Artykuł metodologiczny

Oznaczanie morfologii mitochondriów w żywych komórkach za pomocą mikroskopii konfokalnej

DOI:

10.3791/68167

⸱

3 lipca 2025

 ,  ,  ,  , 
1NMPA Key Laboratory for Research and Evaluation of Drug Metabolism & Guangdong Provincial Key Laboratory of New Drug Screening, School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, 2Central Laboratory, Southern Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu opisujemy krok po kroku protokół i kładziemy nacisk na kluczowe szczegóły dotyczące określania cech morfologicznych mitochondriów w żywych komórkach, w tym przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i analizę danych. Ta metoda jest powszechnie stosowana do badania morfologii mitochondriów w celu badania różnych schorzeń.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamiczna równowaga fuzji i rozszczepienia mitochondriów bezpośrednio przyczynia się do homeostazy mitochondriów, która oprócz homeostazy adenozynotrifosforanu (ATP) wpływa na wiele funkcji komórkowych. Dlatego ocena morfologii mitochondriów w warunkach stresu jest niezbędna dla badań mechanistycznych. W pracy opisano szczegółowy protokół analizy morfologii mitochondriów, obejmujący przygotowanie roztworu MitoTracker, barwienie mitochondriów, optymalizację parametrów obrazowania oraz wykrywanie cech morfologicznych. MitoTrackery są powszechnie stosowanymi, opłacalnymi barwnikami specyficznymi dla mitochondriów. Jednak pewne zmiany w morfologii mitochondriów mogą wystąpić z powodu niewłaściwej obsługi, która może być niezauważalna i nie odzwierciedlać prawdziwego stanu mitochondriów. Dlatego konieczne jest zrozumienie, jak analizować zmiany w morfologii mitochondriów za pomocą MitoTrackers. W protokole wykorzystano komórki SH-SY5Y stymulowane jodkiem 1-metylo-4-fenylopirydyniowego (MPP+) w celu zilustrowania protokołu mitochondrialnej analizy morfologicznej. W porównaniu z komórkami kontrolnymi, komórki stymulowane MPP+ wykazywały mniejsze i bardziej rozdrobnione mitochondria, z parametrami morfologicznymi wskazującymi na zmniejszony ślad mitochondrialny. Wyniki te sugerują, że barwienie MitoTracker jest skuteczną i wykonalną metodą mitochondrialnej analizy morfologicznej, która (z niewielkimi modyfikacjami) może być stosowana do badania różnych schorzeń.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Morfologia mitochondriów jest utrzymywana przez dynamiczną równowagę fuzji i rozszczepienia mitochondriów, a tym samym wpływa na homeostazę energetyczną i wiele innych funkcji komórkowych, prowadząc do różnych patologii, takich jak choroby neurodegeneracyjne, rak i stany zapalne 1,2,3,4,5 . Aby zaobserwować morfologię mitochondriów, opracowano kilka selektywnych barwników mitochondrialnych, w tym zarówno sondy, jak i przeciwciała, do stosowania z mikroskopem konfokalnym. Niektóre sondy specyficzne dla mitochondriów, takie jak tetrametylodamina i rodamina 123, działają w oparciu o potencjał błony mitochondrialnej (MMP), co ogranicza ich zastosowanie w badaniach warunków zaburzających MMP 6,7. I odwrotnie, barwienie przeciwciał zapewnia niezależną od MMP ocenę morfologiczną w celu zbadania morfologii mitochondriów w komórkach utrwalonych. Chociaż odpowiednie barwienie pozwala na ocenę morfologii mitochondriów w komórkach utrwalonych, badanie morfologii mitochondriów w żywych komórkach upośledzonych przez niektóre induktory pozostaje wyzwaniem. MitoTracker, przepuszczalna dla komórek kationowa i specyficzna dla mitochondriów sonda fluorescencyjna, oferuje rozwiązanie tego wyzwania, umożliwiając barwienie zarówno żywych, jak i stałych komórek. Sonda ta jest szeroko stosowana do badania morfologii mitochondriów w badaniach nad różnymi chorobami 8,9,10,11. Niemniej jednak niektóre badania wykazały problemy, takie jak wysoki sygnał tła i niespecyficzne wiązanie, nawet jeśli sonda jest używana ściśle zgodnie z wytycznymi dostarczonymi przez producenta. Obserwacje te podkreślają znaczenie dokładnego zrozumienia przygotowania próbek i pozyskiwania obrazów dla pomyślnej analizy morfologii mitochondriów.

Aby ułatwić analizę morfologii mitochondriów, opracowano różne programy i algorytmy przetwarzania obrazu 12,13,14,15,16. W tym badaniu wykorzystaliśmy makronarzędzie Mitochondrial Network Analysis (MiNA) w ImageJ do analizy morfologii mitochondriów13. Narzędzie to skutecznie identyfikuje i charakteryzuje cechy morfologiczne sieci mitochondrialnych poprzez obliczenie dziewięciu parametrów opisowych, w tym liczby osobników (struktur bez żadnych rozgałęzień), liczby sieci (liczby obiektów z co najmniej jednym pikselem połączenia), średniej długości (średniej długości wszystkich pręcików i gałęzi), mediany długości (mediany długości wszystkich pręcików i rozgałęzień), odchylenia standardowego długości (odchylenia standardowego poszczególnych długości), średnia wielkość sieci (średnia liczba oddziałów w sieci), mediana wielkości sieci (środkowa wartość liczby oddziałów w sieci), odchylenie standardowe rozmiaru sieci (odchylenie standardowe liczby gałęzi w sieci) oraz ślad mitochondrialny (całkowita powierzchnia sygnału po separacji tła). W tym protokole ślad mitochondrialny został wybrany jako parametr reprezentatywny.

Celem tego badania jest przedstawienie krok po kroku protokołu analizy morfologicznej mitochondriów, koncentrującego się na kluczowych szczegółach. Użyliśmy komórek SH-SY5Y indukowanych przez MPP+, aby zademonstrować ten protokół. MPP+ hamuje kompleks I mitochondrialnego łańcucha oddechowego w neuronach dopaminergicznych, powodując uszkodzenie morfologii i funkcji mitochondriów 8,17. Opisany w niniejszej pracy protokół analizy morfologicznej umożliwia uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości oraz ocenę parametrów istotnych dla określenia cech morfologicznych sieci mitochondrialnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie

  1. Rozpuścić MPP+ w dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu uzyskania 1 mM roztworu podstawowego i przechowywać go w temperaturze -30 °C w ciemności (patrz tabela materiałów).
  2. Rozpuścić 50 μg MitoTrackera (MitoTracker Red CMXRos) w 94 μl DMSO, aby uzyskać 1 mM roztwór podstawowy. Roztwór podstawowy rozdzielić na kilka probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -30 °C przed światłem do czasu dalszego użycia.
  3. Inkubować komórki SH-SY5Y w kolbach z pożywką F-12 Modified Eagle Mixture/Nutrient Mixture F-12 firmy Dulbecco uzupełnioną 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w wilgotnym środowisku z 5% CO2 i 95% powietrzem w temperaturze 37 °C. W celu pasażowania odłączyć komórki 0,05% roztworem trypsyny na 1 minutę i odwirować przy 100 × g przez 3 minuty.

2. MPP+ stymulacja

  1. Wysiewaj komórki SH-SY5Y na konfokalnych szalkach ze szklanym dnem i utrzymuj je w pożywce DMEM/F12 uzupełnionej 1% (v/v) FBS przez noc.
  2. Zastąp pożywkę hodowlaną, a następnie inkubuj komórki z lub bez MPP+ przez 24 godziny.

3. Barwienie MitoTracker

  1. Wstępnie podgrzej DMEM/F12, a następnie rozcieńcz roztwór podstawowy MitoTracker za pomocą DMEM/F12, aby uzyskać roztwór roboczy o długości 50 nM. Roztwór należy chronić przed światłem podczas całego zabiegu.
  2. Usuń pożywkę do hodowli komórkowych i umyj naczynia konfokalne 2x świeżym DMEM/F12.
  3. Inkubować komórki w każdym naczyniu z 1 ml roztworu roboczego MitoTracker przez 15 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
  4. Usuń roztwór roboczy MitoTracker i przemyj 2x DMEM/F12.
  5. Dodać 1 ml DMEM/F12 do każdej szalki i inkubować w inkubatorze komórkowym przed obrazowaniem.

4. Parametry obrazowania dla mikroskopu konfokalnego

  1. Wstępnie wyrównaj mikroskop do kolejnych operacji. Pod panelem akwizycji dostosuj parametry związane ze ścieżką światła, ustawiając długości fal wzbudzenia i emisji.
  2. Ustaw parametry w następujący sposób: rozmiar otworka, 1,2 AU; rozmiar skanu pikseli, 1,024 x 1,024; czas przebywania pikseli, 2,4 μs (średnio 2x) (zachowaj spójność dla celów kalibracji).

5. Optymalizacja parametrów obrazowania

UWAGA: Unikaj ekspozycji oczu zarówno na bezpośrednie, jak i rozproszone promieniowanie z widzialnego i/lub niewidocznego lasera.

  1. Użyj światła halogenowego, aby skupić się na komórkach za pomocą planarnej apochromatycznej soczewki obiektywowej 60x (1,4 NA), aby uniknąć fototoksyczności.
  2. Dostosuj moc lasera i wysokie napięcie (HV) do poziomu nieco poniżej poziomu nasycenia, ustaw współczynnik powiększenia na 3, a następnie uchwyć obrazy.
  3. Przesuń obszar zainteresowania i skup się na komórkach, aby przechwycić obrazy bez zmiany jakichkolwiek ustawień.

6. Analiza danych

UWAGA: Dane były analizowane przy użyciu ImageJ preinstalowanego z wtyczką MiNA13. Aby uzyskać dokładne, odpowiednie pomiary, obrazy powinny uchwycić niezależnie rozdzielone mitochondria z czystym i jasnym zabarwieniem.

  1. Aby poprawić jakość obrazu przed transformacją binarną i szkieletyzacją, otwórz obraz i przeprowadź wstępne przetwarzanie. Użyj narzędzia ROI, aby zaznaczyć obszar pojedynczej komórki. Zastosuj proces | Filtry | Funkcja Unsharp Mask (Maska wyostrzająca) w celu zwiększenia ostrości i korzystania z opcji Proces | Funkcja Zwiększ kontrast, aby zredukować nadmierne wzmocnienie szumów. Aby usunąć odgłosy soli i pieprzu, użyj punktu menu Proces | Filtry | Funkcja mediany (patrz rysunek uzupełniający S1).
  2. Aby skonstruować uproszczony model morfologiczny do obliczenia parametrów opisowych, przekonwertuj obraz na binarny za pomocą progowania (kliknij na Process | Binarny | Utwórz plik binarny), a następnie zszkieletuj obraz binarny za pomocą funkcji Skeletonize (kliknij pozycję Process | Binarny | Skeletonizacja) (patrz rysunek uzupełniający S2).
  3. Grupowanie wszystkich pikseli w szkielecie za pomocą polecenia Analizuj | Szkielet | Funkcja analizy szkieletu (2D/3D). Uprość analizę, używając narzędzia MiNA do obliczenia dziewięciu parametrów opisowych na szkieletowym obrazie (patrz rysunek uzupełniający S3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia szczegółową, krok po kroku procedurę analizy morfologicznej mitochondriów za pomocą trzech współzależnych modułów optymalizacji: standaryzacja protokołów przygotowania próbek, systematyczna optymalizacja parametrów optycznych dla obrazowania mikroskopii konfokalnej oraz wytyczne dotyczące obliczeniowego przetwarzania obrazu. Optymalny protokół przygotowania próbki ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych danych obrazowania mitochondriów. Systematyczna ocena stężeń MitoTracker Red CMXRos w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badania ustanawiają systematyczną metodologię analizy morfologii mitochondriów w żywych komórkach w warunkach stresu. Do kluczowych etapów procesu w obrazowaniu mitochondriów należą: odpowiednie stężenie sond MitoTracker, dokładne umycie naczyń konfokalnych przed akwizycją obrazu, zminimalizowanie zaburzeń stanu komórkowego oraz ustawienie odpowiednich parametrów obrazowania.

Stosowanie wyższych stężeń MitoTracker może indukować cytotoksyczność, czyniąc mitochondria wrażliwymi na moc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (81974501).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Jodek 1-metylo-4-fenylopirydyniowy (MPP+)Macklin powiedział:M875357Służy do wywoływania stresu oksydacyjnego
Naczynie konfokalneGNIAZDO801001Służy do hodowli komórek
Mikroskop konfokalnyNikonKlasa C2Służy do przechwytywania obrazów
Zmodyfikowana mieszanka pożywki i składników odżywczych Eagle firmy Dulbecco F-12ThermoFisher Naukowy11320033Służy do odżywiania komórek
Dimetylosulfotlenek (DMSO)BeyotimeZobacz materiał ST038Służy do rozpuszczania sondy mitotracker
Surowica płodowa bydlęca (FBS)ThermoFisher NaukowyA3161001CSłuży do odżywiania komórek
ObrazJNarodowe Instytuty ZdrowiaObrazJSłuży do analizy morfologii mitochondriów
MitoTracker Czerwony CMXRosThermoFisher NaukowyZobacz materiał M7512Służy do wizualizacji mitochondriów
Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS)ThermoFisher NaukowyC10010500BTSłuży do mycia komórek na naczyniach konfokalnych
Komórka SH-SY5YKontroler ATCC (Kontroler TCRL-2266Służy do demonstrowania przepływu pracy analizy morfologii mitochondriów
Adapter sceniczny TI-SH-UNikonMEC59110Służy do zabezpieczania próbek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. von der Malsburg, A., et al. Structural mechanism of mitochondrial membrane remodelling by human OPA1. Nature. 620 (7976), 1101-1108 (2023).
  2. Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (4), 204-224 (2020).
  3. Kalia, R., et al. Structural basis of mitochondrial receptor binding and constriction by DRP1. Nature. 558 (7710), 401-405 (2018).
  4. Cao, Y. L., et al. MFN1 structures reveal nucleotide-triggered dimerization critical for mitochondrial fusion. Nature. 542 (7641), 372-376 (2017).
  5. Chan, D. C. Mitochondrial dynamics and its involvement in disease. Annu Rev Pathol. 15, 235-259 (2020).
  6. Solaini, G., Sgarbi, G., Lenaz, G., Baracca, A. Evaluating mitochondrial membrane potential in cells. Biosci Rep. 27 (1-3), 11-21 (2007).
  7. Gan, Z., Audi, S. H., Bongard, R. D., Gauthier, K. M., Merker, M. P. Quantifying mitochondrial and plasma membrane potentials in intact pulmonary arterial endothelial cells based on extracellular disposition of rhodamine dyes. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol. 300 (5), L762-L772 (2011).
  8. Zhong, J., et al. Roflupram exerts neuroprotection via activation of CREB/PGC-1α signalling in experimental models of Parkinson's disease. Br J Pharmacol. 177 (10), 2333-2350 (2020).
  9. Xu, B. T., et al. Mitofusin-2 mediates cannabidiol-induced neuroprotection against cerebral ischemia in rats. Acta Pharmacol Sin. 44 (3), 499-512 (2023).
  10. Hu, T., et al. PRDM16 exerts critical role in myocardial metabolism and energetics in type 2 diabetes induced cardiomyopathy. Metabolism. 146, 155658(2023).
  11. Reichardt, C., et al. DNA-binding protein-A promotes kidney ischemia/reperfusion injury and participates in mitochondrial function. Kidney Int. 106 (2), 241-257 (2024).
  12. Ahmad, T., et al. Computational classification of mitochondrial shapes reflects stress and redox state. Cell Death Dis. 4 (1), e461(2013).
  13. Valente, A. J., Maddalena, L. A., Robb, E. L., Moradi, F., Stuart, J. A. A simple imagej macro tool for analyzing mitochondrial network morphology in mammalian cell culture. Acta Histochem. 119 (3), 315-326 (2017).
  14. Hemel, I., Engelen, B., Luber, N., Gerards, M. A hitchhiker's guide to mitochondrial quantification. Mitochondrion. 59, 216-224 (2021).
  15. Vowinckel, J., Hartl, J., Butler, R., Ralser, M. Mitoloc: A method for the simultaneous quantification of mitochondrial network morphology and membrane potential in single cells. Mitochondrion. 24, 77-86 (2015).
  16. Dagda, R. K., et al. Loss of PINK1 function promotes mitophagy through effects on oxidative stress and mitochondrial fission. J Biol Chem. 284 (20), 13843-13855 (2009).
  17. Przedborski, S., Tieu, K., Perier, C., Vila, M. MPTP as a mitochondrial neurotoxic model of Parkinson's disease. J Bioenerg Biomembr. 36 (4), 375-379 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

MitoTracker StainingSH SY5Y CellsMitochondrial FusionMitochondrial FissionFluorescence ImagingSkeletonization AnalysisMPP StimulationImage Segmentation

Powiązane artykuły