Szpatułka Montevideo Urządzenie do witryfikacji zarodków ssaków

Geraldine Schlapp; María Noel Meikle; Lucía Goyeneche; Pedro Dos Santos Neto; Martina Crispo

doi:10.3791/68176

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szpatułka Montevideo Urządzenie do witryfikacji zarodków ssaków

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68176

⸱

6 czerwca 2025

Geraldine Schlapp^*¹ , María Noel Meikle^*¹ , Lucía Goyeneche² , Pedro Dos Santos Neto³ , Martina Crispo¹

¹Laboratory Animal Biotechnology Unit, Institut Pasteur de Montevideo, ²Centro de Esterilidad Montevideo, ³Fundación IRAUy, Instituto de Reproducción Animal de Uruguay

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym miejscu przedstawiamy protokół Spatula Montevideo do witryfikacji zarodków przedimplantacyjnych myszy i owiec, składający się z domowej szpatułki i wykorzystujący domowe roztwory. Zarodki są szybko równoważone w dwóch roztworach krioprotekcyjnych o rosnącym stężeniu, ładowane na szpatułkę, zanurzane w ciekłym azocie, a na koniec zamykane słomką o pojemności 0,5 ml.

Streszczenie

W badaniu tym opisano wydajną i opłacalną metodę witryfikacji kriokonserwacji zarodków myszy i owiec, znaną jako Spatula Montevideo (MVD). Protokół ten wykorzystuje domowej roboty szpatułkę jako urządzenie nośne, które jest przygotowywane z końcówką do ładowania żelu. Zarodki są szybko równoważone w dwóch domowych roztworach krioprotekcyjnych o rosnącym stężeniu, ładowane do szpatułki, a następnie bezpośrednio zanurzane w ciekłym azocie. Około 30-40 zarodków myszy w fazie przedimplantacyjnej można załadować na szpatułkę, która jest następnie zamykana słomką o pojemności 0,5 ml. Użycie szpatułek zamiast krioprobówek, które są często używane do przechowywania zeszklonych zarodków, optymalizuje przestrzeń w ciekłym azocie Dewara. Dodatkowo proces ocieplania wymaga jedynie domowego roztworu sacharozy o malejącym stężeniu, aby nawodnić zarodki i przywrócić ich morfologię. Nasze laboratorium od ponad 10 lat z powodzeniem stosuje Spatula Montevideo do zarodków przedimplantacyjnych myszy i owiec. Szpatułka Montevideo wykazała średni wskaźnik wyzdrowienia (zarodki odzyskane/zszklone) wynoszący 84% i wskaźnik przeżywalności (zarodki zdolne do życia/ozdrowieńców) wynoszący 97% w zarodkach myszy. Witryfikacja mysich zarodków przyniosła lepsze wyniki niż powolne zamrażanie, chociaż nie zaobserwowano żadnych różnic w wynikach reprodukcyjnych (ciąża, poród i wskaźniki urodzeń). W przypadku zarodków owiec za pomocą Spatula Montevideo osiągnięto podobne wskaźniki przeżywalności i rozwoju zarodków w porównaniu z urządzeniem komercyjnym. Chociaż odsetek ciąż był wyższy w przypadku urządzenia komercyjnego, wskaźnik przeżywalności jagniąt nie różnił się znacząco między urządzeniami. Metoda witryfikacji Spatula Montevideo jest prostą techniką kriokonserwacji, która może być stosowana do przechowywania nadwyżek zarodków, tworzenia kopii zapasowych genetycznie zmodyfikowanych linii myszy i modeli owiec oraz ułatwiania ich wymiany między naukowcami na całym świecie.

Wprowadzenie

Wydajność generowania zwierząt modyfikowanych genetycznie (GM) znacząco wzrosła dzięki opracowaniu metod opartych na endonukleazach, w szczególności CRISPR/Cas9. Wiele laboratoriów na całym świecie wytwarza różne linie myszy i szczurów GM, które powinny być krio konserwowane, aby zapobiec dryfowi genetycznemu i zachować integralność oryginalnego fenotypu¹. Ponadto archiwizacja eliminuje konieczność ciągłego rozrodu, co często prowadzi do nadmiernej liczby zwierząt. Niektóre laboratoria przesyłają linie myszy GM w formie krio konserwowanych embrionów lub plemników do międzynarodowych repozytoriów, co ułatwia wymianę tych modeli, unikając jednocz....