Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja DNA oparta na matrycy do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji na odkażonych próbkach plwociny

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68147

⸱

6 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Molecular Biology and Human Genetics, SAMRC Centre for TB Research, DSI-NRF Centre of Excellence for Biomedical TB Research, Department of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 2National Health Laboratory Service, Green Point Tuberculosis Laboratory, 3Division of Medical Microbiology, Department of Pathology, University of Cape Town, 4Division of Medical Microbiology, Department of Pathology, University of Cape Town, 5Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Zuckerberg San Francisco General Hospital and Trauma Centre, University of California, San Francisco, 6Department of Medicine, University of California, San Diego, School of Medicine, 7Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND), Campus Biotech

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy zoptymalizowaną metodę ekstrakcji DNA z odkażonej plwociny przy użyciu metody ekstrakcji opartej na matrycy w połączeniu z oczyszczaniem kulek magnetycznych w celu dalszego ukierunkowanego sekwencjonowania Mycobacterium tuberculosis.

Streszczenie

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) jest obecnie uznawane za potężne narzędzie do szybkiej i dokładnej diagnozy gruźlicy lekoopornej (DR-TB). Targeted NGS (tNGS) oferuje uproszczone podejście poprzez skupienie się na określonych genach związanych z opornością na leki, omijając potrzebę stosowania tradycyjnych metod opartych na hodowlach, których czas realizacji wynosi od tygodni do miesięcy. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zaleciła tNGS jako cenną strategię poprawy diagnostyki gruźlicy (TB) w celu ukierunkowania leczenia i poprawy wyników leczenia, szczególnie w warunkach ograniczonych zasobów. Spośród zalecanych przez WHO testów tNGS wybraliśmy metodę, która zapewnia szybkie i kompleksowe badanie wrażliwości leków, określenie linii i typowanie szczepu. Chociaż dostępne są standardowe metody ekstrakcji DNA, mogą być czasochłonne i pracochłonne. Aby sprostać temu wyzwaniu, zoptymalizowaliśmy uproszczony, oparty na matrycy protokół ekstrakcji DNA w połączeniu z oczyszczaniem kulek magnetycznych. Metoda ta oferuje szybkie i skuteczne podejście do ekstrakcji DNA bezpośrednio z odkażonych osadów plwociny, umożliwiając szybką analizę tNGS na dalszych etapach. Usprawniając proces ekstrakcji DNA z osadu plwociny, protokół ten może ułatwić szersze zastosowanie tNGS w rutynowych warunkach klinicznych, ostatecznie przyczyniając się do poprawy wyników leczenia pacjentów i przyczyniając się do globalnych wysiłków na rzecz kontroli gruźlicy.

Wprowadzenie

Szacuje się, że w 2023 roku na całym świecie około 3,7 miliona osób z gruźlicą nie zostało zdiagnozowanych i nie otrzymało leczenia, co podkreśla znaczące zagrożenie, jakie TB stanowi dla zdrowia publicznego w skali globalnej1. Według szacunków WHO w 2023 roku u około 400 000 osób rozwinęła się gruźlica oporna na ryfampicynę (RR-TB) lub gruźlica wielolekooporna (MDR-TB)1. Szybka diagnostyka i leczenie TB oraz DR-TB są niezbędne do osiągnięcia kamieni milowych i celów w zakresie redukcji zapadalności i śmiertelności z powodu gruźlicy1.

Opieranie się na konwencjonalnych metodach hodowli i fenotypowym testowaniu wrażliwości na leki (pDST) opóźnia określenie profilu oporności izolatów klinicznych oraz wdrożenie leczenia, przy czasie oczekiwania wynoszącym od 6 do 8 tygodni, a ponadto wymaga złożonej infrastruktury do biologicznego zabezpieczenia. Rutynowe testy diagnostyczne w połączeniu z NGS w przypadku DR-TB mogą dostarczyć kompleksowego profilu oporności na leki i usprawnić personalizację schematów leczenia MDR-TB, jednocześnie skracając czas do rozpoczęcia skutecznej terapii z tygodni lub miesięcy do zaledwie kilku dni2,3,4.

W latach 2023 i 2024 WHO zarekomendowała stosowanie tNGS jako nowej klasy diagnostyki służącej do szybkiego określania podatności na leki przeciwtuberculosisowe pierwszego i drugiego rzutu5. Dzięki temu staje się ono cennym narzędziem wspomagającym decyzje terapeutyczne bez konieczności hodowli Mycobacterium tuberculosis (MTB) w laboratoriach o 3. poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3). Podejście tNGS to skondensowana forma sekwencjonowania, która wykorzystuje reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) do amplifikacji genów odpowiedzialnych za oporność na leki przed przystąpieniem do sekwencjonowania. spośród testów tNGS rekomendowanych przez WHO wybraliśmy test Deeplex Myc-TB, o którym doniesiono, że spełnia kryteria klasowe w zakresie wykrywania oporności na ryfampicynę, izoniazyd, etambutol, pirazynamid, fluorochinolony, amikacynę, streptomycynę, linezolid, bedakwinę i klofazyminę. Wykorzystujemy ten test do oceny przydatności DNA wyekstrahowanego zgodnie z niniejszym protokołem do dalszych analiz tNGS.

Dodatkowo WHO opublikowało 2gie wydanie katalogu mutacji związanych z lekoopornością MTB, zapewniając wytyczne dotyczące wykorzystania sekwencjonowania całego genomu (WGS) i tNGS do przewidywania wrażliwości na leki i prowadzenia leczenia6. Niedawny przegląd systematyczny i metaanaliza wykazały, że tNGS charakteryzowało się czułością i swoistością wynoszącą odpowiednio 94,1% i 98,1% w wykrywaniu lekooporności, w oparciu o 23 cele w różnych regionach genomu MTB nadających oporność, w porównaniu z pDST7.

Jednakże wdrożenie tych metod pozostaje trudne ze względu na złożoność i koszty związane w szczególności z wymaganymi procesami roboczymi, infrastrukturą i sprzętem. Krytycznym wyzwaniem jest wyizolowanie wystarczającej ilości wysokiej jakości DNA prątków bezpośrednio z osadu zdekontaminowanej plwociny, co stanowi kluczowy etap dla późniejszych zastosowań tNGS. Aby rozwiązać ten problem, przedstawiamy szybką i prostą metodę ekstrakcji DNA dostosowaną do tNGS.

Znormalizowana metoda ekstrakcji DNA dla wybranego testu tNGS MTB obejmuje wewnętrzny protokół manualny i zautomatyzowany8. W niniejszym opracowaniu opisujemy uproszczony protokół ekstrakcji DNA oparty na matrycy (Rysunek 1). Metoda ta wykorzystuje InstaGene Matrix (IGM), który wiąże metale i białka, umożliwiając wysokiej jakości ekstrakcję kwasów nukleinowych bezpośrednio z odkażonych osadów plwociny. To alternatywne rozwiązanie zapewnia krótszy czas oczekiwania na wynik oraz wystarczającą wydajność DNA dla późniejszego tNGS. Protokół ten eliminuje złożoność metod manualnych i zautomatyzowanych, zapewniając jednocześnie wysoką jakość tNGS w celu szybkiej diagnostyki wariantów nadających oporność w MTB. W obliczu rosnącego zainteresowania wykorzystaniem tNGS w dziedzinie mykobakteriologii, niniejszy protokół może ułatwić jego wdrożenie do rutynowych procesów diagnostycznych.

Schemat ekstrakcji i oczyszczania DNA z plwociny z użyciem homogenizatora i kulek magnetycznych.
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie metod ekstrakcji DNA prątków z dekontaminowanych osadów plwociny z wykorzystaniem zawiesiny macierzy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

Badania te zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań: Bezpieczeństwo Biologiczne i Środowiskowe (REC: BES) na Uniwersytecie w Stellenbosch: BES-2024-25384 oraz przez Komitet Etyki Badań z Udziałem Ludzi: N21/09/093 i N09/11/296.

1. Przygotowanie próbek osadu z plwociny

UWAGA: Następujące kroki należy wykonać w laboratorium trzeciego stopnia bezpieczeństwa biologicznego (BSL3) przed ekstrakcją DNA.

  1. Przygotuj alikwot próbki osadu z plwociny, wcześniej zdekontaminowanej przy użyciu N-acetylocysteiny (NALC) i wodorotlenku sodu (NaOH) (NALC/NaOH), przenosząc 500 µL-2 mL do probówki low-bind o pojemności 1,5 mL lub 2 mL.
  2. Umieść probówki zawierające próbki osadu z plwociny pionowo w statywie i wstaw je do inkubatora w temperaturze 80 °C na 1 h w celu inaktywacji prątków poprzez obróbkę termiczną.
  3. Po 1 h wyjmij statyw z próbkami, przetrzyj powierzchnie probówek i umieść je w odpowiednim pojemniku przeznaczonym do transportu do laboratorium o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL2).
    UWAGA: Przed dalszą obróbką lub przechowywaniem należy pozwolić próbkom ostygnąć do temperatury pokojowej.

2. Ekstrakcja DNA przy użyciu zawiesiny matrycowej i homogenizatora wysokich obrotów (Rysunek 2)

  1. Przed rozpoczęciem pracy do probótek z nakrętką o pojemności 1,5 lub 2 mL należy dodać trzy szklane kuleczki o średnicy 2 mm, lekko zakręcić probówki i poddać autoklawowaniu (idealnie co najmniej dzień przed ekstrakcją DNA).
  2. Wyjąć zawiesinę matrycy z lodówki i umieścić ją na mieszadle magnetycznym (magnes znajduje się w butelce z odczynnikiem), aby doprowadzić odczynnik do temperatury pokojowej i rozpocząć jego mieszanie.
  3. Włączyć blok grzejny i rozgrzać go do 56 °C (jeśli dostępne są dwa bloki grzejne, drugi należy rozgrzać do 100 °C.
    UWAGA: Następujące kroki można wykonywać na stole laboratoryjnym w placówce o poziomie bezpieczeństwa BSL2:
  4. Odwiruj próbkę osadu z plwociny inaktywowaną ciepłem przy 16 800 × g (lub z maksymalną prędkością) przez 15 min. Za pomocą pipety 20-200 µL delikatnie odessać i usunąć nadsącz, dbając o to, aby osad pozostał nienaruszony.
  5. Wymieszać zawiesinę matrycy poprzez delikatne potrząsanie (nie używać vortexa) i dodać 200 µL dobrze wymieszanej matrycy w celu resuspensji osadu.
  6. Przenieść całą objętość do probówki z nakrętką o pojemności 1,5 mL zawierającej trzy wysterylizowane szklane kuleczki o średnicy 2 mm.
  7. Umieścić próbki w bloku grzejnym i inkubować w 56 °C przez 15 min.
    UWAGA: Jeśli dostępny jest tylko jeden blok grzejny, natychmiast po wyjęciu próbki z bloku grzejnego, po kroku 2.7 należy ustawić temperaturę bloku na 100 °C.
  8. Uhomogenizować próbki za pomocą vortexa przez 10 s w celu rozproszenia komórek.
  9. Umieścić próbki w bloku grzejnym i inkubować w 100 °C przez 10 min.
  10. Uhomogenizować próbki za pomocą homogenizatora wysokich prędkości z następującymi parametrami: jeden cykl 60 s przy 4,0 m/s.
  11. Wirować przy 12 000 × g przez 5 min. Przenieść 130 µL nadsączu zawierającego DNA do nowej probówki low-binding o pojemności 1,5 mL, nie naruszając osadu (matrycy z debris komórkowym). Pierwszą probówkę zawierającą matrycę i debris komórkowy należy wyrzucić.
    UWAGA: BEZPIECZNY PUNKT ZATRZYMANIA. W przypadku przerwania pracy, zamrozić próbki w -20 °C do czasu kontynuacji oczyszczania DNA.
  12. Przejść do oczyszczania DNA przy użyciu kuleczek magnetycznych.

Schemat przetwarzania próbki plwociny: etapy wirowania, mieszania w wortexie, inkubacji i homogenizacji.
Rysunek 2: Metoda ekstrakcji DNA oparta na macierzy w połączeniu z homogenizatorem wysokich obrotów. Skrót: HSH = homogenizator wysokich obrotów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

3. Oczyszczanie DNA przy użyciu kulek magnetycznych (Rysunek 3)

UWAGA: Przed przystąpieniem do oczyszczania DNA należy wykonać kroki 3.1 i 3.2.

  1. Wyjąć kuleczki magnetyczne z lodówki i pozostawić pojemnik w temperaturze pokojowej przez 30 min w celu wyrównania temperatury. Alternatywnie, wymieszać butelkę z zapasem kuleczek magnetycznych na wirówce typu vortex, aby resuspendować wszystkie kuleczki, odpipetować alikwot 1 280 µL do nowej probówki (do oczyszczania 21 próbek) i pozostawić w temperaturze pokojowej w celu wyrównania temperatury.
  2. Przygotować 9 mL 80% etanolu, dodając 7,2 mL czystego alkoholu etylowego do 1,8 mL filtrowanej i wysterylizowanej wody.
    UWAGA: Kolejne kroki można wykonywać na stole laboratoryjnym w placówce BSL2.
  3. Dokładnie wymieszać na wirówce typu vortex butelkę z zapasem kuleczek magnetycznych lub przygotowany alikwot, aby upewnić się, że kuleczki zostały resuspendowane przed użyciem. Powtarzać mieszanie po każdych 10 próbkach, aby zapewnić jednorodność zawiesiny.
  4. Dodać 1,2x objętości (156 µL) kuleczek magnetycznych do wyekstrahowanego DNA (130 µL).
    UWAGA: W przypadku próbek z większą ilością DNA (hodowla), można przetworzyć mniejszy alikwot próbki (np. 50 µL) i oczyścić go przy użyciu 1,2x objętości kuleczek magnetycznych.
  5. Wymieszać próbki, pipetując 10 razy. Inkubować próbki przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  6. Umieścić próbki na statywie magnetycznym do probówek 1,5 mL na 3 min lub do momentu, aż ciecz stanie się klarowna. Ostrożnie odessać i usunąć nadsącz, nie naruszając kuleczek.
  7. Przy probówkach pozostających na magnesie dodać 200 µL 80% etanolu, dbając o to, aby kuleczki nie zostały naruszone, i inkubować przez 30 s.
  8. Ostrożnie odessać i usunąć etanol, nie naruszając kuleczek.
  9. Powtórzyć krok 3.7, aby wykonać łącznie dwa przemycia.
  10. Po drugim przemyciu usunąć etanol. Usunąć pozostałości etanolu za pomocą pipety 1-10 µL.
  11. Pozostawić probówki otwarte, aby kuleczki wyschły na powietrzu przez 10 min lub do momentu, gdy kuleczki nabiorą matowego wyglądu.
    UWAGA: Nie doprowadzić do nadmiernego wysuszenia kuleczek i ich popękania.
  12. Gdy kuleczki nabiorą matowego wyglądu, natychmiast zdjąć probówki z magnesu i dodać 50 µL wody wolnej od nukleaz (NFW) bezpośrednio na kuleczki w każdej próbce. Po dodaniu NFW do wszystkich probówek wymieszać każdą próbkę z osobna, pipetując 10 razy. Sprawdzić, czy w probówce nie ma kuleczek przyklejonych do ścianek i w razie potrzeby powtórzyć etap mieszania. Inkubować próbki przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Czas inkubacji można wydłużyć z 5 min do 10 min, ale nie należy skracać go poniżej 5 min.
  13. Umieścić probówki z powrotem na statywie magnetycznym na 3 min lub do momentu, aż ciecz stanie się klarowna. Przy probówkach znajdujących się na statywie magnetycznym przenieść nadsącz zawierający DNA do wyraźnie oznakowanej, sterylnej probówki o niskim wiązaniu białek. Upewnić się, że kuleczki nie zostały przeniesione wraz z nadsączem.
    UWAGA: Jeśli podczas przenoszenia w końcówce pipety widoczne są kuleczki, przenieść nadsącz z powrotem do probówki na statywie magnetycznym, aby oddzielić go przez kolejne 3 min. Nie przenosić kuleczek do nowej probówki.
    BEZPIECZNY PUNKT ZATRZYMANIA. W przypadku przerwania procedury zamrozić próbki w temperaturze -20 °C do momentu rozpoczęcia kwantyfikacji przy użyciu odpowiedniej dla NGS metody oraz późniejszej amplifikacji PCR z wykorzystaniem testu MTB tNGS.

Schemat oczyszczania DNA za pomocą kulek magnetycznych; proces obejmuje mieszanie, inkubację, separację i przemywanie etanolem.
Rycina 3: Oczyszczanie i zagęszczanie DNA przy użyciu kulek magnetycznych. Skróty: NFW = woda wolna od nukleaz; tNGS = ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wyniki

Opis próbek
Łącznie 165 próbek osadu z plwociny, dodatnich w kierunku prątków kwasoodpornych (AFB) w badaniu mikroskopowym przy obciążeniu bakteryjnym co najmniej 1+, zostało rutynowo pobranych i opracowanych przez National Health Laboratory Services (NHLS) Green Point w Kapsztadzie, RPA. DNA wyekstrahowano z próbek osadu z plwociny przy użyciu dwóch różnych objętości [około 2 mL (n = 102) oraz 500 µL (n = 63)]. Porównanie to przeprowadzono w celu oceny, czy mniejsza objętość próbki osadu może dostarczyć wystarczającej ilości DNA do dalszego tNGS.

Rysunek 4 przedstawia porównanie stężeń całkowitego DNA (ng/µL) za pomocą wykresu pudełkowego w zależności od różnych stopni nasilenia obrazu w plwocinach (1+, 2+ i 3+) oraz objętości osadu z plwocin (2 mL i 500 µL). Uzysk DNA zazwyczaj ogólnie spada przy użyciu 500 µL osadu do ekstrakcji, z różną zmiennością w zależności od stopni nasilenia obrazu. Zatem średnie stężenia DNA wyekstrahowane z próbek osadu o objętości co najmniej 2 mL były średnio wyższe niż stężenie DNA wyekstrahowane z osadów o objętości 500 µL, w rozwarstwieniu według obecności AFB w próbce.

Wykres pudełkowy stężenia DNA, stopień rozmazania, porównanie grup; analiza danych, próbki 2 mL vs 500 µL.
Rycina 4: Wpływ objętości osadu plwociny na wydajność DNA w zależności od stopnia rozmazania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 5 przedstawia wykresy pudełkowe ilustrujące średnią liczbę odczytów sekwencjonowania (średnią głębokość pokrycia) wszystkich celów dla próbek osadu z plwociny o różnych stopniach wymazu (1+, 2+ i 3+), przetworzonych z dwóch różnych objętości wejściowych (2 mL i 500 µL). Wartości odstające są reprezentowane przez poszczególne punkty, a oś y jest wyświetlana w skali logarytmicznej, aby uwzględnić zmienność pokrycia. Wysoki rozstęp międzykwartylowy dla próbek 3+ wyekstrahowanych z osadów 500 µL sugeruje większą zmienność przy wyższym obciążeniu bakteryjnym.

Wykres pudełkowy porównujący pokrycie dla różnych stopni rozmazania w różnych objętościach próbek (2 mL, 500 µL).
Rycina 5: Porównanie średniej liczby odczytów sekwencjonowania (głębokość pokrycia) dla wszystkich celów w zależności od stopnia rozmazania i objętości wejściowej próbki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 6 przedstawia ocenę dopuszczalności wyników sekwencjonowania z wykorzystaniem potoku bioinformatycznego powiązanej aplikacji internetowej. Wyniki jakości sekwencjonowania zostały podzielone na kategorie: +++ (wysoce dopuszczalne), ++ (dopuszczalne), + (marginalnie dopuszczalne), - (niedopuszczalne) oraz ND (nieokreślone). Brak słupka na wykresie oznacza, że dla danej kategorii nie uzyskano wyników. Dla zestawu próbek o objętości wejściowej 500 µL stopień rozmazania 1+ wykazuje wyższą proporcję wyników niedopuszczalnych i ND w porównaniu do stopni rozmazania 2+ i 3+. Próbki wyekstrahowane z 500 µL osadu plwociny miały średnią głębokość pokrycia sekwencjonowania wynoszącą 4 316, w porównaniu do 4 810 dla próbek wyekstrahowanych z 2 mL osadu plwociny. Sugeruje to, że DNA wyekstrahowane z osadu plwociny było wystarczające do przeprowadzenia dalszego tNGS, niezależnie od objętości wejściowej.

Na podstawie rozkładu akceptowalności wyników sekwencjonowania, próbki o stopniu rozmycia (smear grade) 3+ wykazały najwyższy wskaźnik sukcesu, przy czym większość sekwencji próbek oceniono jako ++ i +++, w porównaniu do próbek o stopniu rozmycia 1+ i 2+. W przypadku próbek z wkładem 500 µL proporcja próbek w kategoriach - i + jest stosunkowo wyższa we wszystkich stopniach rozmycia w porównaniu do próbek z wkładem 2 mL. Sugeruje to, że więcej próbek przy wkładzie 500 µL trafia do kategorii o niższej jakości i mniejszej akceptowalności. Dla próbek z wkładem 2 mL obserwuje się wyższą proporcję próbek w kategoriach wyższej jakości, ++ i +++, szczególnie dla stopnia rozmycia 3+. Sugeruje to, że próbki z wkładem 2 mL mają większą szansę na uzyskanie lepszych wyników jakości sekwencjonowania w porównaniu do próbek z wkładem 500 µL.

Analiza jakości próbek; histogram porównujący procentowy udział próbek w zależności od objętości (500 μL, 2 mL) oraz stopnia rozmazania.
Rysunek 6: Rozkład wyników jakości w zależności od stopnia rozmazania i objętości wejściowej próbek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Połączenie metody ekstrakcji opartej na matrycy w połączeniu z homogenizatorem o dużej prędkości zostało pierwotnie opublikowane przez Shea i wsp.9. Metoda ta została opracowana i zoptymalizowana dla WGS DNA wyekstrahowanego z kultur MTBC 9,10. Zoptymalizowaliśmy tę metodę do użytku z testem MTB tNGS. Ekstrakcja i oczyszczanie DNA z 21 próbek miały łączny czas realizacji wynoszący 4 godziny i 40 minut, wliczając etapy inkubacji i wirowania. Wiarygodność opisanego protokołu w połączeniu z oczyszczaniem kulkowym w celu ekstrakcji DNA z próbek o stopniach rozmazu wahających się od 1+ do 3+ wykazano na podstawie średniej wydajności (Figura 4), ogólnej głębokości pokrycia wszystkich celów łącznie (Figura 5) oraz wyniku akceptowalności wyniku sekwencjonowania określonego przez powiązaną aplikację internetową (Rysunek 6).

Niedawne badanie nie wykazało spójnego związku między stopniem rozmazu a stężeniem DNA lub głębokością odczytu sekwencjonowania. Autorzy zasugerowali, że zmienność w etapach przetwarzania i oczyszczania próbek może wpływać na wydajność w próbkach o wysokiej jakości rozmazu, szczególnie gdy zanieczyszczenia nie są skutecznie usuwane. Ponadto sekwencjonowanie z osadu plwociny pozostaje wyzwaniem ze względu na złożoność puli DNA, w której DNA niebędące celem może konkurować z DNA MTB11. Chociaż nie zaobserwowaliśmy żadnej wyraźnej korelacji między wejściowym stężeniem DNA a głębokością sekwencjonowania, ważne jest, aby pamiętać, że wejście DNA przed docelowym PCR nie powinno przekraczać 100 ng, zgodnie z instrukcjami producenta, ponieważ może to prowadzić do zahamowania PCR. Dodatkowo, większe obciążenie bakteryjne, próbki osadu plwociny 2+ i 3+ mogą zawierać więcej zanieczyszczeń, takich jak ludzkie DNA, szczątki komórkowe i inne inhibitory, które mogą zakłócać amplifikację PCR i przygotowanie biblioteki.

Etap oczyszczania funkcjonuje również jako etap koncentracji, zwiększając wydajność prątkowego DNA przed tNGS. Metoda ta jest skuteczna w przetwarzaniu próbek o niskim obciążeniu bakteryjnym i wykazała niezawodną wydajność przy objętościach tak małych jak 500 μl, dzięki czemu nadaje się do rutynowych ustawień, w których dostępna jest ograniczona objętość próbki. Jego zastosowanie może zmniejszyć potrzebę wizyt kontrolnych w klinikach, minimalizując w ten sposób ryzyko utraty pacjenta na kontrolę. Ponadto metoda jest prosta i nie wymaga zaawansowanej wiedzy laboratoryjnej, co dodatkowo wspiera jej integrację z ustawieniami o ograniczonych zasobach.

Należy jednak zwrócić uwagę na kilka punktów dotyczących protokołu. Próbek nie należy zamrażać ani przechowywać w lodówce bezpośrednio po inkubacji w temperaturze 80 °C. Szybkie chłodzenie bezpośrednio po obróbce cieplnej może spowodować kondensację pary wodnej na wewnętrznych powierzchniach probówki, co prowadzi do rozcieńczenia próbki i potencjalnie wpływa na dalszą ekstrakcję DNA. Ponadto nagłe chłodzenie może zwiększyć ryzyko degradacji próbki poprzez promowanie fragmentacji kwasów nukleinowych lub aktywności enzymatycznej, które mogły nie zostać całkowicie dezaktywowane podczas obróbki cieplnej. Rozważania te są szczególnie istotne podczas przetwarzania próbek plwociny w celu wykrycia MTB. Zgodnie z zaleceniami WHO dotyczącymi barwienia Ziehl-Neelsen, stopień rozmazu 1+ odpowiada 10-99 AFB na 100 pól zanurzeniowych oleju, 2+ oznacza 1-10 AFB na pole na co najmniej 50 polach, a 3+ oznacza więcej niż 10 AFB na pole na co najmniej 20 polach12.

Ograniczeniem tej metody jest brak automatyzacji ze względu na wymóg ręcznej homogenizacji za pomocą homogenizatora o dużej prędkości lub urządzenia do ubijania kulek. Aby temu zaradzić, trwają wysiłki koncentrujące się na udoskonaleniu protokołu poprzez testowanie krótszych czasów inkubacji, niższych temperatur inkubacji i alternatywnych podejść do szybkiej homogenizacji.

Tak więc ta metoda ekstrakcji DNA oparta na matrycy, w połączeniu z szybkim homogenizatorem, jest techniką szybkiej ekstrakcji DNA, która wykorzystuje ciepło i bicie kulek w celu uwolnienia genomowego DNA, jednocześnie usuwając inhibitory PCR, takie jak metale i białka.

Oświadczenia

Autor T. R. otrzymuje wsparcie finansowe od FIND w ramach umowy o świadczenie usług z UC San Diego. Autor T. R. otrzymał grant z NIH na opracowanie i ocenę rozwiązania tNGS dla lekoopornej gruźlicy (R01AI176401). Autor T. R. jest współzałożycielem, członkiem zarządu i nieopłacanym udziałowcem Verus Diagnostics Inc.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować zespołowi laboratoryjnemu zajmującemu się gruźlicą w NHLS - Green Point, Republika Południowej Afryki, za udzielenie pomocy technicznej. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (NIH) i Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND), projekt TS ELiOT Grant ID: R01AI153213, Unitaid Grant ID: 2019-32-FIND MDR. Figury zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alternatywa: Benchmark BeadBlaster 24Benchmark naukowyZobacz materiał D2400
Odczynnik na bazie kulek AMPure XPBeckman CoulterNr kat. A63881
Autoklawowane lub sterylne kulki szklane (2 mm)Sigma-AldrichZ273627-1EA
Alkohol etylowy, czysty Sigma-AldrichE7023-500ML
Końcówki do pipet z filtrem (10 &mikro; L)Bio-Smart NaukowyCzołg FT-10-R
Końcówki do pipet z filtrem (1000 &mikro; L)Bio-Smart NaukowyFT1000-R
Końcówki do pipet z filtrem (20 &mikro; l)Bio-Smart NaukowyMiernik FT20-R
Końcówki do pipet z filtrem (200 &mikro; L)Bio-Smart NaukowyFT200-R
Blok grzewczy od 37 stopni C do 100 ° C Eppendorf powiedział:5382000031
Homogenizator szybkoobrotowy (HSM) jako FastPrep-24MP Biomedycyna116005500
Inkubator 80 ° CGrupa LasecIBLPDHG-9030A
Macierz InstaGeneBio-Rad Laboratories Inc.BBRD7326030
Mikroprobówki o niskim poziomie wiązania (1,5 ml lub 2 ml)Eppendorf powiedział:EP0030108051-250EA
Stojak magnetyczny na 1,5 i ndash; 2 ml probówkiThermo Fisher Scientific Inc.Numer katalogowy 12321D
Mieszadło magnetyczneMerckZ671886
MikrowirówkaEppendorf powiedział:5406000046
System oczyszczania wody czystej Milli-Q IX 7015MerckZIX7015T0C
Woda wolna od nukleaz (NFW), klasa molekularnaThermo Fisher Scientific Inc.Zobacz materiał AM9937
Pipety (P10, P20, P200 i P1000)Eppendorf powiedział:EP3123000918-1EA
Probówki do oznaczania kubitówThermo Fisher Scientific Inc.Numer katalogowy Q32856 powiedział:
Zestaw do oznaczania Qubit dsDNA HSThermo Fisher Scientific Inc.Q33231 powiedział:
Przyrząd do fluorometru kubitowegoThermo Fisher Scientific Inc.Numer katalogowy Q33226 powiedział:
Rurki z nakrętką (1,5 ml)Specjalności naukowe Inc.P2TUB056C-0001.5ST
WirGrupa LasecWMBB0L0E0216

Bibliografia

  1. Global Tuberculosis Report 2024. Geneva: WHO. , World Health Organization. https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-programme/tb-reports/global-tuberculosis-report-2024 (2024).
  2. De Araujo, L., et al. Implementation of targeted next-generation sequencing for the diagnosis of drug-resistant tuberculosis in low-resource settings: a programmatic model, challenges, and initial outcomes. Front Public Health. 11, 1204064(2023).
  3. Murphy, S. G., et al. Direct detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using targeted next generation sequencing. Front Public Health. 11, 1206056(2023).
  4. Kambli, P., et al. Targeted next generation sequencing directly from sputum for comprehensive genetic information on drug resistant Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 127, 102051(2021).
  5. WHO Consolidated Guidelines on Tuberculosis.Module 3: Diagnosis. Rapid diagnostics for tuberculosis detection. Third edition. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/376221/9789240089488-eng.pdf?sequence=1 (2024).
  6. Catalogue of mutations in Mycobacterium tuberculosis. complex and their association with drug resistance. Second edition. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/374061/9789240082410-eng.pdf?sequence=1 (2023).
  7. Schwab, T. C., et al. Targeted next-generation sequencing to diagnose drug-resistant tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 24 (10), 1162-1176 (2024).
  8. Deeplex Myc-TB manual version 5. , GenoScreen. https://acrobat.adobe.com/link/track?uri=urn%3Aaaid%3Ascds%3AUS%3A67c2b53f-c91d-3a73-a6ea-4769e7c8fe57 (2023).
  9. Shea, J., et al. Comprehensive whole-genome sequencing and reporting of drug resistance profiles on clinical cases of Mycobacterium tuberculosis in New York State. J Clin Microbiol. 55 (6), 1871-1882 (2017).
  10. Conceição, E. C., et al. Mycobacterium tuberculosis. DNA extraction using InstaGene Matrix and high-speed homogenizer from clinical primary culture. , https://www.protocols.io/view/mycobacterium-tuberculosis-dna-extraction-using-in-dhvs366e (2024).
  11. Nilgiriwala, K., et al. Genomic sequencing from sputum for tuberculosis disease diagnosis, lineage determination, and drug susceptibility prediction. J Clin Microbiol. 61 (3), e0157822(2023).
  12. Laboratory Services in Tuberculosis Control Part II: Microscopy. Geneva: WHO. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/65942/WHO_TB_98.258_(part2).pdf?sequence=2 (1998).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Celowane NGSgruźlica lekoopornaoczyszczanie za pomocą kulek magnetycznychbadanie wrażliwości na lekiokreślanie linii rozwojowejtypowanie szczepów
Ekstrakcja DNA oparta na matrycy do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji na odkażonych próbkach plwociny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.