W tym badaniu opisujemy krok po kroku protokół i kładziemy nacisk na kluczowe szczegóły dotyczące określania cech morfologicznych mitochondriów w żywych komórkach, w tym przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i analizę danych. Ta metoda jest powszechnie stosowana do badania morfologii mitochondriów w celu badania różnych schorzeń.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Oznaczanie morfologii mitochondriów w żywych komórkach za pomocą mikroskopii konfokalnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dynamiczna równowaga fuzji i rozszczepienia mitochondriów bezpośrednio przyczynia się do homeostazy mitochondriów, która oprócz homeostazy adenozynotrifosforanu (ATP) wpływa na wiele funkcji komórkowych. Dlatego ocena morfologii mitochondriów w warunkach stresu jest niezbędna dla badań mechanistycznych. W pracy opisano szczegółowy protokół analizy morfologii mitochondriów, obejmujący przygotowanie roztworu MitoTracker, barwienie mitochondriów, optymalizację parametrów obrazowania oraz wykrywanie cech morfologicznych. MitoTrackery są powszechnie stosowanymi, opłacalnymi barwnikami specyficznymi dla mitochondriów. Jednak pewne zmiany w morfologii mitochondriów mogą wystąpić z powodu niewłaściwej obsługi, która może być niezauważalna i nie odzwierciedlać prawdziwego stanu mitochondriów. Dlatego konieczne jest zrozumienie, jak analizować zmiany w morfologii mitochondriów za pomocą MitoTrackers. W protokole wykorzystano komórki SH-SY5Y stymulowane jodkiem 1-metylo-4-fenylopirydyniowego (MPP+) w celu zilustrowania protokołu mitochondrialnej analizy morfologicznej. W porównaniu z komórkami kontrolnymi, komórki stymulowane MPP+ wykazywały mniejsze i bardziej rozdrobnione mitochondria, z parametrami morfologicznymi wskazującymi na zmniejszony ślad mitochondrialny. Wyniki te sugerują, że barwienie MitoTracker jest skuteczną i wykonalną metodą mitochondrialnej analizy morfologicznej, która (z niewielkimi modyfikacjami) może być stosowana do badania różnych schorzeń.
Wprowadzenie
Morfologia mitochondriów jest utrzymywana przez dynamiczną równowagę fuzji i rozszczepienia mitochondriów, a tym samym wpływa na homeostazę energetyczną i wiele innych funkcji komórkowych, prowadząc do różnych patologii, takich jak choroby neurodegeneracyjne, rak i stany zapalne 1,2,3,4,5 . Aby zaobserwować morfologię mitochondriów, opracowano kilka selektywnych barwników mitochondrialnych, w tym zarówno sondy, jak i przeciwciała, do stosowania z mikroskopem konfokalnym. Niektóre sondy specyficzne dla mito....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie
- Rozpuścić MPP+ w dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu uzyskania 1 mM roztworu podstawowego i przechowywać go w temperaturze -30 °C w ciemności (patrz tabela materiałów).
- Rozpuścić 50 μg MitoTrackera (MitoTracker Red CMXRos) w 94 μl DMSO, aby uzyskać 1 mM roztwór podstawowy. Roztwór podstawowy rozdzielić na kilka probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -30 °C przed światłem do czasu dalszego użycia.
- Inkubować komórki SH-SY5Y w kolbach z pożywką F-12 Modified Eagle Mixture/Nutrient Mixture F-12 firmy Dulbecco uzupełnioną 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół przedstawia szczegółową, krokowa procedurę analizy morfologicznej mitochondriów poprzez trzy współzależne moduły optymalizacji: standaryzację protokołów przygotowania preparatów, systematyczną optymalizację parametrów optycznych obrazowania mikroskopowego konfokalnego oraz wytyczne dotyczące komputerowego przetwarzania obrazu. Optymalny protokół przygotowania próbek ma krytyczne znaczenie dla uzyskania wiarygodnych danych obrazowania mitochondriów. Systematyczna ocena stężeń MitoTracker Red CMXRos wyka.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejsze badania ustanawiają systematyczną metodologię analizy morfologii mitochondriów w żywych komórkach w warunkach stresu. Do kluczowych etapów procesu w obrazowaniu mitochondriów należą: odpowiednie stężenie sond MitoTracker, dokładne umycie naczyń konfokalnych przed akwizycją obrazu, zminimalizowanie zaburzeń stanu komórkowego oraz ustawienie odpowiednich parametrów obrazowania.
Stosowanie wyższych stężeń MitoTracker może indukować cytotoksyczność, czyniąc mitochondria wrażliwymi na moc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Prace te były wspierane przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (81974501).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Jodek 1-metylo-4-fenylopirydyniowy (MPP+) | Macklin powiedział: | M875357 | Służy do wywoływania stresu oksydacyjnego |
| Naczynie konfokalne | GNIAZDO | 801001 | Służy do hodowli komórek |
| Mikroskop konfokalny | Nikon | Klasa C2 | Służy do przechwytywania obrazów |
| Zmodyfikowana mieszanka pożywki i składników odżywczych Eagle firmy Dulbecco F-12 | ThermoFisher Naukowy | 11320033 | Służy do odżywiania komórek |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Beyotime | Zobacz materiał ST038 | Służy do rozpuszczania sondy mitotracker |
| Surowica płodowa bydlęca (FBS) | ThermoFisher Naukowy | A3161001C | Służy do odżywiania komórek |
| ObrazJ | Narodowe Instytuty Zdrowia | ObrazJ | Służy do analizy morfologii mitochondriów |
| MitoTracker Czerwony CMXRos | ThermoFisher Naukowy | Zobacz materiał M7512 | Służy do wizualizacji mitochondriów |
| Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) | ThermoFisher Naukowy | C10010500BT | Służy do mycia komórek na naczyniach konfokalnych |
| Komórka SH-SY5Y | Kontroler ATCC (Kontroler T | CRL-2266 | Służy do demonstrowania przepływu pracy analizy morfologii mitochondriów |
| Adapter sceniczny TI-SH-U | Nikon | MEC59110 | Służy do zabezpieczania próbek |
Bibliografia
- von der Malsburg, A., et al. Structural mechanism of mitochondrial membrane remodelling by human OPA1. Nature. 620 (7976), 1101-1108 (2023).
- Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
