Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezanestezjologiczne pomiary tętna u swobodnie poruszających się danio pręgowanego

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68145

⸱

18 kwietnia 2025

 ,  ,  , 
1Scientific and Technological Centre of Unique Instrumentation of RAS, 2Moscow State University, 3Cherepovets State University, 4Papanin Institute for Biology of Inland Waters RAS

W tym artykule

Podsumowanie

Celem badania jest opracowanie technologii do pomiaru tętna bez znieczulenia u ruszających się rybek zebrafish. Nasze podejście łączy obrazowanie w podczerwieni krótkofalowej z opartym na maszynowym uczeniu śledzeniem tętna. Jest to technika nieinwazyjna, bez oznaczeń i przyjazna dla użytkownika, która nadaje się do szerokiej gamy badań na modelu rybki zebrafish.

Streszczenie

Rybka zebry (Danio rerio) jest szeroko stosowanym organizmem modelowym w badaniach fizjologicznych, farmakologicznych i toksykologicznych ze względu na jego genetyczne podobieństwo do ludzi oraz przezroczysty etap embrionalny, co ułatwia nieinwazyjne badania układu krążenia. Jednak obecne metody oceny częstości akcji serca u rybek zebry często polegają na stosowaniu znieczulenia w celu unieruchomienia badanego organizmu, co wprowadza fizjologiczne zmiany, które obniżają dokładność i powtarzalność danych. Niniejsze badanie przedstawia nowatorską, niewymagającą znieczulenia technikę pomiaru tętna u swobodnie poruszających się larw rybki zebry, rozwiązując tym samym krytyczne ograniczenie w badaniach nad układem krążeniem. Zaproponowane podejście integruje obrazowanie w podczerwieni krótkofalowej z opartym na uczeniu maszynowym śledzeniem akcji serca, umożliwiając precyzyjne i ciągłe monitorowanie czynności serca u nieunieruchomionych okazów. Przeszkoloną sieć konwolucyjną wykorzystano do wykrywania regionu serca, a z sekwencji obrazów wyodrębniono sygnał fotopletyzmograficzny w celu określenia częstości akcji serca. Walidacja eksperymentalna wykazała niezawodność i spójność metody w różnych warunkach testowych. Kluczową zaletą metodologii jest jej zdolność do zachowania naturalnego stanu fizjologicznego rybki zebry, minimalizującą artefakty spowodowane stresem. Ta nieinwazyjna, niewymagająca oznakowania technika oferuje znaczne zalety w badaniu fizjologii układu krążenia, toksyczności leków na serce oraz toksykologii środowiskowej, rozszerzając potencjalne zastosowania rybki zebry jako modelu w badaniach biomedycznych.

Wprowadzenie

Rybeczka (Danio rerio), mała ryba z rodziny karpiowatych, stała się niezbędnym organizmem modelowym ze względu na swoją małą wielkość, wysoką zdolność reprodukcyjną i łatwość manipulacji genetycznych1,2,3. Ocena częstości akcji serca u przejrzystych zarodków rybeczki jest coraz częściej wykorzystywana w fizjologii, embriologii, toksykologii i innych dziedzinach4,5,6,7,8. Z jednej strony, ta przydatność wynika z faktu, że genom rybeczki zawiera geny związane z chorobami układu krążenia u ludzi9, a serce Dania rerio dzieli podobne struktury i szlaki sygnałowe z ludźmi10,11. To sprawia, że rybeczka jest nieocenione modelem do badań nad rozwojem serca i chorobami11,12,13. Z drugiej strony, częstość akcji serca rybeczki jest wrażliwa na wpływy zewnętrzne, co sprawia, że jest doskonałym modelem do badań fizjologicznych i toksykologicznych poprzez porównywanie funkcji serca u ryb poddanych leczeniu i niepoddanych leczeniu7,8,14.

Osiągnięto znaczny postęp w rozwijaniu nieinwazyjnych metod optycznych do oceny częstości akcji serca u przejrzystych zarodków ryb15,16. Techniki te oferują zaletę szybkiego zbierania danych z dużych wielkości prób. W konsekwencji, opracowano w pełni zautomatyzowane podejścia do oceny częstości akcji serca u zarodków ryb4,5,6,17.

Jednakże, niektóre ograniczenia obecnie ograniczają użycie tych technik do okresu 3-4 dpf. Pierwszym ograniczeniem jest utrata przezroczystości z powodu pigmentacji ciała ryby. Drugim jest rosnąca ruchliwość zarodków w miarę upływu czasu. Przedłużenie okresu wczesnego rozwoju rybeczki, podczas którego można stosować podejścia optyczne, zwiększyłoby ich użyteczność, umożliwiając długoterminowe projekty eksperymentalne do badania kardiomiopatii, wrodzonych wad serca i różnych wpływów na układ krążenia, w tym śledzenie dynamiki efektów w czasie. Nasza grupa ostatnio zajęła się problemem utraty przezroczystości, stosując obrazowanie w zakresie krótkofalowej podczerwieni 900-1700 nm18. Niniejszy artykuł koncentruje się na rozwiązaniu problemu ruchliwości zarodków.

Zwykle środki znieczulające, takie jak metansulfolan trykainy (MS-222), są używane do unieruchamiania swobodnie pływających zarodków ryb i larw przed wykonaniem zdjęć14,19,20. Jednak MS-222 znacznie obniża częstość akcji serca21,22, podobnie jak inne środki znieczulające23. Staje się trudno rozróżnić, czy obserwowane zmiany w funkcji serca są spowodowane leczeniem eksperymentalnym, środkiem znieczulającym, czy też interakcją między nimi. Innym sposobem na przedłużenie okresu niskiej ruchliwości zarodka jest obniżenie temperatury podczas wczesnego rozwoju8. Jednakże, to podejście nie zawsze jest zgodne z celami badań i tylko minimalnie przedłuża okres rejestracji.

W niniejszym badaniu, wprowadzamy nową metodę do rozwiązania problemu ruchliwości zarodków podczas rejestracji częstości akcji serca. Przeszkoliliśmy sieciową konwolucyjną do identyfikacji obszaru zainteresowania serca w nagraniach swobodnie pływających zarodków rybeczki. Okresowa zmiana intensywności pikseli w tym obszarze jest wykorzystywana do wyprowadzenia fotopletyzmogramu (PPG), który następnie jest używany do obliczenia częstości akcji serca. Opracowany aplikacja stacjonarna, AutoHR, wykorzystuje zarówno trenowanie sieci neuronowych, jak i przetwarzanie stosu obrazów, zapewniając łatwość użycia i powtarzalność protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

```html

Zebrafish zostały hodowane i wychowane zgodnie z ustanowionymi protokołami ZFIN24. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Bioetyczny Centrum Naukowego i Technologicznego Unikalnych Instrumentów Rosyjskiej Akademii Nauk (STC UI RAS), protokół nr 3/24, data 21/08/2024, i są zgodne z wytycznymi STC UI RAS dotyczącymi opieki nad rybkami. Podręczniki do poszczególnych wersji są dostępne na życzenie.

1. Przygotowanie sprzętu do pomiaru

  1. Wybór sprzętu
    1. Wybór źródła światła: Wybierz źródło światła LED emitujące w zakresie podczerwieni bliskiej, szczególnie od 800 nm, o minimalnej mocy wyjściowej 3 W. W tym badaniu użyto LED o centralnej długości fali 940 nm i pasmie 40 nm.
    2. Wybór kamery wideo: Wybierz kamerę wyposażoną w czujnik wrażliwy na zakres długości fal emitowany przez źródło światła i o częstotliwości klatek co najmniej 60 fps. Odwołaj się do arkusza danych kamery, aby określić skok pikseli p, rozmiar czujnika wzdłuż krótszej krawędzi h oraz częstotliwość klatek. W tym badaniu kamera ma skok pikseli p = 5 µm i szerokość czujnika h = 5,12 mm.
    3. Wybór rozmiaru formy agarozy, która jest co najmniej 1,5 razy większa niż długość larwki B. Oblicz minimalne i maksymalne dopuszczalne powiększenie układu optycznego za pomocą podanych wyrażeń. Upewnij się, że Mmax ≤ Mmin. Jeśli warunek ten nie jest spełniony, wybierz kamerę o większym h i/lub mniejszym i/lub mniejszym S.
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
      gdzie Smax to długość największej formy agarozy w zestawie form. Można przygotować zestaw form o różnych rozmiarach. W tym badaniu użyto S = 10 mm.
      UWAGA: Równania są pochodnymi opartymi na geometrii schematu optycznego i proporcjach ciała rybek. Szczegółowe wyjaśnienia znajdują się w sekcji Dyskusja.
    4. Wybór obiektywu: W tym badaniu użyto układu optycznego o zmiennym powiększeniu w zakresie od MOSmin = 0,4x do MOSmax = 1,5x, maksymalnej długości ogniskowej fmax = 150 mm i odległości roboczej mm.
      UWAGA: Symbol x oznacza współczynnik powiększenia układu optycznego.
      1. Wybierz system typu mikroskopu o zmiennym powiększeniu, którego zakres (MOSmin - MOSmax) pozostaje w dopuszczalnym zakresie (Mmin - Mmax). Odwołaj się do arkusza danych obiektywu, aby określić maksymalną długość ogniskową fmax oraz odpowiednią odległość roboczą L dla MOSmax.
      2. Upewnij się, że warunek fmax ≤ Mmax • L jest spełniony. Jeśli warunek ten nie jest spełniony, wybierz obiektyw o innym fmax i/lub L. Upewnij się, że typ mocowania kamery i obiektywu są kompatybilne.
    5. Wybierz obiekt testowy (linijkę lub siatkę) o znanym skoku i całkowitej długości co najmniej . Wybierz obiekt testowy w postaci linijki lub siatki o znanym skoku i całkowitej wielkości co najmniej Smax.
  2. Zestawienie podstawy do akwizycji obrazu (Rysunek 1).
    1. Zamocuj okrągłą pręt na stabilnej podstawie. Złóż system obrazowania, przymocowując obiektyw do kamery. Zamontuj kanał obrazu na pręcie z oknem wejściowym skierowanym w górę.
    2. Zamontuj mechanizm fokusu na pręcie. Zamontuj podstawę ze szklaną powierzchnią roboczą o minimalnym średnicy 30 mm na mechanizmie fokusu.
    3. Złóż iluminator: Umieść LED na metalowym podłożu, aby zapewnić wydajne odprowadzanie ciepła. Umieść soczewkę kolimatora wypukłego płaskiego o średnicy 23 mm i ogniskowej 30 mm w odległości 30 mm od LED.
    4. Zamontuj iluminator na podstawie za pomocą trójosiowego uchwytu regulowanego, umieszczając go nad powierzchnią roboczą z soczewką skierowaną w dół.
    5. Dostosuj iluminator i system obrazu. Umieść iluminator współosiowo z systemem obrazu. Włącz iluminator i podłącz kamerę do komputera.
    6. Uruchom aplikację kamery i aktywuj tryb podglądu zgodnie z instrukcjami w instrukcji obsługi kamery. Umieść obiekt testowy na podstawie. Dostosuj odległość roboczą i powiększenie mikroskopu

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pulsacja serca rybek zebrowych w wieku 12 dpf została określona zgodnie z opisanym wyżej protokołem (Dodatkowe wideo 1). Filmy zawierają sekwencję obrazów swobodnie pływających larw rybki zebrowej, fotopletyzmograf pochodzący z tych sekwencji zgodnie z zaproponowanym protokołem oraz odpowiadającą wartość pulsu obliczoną na podstawie fotopletyzmografii.

Oznaczone dane zostały losowo podzielone na zbiory treningowe, testowe i walidacyjne w proporcji 3:2:1 podczas treningu. Nastę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tej pracy przedstawiamy protokół eksperymentalny do pomiaru tętna wolno pływających larw rybki Danio rerio. Oceniliśmy to podejście poprzez kilka eksperymentów, demonstrując jego skuteczność. Kluczowe elementy zaproponowanej metody obejmują zarówno rozwiązania sprzętowe, jak i oprogramowanie. Po pierwsze, użyliśmy podczerwieni do obrazowania, co, jak wcześniej wykazano, pozwala uniknąć problemów związanych z pigmentacją i zwiększa przejrzystość tkanek, ułatwiając dokładne określenie tętna18. Po ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy ujawili wszelkie konflikty interesów.

Podziękowania

To badanie zostało wsparte przez Federalny Program Zadań Państwowych STC UI RAS (FFNS-2025-0008). Praca ta została wykonana przy użyciu sprzętu Centrum Dla Wspólnego Korzystania STC UI RAS [http:// https://ckp.ntcup.ru/pl/].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Czynniki
Niskotająca się agarozaBiozym850111
Sól kuchennaPegasus N/A
Tricaine (Etyl 3-aminobenzoesanu metylosulfonianu) Sigma-AldrichE10505MS-222
Wyposażenie
Podstawa z prętemAltamiSM-U1
Obiektyw kolimatorowyJLLSCMGGXDługość ogniskowa 30 mm
Mechanizm ustawiania ogniskowejAltamiSM-12Średnica=76 mm
Dioda LEDCreeTR-3535IR-3W
ObiektywSFK SecurityGniazdo C, F1.6, 1/3”,
Kamera bliskiej podczerwieniToupTekSWIR1300KMA
Pipeta PasteuraPE-LD149293
Miszka Petriego 35 x 15 mm BD Falcon351008
Formy plastikoweN/AN/AWykonane drukowaniem 3D
ZasilaczaUnit-TUTP3300TFL-II
PodstawaN/AN/AWykonane drukowaniem 3D
Nóżki sztolnioweErichKrause19145
Obiekt testowyWally SkyMS-1-EB
Oprogramowanie
EfficientDetN/AN/Ahttps://github.com/rwightman/efficientdet-pytorch
Model EfficientNet-b0N/AN/Ahttps://arxiv.org/abs/1905.11946
Google API ClientGoogleN/AGoogle API Client to biblioteka klienta Python dla interfejsów API opartych na odkryciu Google. https://github.com/googleapis/google-api-python-client
Hardware
Siať wieloskalowaN/AN/Ahttps://arxiv.org/abs/2209.14145
NVIDIA DIGITSNVIDIAN/ANVIDIA DIGITS to otoczka dla Caffe, która zapewnia graficzny interfejs internetowy. https://developer.nvidia.com/digits
NVIDIA GPUNVIDIAN/AWymagana jest karta graficzna NVIDIA, ponieważ niektóre z poniższych narzędzi programistycznych nie będą działać w przeciwnym wypadku. https://www.nvidia.com
OpenCVIntelN/AOpenCV to biblioteka do widzenia komputerowego. https://opencv.org
PythonPython Software FoundationN/APython to język programowania. https://www.python.org

Bibliografia

  1. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Exp Neurol. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
  2. Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Front Cell Dev Biol. 9, 616551(2021).
  3. Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquat Toxicol. 234, 105813(2021).
  4. Pylatiuk, C., et al. Automatic zebrafish heartbeat detection and analysis for zebrafish embryos. Zebrafish. 11 (4), 379-383 (2014).
  5. Krishna, S., Chatti, K., Galigekere, R. R. Automatic and robust estimation of heart rate in zebrafish larvae. IEEE Trans Auto Sci Eng. 15 (3), 1041-1052 (2018).
  6. Gierten, J., et al. Automated high-throughput heartbeat quantification in medaka and zebrafish embryos under physiological conditions. Sci Rep. 10 (1), 2046(2020).
  7. Meng, H., Liang, J., Zheng, X., Zhang, K., Zhao, Y. Using a high-throughput zebrafish embryo screening approach to support environmental hazard ranking for cardiovascular agents. Sci Total Environ. 702, 134703(2020).
  8. Krylov, V., et al. Influence of hypomagnetic field on the heartbeat in zebrafish embryos. Front Physiol. 13, 1040083(2022).
  9. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  10. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Ann Rev Gene. 46, 397-418 (2012).
  11. Bowley, G., et al. Zebrafish as a tractable model of human cardiovascular disease. Br J Pharmacol. 179 (5), 900-917 (2022).
  12. Brown, D. R., Samsa, L. A., Qian, L., Liu, J. Advances in the study of heart development and disease using zebrafish. J Cardiovas Dev Dis. 3 (2), 13(2016).
  13. Dhillon, S. S., et al. Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in Zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs. PLoS One. 8 (4), e60552(2013).
  14. Bedrossiantz, J., et al. Heart rate and behavioral responses in three phylogenetically distant aquatic model organisms exposed to environmental concentrations of carbaryl and fenitrothion. Sci Total Environ. 865, 161268(2023).
  15. Santoso, F., et al. An overview of methods for cardiac rhythm detection in zebrafish. Biomedicines. 8 (9), 329(2020).
  16. Ling, D., Chen, H., Chan, G., Lee, S. M. Y. Quantitative measurements of zebrafish heartrate and heart rate variability: A survey between 1990-2020. Comp Biol Med. 142, 105045(2022).
  17. Ferreira, M. S., et al. FEHAT: Efficient, large scale and automated heartbeat detection in medaka fish embryos. Bioinformatics. 40 (12), btae664(2024).
  18. Volkov, M., et al. Optical transparency and label-free vessel imaging of zebrafish larvae in shortwave infrared range as a tool for prolonged studying of cardiovascular system development. Sci Rep. 12 (1), 20884(2022).
  19. Machikhin, A., et al. Microscopic photoplethysmography-based evaluation of cardiotoxicity in whitefish larvae induced by acute exposure to cadmium and phenol. J Biophoton. 17 (9), e202400111(2024).
  20. Machikhin, A. S., Burlakov, A. B., Volkov, M. V., Khokhlov, D. D. Imaging photoplethysmography and videocapillaroscopy enable noninvasive study of zebrafish cardiovascular system functioning. J Biophoton. 13 (7), e202000061(2020).
  21. Denvir, M. A., Tucker, C. S., Mullins, J. J. Systolic and diastolic ventricular function in zebrafish embryos: Influence of norepenephrine, MS-222 and temperature. BMC Biotechnol. 8 (1), 1-8 (2008).
  22. Santoso, F., et al. Development of a simple ImageJ-based method for dynamic blood flow tracking in zebrafish embryos and its application in drug toxicity evaluation. Inventions. 4 (4), 65(2019).
  23. Vieira, R. S. F., Sousa, D., Félix, L. M., Venâncio, C. A. S. Anaesthetic profile of thymol and menthol in zebrafish larvae model. Aquaculture and Fisheries. , (2024).
  24. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
  25. Azad, R., et al. Loss functions in the era of semantic segmentation: A survey and outlook. ArXiv. , (2023).
  26. Machikhin, A. S., et al. Combined optical and acoustic microscopy for non-invasive cardiovascular studies using zebrafish model. IEEE Trans Instrument Measurement. 74, 1-13 (2025).
  27. Wavelet analysis of Photoplethysmogram in zebrafish larvaе cardiovascular system Study. Slavin, A. E., Guryleva, A. V., Bukova, V. I., Shuman, L. A., Burlakov, A. B. 2024 26th Int Conf Digital Signal Proc Appl DSPA 2024, , 1-5 (2024).
  28. Kumari, S., Singh, D. Phenylthiourea-mediated experimental depigmentation reduces seizurogenic response of pentylenetetrazol in zebrafish larva. J Pharm Toxicol Methods. 128, 107532(2024).
  29. Xu, Y., et al. Highly sensitive response to the toxicity of environmental chemicals in transparent casper zebrafish. Sci Total Environ. 948, 174865(2024).
  30. Vedder, V. L., et al. pyHeart4Fish: Chamber-specific heart phenotype quantification of zebrafish in high-content screens. Front Cell Dev Biol. 11, 1143852(2023).
  31. Lane, S., More, L. A., Asnani, A. Zebrafish models of cancer therapy-induced cardiovascular toxicity. J Cardiovas Dev Dis. (2), 8(2021).
  32. Maciag, M., Wnorowski, A., Mierzejewska, M., Plazinska, A. Pharmacological assessment of zebrafish-based cardiotoxicity models. Biomed pharmacother. 148, 112695(2022).
  33. Krylov, V. V., et al. Non-invasive recording of heartbeats in Danio rerio and Daphnia magna to assess the toxicity of imidacloprid and glyphosate. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 288, 110075(2025).
  34. Meng, H., Liang, J., Zheng, X., Zhang, K., Zhao, Y. Using a high-throughput zebrafish embryo screening approach to support environmental hazard ranking for cardiovascular agents. Sci Total Environ. 702, 134703(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Tętno ryby danio-ostrodybnejpomiar bez znieczuleniaobrazowanie w krótkofalowej podczerwienimonitorowanie częstości akcji sercasygnał fotopletyzmograficznyśledzenie za pomocą sieci neuronowychfizjologia układu sercowo-naczyniowegośledzenie pracy serca z wykorzystaniem uczenia maszynowegoocena kardiotoksyczności
Bezanestezjologiczne pomiary tętna u swobodnie poruszających się danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.