Method Article

Ekstrakcja DNA oparta na matrycy do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji na odkażonych próbkach plwociny

DOI:

10.3791/68147

⸱

June 6th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Molecular Biology and Human Genetics, SAMRC Centre for TB Research, DSI-NRF Centre of Excellence for Biomedical TB Research, Department of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 2National Health Laboratory Service, Green Point Tuberculosis Laboratory, 3Division of Medical Microbiology, Department of Pathology, University of Cape Town, 4Division of Medical Microbiology, Department of Pathology, University of Cape Town, 5Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Zuckerberg San Francisco General Hospital and Trauma Centre, University of California, San Francisco, 6Department of Medicine, University of California, San Diego, School of Medicine, 7Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND), Campus Biotech

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy zoptymalizowaną metodę ekstrakcji DNA z odkażonej plwociny przy użyciu metody ekstrakcji opartej na matrycy w połączeniu z oczyszczaniem kulek magnetycznych w celu dalszego ukierunkowanego sekwencjonowania Mycobacterium tuberculosis.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) jest obecnie uznawane za potężne narzędzie do szybkiej i dokładnej diagnozy gruźlicy lekoopornej (DR-TB). Targeted NGS (tNGS) oferuje uproszczone podejście poprzez skupienie się na określonych genach związanych z opornością na leki, omijając potrzebę stosowania tradycyjnych metod opartych na hodowlach, których czas realizacji wynosi od tygodni do miesięcy. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zaleciła tNGS jako cenną strategię poprawy diagnostyki gruźlicy (TB) w celu ukierunkowania leczenia i poprawy wyników leczenia, szczególnie w warunkach ograniczonych zasobów. Spośród zalecanych przez WHO testów tNGS wybraliśmy metodę, która zapewnia szybkie i kompleksowe badanie wrażliwości leków, określenie linii i typowanie szczepu. Chociaż dostępne są standardowe metody ekstrakcji DNA, mogą być czasochłonne i pracochłonne. Aby sprostać temu wyzwaniu, zoptymalizowaliśmy uproszczony, oparty na matrycy protokół ekstrakcji DNA w połączeniu z oczyszczaniem kulek magnetycznych. Metoda ta oferuje szybkie i skuteczne podejście do ekstrakcji DNA bezpośrednio z odkażonych osadów plwociny, umożliwiając szybką analizę tNGS na dalszych etapach. Usprawniając proces ekstrakcji DNA z osadu plwociny, protokół ten może ułatwić szersze zastosowanie tNGS w rutynowych warunkach klinicznych, ostatecznie przyczyniając się do poprawy wyników leczenia pacjentów i przyczyniając się do globalnych wysiłków na rzecz kontroli gruźlicy.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szacuje się, że w 2023 r. 3,7 miliona osób z gruźlicą na całym świecie pozostało niezdiagnozowanych i nieleczonych, co podkreśla poważne zagrożenie, jakie gruźlica stanowi dla zdrowia na świecie1. WHO szacuje, że w 2023 r. u około 400 000 osób rozwinęła się gruźlica oporna na ryfampicynę (RR-TB) lub wielolekooporna (MDR-TB)1. Szybkie diagnozowanie i leczenie gruźlicy i DR-TB ma zasadnicze znaczenie dla osiągnięcia kamieni milowych i celów w zakresie zmniejszenia zachorowalności i śmiertelności z powodu gruźlicy1.

Poleganie na konwencjonalnych metodach hodowli i fenotypowych testach wrażliwości leków (pDST) opóźnia określenie profilu oporności izolatów klinicznych i leczenie, z czasem realizacji wynoszącym 6-8 tygodni, i wymaga złożonej infrastruktury biologicznej. Rutynowe testy diagnostyczne, w połączeniu z NGS DR-TB, mogą zapewnić kompleksowy profil lekooporności i poprawić personalizację schematów MDR-TB, jednocześnie skracając czas do skutecznego leczenia z tygodni lub miesięcy do dni 2,3,4.

W latach 2023 i 2024 WHO zaleciła stosowanie tNGS jako nowej klasy diagnostyki w celu szybkiego określenia wrażliwości na leki przeciwgruźlicze pierwszego i drugiego rzutu5. To sprawia, że jest to cenne narzędzie do podejmowania decyzji dotyczących leczenia bez konieczności hodowli Mycobacterium tuberculosis (MTB) w laboratoriach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3). Podejście tNGS to skondensowana forma sekwencjonowania, która wykorzystuje reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) do amplifikacji celów genowych nadających oporność na leki przed sekwencjonowaniem. Spośród zalecanych przez WHO testów tNGS wybraliśmy test Deeplex Myc-TB, który według doniesień spełnia kryteria oparte na klasie wykrywania oporności na ryfampicynę, izoniazyd, etambutol, pirazynamid, fluorochinolony, amikacynę, streptomycynę, linezolid, bedakilinę i klofaziminę. Używamy tego testu do oceny przydatności DNA wyekstrahowanego przy użyciu tego protokołu dla dalszych tNGS.

Ponadto Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) opublikowała 2. edycję katalogu mutacji związanych z lekoopornością w MTB, zapewniając mapę drogową dla zastosowania sekwencjonowania całego genomu (WGS) i tNGS do przewidywania wrażliwości leków i kierowania leczeniem6. Niedawny przegląd systematyczny i metaanaliza wykazały, że tNGS miał czułość i swoistość odpowiednio 94,1% i 98,1% w wykrywaniu oporności na leki, w oparciu o 23 cele w różnych regionach nadających oporność w genomie MTB, w porównaniu z pDST7.

Jednak wdrożenie tych metod pozostaje wyzwaniem ze względu na złożoność i koszty związane z wymaganymi przepływami pracy, infrastrukturą i sprzętem. Krytycznym wyzwaniem jest wyizolowanie wystarczającej ilości wysokiej jakości prątkowego DNA bezpośrednio z osadu odkażonej plwociny, co jest kluczowym krokiem w dalszych zastosowaniach tNGS. Aby temu zaradzić, przedstawiamy szybką i prostą metodę ekstrakcji DNA dostosowaną do tNGS.

Standaryzowana metoda ekstrakcji DNA dla wybranego testu MTB tNGS obejmuje wewnętrzny protokół ręczny i automatyczny8. W tym miejscu opisujemy uproszczony, oparty na matrycy protokół ekstrakcji DNA (ryc. 1). Metoda wykorzystuje InstaGene Matrix (IGM), który wiąże metale i białka, umożliwiając wysokiej jakości ekstrakcję kwasów nukleinowych bezpośrednio z odkażonych osadów plwociny. Ta alternatywa zapewnia szybszy czas realizacji i wystarczającą wydajność DNA dla dalszych tNGS. Protokół ten pokonuje złożoność metod ręcznych i automatycznych, zapewniając jednocześnie jakość tNGS do szybkiej diagnozy wariantów, które nadają oporność w MTB. Wraz z rosnącym zainteresowaniem wykorzystaniem tNGS w dziedzinie mikobakteriologii, protokół ten może ułatwić jego zastosowanie w rutynowych przepływach pracy diagnostycznej.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie metod ekstrakcji prątków DNA z odkażonych próbek osadu plwociny przy użyciu zawiesiny matrycy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Badań: Bezpieczeństwo Biologiczne i Środowiskowe (REC: BES) na Uniwersytecie Stellenbosch: BES-2024-25384 oraz Komitet Etyki Badań Naukowych: N21/09/093 i N09/11/296.

1. Przygotowanie próbki osadu plwociny

UWAGA: Poniższe kroki należy wykonać w laboratorium o trzecim poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL3) przed ekstrakcją DNA.

  1. Przygotować podwielokrotność próbki osadu plwociny uprzednio odkażonej przy użyciu N-acetylo-L-cysteiny (NALC) i wodorotlenku sodu (NaOH) (NALC/NaOH), przenosząc 500 μl-2 ml do probówki o niskim stopniu wiązania o pojemności 1,5 ml lub 2 ml.
  2. Umieścić probówki zawierające próbki osadu plwociny w pozycji pionowej w stojaku na probówki, następnie umieścić próbki w piecu w temperaturze 80 °C i inkubować przez 1 godzinę w celu dezaktywacji prątków poprzez obróbkę cieplną.
  3. Po 1 godzinie wyjmij stojak na probówki z próbkami, wytrzyj powierzchnie probówek i umieść je w odpowiednim pojemniku do transportu do laboratorium na drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL2).
    UWAGA: Pozwól próbkom ostygnąć do temperatury pokojowej przed dalszym przenoszeniem lub przechowywaniem.

2. Ekstrakcja DNA za pomocą zawiesiny matrycy i homogenizatora o dużej prędkości (ryc. 2)

  1. Przed rozpoczęciem dodaj trzy szklane kulki o średnicy 2 mm do probówek z nakrętką o pojemności 1,5 lub 2 ml, luźno zakręconych i autoklaw (najlepiej co najmniej dzień przed ekstrakcją DNA).
  2. Wyjmij zawiesinę matrycy z lodówki i umieść ją na mieszadle magnetycznym (magnes jest dołączony do butelki z odczynnikiem), aby doprowadzić odczynnik do temperatury pokojowej i rozpocząć mieszanie odczynnika.
  3. Włączyć blok grzewczy i rozgrzać do 56 °C (jeśli dostępne są dwa bloki grzewcze, podgrzej drugi do 100 °C.
    UWAGA: Następujące czynności można wykonać na stole laboratoryjnym w obiekcie BSL2:
  4. Odwirować inaktywowaną termicznie próbkę osadu plwociny o masie 16 800 × g (lub pełnej prędkości) przez 15 minut. Za pomocą pipety o pojemności 20-200 μl delikatnie odessać i wyrzucić supernatant, upewniając się, że osad pozostaje nienaruszony.
  5. Wymieszać zawiesinę matrycy przez delikatne potrząsanie (nie wirować) i dodać 200 μl dobrze wymieszanej matrycy w celu ponownego zawieszenia osadu.
  6. Odpipetować całą objętość do zakrętki o pojemności 1,5 ml zawierającej trzy wstępnie wysterylizowane szklane kulki o średnicy 2 mm.
  7. Umieścić próbki w bloku grzewczym i inkubować w temperaturze 56 °C przez 15 minut.
    UWAGA: Natychmiast po wyjęciu próbki z bloku grzewczego, należy ustawić blok grzewczy na 100 °C po kroku 2.7, jeśli dostępny jest tylko jeden blok grzewczy.
  8. Homogenizować próbki za pomocą wiru przez 10 s w celu rozproszenia komórek.
  9. Umieścić próbki w bloku grzewczym i inkubować w temperaturze 100 °C przez 10 minut.
  10. Homogenizować próbki za pomocą homogenizatora szybkoobrotowego o następujących parametrach: jeden cykl 60 s z prędkością 4,0 m/s.
  11. Wirować przy 12 000 × g przez 5 min. Przenieść 130 μl supernatantu zawierającego DNA do świeżej probówki o niskiej wiązalności o pojemności 1,5 ml bez naruszania osadu (matrycy z resztkami komórek). Wyrzuć pierwszą probówkę zawierającą matrycę i resztki komórek.
    UWAGA: BEZPIECZNY PUNKT ZATRZYMANIA. W przypadku przerwania należy zamrozić próbki w temperaturze -20 °C, aż będą gotowe do kontynuowania oczyszczania DNA.
  12. Kontynuuj oczyszczanie DNA za pomocą kulek magnetycznych.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Metoda ekstrakcji DNA oparta na matrycy w połączeniu z homogenizatorem o dużej prędkości. Skrót: HSH = homogenizator wysokoobrotowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Oczyszczanie DNA za pomocą kulek magnetycznych (ryc. 3)

UWAGA: Przed przystąpieniem do oczyszczania DNA wykonaj kroki 3.1 i 3.2.

  1. Wyjmij koraliki magnetyczne z lodówki i umieść pojemnik w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby uzyskać równowagę. Alternatywnie, należy przemieszać wirowo butelkę z kulkami magnetycznymi, aby ponownie zawiesić wszystkie kulki i zassać podwielokrotność 1 280 μl do nowej probówki (w celu oczyszczenia 21 próbek) i umieścić w temperaturze pokojowej w celu zrównoważenia.
  2. Przygotuj partię 9 ml 80% etanolu, dodając 7,2 ml czystego alkoholu etylowego do 1,8 ml przefiltrowanej i wysterylizowanej wody.
    UWAGA: Poniższe czynności można wykonać na stole laboratoryjnym w obiekcie BSL2.
  3. Dokładnie przekręć butelkę z kulkami magnetycznymi lub przygotowaną porcję, aby upewnić się, że kulki zostały ponownie zawieszone przed użyciem. Powtórzyć wirowanie po każdych 10 próbkach, aby zapewnić jednorodną zawiesinę.
  4. Dodać 1,2x objętość (156 μL) kulek magnetycznych do wyekstrahowanego DNA (130 μL).
    UWAGA: W przypadku próbek z większą ilością DNA (hodowla) można przetworzyć mniejszą porcję próbki (np. 50 μL) i oczyścić ją 1,2-krotnie większą objętością kulek magnetycznych.
  5. Wymieszać próbki, pipetując 10 razy. Próbki należy inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Umieść próbki na stojaku magnetycznym w probówce o pojemności 1,5 ml na 3 minuty lub do momentu, gdy ciecz stanie się klarowna. Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant, nie naruszając kulek.
  7. Za pomocą probówek na magnesie dodaj 200 μl 80% etanolu, upewniając się, że kulki pozostają nienaruszone i pozostawić do inkubacji przez 30 sekund.
  8. Ostrożnie zassać i wyrzucić etanol, nie naruszając kulek.
  9. Powtórz krok 3.7, co daje w sumie dwa prania.
  10. Po drugim umyciu wyjmij i wyrzuć etanol. Usuń resztki etanolu za pomocą pipety o pojemności 1-10 μl.
  11. Pozostaw probówki otwarte, aby wysuszyć koraliki na powietrzu przez 10 minut lub do momentu, gdy koraliki będą miały matowy wygląd.
    UWAGA: Nie pozwól, aby koraliki przeschły i popękały.
  12. Gdy kulki uzyskają matowy wygląd, natychmiast wyjmij rurki z magnesu i dodaj 50 μl wody wolnej od nukleaz (NFW) bezpośrednio na kulki w każdej próbce. Po dodaniu NFW do wszystkich probówek, wymieszaj każdą pojedynczą próbkę, pipetując 10 razy. Sprawdź probówkę pod kątem kulek, które utknęły po wewnętrznej stronie rurki i w razie potrzeby powtórz etap mieszania. Próbki należy inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Inkubację można zwiększyć z 5 min do 10 min, ale nie należy skracać czasu inkubacji do mniej niż 5 min.
  13. Umieść probówki z powrotem na stojaku magnetycznym na 3 minuty lub do momentu, gdy płyn będzie klarowny. Za pomocą probówek umieszczonych na stojaku magnetycznym przenieś supernatant zawierający DNA do wyraźnie oznaczonej, sterylnej probówki o niskim stopniu wiązania. Upewnij się, że kulki nie są przenoszone do supernatantu.
    UWAGA: Jeśli podczas przenoszenia na końcówce pipety widoczne są kulki, odpipetuj supernatant z powrotem do probówki na stojaku magnetycznym, aby oddzielić na dodatkowe 3 minuty. Nie przenoś koralików do nowej tuby.
    BEZPIECZNY PUNKT ZATRZYMANIA. W przypadku przerwania należy zamrozić próbki w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będą gotowe do kontynuowania oznaczania ilościowego przy użyciu metody odpowiedniej dla NGS, a następnie amplifikacji PCR przy użyciu testu MTB tNGS.

figure-protocol-2
Ryc. 3: Oczyszczanie i zagęszczanie DNA za pomocą kulek magnetycznych. Skróty: NFW = woda wolna od nukleaz; tNGS = ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przykładowy opis
W sumie 165 próbek osadu plwociny, dodatnich na obecność pałeczek kwasoodpornych (AFB) pod mikroskopem z ładunkiem bakteryjnym co najmniej 1+, zostało rutynowo pobranych i przetworzonych przez National Health Laboratory Services (NHLS) Green Point w Kapsztadzie w Republice Południowej Afryki. DNA wyekstrahowano z próbek osadu plwociny przy użyciu dwóch różnych objętości [około 2 ml (n = 102) i 500 μl (n = 63)]. Porównanie to przeprowadzono w celu oceny, czy mniejsza objętość próbki osadu może dostarczyć wystarczające DNA dla tNGS.

Rysunek 4 przedstawia porównanie wykresu pudełkowego całkowitego stężenia DNA (ng / μL) w różnych stopniach rozmazu plwociny (1+, 2+ i 3+) oraz objętości osadu plwociny (2 ml i 500 μl). Wydajność DNA na ogół zmniejsza się ogólnie przy użyciu 500 μl osadu do ekstrakcji, przy czym występuje zmienność w zależności od stopnia rozmazu. Zatem średnie stężenia DNA wyekstrahowane z próbek osadu o objętości co najmniej 2 ml były średnio wyższe niż stężenie DNA wyekstrahowane z osadów o objętości 500 μl, stratyfikowanych przez AFB próbki.

figure-results-1
Rysunek 4: Wpływ objętości osadu plwociny na wydajność DNA w różnych stopniach rozmazu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5 przedstawia wykresy pudełkowe, które ilustrują średnią liczbę odczytów sekwencjonowania (średnia głębokość pokrycia) wszystkich celów dla próbek osadu plwociny o różnym stopniu rozmazu (1+, 2+ i 3+) przetworzonych z dwóch różnych objętości wejściowych (2 ml i 500 μl). Wartości odstające są reprezentowane przez pojedyncze punkty, a oś y jest wyświetlana w skali logarytmicznej, aby uwzględnić różnice w pokryciu. Wysoki zakres międzykwartylowy dla próbek 3+ ekstrahowanych z osadów o objętości 500 μl sugeruje większą zmienność przy wyższych obciążeniach bakteryjnych.

figure-results-2
Rysunek 5: Porównanie średniej liczby odczytów sekwencjonowania (głębokości pokrycia) dla wszystkich celów w różnych klasach rozmazu i objętościach wejściowych próbek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6 przedstawia ocenę akceptowalności wyników sekwencjonowania przy użyciu potoku bioinformatycznego powiązanej aplikacji internetowej. Wyniki jakości sekwencjonowania są podzielone na kategorie: +++ (wysoce akceptowalne), ++ (dopuszczalne), + (marginalnie akceptowalne), - (niedopuszczalne) i ND (nieokreślone). Brak słupka na wykresie oznacza, że nie uzyskano żadnych wyników dla tej konkretnej kategorii. Rozmaz stopnia 1+ wykazuje wyższy odsetek wyników niedopuszczalnych i ND w porównaniu z rozmazami o stopniu 2+ i 3+ dla zestawu próbek wejściowych o objętości 500 μl. Próbki wyekstrahowane z 500 μl osadu plwociny miały średnią głębokość sekwencjonowania wynoszącą 4,316 w porównaniu do 4,810 dla próbek wyekstrahowanych z 2 ml osadu plwociny. Sugeruje to, że DNA wyekstrahowane z osadu plwociny było odpowiednie do wykonywania dalszych tNGS, niezależnie od objętości wejściowej.

Opierając się na rozkładzie akceptowalności wyników sekwencjonowania, próbki o stopniu rozmazu 3+ miały najwyższy wskaźnik sukcesu, przy czym większość sekwencji próbek była oceniana jako ++ i +++ w porównaniu z próbkami o stopniu rozmazu 1+ i 2+. W przypadku próbek wejściowych o pojemności 500 μl odsetek próbek w kategoriach - i + jest stosunkowo wyższy we wszystkich klasach rozmazu w porównaniu z próbkami wejściowymi o pojemności 2 ml. Sugeruje to, że więcej próbek należy do kategorii o niższej jakości, mniej akceptowalnych dla danych wejściowych o pojemności 500 μl. W przypadku próbek wejściowych o pojemności 2 ml występuje większy odsetek próbek w kategoriach wyższej jakości, ++ i +++, szczególnie w przypadku rozmazu klasy 3+. Sugeruje to, że próbki z wkładem 2 ml mają większe szanse na uzyskanie lepszych wyników jakości sekwencjonowania w porównaniu z tymi z wkładem 500 μl.

figure-results-3
Rysunek 6: Rozkład wyników jakości według stopnia rozmazu i objętości wejściowej próby. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenie metody ekstrakcji opartej na matrycy w połączeniu z homogenizatorem o dużej prędkości zostało pierwotnie opublikowane przez Shea i wsp.9. Metoda ta została opracowana i zoptymalizowana dla WGS DNA wyekstrahowanego z kultur MTBC 9,10. Zoptymalizowaliśmy tę metodę do użytku z testem MTB tNGS. Ekstrakcja i oczyszczanie DNA z 21 próbek miały łączny czas realizacji wynoszący 4 godziny i 40 minut, wliczając etapy inkubacji i wirowania. Wiarygodność opisanego protokołu w połączeniu z oczyszczaniem kulkowym w celu ekstrakcji DNA z próbek o stopniach rozmazu wahających się od 1+ do 3+ wykazano na podstawie średniej wydajności (Figura 4), ogólnej głębokości pokrycia wszystkich celów łącznie (Figura 5) oraz wyniku akceptowalności wyniku sekwencjonowania określonego przez powiązaną aplikację internetową (Rysunek 6).

Niedawne badanie nie wykazało spójnego związku między stopniem rozmazu a stężeniem DNA lub głębokością odczytu sekwencjonowania. Autorzy zasugerowali, że zmienność w etapach przetwarzania i oczyszczania próbek może wpływać na wydajność w próbkach o wysokiej jakości rozmazu, szczególnie gdy zanieczyszczenia nie są skutecznie usuwane. Ponadto sekwencjonowanie z osadu plwociny pozostaje wyzwaniem ze względu na złożoność puli DNA, w której DNA niebędące celem może konkurować z DNA MTB11. Chociaż nie zaobserwowaliśmy żadnej wyraźnej korelacji między wejściowym stężeniem DNA a głębokością sekwencjonowania, ważne jest, aby pamiętać, że wejście DNA przed docelowym PCR nie powinno przekraczać 100 ng, zgodnie z instrukcjami producenta, ponieważ może to prowadzić do zahamowania PCR. Dodatkowo, większe obciążenie bakteryjne, próbki osadu plwociny 2+ i 3+ mogą zawierać więcej zanieczyszczeń, takich jak ludzkie DNA, szczątki komórkowe i inne inhibitory, które mogą zakłócać amplifikację PCR i przygotowanie biblioteki.

Etap oczyszczania funkcjonuje również jako etap koncentracji, zwiększając wydajność prątkowego DNA przed tNGS. Metoda ta jest skuteczna w przetwarzaniu próbek o niskim obciążeniu bakteryjnym i wykazała niezawodną wydajność przy objętościach tak małych jak 500 μl, dzięki czemu nadaje się do rutynowych ustawień, w których dostępna jest ograniczona objętość próbki. Jego zastosowanie może zmniejszyć potrzebę wizyt kontrolnych w klinikach, minimalizując w ten sposób ryzyko utraty pacjenta na kontrolę. Ponadto metoda jest prosta i nie wymaga zaawansowanej wiedzy laboratoryjnej, co dodatkowo wspiera jej integrację z ustawieniami o ograniczonych zasobach.

Należy jednak zwrócić uwagę na kilka punktów dotyczących protokołu. Próbek nie należy zamrażać ani przechowywać w lodówce bezpośrednio po inkubacji w temperaturze 80 °C. Szybkie chłodzenie bezpośrednio po obróbce cieplnej może spowodować kondensację pary wodnej na wewnętrznych powierzchniach probówki, co prowadzi do rozcieńczenia próbki i potencjalnie wpływa na dalszą ekstrakcję DNA. Ponadto nagłe chłodzenie może zwiększyć ryzyko degradacji próbki poprzez promowanie fragmentacji kwasów nukleinowych lub aktywności enzymatycznej, które mogły nie zostać całkowicie dezaktywowane podczas obróbki cieplnej. Rozważania te są szczególnie istotne podczas przetwarzania próbek plwociny w celu wykrycia MTB. Zgodnie z zaleceniami WHO dotyczącymi barwienia Ziehl-Neelsen, stopień rozmazu 1+ odpowiada 10-99 AFB na 100 pól zanurzeniowych oleju, 2+ oznacza 1-10 AFB na pole na co najmniej 50 polach, a 3+ oznacza więcej niż 10 AFB na pole na co najmniej 20 polach12.

Ograniczeniem tej metody jest brak automatyzacji ze względu na wymóg ręcznej homogenizacji za pomocą homogenizatora o dużej prędkości lub urządzenia do ubijania kulek. Aby temu zaradzić, trwają wysiłki koncentrujące się na udoskonaleniu protokołu poprzez testowanie krótszych czasów inkubacji, niższych temperatur inkubacji i alternatywnych podejść do szybkiej homogenizacji.

Tak więc ta metoda ekstrakcji DNA oparta na matrycy, w połączeniu z szybkim homogenizatorem, jest techniką szybkiej ekstrakcji DNA, która wykorzystuje ciepło i bicie kulek w celu uwolnienia genomowego DNA, jednocześnie usuwając inhibitory PCR, takie jak metale i białka.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor T. R. otrzymuje wsparcie finansowe od FIND w ramach umowy o świadczenie usług z UC San Diego. Autor T. R. otrzymał grant z NIH na opracowanie i ocenę rozwiązania tNGS dla lekoopornej gruźlicy (R01AI176401). Autor T. R. jest współzałożycielem, członkiem zarządu i nieopłacanym udziałowcem Verus Diagnostics Inc.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować zespołowi laboratoryjnemu zajmującemu się gruźlicą w NHLS - Green Point, Republika Południowej Afryki, za udzielenie pomocy technicznej. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (NIH) i Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND), projekt TS ELiOT Grant ID: R01AI153213, Unitaid Grant ID: 2019-32-FIND MDR. Figury zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alternatywa: Benchmark BeadBlaster 24Benchmark naukowyZobacz materiał D2400
Odczynnik na bazie kulek AMPure XPBeckman CoulterNr kat. A63881
Autoklawowane lub sterylne kulki szklane (2 mm)Sigma-AldrichZ273627-1EA
Alkohol etylowy, czysty Sigma-AldrichE7023-500ML
Końcówki do pipet z filtrem (10 &mikro; L)Bio-Smart NaukowyCzołg FT-10-R
Końcówki do pipet z filtrem (1000 &mikro; L)Bio-Smart NaukowyFT1000-R
Końcówki do pipet z filtrem (20 &mikro; l)Bio-Smart NaukowyMiernik FT20-R
Końcówki do pipet z filtrem (200 &mikro; L)Bio-Smart NaukowyFT200-R
Blok grzewczy od 37 stopni C do 100 ° C Eppendorf powiedział:5382000031
Homogenizator szybkoobrotowy (HSM) jako FastPrep-24MP Biomedycyna116005500
Inkubator 80 ° CGrupa LasecIBLPDHG-9030A
Macierz InstaGeneBio-Rad Laboratories Inc.BBRD7326030
Mikroprobówki o niskim poziomie wiązania (1,5 ml lub 2 ml)Eppendorf powiedział:EP0030108051-250EA
Stojak magnetyczny na 1,5 i ndash; 2 ml probówkiThermo Fisher Scientific Inc.Numer katalogowy 12321D
Mieszadło magnetyczneMerckZ671886
MikrowirówkaEppendorf powiedział:5406000046
System oczyszczania wody czystej Milli-Q IX 7015MerckZIX7015T0C
Woda wolna od nukleaz (NFW), klasa molekularnaThermo Fisher Scientific Inc.Zobacz materiał AM9937
Pipety (P10, P20, P200 i P1000)Eppendorf powiedział:EP3123000918-1EA
Probówki do oznaczania kubitówThermo Fisher Scientific Inc.Numer katalogowy Q32856 powiedział:
Zestaw do oznaczania Qubit dsDNA HSThermo Fisher Scientific Inc.Q33231 powiedział:
Przyrząd do fluorometru kubitowegoThermo Fisher Scientific Inc.Numer katalogowy Q33226 powiedział:
Rurki z nakrętką (1,5 ml)Specjalności naukowe Inc.P2TUB056C-0001.5ST
WirGrupa LasecWMBB0L0E0216

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-programme/tb-reports/global-tuberculosis-report-2024 (2024).">Global Tuberculosis Report 2024. Geneva: WHO. , World Health Organization. https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-programme/tb-reports/global-tuberculosis-report-2024 (2024).
  2. Implementation of targeted next-generation sequencing for the diagnosis of drug-resistant tuberculosis in low-resource settings: a programmatic model, challenges, and initial outcomes. Front Public Health. 11, 1204064(2023).">De Araujo, L., et al. Implementation of targeted next-generation sequencing for the diagnosis of drug-resistant tuberculosis in low-resource settings: a programmatic model, challenges, and initial outcomes. Front Public Health. 11, 1204064(2023).
  3. Direct detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using targeted next generation sequencing. Front Public Health. 11, 1206056(2023).">Murphy, S. G., et al. Direct detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using targeted next generation sequencing. Front Public Health. 11, 1206056(2023).
  4. Targeted next generation sequencing directly from sputum for comprehensive genetic information on drug resistant Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 127, 102051(2021).">Kambli, P., et al. Targeted next generation sequencing directly from sputum for comprehensive genetic information on drug resistant Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 127, 102051(2021).
  5. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/376221/9789240089488-eng.pdf?sequence=1 (2024).">WHO Consolidated Guidelines on Tuberculosis.Module 3: Diagnosis. Rapid diagnostics for tuberculosis detection. Third edition. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/376221/9789240089488-eng.pdf?sequence=1 (2024).
  6. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/374061/9789240082410-eng.pdf?sequence=1 (2023).">Catalogue of mutations in Mycobacterium tuberculosis. complex and their association with drug resistance. Second edition. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/374061/9789240082410-eng.pdf?sequence=1 (2023).
  7. Targeted next-generation sequencing to diagnose drug-resistant tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 24 (10), 1162-1176 (2024).">Schwab, T. C., et al. Targeted next-generation sequencing to diagnose drug-resistant tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 24 (10), 1162-1176 (2024).
  8. https://acrobat.adobe.com/link/track?uri=urn%3Aaaid%3Ascds%3AUS%3A67c2b53f-c91d-3a73-a6ea-4769e7c8fe57 (2023).">Deeplex Myc-TB manual version 5. , GenoScreen. https://acrobat.adobe.com/link/track?uri=urn%3Aaaid%3Ascds%3AUS%3A67c2b53f-c91d-3a73-a6ea-4769e7c8fe57 (2023).
  9. Comprehensive whole-genome sequencing and reporting of drug resistance profiles on clinical cases of Mycobacterium tuberculosis in New York State. J Clin Microbiol. 55 (6), 1871-1882 (2017).">Shea, J., et al. Comprehensive whole-genome sequencing and reporting of drug resistance profiles on clinical cases of Mycobacterium tuberculosis in New York State. J Clin Microbiol. 55 (6), 1871-1882 (2017).
  10. DNA extraction using InstaGene Matrix and high-speed homogenizer from clinical primary culture. , https://www.protocols.io/view/mycobacterium-tuberculosis-dna-extraction-using-in-dhvs366e (2024).">Conceição, E. C., et al. Mycobacterium tuberculosis. DNA extraction using InstaGene Matrix and high-speed homogenizer from clinical primary culture. , https://www.protocols.io/view/mycobacterium-tuberculosis-dna-extraction-using-in-dhvs366e (2024).
  11. Genomic sequencing from sputum for tuberculosis disease diagnosis, lineage determination, and drug susceptibility prediction. J Clin Microbiol. 61 (3), e0157822(2023).">Nilgiriwala, K., et al. Genomic sequencing from sputum for tuberculosis disease diagnosis, lineage determination, and drug susceptibility prediction. J Clin Microbiol. 61 (3), e0157822(2023).
  12. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/65942/WHO_TB_98.258_(part2).pdf?sequence=2 (1998).">Laboratory Services in Tuberculosis Control Part II: Microscopy. Geneva: WHO. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/65942/WHO_TB_98.258_(part2).pdf?sequence=2 (1998).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA ExtractionNext Generation SequencingTargeted NGSDrug Resistant TuberculosisSputum SamplesMagnetic Bead PurificationDecontaminated SputumDrug Susceptibility TestingLineage DeterminationStrain Typing

Related Articles