Optymalizacja izolacji i oczyszczania mysich komórek mezangialnych kłębuszków nerkowych

Summary

To badanie opracowało zoptymalizowany protokół izolacji mysich komórek mezangialnych (MC) i ich hodowli komórkowej ex vivo. Komórki te mogą być wielokrotnie pasażowane, zamrażane, ożywiane i hodowane bez uszczerbku dla wzrostu komórek lub ekspresji białek.

Abstract

Komórki mezangialne (MCs) to komórki zrębu znajdujące się w środkowej przestrzeni kłębuszków nerkowych, pełniące kluczowe funkcje w homeostazie kłębuszków nerkowych. Metody izolacji, oczyszczania i hodowli kłębuszkowych MC są opracowywane i optymalizowane od 1980 roku do stosowania w badaniach biomedycznych, szczególnie w dziedzinie nefrologii. Myszy są najczęściej wykorzystywanymi eksperymentalnymi modelami zwierzęcymi w badaniach nad chorobami nerek. W tym badaniu opracowaliśmy zoptymalizowany protokół izolacji mysich MC i hodowli komórek ex vivo. Komórki te mogą być wielokrotnie pasażowane, zamrażane, ożywiane i hodowane bez uszczerbku dla wzrostu komórek lub ekspresji białek. To zoptymalizowane podejście znacznie skraca czas trwania badania dla badaczy i umożliwia długoterminową ochronę komórek. Niezbędny sprzęt do zabiegów jest łatwo dostępny w podstawowym laboratorium biomedycznym, a etapy procedury są proste. Pozyskanie komórek docelowych wymaga tylko 2-3 tygodni, co stanowi skrócenie o co najmniej 1 tydzień w porównaniu z istniejącymi metodami.

Introduction

Kłębuszek nerkowy to sieć naczyń włosowatych, która spełnia podstawowe zadanie filtrowania krwi do tworzenia moczu¹. Komórki mezangialne (MC) są osadzone w macierzy mezangialnej, znajdującej się między naczyniami włosowatymi kłębuszków nerkowych i są wyjątkowo rozmieszczone, aby wpływać na dynamikę kłębuszków nerkowych poprzez swoje różnorodne funkcje². MC odgrywają kluczową rolę w kłębuszkach nerkowych, w tym w rozwoju kłębuszków nerkowych, strukturalnym wsparciu naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych, fagocytozie i wytwarzaniu macierzy błony podstawnej kłębuszków nerkowych³. Badanie komórek mezangialnych ma kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat fizjologii i patologii nerek.

Udział komórek mezangialnych w stanach patologicznych jest również godny uwagi. W odpowiedzi na uszkodzenie lub chorobę kłębuszków nerkowych, taką jak nefropatia cukrzycowa lub kłębuszkowe zapalenie nerek, komórki mezangialne mogą się namnażać i wydzielać nadmiar składników macierzy zewnątrzkomórkowej, co prowadzi do stwardnienia kłębuszków nerkowych i upośledzenia funkcji nerek4^,5. Zrozumienie funkcji i mechanizmów regulacyjnych komórek mezangialnych jest zatem niezbędne do opracowania strategii terapeutycznych w chorobach nerek.

Mysie komórki mezangialne umożliwiają badaczom modelowanie i badanie procesów molekularnych i komórkowych związanych z takimi stanami jak nefropatia IgA⁶, nefropatia cukrzycowa⁷, oraz ogniskowe segmentalne stwardnienie kłębuszków nerkowych (FSGS)^8,9. Biorąc pod uwagę ich rolę w zwłóknieniu nerek i zapaleniu, mysie kłębuszkowe MC są często stosowane w badaniach klinicznych do oceny skuteczności związków terapeutycznych^9,10. Ponadto mysie komórki mezangialne są ważnym narzędziem do badania wpływu różnych szlaków sygnałowych na czynność nerek, w tym szlaku RhoA/ROCK¹¹ i szlaku transformującego czynnika wzrostu-beta (TGF-β)¹². Badania te pomagają wyjaśnić, w jaki sposób te cząsteczki sygnałowe przyczyniają się do postępu choroby nerek. Niezależnie od tego, czy są wykorzystywane do modelowania chorób, opracowywania terapii czy badań nad transdukcją sygnału, mysie MC nadal służą jako kluczowe źródło wiedzy na temat zdrowia i chorób nerek.

Mackay et al. ustalili metodę pozyskiwania ex vivo linii komórkowych komórek nabłonka kłębuszkowego, mezangialnego i śródbłonka od myszy transgenicznych w 1988 roku¹³. Wilson i Stewart opracowali metodę izolowania i oczyszczania pierwotnych MC z tkanki nerkowej pacjenta, która obejmuje trzy rundy przesiewania i intensywne mycie mediami¹⁴. Menè i Stoppacciaro zaproponowali również metodę izolowania pierwotnych MC z tkanki nerkowej pacjenta lub szczura. Technika ta obejmuje dwie rundy przesiewania, dwa pchnięcia igłą i trawienie kolagenazą. Komórki uzyskane z 4-8 nerek szczurów są siane na płytce sześciodołkowej, chociaż wydajność jest stosunkowo niska¹⁵. Metody te wymagają rozbioru nerek na małe kawałki przed przetworzeniem. Dodatkowo, te podejścia potrzebują około 3-4 tygodni, aby uzyskać oczyszczone MC.

Myszy są najczęściej wykorzystywanymi eksperymentalnymi modelami zwierzęcymi w badaniach nad chorobami nerek. Jednak nadal brakuje systematycznej metody izolowania mysich MC. W tym badaniu opracowaliśmy zoptymalizowany protokół izolacji mysich MC i hodowli komórek ex vivo. Metoda ta może być stosowana w przypadku użycia pierwotnych mysich MC nerek do badań eksperymentalnych. W porównaniu z poprzednimi metodami, takie podejście eliminuje potrzebę cięcia tkanek i przesiewania przed trawieniem. Zamiast tego cała nerka myszy jest mielona za pomocą młynka do komórek i bezpośrednio trawiona kolagenazą. Roztwór wytrawiający jest następnie dwukrotnie przesiewany, przy czym wszystkie komórki są zbierane na drugim sicie i ponownie zawieszane. Ta metoda pozwala dwóm nerkom myszy wyprodukować wystarczającą ilość komórek, aby w ciągu 10 dni wysiać od dwóch do trzech 100-milimetrowych szalek hodowlanych. Oczyszczone MC są następnie otrzymywane poprzez hodowlę i oczyszczanie przy użyciu specjalistycznej pożywki zawierającej D-walinę. Komórki te mogą być wielokrotnie pasażowane, zamrażane, ożywiane i hodowane bez uszczerbku dla wzrostu komórek lub ekspresji białek. Sprzęt niezbędny do tych zabiegów jest łatwo dostępny dla podstawowych laboratoriów biomedycznych, a cały proces trwa zaledwie 2-3 tygodnie w celu uzyskania komórek docelowych. Metoda ta nadaje się do badań z udziałem mysich MC w celu zbadania chorób lub mechanizmów związanych z nerkami, ponieważ jest skuteczna i oszczędza czas.

Protocol

Eksperymenty na zwierzętach były zgodne z wytycznymi ARRIVE, a wszystkie procedury na zwierzętach były przeprowadzane zgodnie z ustawodawstwem krajowym i Dyrektywą Komisji Europejskiej (2010/63/UE). Myszy były trzymane i utrzymywane w warunkach wolnych od patogenów, zgodnie z wymaganiami Komitetów ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szpitala Zachodniochińskiego Uniwersytetu Syczuańskiego. Wszystkie badania eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szpitala Zachodniochińskiego Uniwersytetu Sichuan. Ośmiotygodniowe samce myszy C57BL / 6JGpt użyto do izolacji komórek mezangialnych w tym teście. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów. Rysunek 1 ilustruje procedury izolowania i oczyszczania mysich komórek kłębuszków nerkowych.

1. Przygotowanie odczynników do izolacji mysich MC

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie odczynniki i sprzęt są sterylne.

1. Kolagenaza typu I (750 U/ml): Zważyć proszek i rozpuścić na krótko przed użyciem w RPMI 1640.
2. Pożywka do hodowli komórek mezangialnych 1: Wymieszaj RPMI 1640 z 2 mM glutaminy, 17% FBS, antybiotykami (100 jednostek/ml penicyliny plus 10 000 μg/ml streptomycyny) i 0,1 U/ml insuliny.
3. Pożywka do hodowli komórek mezangialnych 2: Połącz RPMI 1640 (D-walina) z 2 mM glutaminy, 10% FBS, antybiotykami (100 jednostek/ml penicyliny plus 10 000 μg/ml streptomycyny), ITS-G (insulina, transferyna, roztwór selenu 100x) i 0,1 U/ml insuliny. Pożywkę do hodowli komórek mezangialnych przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1 miesiąca po przygotowaniu.
4. Pożywki do krioprezerwacji komórek: Przygotuj mieszaninę pożywki RPMI 1640, surowicy i DMSO w stosunku 7:2:1.

2. Izolacja mysich MC

1. Humanitarne uśmiercanie myszy poprzez uduszenie CO₂ , a następnie zwichnięcie szyjki macicy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Zanurz tusze w zlewce zawierającej 75% alkoholu w celu sterylizacji, a następnie przenieś zwierzę na aseptyczną powierzchnię roboczą.
   UWAGA: Po zakończeniu uduszenia CO₂ obserwuje się u myszy brak bicia serca i oddychania. Następnie wykonuje się zwichnięcie szyjki macicy w celu zapewnienia eutanazji.
2. Aseptycznie usuń nerki myszy za pomocą nożyczek i pęsety, umieść je na szalce Petriego, spłucz EBSS (Earle's Balanced Salt Solution), a następnie ostrożnie usuń tkankę łączną i torebkę nerkową za pomocą pęsety.
3. Przekrój nerkę na pół pionowo, dodaj 3-4 ml roztworu kolagenazy I i zmiel plastikowym tłuczkiem do komórek.
4. Odpipetować wszystkie tkanki i roztwór z płytki Petriego do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Opłucz szalkę Petriego 1-2 ml roztworu kolagenazy I, aby upewnić się, że cała tkanka została przeniesiona. Umieścić roztwór w wytrząsarce w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 120 obr./min przez 30 minut. Następnie dodać równą objętość roztworu zatrzymującego (pożywka hodowlana 1).
5. Odpipetować roztwór z probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, przepuścić go przez sitko o pojemności 100 μm i zebrać filtrat do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
6. Przepuścić płyn z etapu 2.5 przez sitko o średnicy 40 μm, zachowując tylko komórki znajdujące się na sitku o średnicy 40 μm. Kilkakrotnie przepłukać sitko pożywką hodowlaną 1, aby zapewnić zebranie jak największej liczby komórek na sitku. Przenieść zebrane komórki z sitka do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
7. Odwirować zawiesinę o sile 600 x g przez 5 minut (w temperaturze pokojowej), a następnie ponownie zawiesić komórki w naczyniu do hodowli komórkowych zgodnie z gęstością komórek. Ogólnie rzecz biorąc, należy ponownie zawiesić komórki z dwóch nerek w dwóch lub trzech 100-milimetrowych szalkach hodowlanych (10 ml pożywki hodowlanej 1/100 mm). Umieścić naczynia w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C z 95% powietrzem/5% CO_{2 .}
8. Zbadaj morfologię i adhezję komórek pod mikroskopem (40×) następnego dnia. Jeśli w pożywce hodowlanej znajdują się pływające martwe komórki, użyj pipety, aby usunąć pożywkę z dna naczynia hodowlanego, uważając, aby nie naruszyć przyczepionych komórek.
9. Dodaj 1-2 ml PBS wzdłuż wewnętrznej krawędzi naczynia hodowlanego, aby przepłukać komórki. Użyj pipety, aby usunąć cały PBS z dna szalki hodowlanej, a na koniec dodaj 10 ml pożywki hodowlanej 1 wzdłuż wewnętrznej krawędzi szalki hodowlanej.

3. Oczyszczanie mysich MC

1. Jednego dnia po rozdzieleniu należy usunąć nieprzylegające komórki, delikatnie myjąc i zastępując pożywkę hodowlaną świeżą pożywką hodowlaną 1, jak opisano w kroku 2.8. Obserwować komórki kłębuszków nerkowych pod mikroskopem z kontrastem fazowym (40×).
   UWAGA: Jasne kuliste kształty reprezentują kłębuszki nerkowe, podczas gdy otaczające je komórki wykazują cechy przypominające kostkę brukową, charakterystyczne dla komórek nabłonkowych (Rysunek 2A).
2. Obserwuj morfologię komórki po 1-3 dniach (Rysunek 2B-C). Komórki w kształcie gwiaździsty i wrzecionowatego pojawią się wokół komórek brukowych, jak pokazano na Rysunek 2D.
3. Gdy komórki osiągną 80% zbieżności (zwykle w ciągu 7-10 dni), umyj komórki dwukrotnie sterylnym PBS, a następnie trypsynizuj komórki 0,25% roztworem trypsyny (2 ml 0,25% roztworu trypsyny na 100 mm naczynie).
4. Początkowy proces trypsynizacji komórek może trwać około 20 minut. Po dodaniu trypsyny umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Obserwuj proces w czasie rzeczywistym pod mikroskopem kontrastu fazowego (40×), aby ocenić trypsynizację komórek.
5. Zakończ proces trypsynizacji, dodając równą objętość pożywki 2, gdy większość komórek wykazuje zaokrągloną morfologię i odrywa się od powierzchni naczynia.
6. Odwirować komórki o masie 600 × g przez 5 minut (w temperaturze pokojowej), a następnie ponownie zawiesić je w pożywce 2. Ogólnie rzecz biorąc, ponownie zawiesić komórki z jednej szalki o średnicy 100 mm w dwóch szalkach hodowlanych o średnicy 100 mm (10 ml pożywki hodowlanej 2/100 mm).
7. Zmień pożywkę hodowlaną 2 następnego dnia. Obserwuj liczne zawieszone komórki i fragmenty komórek pod mikroskopem (40×), ponieważ tylko MC mogą przetrwać i namnażać się w pożywce D-waliny¹⁶. Zmieniaj pożywkę co 1-2 dni, aby usunąć martwe komórki. Komórkami przylegającymi w kulturze są MC (Rysunek 3A-D). Określ tempo wzrostu izolowanych MC (Rysunek 3E).
8. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, trypsynizuj je i przechodź. MC zwykle potrzebują około 5-10 minut na trypsynizację.

4. Długoterminowe zachowanie mysich MC

UWAGA: Ponieważ komórki pierwotne mogą różnicować się i mutować wraz z upływem czasu i wielokrotnymi przejściami, zamrażaj i przechowuj MC po oczyszczeniu komórek dla długoterminowego zachowania.

1. Ostrożnie usunąć supernatant wzdłuż dolnej krawędzi naczynia za pomocą pipety, umyć komórki dwukrotnie sterylnym PBS, a następnie trypsynizować 0,25% roztworem trypsyny (2 ml 0,25% roztworu trypsyny na 100 mm naczynia). Postępuj zgodnie z krokami trypsynizacji zgodnie z opisem w krokach 3.3-3.8.
2. Po trypsynizacji dodaj równą objętość pożywki 2, aby zakończyć proces i przenieś cały płyn do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki w stężeniu 600 × g przez 5 minut (w temperaturze pokojowej), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS w celu policzenia komórek.
3. Użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć komórki. Pobrać 20 μl z 1 ml zawieszonego roztworu komórek i dodać je do dedykowanej płytki do zliczania komórek, aby określić całkowitą liczbę komórek. Na podstawie liczby komórek ponownie zawieś je w pożywce do kriokonserwacji komórek (1 ml pożywki do kriokonserwacji komórek na 10⁶ komórek).
4. Przenieść roztwór komórkowy do probówek do kriokonserwacji (1 ml pożywki do krioprezerwacji komórek na 2 ml probówki do krioprezerwacji) i przeprowadzić powolne zamrażanie do temperatury -80 °C przed przeniesieniem do ciekłego azotu w celu konserwacji.
   UWAGA: W razie potrzeby ponownie zawiesić i wysadzić komórki w szalkach do hodowli komórkowych w celu amplifikacji. Komórki powinny być używane między fragmentami 3 i 8 po ich pełnym scharakteryzowaniu¹⁷.

5. Identyfikacja mysich MC

UWAGA: Po dwukrotnym przejściu komórek, zidentyfikuj mysie MC za pomocą następujących technik.

1. Western blot mysich MCs
   UWAGA: Odczynniki potrzebne do przeprowadzenia zabiegu podano w Tabeli Uzupełniającej 1.
   1. Trypsynizuj komórki, wykonując te same czynności, co w 3.3-3.8 i kroku 4.1.
   2. Po zebraniu komórek poddaj je lizie w celu ekstrakcji białek i zmierz stężenie białka.
   3. Pobrać odpowiednią ilość próbki (zwykle 20 ng), dodać bufor ładujący i dokonać denaturacji w temperaturze 100 °C przez 5 minut.
   4. Rozpuść białko (20 ng) za pomocą 10% żelu SDS-PAGE lub 7,5% żelu SDS-PAGE, a następnie przenieś je do membrany celulozowej pod stałym napięciem.
   5. Zatkać błonę 5% mlekiem beztłuszczowym, a następnie inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze 4 °C na wytrząsarce przez noc.
   6. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę po trzykrotnym przemyciu TBST (Tris Buffered Saline with Tween 20).
   7. Wykrywanie sygnałów za pomocą systemu obrazowania.
      UWAGA: Podstawowe przeciwciała użyte w tym badaniu obejmowały mysi anty-αSMA (1:500), króliczą anty-wimentynę (1:2000), króliczą antyfibronektynę (1:2000) i mysi anty-GAPDH (1:50000). Przeciwciała drugorzędowe użyte w tym badaniu obejmowały kozie przeciwciała anty-królicze IgG (H + L) (1:5000) sprzężone z peroksydazą i kozie anty-mysie IgG (H + L) sprzężone z peroksydazą (1:5000).
2. Barwienie immunofluorescencyjne mysich MCs
   UWAGA: Odczynniki potrzebne do przeprowadzenia zabiegu podano w Tabeli Uzupełniającej 2.
   1. Trypsynizuj komórki, wykonując te same czynności, co w krokach 3.3-3.8 i 4.1.
   2. Zawieś ponownie komórki i policz je. Weź 1 x 10⁵ komórek i dodaj je do naczynia do hodowli komórek ze szklanym dnem o średnicy 15 mm (1 ml pożywki hodowlanej, 2 na szklane dno o średnicy 15 mm).
   3. Utrwal MC 4% paraformaldehydem przez 15 minut (1 ml 4% paraformaldehydu na 15 mm szklane dno), a następnie przemyj trzy razy PBS.
   4. Potraktuj MC 0,1% Triton X-100 przez 10 minut, aby przeniknąć przez błony komórkowe.
   5. Po trzech kolejnych płukaniach PBS zablokuj komórki w temperaturze pokojowej 3% roztworem BSA PBS na 30 minut.
   6. Umyć komórki i inkubować je z pierwszorzędowymi przeciwciałami anty-mysimi αSMA i anty-króliczymi przeciwciałami wimentyny w temperaturze 4 °C przez noc.
   7. Inkubować przez 1 godzinę z wtórną anty-mysią IgG osła skoniugowaną z czerwoną Alexa 594 i anty-króliczą IgG osła skoniugowaną z zielonym FITC w temperaturze pokojowej.
   8. Użyj DAPI do barwienia jądrowego przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
   9. Dodaj nośnik fluoromount i przykryj szklanym szkiełkiem. Analizuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego.
      UWAGA: Podstawowe przeciwciała użyte w tym badaniu obejmowały mysi anty-αSMA (1:200) i króliczą anty-wimentynę (1:200). Przeciwciała drugorzędowe użyte w tym badaniu obejmowały przeciwciała anty-mysie IgG skoniugowane z czerwoną Alexą 594 (1:400), przeciwciała anty-królicze osła skoniugowane z zielonym FITC (1:400) i DAPI (1:1000).
3. Cytometria przepływowa mysich MC
   1. Trypsynizuj komórki, wykonując te same czynności, co w krokach 3.3-3.8 i 4.1.
   2. Zawieś ponownie komórki i policz je. Weź 5 x 10⁵ komórek i umyj je raz 3 ml PBS.
   3. Ponownie zawiesić komórki ze 100 μl PBS w probówce przepływowej, a następnie dodać 1-2 μl przeciwciała anty-mysiego PDGFRB (CD140b).
   4. Inkubować komórki na lodzie przez 30 minut w ciemności, a następnie analizować za pomocą cytometrii przepływowej.

Results

To badanie opracowało zoptymalizowany protokół izolacji mysich MCs i hodowli komórek ex vivo. O ile nam wiadomo, nie istnieje żadna standardowa metoda walidacji pierwotnych MC ex vivo. Zgodnie z wcześniejszymi publikacjami, MC charakteryzują się wyrażeniem αSMA, wimentyny i fibronektyny^3,14,15. Do wykrycia poziomów ekspresji MC wykorzystano analizę Western blot. MC wyizolowane w tym badaniu wykazywały znacznie ...

Discussion

Choroby związane z nerkami są bardzo rozpowszechnione, a myszy są szeroko stosowane jako główny model zwierzęcy do badania tych schorzeń ze względu na ich genetyczne podobieństwo do ludzi i dostępność dobrze ugruntowanych modeli chorób. Komórki mezangialne odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu prawidłowej struktury i funkcji kłębuszków nerkowych, zapewniając wsparcie strukturalne, regulując filtrację kłębuszkową i uczestnicząc w odpowiedziach immunologicznych. Chociaż istnieją różne techniki eksperymentalne izolowania kom...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 &mikro; m Sitko do komórek	Biosharp	BS-100-CS
100 mm szalka Petriego	Sorfa	230301
15 mL Probówka wirówkowa	Sorfa	411000
15 mm szklane naczynie do hodowli komórkowych	Sorfa	201200
180 kDa Plus Marker białkowy	Vazyme	MP201-01
2 mM L-glutamina	BasalMedia	S210JV
4% Paraformaldehyd	Biosharp	BL539A
40 &mikro; m Sitko do komórek	Biosharp	BS-40-XBS
50 ml Probówka wirówkowa	Sorfa	41000
60 mm Szalka Petriego	Sorfa	230201
75% Alkohol	Knowles	64-17-5
96 dołkowe płytki do hodowli komórkowych, antybiotyki	Servicebio	CCP-96H
(10 μ g/ml ceftriaksonu plus 100 μ g / ml gentamycyny)	NCM	C100C5
BCA (kwas bicunchoninowy) Zestaw do oznaczania białek	CWBIO	CW0014S
Zestaw do liczenia komórek-8	Oriscience	CB101
Mikroskop konfokalny	FV-3000	Olympus
	DMSO Sigma	D2650
DMSO	Sigma	D2650
Earle's Zrównoważony roztwór soli (1x EBSS)	Beyotime	C0213
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Excell	FSP500
Analizator komórek fluorescencyjnych	Mira FL	Countstar
Fluoromount media	Southern Biotech	0100-01
Insulina, transferyna, roztwór selenu 100x (ITS -G)	Gibco	41400045
Mikroskop odwróconej fluorescencji	Bufor	IX83
	Adilab	PP1101
Jednoetapowy zestaw do przygotowania PAGE (10%)	Oriscience	PB102
Jednoetapowy zestaw do przygotowania strony (7,5%)	Oriscience	PB101
anty-mysie CD140b	Biolegend	323605
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Servicebio	G4202
Tłuczek do komórek plastikowych	Biofil	CC-4090
Koktajl inhibitorów proteinaz	Roche	4693159001
Membrana PVDF	Vazyme	E802-01
Rekombinowana insulina ludzka	Solarbio	11061-68-0
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium	Corning	10-040-CV
SDS-PAGE Bufor do ładowania próbek (5x)	Servicebio	G2013
Specjalnie dostosowany Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium (D-walina zamiast L-waliny)	Procell	WH3923U222
TBS (Tris Buffered Saline)	Servicebio	G0001-2L
Triton X-100	Biosharp	BS084
Trypsyna-EDTA (0,25%)	Gibco	25200072
Tween 20	Biosharp	BS100
Typ I Kolagenaza	Solarbio	Zobacz materiał CB140