacjentów z przemijającymi atakami niedokrwiennymi i miażdżycą tętnic szyjnych12. Natomiast zaburzenie krzepnięcia Zespół Scotta wynika z mutacji ANO6, która koduje scramblazę fosfolipidową TMEM-16F, prowadząc do niedostatecznej ekspozycji na PS płytek krwi13. Idiopatyczne zaburzenia krzepnięcia krwi i krwawienia wewnątrzczaszkowe mogą być związane ze zmniejszoną zdolnością do wytwarzania proagulacyjnych płytek krwi14.

Stąd, ocena prokoagulacyjnych płytek krwi jest częścią analizy funkcji płytek krwi nie tylko podczas podstawowych badań nad mechanizmami aktywacji płytek krwi i w konsekwencji zakrzepicy i hemostazy, ale także podczas analizy klinicznej ryzyka zakrzepicy lub krwawienia u pacjentów w różnych stanach patologicznych. Panel Międzynarodowego Towarzystwa Zakrzepicy i Hemostazy (ISTH) zalecił stosowanie wiązania aneksyny V i ekspresji selektyny P za pomocą cytometrii przepływowej w celu odróżnienia prokoagulantów od innych subpopulacji płytek krwi15. W artykule omówiono również różne metody, które można wykorzystać do analizy płytek krwi prokoagulujących i apoptotycznych, ale nie opisano ich szczegółowo. Metody te obejmują wykrywanie (1) aktywacji płytek krwi przez PAC1/JonA lub wiązanie fibrynogenu (cytometria przepływowa); (2) wydzielanie alfa-granulek przez ekspresję selektyny P (cytometria przepływowa); (3) Narażenie na PS przez wiązanie aneksyny V z laktadheryną (cytometria przepływowa); (4) utrata integralności błony w wyniku znakowania GSAO (cytometria przepływowa); (5) zmiany morfologiczne, takie jak balonowanie (mikroskopia); (6) wykrywanie aktywacji kaspazy za pomocą testu kaspazy (immunoblotting/luminometria/cytometria przepływowa) lub degradacji substratu cytoszkieletu żelsoliny (immunoblotting); (7) utrata potencjału błony mitochondrialnej przez barwniki wrażliwe na potencjał mitochondriów, takie jak JC-1/Mitotracker (cytometria przepływowa); (8) mitochondrialne wewnętrzne markery apoptozy Bax, Bak i uwalnianie cytochromu c (immunoblotting); (9) funkcja prokoagulacji za pomocą testu wytwarzania trombiny i wiązania czynnika krzepnięcia Xa/Va (cytometria przepływowa, mikroskopia); (10) Cytozolowy i mitochondrialny wzrost wapnia za pomocą fluorescencyjnych barwników wrażliwych na wapń (cytometria przepływowa, fluorometria, mikroskopia).

Niniejsze badanie zagłębia się w kompleksowe protokoły analizy płytek krwi proagulant, jak również odróżnia je od płytek proagregacyjnych i apoptotycznych. Większość opisanych procedur opiera się na cytometrii przepływowej, która ma zalety (1) jest łatwo dostępna i łatwa w użyciu, (2) wymaga małej objętości próbki oraz (3) umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu subpopulacji płytek krwi (proagregacyjnych, prokoagulacyjnych i apoptotycznych)15. Te protokoły oparte na cytometrii przepływowej są uzupełnione funkcjonalnymi testami aktywności prokoagulacyjnej opartymi na testach wiązania czynnika krzepnięcia i testach wytwarzania trombiny na podstawie skrzepów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ludzcy uczestnicy zostali zrekrutowani do badania w celu pobrania krwi z żył obwodowych po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody, ściśle przestrzegając zaleceń i zgody Institutional Review Board of Cleveland Clinic Lerner Research Institute, przy czym wszystkie metodologie badań były zgodne ze standardami określonymi w Deklaracji Helsińskiej. Uwzględniono zdrowych dorosłych uczestników w wieku powyżej 18 lat, podczas gdy osoby poniżej 18 roku życia, osoby z niedawną historią zdarzeń zakrzepowych w ciągu ostatnich sześciu miesięcy, osoby z historią alkoholizmu lub nadużywania narkotyków oraz uczestnicy, którzy stosowali leki przeciwpłytkowe lub przeciwzakrzepowe w ciągu ostatnich czterech tygodni, zostali wykluczeni. Szczegółowy opis materiałów i odczynników użytych w protokołach znajduje się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie płytek krwi

  1. Pobrać próbki krwi z żył obwodowych do antykoagulantu ACD (1:9 v/v) od ludzi po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody, ściśle przestrzegając zaleceń zatwierdzonych przez Institutional Review Board.
  2. Odwirować krew zebraną w ACD w stężeniu 100 x g przez 20 minut w temperaturze 22 °C w celu uzyskania osocza bogatopłytkowego (PRP) jako supernatantu.
  3. Odwirować PRP przy 800 x g przez 7 minut w temperaturze 22 °C po dodaniu 3 μM PGE1 i 2 mM EDTA.
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad płytek krwi w buforze A (patrz tabela materiałów) przez delikatne pipetowanie.
  5. Odwirować płytki krwi zawieszone w buforze A o stężeniu 800 x g przez 7 minut w temperaturze 22 °C.
  6. Zawiesić osad płytek krwi w buforze B (patrz tabela materiałów) przez delikatne pipetowanie.
  7. Dostosuj końcową liczbę płytek krwi do 1 × 107/ml za pomocą automatycznego licznika komórek.
    UWAGA: Wszystkie czynności należy wykonywać w sterylnych warunkach i należy podjąć środki ostrożności w celu utrzymania płytek krwi w stanie spoczynku, unikając narażenia na nadmierne ścinanie podczas pipetowania.

2. Analiza prokoagulantów płytek krwi za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Uzupełnij umyte ludzkie płytki krwi 2,5 mM wapnia (0,5 μl podstawowego roztworu CaCl2 0,5 M w 100 μl zawiesiny płytek krwi).
  2. Utrzymuj jedną frakcję płytek krwi niestymulowaną, a pozostałe frakcje stymuluj trombiną (0,1 U/ml, 0,25 U/ml, 0,5 U/ml), kondroksyną (20 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/ml) lub ich kombinacją przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Po stymulacji dodać po 1 μl PE-aneksyny V, FITC-PAC1 i APC-przeciwciała anty-ludzkiego CD62P do 100 μl stymulowanych zawiesin płytkowych.
  4. Płytki krwi inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  5. Utrwalić płytki krwi, dodając równą objętość (1:1) 2% formaliny.
  6. Przeanalizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej, aby określić ilościowo płytki krwi prokoagulantu15,16.
  7. Narysuj amorficzną bramę, która obejmie płytki krwi, oddzielając je od szumu i cząstek wielopłytkowych.
  8. Zbierz wszystkie dane dotyczące fluorescencji za pomocą czterokwadrantowej amplifikacji logarytmicznej dla 10 000 zdarzeń w bramce płytek krwi z każdej próbki.
  9. Zdefiniuj regiony dla płytek krwi na podstawie dodatniej lub ujemnej fluorescencji dla ekspozycji na fosfatydyloserynę (PS) (wiązanie Aneksyny V), ekspresji selektyny P (CD62P) i aktywacji integryny αIIbβ3 (wiązanie PAC1).
  10. Rozważ płytki krwi dodatnie zarówno dla ekspozycji PS (wiązanie aneksyny V), jak i ekspresji selektyny P (CD62P), ale ujemne dla aktywacji integryny αIIbβ3 (wiązanie PAC1) jako prokoagulantów płytek krwi (Figura 1) (Tabela 1).
  11. Podobnie, rozważ płytki krwi dodatnie zarówno dla aktywacji integryny αIIbβ3 (wiązanie PAC1) i ekspresji selektyny P (CD62P), ale ujemne dla ekspozycji na PS (wiązanie Aneksyny V) jako proagregacyjne płytki krwi.
    UWAGA: Płytki krwi ujemne zarówno dla aktywacji integryny αIIbβ3 (wiązanie PAC1), jak i ekspresji selektyny P (CD62P), ale dodatnie dla ekspozycji PS (wiązanie Aneksyny V) to prawdopodobnie apoptotyczne płytki krwi15,16.

3. Analiza mitochondrialnego wapnia metodą cytometrii przepływowej

  1. Rozcieńczyć przemyte ludzkie płytki krwi do 1 × 106/ml i uzupełnić 2,5 mM wapnia (0,5 μl podstawowego roztworu CaCl2 0,5 M w 100 μl zawiesiny płytek krwi).
  2. Oznacz płytki krwi 5 μM Rhod-2 AM (dla mitochondrialnego wapnia) przez 30 minut w ciemności.
  3. Odpowiednio dobierać płytki krwi, jak opisano w kroku 2.
  4. Analizuj zdarzenia w bramce płytek krwi pod kątem zależnych od czasu zmian średniej fluorescencji nabytych zdarzeń w ciągu 5 minut, używając wykresu rozproszenia gęstości fluorescencji PE (dla Rhod-2 AM) w funkcji czasu.
  5. Zapisuj wyjściowy poziom wapnia przez pierwsze 1 minutę.
  6. Dodaj trombinę (0,1 U/ml, 0,25 U/ml lub 0,5 U/ml), kondroksynę (20 ng/mL, 50 ng/ml lub 100 ng/ml) lub ich kombinację i kontynuuj zbieranie danych dla kolejnych 4 min17.

4. Analiza potencjału błony mitochondrialnej metodą cytometrii przepływowej

  1. Uzupełnij umyte ludzkie płytki krwi 2,5 mM wapnia (0,5 μl podstawowego roztworu CaCl2 0,5 M w 100 μl zawiesiny płytek krwi).
  2. Utrzymuj jedną frakcję płytek krwi niestymulowaną, a pozostałe frakcje stymuluj trombiną (0,1 U/ml, 0,25 U/ml lub 0,5 U/ml), kondroksyną (20 ng/mL, 50 ng/ml lub 100 ng/ml) lub ich kombinacją przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Po stymulacji do stymulowanych zawiesin płytek krwi dodać barwnik znakujący mitochondria (patrz tabela materiałów) o końcowym stężeniu 500 nM.
  4. Inkubuj płytki krwi przez 30 minut w ciemności.
  5. Utrwal płytki krwi, dodając równą objętość 2% formaliny.
  6. Analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej17.
  7. Odpowiednio dobierać płytki krwi zgodnie z opisem w kroku 2.
  8. Analizuj zdarzenia w bramce płytek krwi pod kątem spadku fluorescencji w kanale PE (dla barwnika znakującego mitochondria) cytometru przepływowego.

5. Analiza aktywności kaspazy 3 i kaspazy 8 za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Uzupełnij umyte ludzkie płytki krwi 2,5 mM wapnia (0,5 μl podstawowego roztworu CaCl2 0,5 M w 100 μl zawiesiny płytek krwi).
  2. Utrzymuj jedną frakcję płytek krwi niestymulowaną, a pozostałe frakcje stymuluj trombiną (0,1 U/ml, 0,25 U/ml lub 0,5 U/ml), kondroksyną (20 ng/mL, 50 ng/ml lub 100 ng/ml) lub ich kombinacją przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Po stymulacji dodać odczynnik do wykrywania apoptozy w proporcji 1:1000 (v/v) (patrz tabela materiałów) (zarówno dla wewnętrznych, jak i zewnętrznych szlaków apoptozy) lub 1:300 (v/v) FITC-IETD-FMK (dla kaspazy 8 zewnętrznego szlaku apoptozy) do stymulowanych zawiesin płytek krwi.
  4. Inkubuj płytki krwi przez 30 minut w ciemności.
  5. Utrwal płytki krwi, dodając równą objętość 2% formaliny.
  6. Analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej17.
  7. Odpowiednio dobierać płytki krwi, jak opisano w kroku 2.
  8. Analizuj zdarzenia w bramce płytek krwi pod kątem fluorescencji w kanale FITC (dla kaspazy 3/7 lub kaspazy 8) cytometru przepływowego.

6. Analiza wiązania protrombiny za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Sprzęż bydlęcą protrombinę z barwnikiem Alexa Fluor 488 za pomocą zestawu do znakowania białek (patrz tabela materiałów), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Uzupełnić umyte płytki krwi ludzkiej 2,5 mM wapnia (0,5 μL podstawowego roztworu CaCl2 0,5 M w 100 μl zawiesiny płytek krwi).
  3. Utrzymuj jedną frakcję płytek krwi niestymulowaną, a pozostałe frakcje stymuluj trombiną (0,1 U/ml, 0,25 U/ml lub 0,5 U/ml), kondroksyną (20 ng/mL, 50 ng/ml lub 100 ng/ml) lub ich kombinacją przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Po stymulacji dodać sprzężoną z AF488 bydlęcą protrombinę (100 μg/ml) i po 1 μl przeciwciała anty-ludzkiego CD62P PE-aneksyny V i APC do 100 μl stymulowanych zawiesin płytek krwi.
  5. Utrwal płytki krwi, dodając równą objętość 2% formaliny.
  6. Analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej17 w celu ilościowego określenia wiązania protrombiny z płytkami krwi
    7. .
  7. Narysuj bramę amorficzną, która obejmie płytki krwi oddzielone od szumu i cząstek wielopłytkowych.
  8. Zbierz wszystkie dane dotyczące fluorescencji za pomocą czterokwadrantowej amplifikacji logarytmicznej dla 10 000 zdarzeń w bramce płytek krwi z każdej próbki.
  9. Narysuj obszary dla płytek krwi z fluorescencją dodatnią lub ujemną dla ekspozycji na PS (wiązanie Aneksyny V), ekspresji selektyny P (CD62P) i protrombiny AF488 (wiązanie protrombiny).
  10. Określ proporcję wszystkich zdarzeń związanych z płytkami krwi, a także odsetek płytek krwi dodatnich zarówno dla ekspozycji PS (wiązanie aneksyny V), jak i ekspresji selektyny P (CD62P) (płytki prokoagulacji), które są dodatnie dla wiązania protrombiny.

7. Analiza wiązania protrombiny za pomocą mikroskopii konfokalnej

  1. Sprzęż bydlęcą protrombinę z barwnikiem Alexa Fluor 488 za pomocą zestawu do znakowania białek (patrz tabela materiałów), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Uzupełnić umyte płytki krwi ludzkiej 2,5 mM wapnia (0,5 μL podstawowego roztworu CaCl2 0,5 M w 100 μl zawiesiny płytek krwi).
  3. Utrzymuj jedną frakcję płytek krwi niestymulowaną, a pozostałe frakcje stymuluj trombiną (0,1 U/ml, 0,25 U/ml lub 0,5 U/ml), kondroksyną (20 ng/mL, 50 ng/ml lub 100 ng/ml) lub ich kombinacją przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Po stymulacji dodać sprzężoną z AF488 bydlęcą protrombinę (100 μg/ml) i po 1 μl przeciwciała anty-ludzkiego CD62P PE-aneksyny V i APC do 100 μl stymulowanych zawiesin płytek krwi.
  5. Utrwal płytki krwi, dodając równą objętość 2% formaliny.
  6. Utrwalone płytki krwi umieścić na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną.
  7. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą roztworu zapobiegającego blaknięciu.
  8. Alternatywnie, powlekaj szkiełka nakrywkowe kolagenem (100 μg/ml) przez 1 godzinę w wilgotnej komorze.
  9. Zablokować powlekane szkiełka nakrywkowe 0,5% BSA w PBS na 1 godzinę.
  10. Oznaczyć płytki krwi protrombiną bydlęcą sprzężoną z AF488 (100 μg/ml) i po 1 μl PE-aneksyny V i przeciwciała anty-ludzkiego CD62P APC.
  11. Pozostaw oznakowane płytki krwi do przylegania przez 20 minut do szkiełek nakrywkowych pokrytych kolagenem.
  12. Szkiełka nakrywkowe z przylegającymi płytkami krwi przemyć trzykrotnie PBS.
  13. Utrwal szkiełka nakrywkowe 2% paraformaldehydem przez 1 godzinę.
  14. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą roztworu zapobiegającego blaknięciu.
  15. Obserwuj szkiełka pod mikroskopem konfokalnym przy powiększeniu obiektywu 63×.
  16. Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania Fiji do ilościowego oznaczania fluorescencji.

8. Test wytwarzania trombiny zależny od fosfolipidów płytek krwi na podstawie skrzepów

  1. Uzupełnij umyte ludzkie płytki krwi 2,5 mM wapnia (0,5 μl podstawowego roztworu CaCl2 0,5 M w 100 μl zawiesiny płytek krwi).
  2. Utrzymuj jedną frakcję płytek krwi niestymulowaną, a pozostałe frakcje stymuluj trombiną (0,1 U/ml, 0,25 U/ml lub 0,5 U/ml), kondroksyną (20 ng/mL, 50 ng/ml lub 100 ng/ml) lub ich kombinacją przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Dodać 100 μl poddanych działaniu substancji płytek krwi do mieszaniny 50 μl zebranego normalnego osocza i 50 μl roztworu kaolinu o niskim zmętnieniu (20 mg/ml), wstępnie inkubowanego w temperaturze 37 °C przez 5 min.
  4. Dodać 5 mM CaCl2 do mieszaniny.
  5. Monitorować tworzenie się skrzepów za pomocą zmętnienia na czytniku mikropłytek, mierząc absorbancję przy 660 nm co 60 s przez 1 godzinę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Część aktywowanych płytek krwi staje się „prokoagulacyjna”, co objawia się charakterystycznym wzrostem ekspresji powierzchniowej fosfatydyloseryny (PS) oraz P-selektyny; odróżnia to te płytki od płytek „apoptotycznych”, które wykazują jedynie ekspozycję PS, a także od płytek „proagregacyjnych”, które są dodatnie pod kątem ekspresji P-selektyny. Stwierdzono, że trombina indukuje zależny od dawki wzrost proporcji płytek prokoagulacyjnych wykazujących ekspresję zarówno P-selektyny, jak i PS, co wykryto odpowiednio poprzez w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Prokoagulanty płytek krwi wykazują wyraźny i trwały wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia po stymulacji26, ale mogą być uzyskiwane przez różne mechanizmy. Są one generowane w wyniku silnej stymulacji agonistycznej kolagenem i trombiną przez odrębne mediatory, w tym przede wszystkim mitochondrialny napływ wapnia18,19 wzdłuż gradientu elektrochemicznego przez wewnętrzną błonę mitochondrialną po indukowanym przez agonistów cytozolowym wzroście wa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają sprzecznych interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Paresh P. Kulkarni i Keith R. McCrae, odpowiednio, dziękują za stypendium i pilota ufundowane przez VeloSano, Cleveland Clinic Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór kwaśnego cytrynianu dekstrozy (ACD) (na 1000 ml)Cytrynian tri-sodu-                     22 g
Kwas cytrynowy-                                                    8 g
Dekstroza-                                                          24,5 g
Woda-                                                                    Uzupełnić objętość do 1000 ml 
Zestaw do znakowania białek Alexa Fluor 488InvitrogenA10235
APC Mysz Anti-Human CD62PBD Pharmingen550888
Bydlęca protrombinaProlytixBCP-1010
Bufor A (preparat płytek krwi)                                      M.W                Połączenie w 1X          Na 100 ml roztworu 10X
HEPES              238.30                20 mM                                      4.766 g
NaCl                          58.44            134 mM                                    7.83 g
KCl                              74.55              2,9 mM                            216,19 mg
MgCl2                  203.30                    1 mM                          203,30 mg
NaH2PO4      156.01              0,34 mM                              53,04 mg
NaHCO3              84 01                    12 mM                     1,01 g
Woda do 100 ml po dostosowaniu pH do 6,2

Rozcieńczyć roztwór 10X w stosunku 1:10 (v/v) wodą Milli Q tuż przed przygotowaniem płytek krwi, aby uzyskać roztwór 1X, który należy uzupełnić następującymi
                                Połączenie w 1X          Na 1 ml 1X roztwór
EGTA                   1 mM           Dodaj 10 μ L (1:100 v/v) 100 mM EGTA 
Glukoza               5 mM         Dodaj 5 μ L (1:200 v/v) 1 M glukoza
PGE1                     3 μ M         Dodaj 3 μ L (1:333 v/v) 1 mM PGE1
roztwór Bufor B (preparat płytek krwi)                                      M.W                Połączenie w 1X          Na 100 ml roztworu 10X
HEPES              238.30                20 mM                                      4.766 g
NaCl                          58.44            134 mM                                    7.83 g
KCl                              74.55              2,9 mM                            216,19 mg
MgCl2                  203.30                    1 mM                          203,30 mg
NaH2PO4      156.01              0,34 mM                              53,04 mg
NaHCO3              84 01                    12 mM                     1,01 g
Woda do 100 ml po dostosowaniu pH do 7,4

Rozcieńczyć roztwór 10X w stosunku 1:10 (v/v) wodą Milli Q tuż przed przygotowaniem płytek krwi, aby uzyskać roztwór 1X, który należy uzupełnić następującymi
                                Połączenie w 1X          Na 1 ml 1X roztwór
Glukoza               5 mM         Dodaj 5 μ L (1:200 v/v) 1 M glukozy 
CaCl2 (0,5 M) (na 50 ml)Masa cząsteczkowa CaCl2,2H2O = 147,02
Rozpuść 3,675 g CaCl2,2H2O w 50 ml Odczynniki do wykrywania kaspazy Milli Q
CellEvent CellEvent-3/7InvitrogenC10423Odczynnik do wykrywania apoptozy
ConvulxinEnzo Life SciencesALX-350-100
EDTA (0,5 M; pH 8) (Na 100 ml)Masa cząsteczkowa EDTA Na2.2H2 O: 372,24 g
Zważyć 18,612 g i zawiesić w 50 ml wody Milli Q i sprawdzić pH (pH ~ 4)
Powoli dodawać 10 N NaOH mieszając i monitorować pH.
EDTA zaczyna rozpuszczać się przy pH około 7 i jest całkowicie rozpuszczalny przy pH 8,
Uzupełnić objętość do 100 ml wodą Milli Q.
EGTA (100 mM; pH 7,4) (dla 100 ml)Masa cząsteczkowa: 380,4
Dodaj 3,804 g EGTA do 50 ml wody Milli Q i sprawdź pH (pH~3)
Mieszając kroplami dodawać 10 N NaOH i monitorować pH
EGTA staje się rozpuszczalna przy pH 7,0 (w przybliżeniu)
Dostosuj pH do 7,4
Uzupełnij objętość do 100 ml wodą
Milli QFITC Mysz Anti-Human PAC-1BD340507
FITC-IETD-FMK Zestaw do barwienia kaspazy 8 (aktywny)Abcamab65614
Mitotracker Red CMXRos (barwnik do etykietowania mitochindria)InvitrogenM7512Stock= 1 mM (50 &mikro; g rozpuszczony w 90 &mikro; l DMSO)
Zapas podrzędny = 100 &mikro; M (10 &mikro; l Zapas + 90 i mikro; l DMSO)
Stężenie robocze = 500nM (0,5 &mikro; l w 100 i mikro; l)
PE Aneksyna VBD Pharmingen560930
Prostaglandyna E1SigmaP5515Stock = 20 mM (1 mg rozpuszczony w 141 &mikro; L DMSO)
Zapas podrzędny = 1 mM (10 &mikro; l Zapas + 190 i mikro; L DMSO)
Stężenie robocze = 3 &mikro; M (3 i mikro; L w 1 ml)
Rhod-2 AMInvitrogenR1244Stock= 5 mM (1 mg rozpuszczony w 178 &mikro; L DMSO)
Zapas podrzędny = 100 &mikro; M (10 &mikro; L Zapas + 90 &mikro; L DMSO)
Stężenie robocze = 500 nM (0,5 &mikro; L w 100 i mikro; L)
Trombina z ludzkiego osoczaSigmaT7572
Green

Bibliografia

  1. Munnix, I., Cosemans, J., Auger, J., Heemskerk, J. Platelet response heterogeneity in thrombus formation. Thromb Haemost. 102 (12), 1149-1156 (2009).
  2. Heemskerk, J. W. M., Mattheij, N. J. A., Cosemans, J. M. E. M. Platelet-based coagulation: Different populations, different functions. J Thromb Haemost. 11 (1), 2-16 (2013).
  3. Podoplelova, N. A., et al. Coagulation factors bound to procoagulant platelets concentrate in cap structures to promote clotting. Blood. 128 (13), 1745-1755 (2016).
  4. Mann, K. G., Butenas, S., Brummel, K. The dynamics of thrombin formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (1), 17-25 (2003).
  5. Jackson, S. P., Schoenwaelder, S. M. Procoagulant platelets: Are they necrotic. Blood. 116 (12), 2011-2018 (2010).
  6. Hua Vivien Mun Yee, V. M. C. Procoagulant platelets and the pathways leading to cell death. Semin Thromb Hemost. 41 (04), 405-412 (2015).
  7. Dale, G. L. Coated-platelets: An emerging component of the procoagulant response. J Thromb Haemost. 3 (10), 2185-2192 (2005).
  8. Vulliamy, P., Armstrong, P. C. Platelets in hemostasis, thrombosis, and inflammation after major trauma. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (3), 545-557 (2024).
  9. Vulliamy, P., et al. Histone H4 induces platelet ballooning and microparticle release during trauma hemorrhage. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (35), 17444-17449 (2019).
  10. Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Zermatten, M. G., Marchetti, M., Alberio, L. Thrombocytopathies: Not just aggregation defects-the clinical relevance of procoagulant platelets. J Clin Med. 10 (5), 894(2021).
  11. Kirkpatrick, A. C., Vincent, A. S., Dale, G. L., Prodan, C. I. Coated platelets predict stroke at 30 days following TIA. Neurology. 89 (2), 125-128 (2017).
  12. Kirkpatrick, A. C., Tafur, A. J., Vincent, A. S., Dale, G. L., Prodan, C. I. Coated platelets improve prediction of stroke and transient ischemic attack in asymptomatic internal carotid artery stenosis. Stroke. 45 (10), 2995-3001 (2014).
  13. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  14. Prodan, C. I., Vincent, A. S., Dale, G. L. Coated platelet levels correlate with bleed volume in patients with spontaneous intracerebral hemorrhage. Stroke. 41 (6), 1301-1303 (2010).
  15. Josefsson, E. C., et al. Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: Communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  16. Kulkarni, P. P., Sonkar, V. K., Gautam, D., Dash, D. AMPK inhibition protects against arterial thrombosis while sparing hemostasis through differential modulation of platelet responses. Thromb Res. 196, 175-185 (2020).
  17. Ekhlak, M., et al. Necroptosis executioner MLKL plays pivotal roles in agonist-induced platelet prothrombotic responses and lytic cell death in a temporal order. Cell Death Differ. 30 (8), 1886-1899 (2023).
  18. Kholmukhamedov, A., Janecke, R., Choo, H. -J., Jobe, S. M. The mitochondrial calcium uniporter regulates procoagulant platelet formation. J Thromb Haemost. 16 (11), 2315-2321 (2018).
  19. Choo, H. -J., Saafir, T. B., Mkumba, L., Wagner, M. B., Jobe, S. M. Mitochondrial calcium and reactive oxygen species regulate agonist-initiated platelet phosphatidylserine exposure. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (12), 2946-2955 (2012).
  20. Jobe, S. M., et al. Critical role for the mitochondrial permeability transition pore and cyclophilin D in platelet activation and thrombosis. Blood. 111 (3), 1257-1265 (2008).
  21. Leytin, V., Allen, D. J., Mykhaylov, S., Lyubimov, E., Freedman, J. Thrombin-triggered platelet apoptosis. J Thromb Haemost. 4 (12), 2656-2663 (2006).
  22. Lopez, J. J., Salido, G. M., Pariente, J. A., Rosado, J. A. Thrombin induces activation and translocation of Bid, Bax and Bak to the mitochondria in human platelets. J Thromb Haemost. 6 (10), 1780-1788 (2008).
  23. Wolf, B. B., et al. Calpain functions in a caspase-independent manner to promote apoptosis-like events during platelet activation. Blood. 94 (5), 1683-1692 (1999).
  24. Kim, O. V., et al. Fatal dysfunction and disintegration of thrombin-stimulated platelets. Haematologica. 104 (9), 1866-1878 (2019).
  25. Schoenwaelder, S. M., et al. Two distinct pathways regulate platelet phosphatidylserine exposure and procoagulant function. Blood. 114 (3), 663-666 (2009).
  26. Abbasian, N., Millington-Burgess, S. L., Chabra, S., Malcor, J. -D., Harper, M. T. Supramaximal calcium signaling triggers procoagulant platelet formation. Blood Adv. 4 (1), 154-164 (2020).
  27. Le, T., et al. An inner activation gate controls TMEM16F phospholipid scrambling. Nat Commun. 10 (1), 1846(2019).
  28. Yang, H., et al. TMEM16F forms a Ca2+-activated cation channel required for lipid scrambling in platelets during blood coagulation. Cell. 151 (1), 111-122 (2012).
  29. Mattheij, N. J. A., et al. Dual mechanism of integrin closure in procoagulant platelets. J Biol Chem. 288 (19), 13325-13336 (2013).
  30. Liu, F., et al. Mitochondrially mediated integrin αiIbβ3 protein inactivation limits thrombus growth. J Biol Chem. 288 (42), 30672-30681 (2013).
  31. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  32. Goelz, N., et al. Platelets express adaptor proteins of the extrinsic apoptosis pathway and can activate caspase-8. PLOS ONE. 16 (1), e0244848(2021).
  33. Shlomovitz, I., Speir, M., Gerlic, M. Flipping the dogma - phosphatidylserine in non-apoptotic cell death. Cell Commun Signal. 17 (1), 139(2019).
  34. Nadine, J. A. M., et al. Coated platelets function in platelet-dependent fibrin formation via integrin αIIbβ3 and transglutaminase factor XIII. Haematologica. 101 (4), 427-436 (2016).
  35. Michelson, A. D. Platelet activation by thrombin can be directly measured in whole blood through the use of the peptide GPRP and flow cytometry: Methods and clinical applications. Blood Coagul Fibrinolysis. 5 (1), 121-131 (1994).
  36. Taylor, M. R., Couto, J. R., Scallan, C. D., Ceriani, R. L., Peterson, J. A. Lactadherin (formerly BA46), a membrane-associated glycoprotein expressed in human milk and breast carcinomas, promotes Arg-Gly-Asp (RGD)-dependent cell adhesion. DNA Cell Biol. 16 (7), 861-869 (1997).
  37. Andersen, M. H., Graversen, H., Fedosov, S. N., Petersen, T. E., Rasmussen, J. T. Functional analyses of two cellular binding domains of bovine lactadherin. Biochemistry. 39 (20), 6200-6206 (2000).
  38. Tan, C. W., Bourcy, M., Pasalic, L., Chen, V. M. Flow cytometry assessment of procoagulant platelets using a dithiol-reactive probe functional disulfide bonds: Methods and protocols. Methods Mol Biol. 1967, 305-321 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nekroza płytek krwiApoptoza płytek krwiCytometria przepływowaMetabolizm płytek krwiStymulacja trombinąWapń mitochondrialnyAktywacja kaspazyEkspresja fosfatydyloseryny
Kompleksowa analiza płytek krwi prokoagulantów wykazujących cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.