Artykuł metodologiczny

Preparat mitochondrialny z mikrogleju do analizy glikanów

DOI:

10.3791/68179

⸱

30 maja 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Health Professions, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Chemistry, North Carolina State University, 3Department of Pathology, Division of Molecular and Cellular Pathology, University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został opracowany do przygotowania oczyszczonych mitochondriów z komórek mikrogleju, izolacji białek mitochondrialnych do uwalniania N-glikanów oraz szybkiego wykrywania subkomórkowych, mitochondrialnych glikanów za pomocą desorpcji laserowej wspomaganej matrycą w podczerwieni, jonizacji elektrorozpylanej w połączeniu z precyzyjnym analizatorem mas o wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie wzorców glikozylacji białek mitochondrialnych w mikrogleju jest kluczowe dla określenia ich roli w chorobach neurodegeneracyjnych. W tym miejscu przedstawiamy nowatorską i wysokoprzepustową metodologię analizy glikomicznej białek mitochondrialnych wyizolowanych z hodowanego mikrogleju. Metoda ta obejmuje izolację mitochondriów z kultur mikrogleju, ocenę jakości próbek mitochondrialnych, a następnie zoptymalizowaną ekstrakcję białek w celu maksymalizacji wykrywania glikanów oraz spektrometrię mas o wysokiej rozdzielczości (HRAM) wspomaganą desorpcją laserową w podczerwieni z desorpcją laserową i jonizacją (IR-MALDESI) w celu uzyskania szczegółowych profili glikozylacji mitochondrialnej.

Ten protokół podkreśla znaczenie utrzymania integralności mitochondriów podczas izolacji i stosuje rygorystyczną kontrolę jakości w celu zapewnienia odtwarzalności, w tym pomiar czystości mitochondriów po ekstrakcji. Podejście to pozwala na kompleksowe profilowanie zmian glikozylacji w mitochondriach mikrogleju w różnych warunkach eksperymentalnych in vitro, co daje wgląd w zmiany mitochondrialne związane z chorobami neurodegeneracyjnymi. Podejście to można zastosować do innych metod leczenia in vitro, innych typów komórek hodowlanych lub komórek pierwotnych. Dzięki temu ustandaryzowanemu podejściu dążymy do pogłębienia wiedzy na temat mitochondrialnych glikanów mikrogleju, przyczyniając się do szerszego obszaru badań neurodegeneracyjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglej jest dominującym wrodzonym komórkiem odpornościowym w mózgu i stanowi 10-15% komórek w dorosłym mózgu1,2. Wykorzystują swój repertuar receptorów do dynamicznego monitorowania mikrośrodowiska mózgu i regulowania prawidłowego funkcjonowania mózgu w celu utrzymania homeostazy mózgu3. Mikroglej jest bardzo wrażliwy na zmiany w swoim mikrośrodowisku i ulega zmianom w morfologii komórek, immunofenotypie i funkcji w stanach patologicznych lub różnych stymulacjach. Stany aktywacji mikrogleju zależą od zapotrzebowania na energię komórkową wymaganą do ich funkcjonowania, takiego jak fagocytoza, produkcja cytokin lub naprawa tkanek. Dlatego metabolizm energii komórkowej odgrywa kluczową rolę w regulacji zmian w funkcjonowaniu mikrogleju4. Rozregulowanie mikrogleju prowadzi do nadmiernego uwalniania cytokin prozapalnych (np. IL-1β, TNF-α) i reaktywnych form tlenu (ROS), predysponując mózg do zapalenia nerwów5,6. Przewlekła dysregulacja mikrogleju i wynikające z niej środowisko neurozapalne stanowią podstawę dla neurodegeneracji7.

Mózg odpowiada tylko za 2% masy ciała, ale za to 20% całkowitego zużycia energii przez ciało. Mitochondria są głównym źródłem energii w komórkach mózgowych i odgrywają kluczową rolę w patogenezie zarówno ostrych, jak i przewlekłych zaburzeń mózgu8. Wcześniejsze badania wykazały silną korelację między aktywacją mikrogleju a dysfunkcją metaboliczną w starzeniu się9 oraz zaburzeniach związanych z wiekiem, takich jak choroba Alzheimera10,11, podkreślając kluczową rolę mitochondriów w starzeniu się komórek i neurodegeneracji. Upośledzona funkcja mitochondriów prowadzi do zmniejszonej produkcji energii, podwyższonego stresu oksydacyjnego i zwiększonego zapalenia nerwów podczas starzenia się i chorób związanych z wiekiem.

Podczas gdy obszerne badania wyjaśniły rolę mitochondriów w metabolizmie energetycznym, starzeniu się i zaburzeniach mózgu, rola powszechnych modyfikacji potranslacyjnych, takich jak glikozylacja, w biologii i funkcji mitochondriów pozostaje niewystarczająco zbadana. Glikozylacja, enzymatyczne dodawanie ugrupowań cukrowych zwanych glikanami do białek przez enzymy glikozylacji, jest najczęstszą modyfikacją potranslacyjną w większości komórek mózgowych, w tym mikrogleju. Aktywowany mikroglej moduluje swoją funkcję immunologiczną pod wpływem bodźców zapalnych poprzez regulację wewnątrzkomórkowej lub powierzchniowej ekspresji glikanów na powierzchni komórki12. Reakcje pro- i przeciwzapalne wykazywane przez mikroglej po stymulacji są również regulowane przez glikany13. Białka mitochondrialne mają również te modyfikacje glikanów, które regulują ich funkcję i lokalizację. Brakuje jednak szczegółowej analizy specyficznych dla komórki wzorców glikozylacji mitochondrialnej w mikrogleju ze względu na wyzwania techniczne związane z badaniem glikozylacji subkomórkowej. Pomimo dobrze scharakteryzowanej roli glikozylacji w modulowaniu fenotypu mikrogleju, rola glikanów w modulowaniu funkcji mitochondriów, a następnie immunofenotypu komórkowego w mikrogleju pozostaje słabo poznana.

Ograniczone badania nad glikozylacją białek mitochondrialnych skupiały się głównie na identyfikacji wzorców glikozylacji na podstawie lektyny. Lektyny to białka wiążące glikany, które wiążą biomolekularne ugrupowania glikanów14,15, którym brakuje specyficzności i zdolności do dostarczania szczegółowych informacji o składzie glikanów. Metody spektrometrii mas oferują szczegółową identyfikację składu glikanów w celu przezwyciężenia wyzwań analitycznych związanych z analizą lektyn. Jedna z takich metod, jonizacja elektronrozpylania z desorpcją laserową wspomaganą matrycą w podczerwieni (IR-MALDESI), wykorzystuje hybrydową strategię jonizacji, wykorzystując laser średniej podczerwieni do rezonansowego wzbudzania wody znajdującej się w próbkach biologicznych16 w celu desorpcji neutralnych gatunków i poddania ich ortogonalnemu pióropuszowi elektrorozpylania, a następnie analizie przy użyciu precyzyjnego spektrometru masowego Orbitrap o wysokiej rozdzielczości. IR-MALDESI został wcześniej zademonstrowany do bezpośredniej analizy metabolitów tkankowych17, z wyraźnymi zaletami szybkiej analizy18, metoda miękkiej jonizacji i przewidywalność zawartości kwasu sjalowego w glikanach związanych z N w oparciu o wzorce dystrybucji izotopowej adduktów chlorowanych glikanów19. Nie wykazano jednak adaptacji tej platformy do bezpośredniej analizy glikanów subkomórkowych.

Tutaj opisujemy protokół o wysokiej przepustowości do izolacji mitochondriów z komórek mikrogleju, izolacji mitochondrialnych N-glikanów oraz wykrywania i analizy mitochondrialnej N-glikanów za pomocą spektrometrii mas IR-MALDESI. Protokół ten będzie miał fundamentalne znaczenie dla odkrycia nowych spostrzeżeń na temat roli glikozylacji w funkcjonowaniu mitochondriów, potencjalnie identyfikując nowe cele terapeutyczne dla zaburzeń neurozapalnych i neurodegeneracyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. BV2 Hodowla linii komórkowych mikrogleju

  1. Utrzymuj komórki BV-2 (komórki mikrogleju pochodzące od myszy C57BL / 6) w pożywce DMEM o niskim poziomie glukozy uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% Penicillium-Streptomycyną (PenStrep) i 1% aminokwasami endogennymi (NEAA).
  2. Hoduj komórki w kolbach T-175 i pozwól im osiągnąć 70-80% konfluencji.
  3. Podzielić komórki przez inkubację z enzymami dysocjacji komórek przez 5 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO2 , a następnie inaktywację enzymów z równą objętością pożywki komórkowej i odwirowanie komórek przez 5 minut w temperaturze 500 × g w temperaturze pokojowej (RT).
    UWAGA: Zastosowane tutaj enzymy dysocjacji komórek są łagodniejsze dla komórek BV2 niż trypsyna i mogą być stosowane do ochrony ekspresji antygenu na powierzchni komórki.
  4. Odessać pożywkę, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki wzrostowej i policzyć komórki za pomocą błękitu trypanowego (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: Na tym etapie użyliśmy automatycznego licznika komórek, aby zliczyć komórki.
  5. Aby przeprowadzić izolację mitochondriów, kontynuuj, jeśli osad komórkowy zawiera 2 × 107 (20 milionów komórek/osad).

2. Izolacja mitochondriów od komórek mikrogleju

UWAGA: Pracuj szybko, trzymając wszystko na lodzie przez cały czas trwania procedury. Zestaw do izolacji mitochondriów używany do izolacji mitochondriów składa się z trzech składników: odczynników A (bufor do lizy komórek), odczynnika B (bufor stabilizujący) i odczynnika C (bufor do płukania mitochondriów). Inhibitory proteazy należy dodać do odczynnika A i odczynnika C bezpośrednio przed użyciem.

  1. Osad 2 × 107 komórek, odwirowując zebrane komórki w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml w temperaturze 500 × g przez 5 minut. Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant.
  2. Dodać 800 μl odczynnika do izolacji mitochondriów A (bufor do lizy komórek), wirować ze średnią prędkością przez 5 s i inkubować probówkę na lodzie dokładnie przez 2 minuty
    UWAGA: Nie należy przekraczać 2 minut inkubacji.
  3. Dodać 10 μl odczynnika B do izolacji mitochondriów (bufor stabilizujący), wirować z maksymalną prędkością przez 5 s i inkubować probówkę na lodzie przez 5 minut, wirując z maksymalną prędkością co minutę.
  4. Dodać 800 μl odczynnika C do izolacji mitochondriów (bufor do przemywania mitochondriów), kilkakrotnie odwrócić probówkę w celu wymieszania i odwirować probówkę o stężeniu 700 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Nie wirować.
  5. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 2,0 ml i wirować z prędkością 3 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Przenieść supernatant (porcje cytozolowe) do nowej probówki. Osad zawiera izolowane mitochondria.
  7. Dodać 500 μl odczynnika C do izolacji mitochondriów do osadu i odwirować przy 12 000 × g przez 5 minut.
  8. Użyć osadu do ilościowego oznaczania i przetwarzania białka lub przechowywać go w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

3. Szacowanie białka za pomocą testu mikroBCA

UWAGA: Oszacowanie białka dla tego protokołu może być przeprowadzone przy użyciu różnych odczynników i testów. Oznaczanie ilościowe białek cytozolowych lub mitochondrialnych można przeprowadzić poprzez normalizację w stosunku do całkowitego stężenia białka użytego w teście.

  1. Przygotować wzorce albuminy surowicy bydlęcej (BSA) między 0 μg/ml a 200 μg/ml (0 μg/mL, 0,5 μg/ml, 1 μg/mL, 2,5 μg/ml, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/ml, 40 μg/mL, 200 μg/ml) i ślepe próby tylko z buforem do lizy.
  2. Dodać 150 μl każdego wzorca do płaskodennej 96-dołkowej płytki zawierającej próbki.
  3. Wymieszaj 25 części odczynnika Micro BCA MA (roztwór kwasu bicinchoninowego (BCA)) i 24 części odczynnika MB (roztwór siarczanu miedzi) z 1 częścią odczynnika MC (bufor stabilizujący) (25:24:1, odczynniki MA:MB:MC), aby utworzyć działający odczynnik. Dodać 150 μl zmieszanego odczynnika BCA do każdej próbki i wzorca.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  5. Za pomocą czytnika płytek zmierzyć absorbancję przy długości fali 562 nm i określić ilościowo stężenie białka za pomocą krzywej wzorcowej. Odjąć absorbancję wzorca ślepej próby od pomiaru absorbancji wszystkich innych indywidualnych wzorców i powtórzeń nieznanych próbek, aby uzyskać stężenia białka w próbce.

4. Kontrola jakości preparatu mitochondrialnego (western blot)

  1. Zawiesić osad mitochondrialny w buforze buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) w celu przeprowadzenia kwantyfikacji białka. Określić stężenie białka dla każdej próbki za pomocą testu mikro BCA.
  2. Denaturacja próbek w buforze do próbek w temperaturze 94 oC przez 5 minut.
  3. Załadować równe ilości (20 μg) białka mitochondrialnego do prefabrykowanych żeli (patrz tabela materiałów) wraz ze znacznikiem masy cząsteczkowej.
  4. Uruchom żel na 50 minut przy 100 V.
    UWAGA: Czas pracy może się różnić, dlatego należy przerwać podawanie żelu, gdy białka dotrą do końca żelu wskazanego przez barwnik w buforze próbki.
  5. Przenieść białka z żelu na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) przy użyciu protokołu suchego transferu w systemie transferu western blot przez 7 minut przy napięciu 20 V.
  6. Wyjąć membranę i zablokować za pomocą roztworu blokującego (tabela 1) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Dodać odpowiednie rozcieńczenia pierwszorzędowego przeciwciała do błony w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 oC (COXIV = 1:3 000, GAPDH = 1:3 000).
    UWAGA: Brak zanieczyszczenia jądrowego, retikulum endoplazmatycznego (ER) w preparacie mitochondrialnym można zbadać przy użyciu dodatkowych markerów, takich jak lamina (marker jądrowy) i ERp57 (marker ER) w zachodnich plamach.
  8. Płukać membranę przez 3 x 15 minut buforem do płukania (tabela 1).
  9. Inkubować błonę z odpowiednim rozcieńczeniem przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z HRP w buforze blokującym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę
  10. Płukać membranę przez 3 x 15 min buforem do mycia.
  11. Do opracowania użyj zestawu substratów chemiluminescencyjnych
    12. .
  12. Zeskanuj membranę za pomocą imagera żelowego i membranowego.

5. Izolacja białek mitochondrialnych do ekstrakcji N-glikanów z mikrogleju

  1. Ponownie zawiesić wyizolowane mitochondria w 50 μl buforu do izolacji białek (Tabela 1) i pozostawić na lodzie na 20 minut.
  2. Zassać i dozować trzy razy i pozostawić na 20 minut na lodzie (przed użyciem odwirować). Jeśli osad mitochondrialny nie jest w pełni rozpuszczony, dodaj kolejne 50 μl buforu izolacyjnego i puli do tej samej probówki.
  3. Wirować przy 13 000 × g przez 10 min.
  4. Odzyskać supernatant, zamrażać w temperaturze -80 oC przez co najmniej 1 godzinę i wysuszyć w miarę możliwości w koncentratorze próżniowym.
  5. Zawiesić przed izolacją glikanów przy użyciu buforu trawienia PNGazy (Tabela 1) dla IR-MALDESI.

6. Mitochondrialny preparat N -glikanów dla IR-MALDESI

  1. Załaduj 25-250 μg białka (w maksymalnej objętości 250 μl) wyizolowanych białek mitochondrialnych do filtra o masie cząsteczkowej 10 kDa (MWCO).
  2. Zredukować próbki białka, aby odsłonić ugrupowania glikanów, dodając 2 μl 1 M ditiotreitolu (DTT) do każdej próbki w filtrze.
  3. Rozcieńczyć próbkę 200 μl buforu trawiącego PNGazę i lekko przemieszać, aby uniknąć zakłócenia pracy filtra.
  4. Denaturację białek mitochondrialnych poprzez inkubację próbki w temperaturze 56 °C przez 30 minut.
  5. Użyj 50 μl 1 M jodoacetamidu do alkilowania mitochondriów, aby uzyskać końcowe stężenie ~200 mM i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 60 minut.
  6. Aby dalej zagęścić zdenaturowane metody mitochondrialne, należy odwirować próbki o masie 14 000 × g przez 40 minut. Odrzucić przepływ.
  7. Przepłukać próbkę 100 μl buforu do trawienia PNGazy.
  8. Skoncentrować glikoproteinę na filtrze na 14 000 × g przez 20 minut i odrzucić przepływ. Powtórz etap mycia i koncentratu 2 razy, w sumie 3 razy, uzyskując koncentrat w martwej objętości filtra (~5 μL). Odrzuć cały przepływ.
  9. Wyrzuć fiolkę do pobierania po zakończeniu mycia. Użyj nowej fiolki do pobierania wszystkich przyszłych eluentów i płukania.
  10. Aby rozszczepić glikany ze zdenaturowanych glikowzorców mitochondrialnych, przenieś je do świeżej fiolki zbiorczej i dodaj 2 μl PNGazy wolnej od glicerolu (75 000 jednostek/ml) do filtra. Dodać 98 μl buforu mineralizującego PNGazy, zwiększając całkowitą objętość do 100 μl i mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół na filtrze.
  11. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C przez 18 godzin w celu enzymatycznego rozszczepienia wszystkich N-glikanów z białek mitochondrialnych.
  12. Eluować uwolnione mitochondrialne N-glikany, odwirowując próbkę o sile 14 000 × g przez 20 minut w temperaturze 20 °C.
  13. Przemyć glikany mitochondrialne, dodając 100 μl buforu trawiącego PNGazę do filtra i odwirować w temperaturze 14 000 × g przez 20 minut w temperaturze 20 °C. Zebrać płuczkę zawierającą pozostałe N-glikany w tej samej fiolce zbiorczej co eluent. Powtórzyć czynność 2 razy i wyjąć filtr z fiolki zbiorczej.
  14. Próbki glikanów mitochondrialnych inkubować w zamrażarce o temperaturze -80 °C do momentu zamrożenia (30-60 min) i wysuszyć do końca w temperaturze pokojowej w koncentratorze próżniowym (4-6 godzin dla 400 μl).
    UWAGA: N-glikany mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy przed analizą.
  15. Wysuszone glikany sprzężone z azotem należy zawiesić w 50 μl wody klasy LC/MS bezpośrednio przed analizą IR-MALDESI.

7. Wykrywanie uwolnionych glikanów za pomocą spektrometrii mas IR-MALDESI

  1. Kalibrację masy należy wykonywać każdego dnia eksperymentu. Załadować roztwór kalibracyjny do pompy strzykawkowej i przecisnąć z szybkością 1,2 μl/min. Zastosuj napięcie 3,5 kV, aby uzyskać stabilny pióropusz elektrorozpylania do kalibracji masy zarówno w trybie dodatnim, jak i ujemnym.
  2. Odpipetować 5 μl zawieszonych glikanów mitochondrialnych na miejsce próbki na szkiełku teflonowym do mikrodołka.
  3. Do ablacji należy użyć lasera średniej podczerwieni działającego na długości fali 2,97 μm o energii 1,8 mJ na impuls.
  4. Jonizuj i wykrywaj N-glikany w trybie jonizacji ujemnej. Użyj rozpuszczalnika do elektrorozpylania składającego się z 60% acetonitrylu i 1 mM kwasu octowego, aby wytworzyć stabilny pióropusz elektrorozpylania o natężeniu przepływu 2 μl/min przy napięciu 3,2 kV.
  5. Aby przeprowadzić analizę, należy połączyć IR-MALDESI ze spektrometrem masowym HRAM ustawionym na zdolność rozdzielczą masy 240 000FWHM przy m/z 200, analizując od 500 do 2 000 m/z w trybie jonizacji ujemnej.
  6. Wyłącz automatyczną kontrolę wzmocnienia (AGC) i ustaw stały czas wtrysku na 90 ms. Użyj źródła EasyIC do wewnętrznej kalibracji każdego widma w czasie rzeczywistym, aby osiągnąć wysoką dokładność pomiaru masy (MMA).

8. Analiza danych mitochondrialnej N-glikanów

  1. Ręczna identyfikacja glikanów sprzężonych z N poprzez wyszukiwanie mas monoizotopowych i potwierdzanie rozkładów izotopowych przy użyciu odstępów m/z w celu wyznaczenia podwójnie i potrójnie naładowanych jonów, które mają minimalny próg strumienia jonów wynoszący 1,000 jonów / s.
  2. Przelicz widma mas surowych ze stosunków m/z na neutralne masy monoizotopowe.
  3. Prześlij masy monoizotopowe do internetowego narzędzia do przewidywania struktury oligosacharydów, aby określić potencjalny skład glikanów. Potwierdzanie adnotacji za pomocą eksperymentalnie wyselekcjonowanej bazy danych glikomicznej20; upewnij się, że każda identyfikacja mieści się w marginesie 2,5 ppm MMA, zawiera rdzeń struktury glikanu sprzężonego z N (Hex3HexNAc2) i wyklucza monosacharydy pentozy, KDN lub HexA.
  4. Narysuj potwierdzone struktury glikanów za pomocą nomenklatury SNFG21.
  5. Uzyskaj względną obfitość glikanów z widm surowej masy i znormalizuj z ilością białka mitochondrialnego w μg, aby uzyskać jony/s/μg.
  6. Użyj analizy chi-kwadrat, aby przetestować dobroć dopasowania między teoretycznymi i eksperymentalnymi rozkładami glikanów sprzężonych z N w celu określenia liczby adduktów chloru. Pozwala to na bezpośrednie określenie liczby kwasów sjalowych19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia schematyczny zarys etapów związanych z izolacją mitochondriów z linii komórek mikrogleju BV2 do analizy glikanów metodą spektrometrii mas. Powtarzalność izolacji białek mitochondrialnych między różnymi preparatami mitochondrialnymi z tej samej gęstości początkowej komórek mikrogleju jest przedstawiona na rysunku Rysunek 2, który nie pokazuje znaczącej różnicy między stężeniem białka mitochondrialnego oszacowanym za pomocą testu mikro BCA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglej jest rezydującymi komórkami odpornościowymi mózgu, a modyfikacje glikanów modulują immunofenotyp i funkcję mikrogleju. Te funkcje odpornościowe wymagają znacznej ilości energii komórkowej, która jest dostarczana głównie przez mitochondria. Warto zauważyć, że białka mitochondrialne również wykazują modyfikacje glikanów, które pozostały znacznie niedostatecznie zbadane ze względu na wyzwania technologiczne związane z badaniem subkomórkowej glikozylacji. Większość badań nad glikozylacją mitochondrialną opiera się ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Sethowi Eisenbergowi, doktorantowi w Muddiman Lab na NCSU, za pomoc w nagraniu wideo protokołu spektrometrii mas. Badania te były częściowo wspierane przez School of Engineering Innovation Fellows Program na University of Alabama w Birmingham, AG068309 do D.J.T. i R01GM087964-12 do DCM. Schematy w tym rękopisie zostały narysowane przy użyciu BioRender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
Amersham 600 imagerCytvia 29194217Imager żelowo-membranowy
Countess 3 automatyczny licznik komórekFisher ScientificX003SZ1LY9
Sucha kąpiel Stdrd 4 blck 100-120VThermofisher scientific 
i-Blot2 Gel Transfer DeviceInvitrogenIB21001System przenoszenia Western blot
Mikroskop odwróconyCell Treat04355223EA
Czytnik82050-760
Mini zbiornik na żelInvitrogenA25977
Open Air RockerFisher Marka88861025
Chłopiec z pipetą BioTek229310
Integra- Odczynniki
strong>
Zestaw do izolacji mitochondriówThermofisher scientific 89874
Inhibitor fosfotazyThermofisher naukowy 
Inhibitor proteazyThermofisher naukowy Izolacja 1861281
N-glikanu i odczynniki IR-MALDESI
Acetic acid Fisher ScientificA1135050% w rozpuszczalniku ESI
Acetonitryl Sigma Aldrich34851-4L1 mM w rozpuszczalniku ESI
Wodorowęglan amonu Fisher ScientificA643500100 mM
Roztwór kalibracyjnyThermofisher ScientificA39239Pierce FlexMix
Ditiothreitol Sigma AldrichAC4263801001 M
JodoacetamidSigma AldrichA322-10VL
LC/MS klasa wodyThermofisher Scientific047146.M6
PNGase FBulldog BioNZPP01075000 U/mL, enzym do uwalniania N-glikanów 
Izolacja < strong>N-glikanów i materiały eksploatacyjne IR-MALDESI
Amicon Filtry odśrodkoweFisher Scientific UFC501024MWCO 10 kDa
Orbitrap Exploris 240
Mid-IR LaserJGM Associates, Burlington, MA, USA
Teflonowy szkiełko mikrostudzienneProsolia, Indianapolis, IN, USA
strong>N-glikanów oprogramowanie
GlycoMod Ekspasy https://web.expasy.org/glycomod/
GlyConnectExpasy https://glyconnect.expasy.org/
Izolacja białek i materiały eksploatacyjne western blot  Końcówki ładujące żel
Basix (10 &mikro; L) Basix13-611-102
Końcówki ładujące żel Basix ( 200 &mikro; L) Basix13-611-116
Skrobak do komórekVWR labs14-388-100
Regularne stosy Blot NCInvitrogenIB23001
Blot2 PVDF Regularne stosyInvitrogenIB24001
10  &mikro; L mikropipetaFisher ScientificFBE00010
20 & mikro; Lmikropipeta InvitrogenFBE00020
200  &mikro; L mikropipeta Marka FisherFBE00200
1000 & L mikropipetamarki FisherFBE01000
10  &mikro; Końcówki do pipet L Laboratoria VWR76322-528
20  &mikro; L końcówki do pipetVWR labs76322-134
200  µ Końcówki do pipet L VWR labs76322-150
1000  &mikro; Końcówki do pipet LVWR labs76322-154
Płytka studzienna Marka Fisher14-388-100
Izolacja białek i odczynniki western blot 
Actin przeciwciało ( Gospodarz: Królik )Technologie sygnalizacji komórkowej8457T
Anty-królicze IgG HRP Powiązane Technologie sygnalizacji komórkowej7074S
Bolt 4-12% Bis-tris PlusInvitrogenNW04120BOX
Albumina surowicy bydlęcejOdczynniki FisheraBP9700-100
Przeciwciało COXIV (gospodarz: królik)Technologie sygnalizacji komórkowej4844S Przeciwciało
GAPDH (gospodarz: królik)Technologie sygnalizacji komórkowej2118S
Zestaw do oznaczania białek MicroBCAThermofisher naukowy 23235
Bufor do biegania Nupage MOPS SDS [20x]Thermofisher naukowy NP0001
STRONA Linijka wstępnie barwiona drabinka białkowaThermofisher naukowy 815-968-0747Rozcieńczenie= Stosować 7  &mikro; L do załadowania do pierwszej studzienki
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Aniara DiagnosticsA12-9423-5Przygotuj 1x PBS z 10x proszku 
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermofisher naukowy 32106Zestaw substratów chemiluminescencyjnych
RIPA BufferThermofisher naukowy 89901
Bufor do próbekNovexB0007Bufor do próbek śrubowy LDS jest przygotowywany w stosunku 3:1 próbki do próbki Bufor
Tween-20MP BiomedicalsTWEEN201
Materiały eksploatacyjne do hodowli tkankowych 
Countess SlidesAvantor229411
probówki EppendorfCell Treat414004-265612-5884
Pipeta aspiracyjna 2 mlVista lab5090-0010E
Pipipeta serologiczna 5 mL Fisher Scientific13-678-11D
10 ml pipeta serologiczna Basix13-678-11E
Pipeta serologiczna 25 mlVista labFB012937
50 ml pipeta serologicznaVista lab14955233
15 ml Rurka stożkowaAvantor229225A
stożkowaLeczenie komórkowe4190-0050
T-75 cm2 Kolba do hodowli tkankowychFisher Scientific
T-180 cm2 Kolba do hodowli tkankowychFisher ScientificFB012939
Odczynniki do hodowli tkankowych  Linia komórek mikrogleju
BV2 Kreatywna bioarray CSC-I2227ZNieśmiertelny mikroglej myszy (BV2) pochodzący z mikrogleju noworodków C57/BL6 
Enzymy dysocjacji komórek Thermofisher naukowy 12563029TrypLE 
Pożywka o niskiej zawartości glukozy Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco10567014
Płodowa surowica bydlęcaCytivaSH30071.03HI
Minimalne niezbędne podłoże (MEM) Aminokwasy endogenneGibco11140050
Penicillium StreptomycynaCytiviaSV30010
Bufor fosforanowy sól fizjologicznaCorning21-040-CV
Trypan Blue barin 0,4%InvitrogenZobacz materiał T10282
88870003 mikropłytek Mieszalnik wirowy do izolacji mitochondriów VWR<1861274 Spektrometr masowy < 50 ml rurka FB012937 Bufor fosforanowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dos Santos, S. E., et al. Similar microglial cell densities across brain structures and mammalian species: Implications for brain tissue function. J Neurosci. 40 (24), 4622-4643 (2020).
  2. Shao, F., Wang, X., Wu, H., Wu, Q., Zhang, J. Microglia and neuroinflammation: Crucial pathological mechanisms in traumatic brain injury-induced neurodegeneration. Front Aging Neurosci. 14, 825086(2022).
  3. Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The pathophysiological role of microglia in dynamic surveillance, phagocytosis and structural remodeling of the developing cns. Front Mol Neurosci. 10, 191(2017).
  4. Cheng, J., et al. Early glycolytic reprogramming controls microglial inflammatory activation. J Neuroinflammation. 18 (1), 129(2021).
  5. Cătălin, B., Cupido, A., Iancău, M., Albu, C. V., Kirchhoff, F. Microglia: First responders in the central nervous system. Rom J Morphol Embryol. 54 (3), 467-472 (2013).
  6. Cai, Y., Liu, J., Wang, B., Sun, M., Yang, H. Microglia in the neuroinflammatory pathogenesis of alzheimer's disease and related therapeutic targets. Front Immunol. 13, 856376(2022).
  7. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nat Neurosci. 21 (10), 1359-1369 (2018).
  8. Norat, P., et al. Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation. NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).
  9. Picca, A., et al. Age-associated glia remodeling and mitochondrial dysfunction in neurodegeneration: Antioxidant supplementation as a possible intervention. Nutrients. 14 (12), 2406(2022).
  10. Mcavoy, K., Kawamata, H. Glial mitochondrial function and dysfunction in health and neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 101, 103417(2019).
  11. Fairley, L. H., Wong, J. H., Barron, A. M. Mitochondrial regulation of microglial immunometabolism in alzheimer's disease. Front Immunol. 12, 624538(2021).
  12. Starossom, S. C., et al. Galectin-1 deactivates classically activated microglia and protects from inflammation-induced neurodegeneration. Immunity. 37 (2), 249-263 (2012).
  13. Puigdellívol, M., Allendorf, D. H., Brown, G. C. Sialylation and galectin-3 in microglia-mediated neuroinflammation and neurodegeneration. Front Cell Neurosci. 14, 162(2020).
  14. Gerlach, J. Q., Kilcoyne, M., Eaton, S., Bhavanandan, V., Joshi, L. Non-carbohydrate-mediated interaction of lectins with plant proteins. Adv Exp Med Biol. 705, 257-269 (2011).
  15. Cummings, R. D., Pierce, J. M. The challenge and promise of glycomics. Chem Biol. 21 (1), 1-15 (2014).
  16. Robichaud, G., Barry, J. A., Muddiman, D. C. IR-MALDESI mass spectrometry imaging of biological tissue sections using ice as a matrix. J Am Soc Mass Spectrom. 25 (3), 319-328 (2014).
  17. Barry, J. A., Groseclose, M. R., Robichaud, G., Castellino, S., Muddiman, D. C. Assessing drug and metabolite detection in liver tissue by uv-maldi and ir-maldesi mass spectrometry imaging coupled to ft-icr ms. Int J Mass Spectrom. 377, 448-155 (2015).
  18. Pace, C. L., Muddiman, D. C. Direct analysis of native N-linked glycans by IR-MALDESI. J Am Soc Mass Spectrom. 31 (8), 1759-1762 (2020).
  19. Palomino, T. V., Muddiman, D. C. Predicting sialic acid content of N-linked glycans using the isotopic pattern of chlorine. J Am Soc Mass Spectrom. 34 (7), 1392-1399 (2023).
  20. Mariethoz, J., et al. Glycomics@expasy: Bridging the gap. Mol Cell Proteomics. 17 (11), 2164-2176 (2018).
  21. Varki, A., et al. Symbol nomenclature for graphical representations of glycans. Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).
  22. Yu, H., et al. Comparison of the glycopattern alterations of mitochondrial proteins in cerebral cortex between rat alzheimer's disease and the cerebral ischemia model. Sci Rep. 7 (1), 39948(2017).
  23. Dixit, B., Vanhoozer, S., Anti, N. A., O'Connor, M. S., Boominathan, A. Rapid enrichment of mitochondria from mammalian cell cultures using digitonin. MethodsX. 8, 101197(2021).
  24. Kalathil, A. A., et al. New pathway for cisplatin prodrug to utilize metabolic substrate to overcome cancer intrinsic resistance. central science. 9, 1297-1312 (2023).
  25. Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans. Anal Chem. 87 (14), 7305-7312 (2015).
  26. Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. A quantitative glycomics and proteomics combined purification strategy. J Vis Exp. (109), e53735(2016).
  27. Fischler, D. A., Orlando, R. N-linked glycan release efficiency: A quantitative comparison between NaOCl and PNGase F release protocols. J Biomol Tech. 30 (4), 58-63 (2019).
  28. Tu, A., Muddiman, D. C. Internal energy deposition in infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization with and without the use of ice as a matrix. J Am Soc Mass Spectrom. 30 (11), 2380-2391 (2019).
  29. Barry, J. A., et al. Mapping antiretroviral drugs in tissue by IR-MALDESI MSI coupled to the Q exactive and comparison with LC-MS/MS SRM assay. J Am Soc Mass Spectrom. 25 (12), 2038-2047 (2014).
  30. Samal, J., Palomino, T. V., Chen, J., Muddiman, D. C., Segura, T. Enhanced detection of charged N-glycans in the brain by infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization mass spectrometric imaging. Anal Chem. 95 (29), 10913-10920 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mitochondria mikroglejuizolacja mitochondri wdetekcja N glikan wIR MALDESIwysokorozdzielcza spektrometria masekstrakcja bia ekglikozylacja mitochondri wchoroby neurodegeneracyjnekontrola jako ci

Powiązane artykuły