Artykuł metodologiczny

Multimodalna analiza mikroplastiku w wodzie pitnej przy użyciu rurociągu do analizy nanomembran krzemowych

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68200

⸱

13 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1SiMPore Inc., 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 3URnano, University of Rochester

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół prezentujący optycznie przezroczyste i płaskie podłoże do usprawnionego wychwytywania i analizy cząstek zanieczyszczających w wodzie pitnej. Przedstawiono tutaj Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP): elastyczny rurociąg do wychwytywania, kwantyfikacji i identyfikacji cząstek w ciekłych mediach.

Streszczenie

Biologiczny wpływ zanieczyszczenia mikroplastikiem w żywności i źródłach wody dla ludzi jest w dużej mierze nieznany, a źródła wody pitnej nie są wolne od tego zanieczyszczenia mikroplastikiem. W tym miejscu prezentujemy uproszczone podejście do wychwytywania, ilościowego określania i identyfikacji mikrodrobin plastiku w wodzie pitnej. Przedstawiamy analityczny przepływ pracy określany jako Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP), który wykorzystuje nowatorskie nanomembrany z azotku krzemu, które umożliwiają znaczący "współczynnik koncentracji", który konsoliduje zawieszone cząstki w płaskim obszarze obserwacyjnym w celu indywidualnej, wymiernej i multimodalnej analizy cząstek na tym samym podłożu. Główne zalety SNAP wynikają z zastosowania ultracienkich membran na bazie azotku krzemu umieszczonych w dyskach filtracyjnych o konwencjonalnych rozmiarach, umożliwiających bezpośrednie wychwytywanie i analizę polimerowych MP na tle niepolimerowym. Próbki wody pitnej pochodzące z regionu Rochester w stanie Nowy Jork zostały pobrane z domowych źródeł kranów i przeanalizowane za pomocą SNAP. Cząstki w każdej próbce scharakteryzowano za pomocą optycznej i skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), spektroskopii Ramana i spektroskopii rentgenowskiej z dyspersją energii (EDX), a różne zidentyfikowane składniki określono ilościowo proporcjonalnie do całkowitej wychwyconej cząstki.

Wprowadzenie

Mikroplastik definiuje się jako syntetyczne polimery o rozmiarze mniejszym niż pięć milimetrów1,2. Zanieczyszczenie mikroplastikiem (MP) stanowi rosnący problem dla zdrowia ludzkiego, środowiska i ekologii. Zanieczyszczenie MP stwierdzono we wszystkich typach źródeł wody; Słodka woda, oceany, a nawet źródła wody pitnej3. MP są generowane z podziału na podstawowe źródła tworzyw sztucznych4, a także tekstylia syntetyczne5,6,7. MP są wszechobecne i znaleziono je w tkankach ludzkich, takich jak ludzkie łożysko, kał i krew8,9,10. Rośnie zainteresowanie badaniami nad MP, o czym świadczy ponad 4 100 i 4 600 publikacji odpowiednio w 2023 i 2024 roku (dane PubMed; słowo kluczowe "mikroplastik"), a także rosnące zaniepokojenie opinii publicznej narażeniem ludzi na MP. W odpowiedzi na rosnące zaniepokojenie opinii publicznej, kilka rządowych organów regulacyjnych, takich jak Stan Kalifornia11 i kilka krajów UE12, wdrażały (lub będą) wdrażać przepisy dotyczące poziomów MP w wodzie pitnej. Biorąc pod uwagę wszystkie powyższe, amerykańska Agencja Ochrony Środowiska ogłosiła niedawno, że posłowie są nowym zanieczyszczeniem budzącym obawy. Ocena ryzyka dla ludzi jest jednak poważnie utrudniona ze względu na brak metod wiarygodnego i powtarzalnego wykrywania MP.

Charakterystyka MPS opiera się na metodach analitycznych, takich jak mikroskopia optyczna i elektronowa13 oraz techniki spektroskopowe i spektrometryczne1,14,15 w celu zrozumienia wizualnych cech MPS7 i ich skład, odpowiednio. Próbki zawierające MP powinny zawierać wiele analiz w celu scharakteryzowania, identyfikacji i ilościowego określenia MP i co najmniej wymagać spektroskopii/spektrometrii (tj. spektroskopii Ramana, spektroskopii w podczerwieni lub pirolitycznej chromatografii gazowej ze spektrometrią mas itp.) zgodnie z niektórymi minimalnymi wymaganiami czasopisma dotyczącymi pomiaru tworzyw sztucznych w próbkach środowiskowych, takimi jak Science of the Total Environment16. Spektroskopia Ramana jest bardziej wszechstronna niż spektroskopia w podczerwieni (IR), zwłaszcza w odniesieniu do identyfikacji materiałów w próbkach biologicznych. Spektroskopia Ramana jest techniką rozpraszania światła, dzięki czemu umożliwia łatwiejszą analizę mniejszych cząstek niż IR, technika pochłaniania światła, która wymaga większych cząstek i ma więcej ograniczeń co do umieszczania próbek17. Wcześniej sugerowano, że substraty do spektroskopii Ramana zawierające krzem lub tlenek krzemu mogą dawać wiarygodne wyniki przy minimalnym szumie tła18.

Substraty dla niektórych technik analitycznych, które zazwyczaj są kompatybilne z jednym typem analizy (np. podłoża pokryte złotem wymagane do spektroskopii IR) nie są często kompatybilne z mikroskopią światła transmisyjnego i/lub refleksyjnego. W związku z tym podpróbkowanie replikacji jest popularne wśród badaczy w celu uzyskania próbek odpowiednich dla każdej oddzielnej analizy, ale podpróbkowanie jest czasochłonne i może wykluczyć cząstki o niskiej ilości1,2,6. Zazwyczaj ręczne przenoszenie cząstek z jednego podłoża na drugie jest konieczne do analizy tej samej cząstki w celu scharakteryzowania i identyfikacji za pomocą różnych modalności analitycznych, ale te powolne, ręczne transfery zwiększają prawdopodobieństwo stronniczości, zanieczyszczenia i straty, a także ograniczają analizę MP tylko do cząstek o największych rozmiarach, którymi można manipulować ręcznie13. Te nieoptymalne przepływy pracy wprowadzają liczne wyzwania i problemy z niezawodnością, przyczyniając się do znacznej zmienności kwantyfikacji MP opisanej w literaturze3,7.

Tutaj prezentujemy analityczny przepływ pracy, który nazywamy Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP) do przechwytywania, charakteryzowania, identyfikacji i ilościowego określania MP, oraz demonstrowania użyteczności SNAP poprzez analizę próbek wody pitnej pochodzących z regionu Rochester, NY. SNAP jest możliwy dzięki konwencjonalnym dyskom filtracyjnym o średnicy 25 mm ze zintegrowanymi nanomembranami krzemowymi (patrz tabela uzupełniająca S1 dla właściwości membrany), które oferują jednolity substrat do zagęszczania i analizowania MPs z wody pitnej przy użyciu wielu technik15,19. Po sekwencyjnym zagęszczeniu i wychwyceniu MP na nanomembranach o zmniejszających się rozmiarach odcięcia (20 μm mikroporowaty azotek krzemu (MPSN) z cylindrycznymi porami i 8,0 μm mikroszczelinowy azotek krzemu (MSSN) z prostokątnymi porami pryzmatycznymi), SNAP umożliwia trzy kolejne etapy analityczne: 1) barwienie próbki, mikroskopia optyczna i kwantyfikacja MP, 2) identyfikacja cząstek za pomocą spektroskopii Ramana, a następnie 3) charakterystyka cząstek za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), Umożliwia to wielokrotne analizy tych samych cząstek wychwyconych na jednym podłożu nanomembranowym.

Pokazujemy wiele rurociągów SNAP, wykorzystując zarówno niepowlekane dyski filtracyjne z nanomembrany krzemowej (SiN), jak i pokryte złotem dyski filtrujące z nanomembrany krzemowej (Au-SiN): Rurociąg A) SNAP przeprowadzony na SiN i sekwencyjny charakteryzujący te same MP za pomocą wielu technik analitycznych; Rurociąg B) SNAP wykonany na Au-SiN ze spektroskopią Ramana; i Rurociąg C) SNAP wykonany na Au-SiN z SEM wyposażonym w spektroskopię rentgenowską z dyspersją energii (EDX) (Rysunek 1). Warianty SNAP są zatem elastycznymi, usprawnionymi przepływami pracy analitycznymi, które można stosować do wielu typów próbek i technik analitycznych. W przeciwieństwie do wcześniej opublikowanych metod, które opierają się na membranach polimerowych11, zalety SNAP wynikają z zastosowania nanomembran krzemowych, w których syntetyczne polimery MP są wychwytywane na niepolimerowej membranie na bazie krzemu, co umożliwia identyfikację składu MP na tle niepolimerowym. Co więcej, nanomembrany krzemowe oferują jednolite płaszczyzny ogniskowe, w przeciwieństwie do membran polimerowych, które mają tendencję do marszczenia się, co umożliwia wiele zautomatyzowanych technik mikroskopii i spektroskopii.

Wcześniej scharakteryzowaliśmy użycie nanomembran krzemowych do analiz MP poprzez modelowanie analityczne, wyzwania z cząstkami modelu oraz próbki wody pitnej i powietrza19,20, a także porównując ich właściwości filtracji i mikroskopii optycznej przy użyciu cząstek modelowych z czterema powszechnie stosowanymi membranami15. W tym protokole heurystycznie demonstrujemy użyteczność SNAP do analizy MP w czterech próbkach wody pitnej. Próbki pobrano z czterech różnych źródeł wody w aglomeracji Rochester w stanie Nowy Jork. Każda próbka uwzględniona w tym badaniu pochodziła z odrębnego źródła wód powierzchniowych, takiego jak jezioro Ontario, jezioro Hemlock, mieszanka Hemlock i Ontario oraz jezioro Canandaigua (Rysunek 2). Przechwycone cząstki z tych źródeł wody pitnej obejmowały szeroko rozpowszechnione tworzywa sztuczne, takie jak polistyren (PS) i polietylen (PE), metale ciężkie, takie jak żelazo, krzemionka i cząstki niesyntetyczne.

Protokół

1. Procedury kontroli jakości i preparaty roztworów ultraczystych

  1. Czyszczenie kaptura z przepływem laminarnym i rękawic
    1. Don PPE (środki ochrony osobistej): 100% bawełniany fartuch laboratoryjny i rękawice nitrylowe.
      UWAGA: ŚOI są ciągłe przez cały czas trwania protokołu.
    2. Spryskaj rękawice nitrylowe 99% alkoholem izopropylowym (IPA). Pocierać o siebie ręce, a następnie spłukać wodą z filtrem ~18 MΩ 0,22 μm. Zrób to 3 razy, aby usunąć środek antyadhezyjny z rękawic.
    3. Złóż delikatną chusteczkę z naturalnego włókna na ćwiartki, a następnie spryskaj 70% IPA. Wytrzyj powierzchnię kaptura od tyłu do przodu długimi pociągnięciami, ponownie składając delikatną chusteczkę roboczą na nieużywaną powierzchnię co dwa pociągnięcia. Kontynuuj czyszczenie okapu, aż wszystkie powierzchnie zostaną oczyszczone, a po zabrudzeniu wymień chusteczkę na nową.
    4. Odsłoń silikonową matę rolkową i przetocz się po powierzchni kaptura, aby zebrać wszelkie pozostałe cząsteczki. Aby wyczyścić silikonowy wałek, spryskaj go 99% IPA i wyszoruj dłonią w rękawiczce, a następnie spłucz wodą przefiltrowaną przez 18 MΩ i 0,22 μm. Powtórz 3 razy, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w kapturze.
    5. Ponownie wypłucz rękawice, jak w kroku 1.1.2.
  2. Wytwarzanie wody ultraczystej i IPA.
    1. Napełnij zlewkę o pojemności 1 l wodą o mocy 18 MΩ i umieść ją w okapie.
    2. Zalać strzykawkę o pojemności 60 ml i dołączony filtr strzykawkowy odcinający 0,22 μm, filtrując co najmniej 200 ml wody o pojemności 18 MΩ przez strzykawkę i dołączony filtr.
      UWAGA: Pompa strzykawkowa pozwoli zaoszczędzić czas, ale nie jest wymagana do wykonania opisanego protokołu.
    3. Wypłucz szklany pojemnik z zakrętką 3x wodą przefiltrowaną 18 MΩ, 0,22 μm. Napełnij strzykawką o strzykawce 0,22 μm przefiltrowaną wodą o strzykawce 18 MΩ.
    4. Powtórzyć kroki 1.2.1-1.2.3 z pożądanym stężeniem procentowym IPA zamiast 18 MΩ, przefiltrowaną wodą o stężeniu 0,22 μm, aby uzyskać ultraczystą IPA.

2. Wychwytywanie cząstek z próbek cieczy poprzez filtrację

UWAGA: Poniższy protokół może być stosowany z próbkami płynów innymi niż woda. Zwalidowane metody pobierania próbek powinny być pozostawione uznaniu badacza w oparciu o potrzeby jego badania i próbki.

  1. Don PPE.
    UWAGA: Upewnij się, że powierzchnie rękawic i kaptura są oczyszczone zgodnie z krokami 1.1.2-1.1.5.
  2. Spryskaj silikonową uszczelkę Ultrapure 99% IPA, wyszoruj palcami w rękawiczkach, a następnie spłucz wodą Ultraclean. Powtórz to 3 razy dla każdej uszczelki.
    UWAGA: Liczba uszczelek, które mają być użyte w filtracji, jest równa liczbie tarcz filtrujących, które mają być użyte, plus 1. Zapoznaj się z Rysunek 1B dla grafiki zestawu wizualnego.
  3. Używając strzykawki zagruntowanej w kroku 1.1.2, przepłukać wnętrze strzykawki o pojemności 60 ml wodą ultraczystą, pobierając do strzykawki 30 ml wody ultraczystej i 30 ml powietrza. Przykręcić filtr strzykawkowy, a następnie energicznie wstrząsnąć i dozować. Powtórz to 3x.
    UWAGA: W razie potrzeby można użyć strzykawki o dowolnym rozmiarze w zależności od objętości próbki.
  4. Zmontuj aparat filtracyjny, jak pokazano na grafice montażu wizualnego w Rysunek 1B.
    UWAGA: Użyj czystej pęsety do obsługi tarcz filtra i uszczelek podczas montażu i demontażu.
    1. W przypadku filtracji sekwencyjnej należy upewnić się, że między dyskiem a frytą nośną znajduje się uszczelka, między każdym dyskiem oraz uszczelka między dyskiem a lejkiem filtracyjnym
      2. .
    2. Upewnij się, że dyski są uporządkowane z największym filtrem odcinającym na górze stosu i najmniejszym filtrem odcinającym na dole.
  5. Włącz podciśnienie do aparatu tak, aby przez stos dysków filtra przepływał ujemny przepływ.
  6. Pomiar zanieczyszczenia tła
    UWAGA: Poniższy proces umożliwia ocenę czyszczenia strzykawki i wytwarzania mediów ultraczystych oraz określenie cząstek tła dostarczanych przez elementy systemu.
    1. Za pomocą przepłukanej strzykawki powoli nalej 50 ml ultraczystej wody na nanomembranę pośrodku górnego dysku, aby upewnić się, że cała dozowana ciecz została przefiltrowana.
      UWAGA: W przypadku filtrowania większych objętości próbek (tj. >50 ml) sugeruje się szklany lejek filtracyjny. Wyczyść szklany lejek filtracyjny jak w kroku 2.3. Dodatkowy sprzęt laboratoryjny może wiązać się z dodatkowym ryzykiem zanieczyszczenia cząstkami. Zachowaj ostrożność przy procedurach czyszczenia i zawsze potwierdzaj czystość za pomocą ślepych filtracji przed użyciem interesujących Cię próbek.
    2. Pozwól, aby ultraczysta woda się przefiltrowała. Utrzymuj próżnię włączoną przez dodatkową minutę po filtracji. Gdy próbka całkowicie wyschnie, wyłącz próżnię.
    3. Ostrożnie wyjmij krążki filtra z uszczelek za pomocą czystej pęsety i umieść krążki w odpowiednim czystym i oznakowanym pojemniku do przechowywania, takim jak szklana szalka Petriego lub zaciemnione pudełko.
    4. Zobrazuj dyski filtrujące pod mikroskopem w celu analizy optycznej, zliczania cząstek itp.
  7. W przypadku próbek cieczy należy oczyścić dodatkową uszczelkę jak w kroku 2.2. Zaopatrzyć się w nową strzykawkę dla każdej próbki płynnego podłoża i powtórzyć krok 2.3.
  8. Pobierz żądaną ilość próbki i powoli dozuj próbkę przez nanomembranę pośrodku górnego dysku.
  9. Po zakończeniu filtracji próbki przeprowadź 3-krotne płukanie 1 ml ultraczystej wody, aby upewnić się, że wszystkie cząstki w próbce zostały wystarczająco wypłukane ze wszystkich powierzchni na membranę w środku tarczy filtra.
  10. Utrzymuj próżnię włączoną przez dodatkową minutę, aby całkowicie wysuszyć 3-krotnie wypłukaną próbkę, a następnie wyłącz próżnię.
    1. Powtórzyć kroki 2.7-2.10 dla każdej kontrpróby, która ma być przeprowadzona na próbce będącej przedmiotem zainteresowania.

3. Przygotowanie i barwienie barwnika fluorescencyjnego

UWAGA: Barwienie fluorescencyjne czerwienią nilową i/lub błękitem trypanowym może zakłócać działanie interesujących laserów spektroskopii Ramana.

  1. Barwienie czerwienią nilową (NR)
    1. Załóż środki ochrony osobistej.
    2. Wyczyść rękawice i kaptur jak w krokach 1.1.2-1.1.5.
    3. Zakończ filtrację próbki zgodnie z opisem w krokach 2.7-2.10.
    4. Opłucz dwa szklane pojemniki z zakrętką wodą ultraczystą 3x.
    5. Przygotować 0,1 mg/ml roztwór NR w Ultrapure 99% IPA w czystym szklanym pojemniku.
    6. Delikatnie odwróć 10x do wymieszania.
    7. Przefiltrować roztwór NR za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm do drugiego szklanego pojemnika z zakrętką.
      UWAGA: Filtr używany do wstępnego filtrowania NR powinien mieć mniejsze odcięcie niż filtr używany do filtrowania próbek.
    8. Umieścić krążek filtra, który ma być zabarwiony, na frycie nośnej kolby próżniowej.
    9. Odpipetować 20 μl roztworu o stężeniu 0,1 mg/ml NR na nanomembranę w środku krążka filtra.
      UWAGA: Bejca powinna całkowicie pokrywać porowatą powierzchnię nanomembrany. Jeśli 20 μl to za mało, dodaj dodatkową plamę, aż wszystkie porowate obszary nanomembrany zostaną odpowiednio pokryte plamą.
    10. Inkubuj plamę przez 5 minut.
    11. Przefiltruj próżniowo plamę po zakończeniu inkubacji.
    12. Spłucz 3x 1 ml Ultrapure 99% IPA, aby usunąć nadmiar plam NR.
      UWAGA: Po tym kroku przejdź do poniższej sekcji Barwienie błękitem trypanowym, jeśli ma być wykonane barwienie przeciwstawne.
    13. Pozostaw dysk filtracyjny na frycie nośnej z włączonym próżnią przez 2 minuty, aby przefiltrować i wysuszyć resztki cieczy. Jeśli nie wyschnie po 2 minutach, przenieś dysk filtracyjny za pomocą czystej szklanej szalki Petriego do piekarnika o temperaturze 70 °C na 2-5 minut.
    14. Po wyschnięciu wykonaj mikroskopię fluorescencyjną zgodnie z opisem w kroku 2.6.4 i przejdź do sekcji 4.
  2. Barwienie błękitem trypanowym (TB)
    1. Załóż środki ochrony osobistej.
    2. Wyczyść rękawice i kaptur zgodnie z opisem w krokach 1.1.2-1.1.5.
    3. Zakończ filtrację próbki od kroków 2.7-2.10 lub zacznij od kroku 3.2.4.
    4. Opłucz dwa szklane pojemniki z zakrętką wodą ultraczystą 3x.
    5. Przygotuj plamę 0,4% TB w jednym pojemniku.
      UWAGA: Filtr używany do wstępnej filtracji TB powinien mieć mniejsze odcięcie niż filtr używany do filtrowania próbek.
    6. Delikatnie odwróć 10x do wymieszania.
    7. Przefiltrować roztwór barwienia gruźlicy za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm do drugiego szklanego pojemnika z zakrętką.
      UWAGA: Filtr używany do wstępnej filtracji TB powinien mieć mniejsze odcięcie niż filtr używany do filtrowania próbek.
    8. Umieścić krążek filtra, który ma być zabarwiony, na frycie nośnej kolby próżniowej.
    9. Odmierzyć pipetą 20 μl barwnika 0,4% TB na nanomembranę w środku dysku filtra.
      UWAGA: Bejca powinna całkowicie pokrywać porowatą powierzchnię nanomembrany. Jeśli 20 μl to za mało, dodaj kroplami dodatkową plamę, aż wszystkie porowate obszary nanomembrany zostaną odpowiednio pokryte plamą.
    10. Inkubuj plamę przez 5 minut.
    11. Odfiltruj próżniowo plamę po inkubacji przez 5 minut.
    12. Spłukać 1 ml objętości wody ultraczystej 3x.
    13. Pozostaw dysk filtracyjny na frycie nośnej z włączonym próżnią przez 2 minuty, aby przefiltrować i wysuszyć resztki cieczy. Jeśli nie wyschnie po 2 minutach, przenieś dysk filtracyjny za pomocą czystej szklanej szalki Petriego do piekarnika o temperaturze 70 °C na 2-5 minut.
    14. Po wyschnięciu wykonaj mikroskopię fluorescencyjną zgodnie z opisem w kroku 2.6.4 i przejdź do sekcji 4.

4. Kwantyfikacja cząstek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

  1. Przechwytywanie obrazu za pomocą mikroskopii optycznej
    1. Unieruchomić dysk filtra na szkiełku mikroskopowym za pomocą uszczelki silikonowej lub użyć szkiełka wyrównującego przeznaczonego do użytku z dyskiem filtrującym ze stolikiem mikroskopu. Przesuń dysk filtra, który ma być obrazowany, na stolik mikroskopu.
    2. Zobrazuj nanomembranę za pomocą oświetlenia w jasnym polu, tak aby maksymalne wykryte liczby wynosiły ~ 90% maksymalnego zasięgu kamery wykrywającej.
      UWAGA: Ta wartość 90% wynosi ~59 000 dla detektora 16-bitowego z poziomami bieli na poziomie 65 535.
    3. Zobrazuj nanomembranę za pomocą oświetlenia fluorescencyjnego, tak aby maksymalne intensywności pikseli wynosiły około ~25% maksymalnego zasięgu kamery detektora.
    4. Zapisz obraz w 16-bitowym formacie kompozytowym TIFF.
  2. Kwantyfikacja cząstek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
    1. Korzystając z platformy do analizy obrazu, oddziel kanał(y) fluorescencyjny(e) kompozytowego formatu TIFF wygenerowanego w 4.1.4 od kanału jasnego pola za pomocą funkcji Split-Channels.
    2. Proguj intensywność pikseli za pomocą funkcji Threshold na wartość 10 000,
      UWAGA: Jeśli na cząstkach występuje nalot, próg jest zbyt niski i należy go podnieść.
    3. Zapisz osobny obraz w formacie PNG.
    4. Usuń plamki na obrazie, aby usunąć piksele szumu za pomocą funkcji Usuń plamki.
    5. Zlewnij obraz za pomocą funkcji Watershed.
      UWAGA: Ta funkcja rozdziela sąsiadujące ze sobą cząstki o podobnej wielkości, kosztem rozbijania dużych sąsiadujących cząstek na mniejsze kawałki. Ponieważ często występuje znacznie więcej małych cząstek niż dużych cząstek, może to być dobry kompromis, ale może mieć niezamierzone skutki, takie jak rozbijanie długich włókien na pasma małych cząstek. Sprawdź wyniki obrazu przed zaakceptowaniem danych.
    6. Ustaw skalę progowych obrazów fluorescencyjnych, mierząc szerokość porów na obrazie w jasnym polu. Użyj zmierzonej szerokości porów, aby ustawić skalę w pikselach/μm.
      UWAGA: W przypadku porów prostokątnych najmniejsza szerokość będzie pasować do etykiety produktu. W przypadku porów kołowych średnica będzie zgodna z etykietą produktu określającą wielkość porów (tj. odcięcie) nanomembrany.
    7. Zastosuj funkcję zliczania cząstek platformy analizy obrazu do progowego obrazu fluorescencyjnego, oceniając obszar, miny i maksimum.
    8. Przetwarzaj obrazy fluorescencyjne i w jasnym polu, aby stworzyć kompozyty, które wizualizują domeny fluorescencyjne.
    9. Proguj obraz fluorescencyjny, używając tej samej wartości, co w kroku 4.2.2.
    10. Scalaj kanały za pomocą platformy analizy obrazu. Przypisz kanał fluorescencyjny do kanału czerwonego, a obraz jasnego pola do kanału szarości.
    11. Zapisz kompozyt jako plik PNG.

5. Spektroskopia Ramana

  1. Włącz instrument Ramana i powiązany z nim komputer, umożliwiając każdemu z nich uruchomienie.
  2. Otwórz oprogramowanie na komputerze podłączonym do instrumentu Ramana.
  3. Po zainicjowaniu oprogramowania upewnij się, że Bieżąca aktywność systemu i Stan detektora na dolnej wstążce ekranu programu to Gotowy i mają odpowiednio kolor zielony.
  4. Jeśli przycisk autokalibracji (AC) u dołu ekranu jest czerwony, uruchom żądaną autokalibrację i poczekaj na jej zakończenie, zanim przejdziesz dalej.
  5. Jeśli używasz tylko jednego lasera i jednej siatki:
    1. Kliknij przycisk Exit (Wyjdź) na ekranie Autocalibration (Autokalibracja), a następnie wybierz żądany laser i siatkę z odpowiednich list rozwijanych w obszarze Device Setup (Ustawienia urządzenia) na karcie Acquisition (Akwizycja).
    2. Wróć do czerwonego przycisku AC u dołu ekranu i kliknij Current laser/Grating (Bieżący laser/krata) i zezwól na uruchomienie procedury kalibracji.
  6. Jeśli korzystasz ze wszystkich laserów i siatek, po prostu wybierz Wszystkie lasery i siatki i pozwól systemowi działać.
  7. Jeśli korzystasz z więcej niż jednego lasera i/lub siatki, wybierz Niestandardowe lasery/Siatki i wybierz wszystkie żądane ustawienia. Następnie poczekaj, aż kalibracja zostanie uruchomiona.
  8. Wybierz obiektyw 20x long working distance (LWD) na wieżyczce instrumentu oraz w oprogramowaniu w obszarze Instrument Settings (Ustawienia instrumentu) w zakładce Acquisition (Akwizycja).
  9. Jeśli ten obiektyw nie jest dostępny, użyj alternatywnego obiektywu o małym powiększeniu (np. 5x lub 10x) z odległością roboczą dostosowaną do wysokości dysku filtra.
    UWAGA: Zacznij od obiektywu o mniejszym powiększeniu, aby ułatwić początkową nawigację po nanomembranie dysku filtra.
  10. Umieść dysk filtra na stoliku mikroskopu tak, aby znajdował się w obrębie ścieżki optycznej.
  11. Kliknij opcję Pozyskiwanie wideo na górnej wstążce, aby włączyć optykę wizualizacji.
  12. Wykorzystaj zgrubne i precyzyjne pokrętła ostrości w instrumencie, aby ustawić ostrość nanomembrany dysku filtra.
  13. Z grubsza wyrównaj pory z liniami kursora punktowego na ekranie komputera.
  14. Albo delikatnie obróć dysk filtra na stoliku, aby uzyskać to kwadratowe wyrównanie, albo użyj suwaka wyrównującego przeznaczonego do użytku z dyskiem filtra w stoliku mikroskopowym.
  15. Na karcie Akwizycja w prawym górnym rogu upewnij się, że wybrany tryb oświetlacza to Ciemne pole, aby uzyskać najlepsze wyniki.
  16. Aby uzyskać zszyty obraz, przejdź do karty Wideo na wstążce Karty danych.
  17. Przejdź do pierwszego żądanego pola widzenia, a następnie kliknij przycisk Mozaika w prawym górnym rogu okna wideo i dodaj do mapy. Nawiguj do zewnętrznego przeciwległego rogu żądanego obszaru za pomocą joysticka instrumentu i dodaj do mapy.
  18. Uruchom pobieranie mozaiki za pomocą narzędzia ViewSharp, aby upewnić się, że wszystkie obszary są prawidłowo ostre na końcowym obrazie.
    UWAGA: Obiektywy o mniejszym powiększeniu potrzebują mniej czasu na uzyskanie mozaiki obrazu, podczas gdy obiektywy o większym powiększeniu będą potrzebowały więcej czasu.
  19. Po utworzeniu mozaiki obrazów kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i naciśnij Wyślij do ParticleFinder.
  20. Przejdź do zakładki ParticleFinder w prawym górnym rogu, aby wejść w interakcję z ustawieniami progów.
  21. Aby upewnić się, że wybrano właściwe cząstki, kliknij lewym przyciskiem myszy Obraz na karcie danych ParticleFinder, aby zaznaczyć pola Środek, Cząstka i Przezroczystość. Ustaw suwak przezroczystości na 50%, a rozmiar piksela Środek na 2px.
    UWAGA: Zaznaczenie środka umieści kropkę na środku każdej cząstki, a zaznaczenie cząstki umieści nakładkę na każdym obszarze określonym jako cząstka, przy 50% przezroczystości. Te ustawienia zlokalizują każdą cząstkę i zdefiniują krawędzie każdej cząstki.
  22. W razie potrzeby edytuj parametry progowania cząstek i morfologii/wyboru rozmiaru w zakładce ParticleFinder po prawej stronie programu, aby upewnić się, że wszystkie cząstki i ich parametry rozmiaru/kształtu są prawidłowo zidentyfikowane. Patrz Tabela Uzupełniająca S2 w celu zapoznania się z przykładem, w jaki sposób można zastosować parametry morfologiczne.
    1. Jeśli automatyczne wykrywanie cząstek nie jest wystarczające, przełącz się na ręczne i stopniowo dostosowuj wartości progowe, aż większość właściwych obiektów zostanie zidentyfikowana jako cząstki.
    2. Jeśli morfologia wykrytych cząstek wymaga dalszego doprecyzowania, zaznacz pole obok opcji Zastosuj filtry morfologiczne. Wybierz odpowiednie parametry i ich intensywność w wyświetlonych menu rozwijanych.
      UWAGA: Kolejność, w jakiej wybierane są parametry, może mieć wpływ na wynik wyjściowy.
  23. Jeśli rozmiar, kształt lub inne cechy morfologiczne cząstek są czynnikami krytycznymi, zaznacz pole obok opcji Zastosuj filtr wstępny cząstek, a następnie wybierz i edytuj parametry zgodnie z potrzebami.
  24. Po zidentyfikowaniu cząstek i zaakceptowaniu ich wybranych kształtów/krawędzi, przejdź do przewijanej listy podglądu obrazów cząstek w sekcji Wyniki. Wybierz interesujące Cię cząstki, klikając powiązany obraz cząstek.
  25. Włącz podgląd na żywo za pomocą przycisku kamery wideo u góry ekranu.
  26. Przełącz się na obiektyw LWD 50x, klikając liczbę powiększenia i wybierając odpowiedni obiektyw z menu rozwijanego w aplikacji na dolnej wstążce.
  27. W razie potrzeby przywróć ostrość cząstek za pomocą pokrętła precyzyjnej regulacji.
  28. Uchwyć obrazy poszczególnych cząstek, które mają być przeanalizowane za pomocą spektroskopii Ramanowskiej, a następnie zapisz obrazy jako osobne pliki o odpowiednich nazwach.
  29. Upewnij się, że żądany obszar cząstki, która ma być analizowana za pomocą spektroskopii Ramana, jest prawidłowo umieszczony pod lokalizacją wiązki laserowej.
  30. Po wybraniu odpowiedniego obszaru cząstki do analizy, naciśnij przycisk STOP ALL w górnej części okna, aby wyłączyć optykę wizualizacji.
  31. Ustaw laser na 532 nm, przy 1% mocy dla cząstek niebarwionych i na 785 nm lub 830 nm dla cząstek barwionych fluorescencyjnie.
  32. Ustaw czas akwizycji na 10 s, a akumulacje na 5.
  33. Wybierz kartę Spectra z menu kart danych, a następnie naciśnij przycisk odtwarzania, aby uruchomić wyświetlanie w czasie rzeczywistym (RTD).
    UWAGA: Wykorzystaj informacje uzyskane podczas RTD do optymalizacji ustawień.
  34. Gdy jesteś zadowolony z ustawień i wyników, naciśnij STOP ALL, aby zatrzymać RTD.
  35. Ostateczną zdobycz można teraz odebrać, naciskając okrągły przycisk Spectrum Aquisition obok przycisku RTD.
  36. Zapisz zebrane widma jako osobne pliki o odpowiednich nazwach.
  37. Powtórz kroki 5.28-5.36. dla każdej cząstki będącej przedmiotem zainteresowania.
  38. Po zakończeniu pobierania próbki wyjmij dysk filtrujący i włóż obiektyw z powrotem do 20X LWD zarówno ręcznie na lunecie, jak i w oprogramowaniu.
  39. Powtórzyć kroki 5.10-5.37 dla nowej próbki(-ek).

6. Identyfikacja spektralna

  1. Jeśli zakupiona lub samodzielnie utworzona baza danych spektralnych Ramana nie jest dostępna, przejdź do biblioteki spektroskopii typu open source pod adresem: https://www.openanalysis.org/openspecy/
    UWAGA: OpenSpecy to baza danych spektroskopii Ramana i IR o otwartym kodzie źródłowym, która zawiera 636 widm z trzech różnych bibliotek 276 polimerów i materiałów mających zastosowanie do identyfikacji środowiskowych MP i włókien21. Wstępnie i po przetworzeniu danych spektralnych można równie dobrze wykorzystać w tym zasobie.
  2. Zapisuj widma Ramana jako osobne pliki .csv.
    1. Oznacz kolumnę A jako liczbę falową, po której następują liczby falowe widm, a kolumnę B należy oznaczyć jako Natężenie, po której następują wartości szczytowego natężenia na liczbę falową.
  3. Otwórz widma, przeciągając i upuszczając plik .csv na pasek przeglądania w lewym górnym rogu.
  4. Włącz opcję Wstępne przetwarzanie i identyfikacja.
  5. W obszarze Przetwarzanie wstępne włącz opcje Threshold Signal Noise, Min-Max Normalize, Smoothing/Derivative, Conform Wavenumbers i Baseline Correction (Korekcja linii bazowej).
    UWAGA: Konkretne ustawienia w nim zawarte można dostosować w zależności od indywidualnych cech analizowanych widm.
  6. W obszarze Identyfikacja wybierz pozycję Ramana jako typ widma i Pochodną jako Transformacja biblioteki.
    UWAGA: Ta biblioteka może być również używana do spektroskopii w podczerwieni. W oknie analizy zostanie wyświetlone białe spektrum, przesłane widmo do analizy i widmo czerwone, podejrzane dopasowanie identyfikacyjne.
  7. W przypadku dowolnych widm, które nie zwracają dopasowania r > 0,70 lub rozsądnych korelacji kształtu piku, wykorzystaj 5 najlepszych sugerowanych wyników jako miejsce do rozpoczęcia badania potencjalnych dopasowań zgodnie z preferencjami.
  8. Upewnij się, że zmierzone wartości pików mieszczą się w zakresie ±10 liczb falowych od odpowiadającego mu piku w wybranych widmach odniesienia przed potwierdzeniem dopasowania dla tego piku.
  9. Rejestruj korelacje spektralne, ich wartości korelacji oraz bazę danych, z której pochodzi podejrzewane dopasowanie.
  10. Pobieraj pliki zgodnie z indywidualnymi potrzebami.

7. Skaningowa mikroskopia elektronowa

UWAGA: Jeśli nie pokryjesz dysku filtra metalem przed analizą SEM, przejdź do sekcji 7.2.

  1. Powlekanie metalowe próbek do SEM
    1. Zamontuj dysk filtra na stalowym króćcu SEM za pomocą taśmy węglowej.
    2. Włóż do napylarki i przepompuj komorę do 50 mTorr.
    3. Otwórz zawór odcinający rozpylający Ar (argon).
    4. Oczyść system, wprowadzając Ar do komory przez zawór iglicowy do ciśnienia 300 mTorr, a następnie opróżnij komorę do 50 mTorr. Powtórz 3 razy.
    5. Ustawić ciśnienie końcowe na 100 mTorr za pomocą zaworu iglicowego.
    6. Korzystając z celu Au, umieść Au na dysku filtra za pomocą sputtering.
      UWAGA: Inne źródła docelowe (np. Pt, Ir, Si itp.) mogą być alternatywnie używane zamiast Au; Prąd 20 mA wytwarza 0,1 angstrema/s osadzania przy 100 mTorr.
    7. Odpowietrzyć układ i wyjąć dysk filtra. Utrzymuj tarczę filtra przyklejoną do króćca ze stali nierdzewnej.
  2. Przechwytywanie obrazu SEM
    1. Przymocuj króciec do wielostopniowego uchwytu Zeiss Auriga za pomocą ustalającej.
    2. Włącz narzędzie SEM i komputery, na których jest uruchamiany, a następnie zezwól na uruchomienie każdego z nich.
    3. Otwórz oprogramowanie dołączone do SEM.
    4. Sprawdź, czy system jest pod próżnią (5e-6 Torr).
    5. Odpowietrz blokadę załadunku, naciskając przycisk Vent na głównym korpusie komory loadlock i otwórz blokadę załadunku.
    6. Zamontuj wielostopniowy uchwyt na pokrytym teflonem przyrządzie do wkładania i przymocuj ramię transferowe za pomocą dołączonej płytki śrubowej.
    7. Zamknij blokadę załadunku i pompuj blokadę załadunku, naciskając przycisk Store na głównym korpusie komory loadlock.
      UWAGA: Zakończenie następuje, gdy zielone światła przestaną migać na przycisku Sklep.
    8. Załaduj uchwyt wielostopniowy na stolik w głównej komorze obserwacyjnej, otwierając bramę transferową.
    9. Naciśnij przycisk Przenieś na głównym korpusie zamka załadunku. Brama opadnie i odsłoni wewnętrzną komorę.
    10. Włóż ramię blokujące ładunek (wkręcone w uchwyt wielostopniowy) i przymocuj uchwyt wielostopniowy do stolika.
    11. Odkręć ramię przenoszące blokadę obciążenia i całkowicie wsuń ramię, tak aby znalazło się w blokadzie ładunku.
    12. Zamknij bramkę transferu, naciskając przycisk Prześlij.
    13. Otwórz zawór odcinający, naciskając przycisk EHT w prawym dolnym rogu oprogramowania.
    14. Dostosuj odległość roboczą na 5 mm w strefie danych oprogramowania, a napięcie przyspieszające na 20 kV.
    15. Zlokalizuj membranę dysku filtra za pomocą joysticków XY i Z.
    16. Podnieś stolik za pomocą joysticka Z, aż obraz stanie się ostry.
    17. Skoryguj astygmatyzm, regulując pokrętła stygmatora XY i pokrętło ostrości na konsoli środkowej.
    18. Obrazuj cząstki próbki w żądanym powiększeniu, regulując koło powiększenia na konsoli centralnej, przechwytując obrazy o rozdzielczości 2,048 x 1,536 w 8- lub 16-bitowym formacie tiff.
  3. Analiza cząstek EDX
    1. Wyłącz moduł ChamberScope CCD na pulpicie komputera SEM.
      UWAGA: Jeśli ten krok nie zostanie wykonany, detektor EDX zostanie przytłoczony sygnałem i żadne dane nie zostaną zarejestrowane.
    2. Schłodzić detektor EDX, otwierając oprogramowanie APEX EDX na komputerze EDX, włączając detektor w menu w prawym górnym rogu.
    3. Przechwyć obraz SEM o niskiej rozdzielczości, którego można użyć do mapowania, klikając przycisk Przechwyć obraz.
    4. Otwórz menu karty Mapowanie u góry ekranu oprogramowania.
    5. W obszarze Ustawienia dostosuj rozdzielczość (256 x 256) i czas zatrzymania pikseli (0,16 μs) oraz numer klatki (32-64), aby zapewnić szacowany czas przechwytywania, który powinien wynosić ~5 minut.
    6. Kliknij Utwórz mapę w lewym górnym rogu menu.
    7. Wybierz opcję Potwierdź podgląd elementu, aby ręcznie dostosować wyszukiwanie elementów, lub polegaj na automatycznie zidentyfikowanych szczytach z oprogramowania.
    8. Po zakończeniu wygeneruj raport za pomocą funkcji AutoReport w prawej górnej części oprogramowania do mapowania.

Wyniki

Próbki ślepe procesu i zanieczyszczenia tła
Akceptowalny wynik dla próbki ślepej to taki, który nie zawiera cząstek lub zawiera ich tak mało, że zanieczyszczenie tła (tzn. procesu), jeśli występuje, nie stwarza dużego prawdopodobieństwa pomylenia lub zakłócenia wyników eksperymentu. Suboptymalny wynik dla próbki ślepej to taki, który zawiera wiele cząstek, przez co cząstki będące przedmiotem zainteresowania będą trudne do odróżnienia od zanieczyszczeń tła.

Dopuszczalny poziom zanieczyszczenia procesu powinien wynosić zero lub być jak najbliższy zeru, jednak w przypadku, gdy nie jest to możliwe, kluczowa staje się spójność liczby obserwowanych cząstek tła. Należy przeanalizować kilka próbek ślepych, aby określić powtarzalność wyników. Staranność w stosowaniu protokołów kontroli jakości (patrz sekcja 1), ograniczanie zanieczyszczeń oraz zapewnienie odpowiednich warunków środowiskowych podczas przetwarzania są niezbędne dla utrzymania niskiego poziomu zanieczyszczeń tła. Wyniki dotyczące zanieczyszczeń tła i ich dopuszczalność mogą również w dużym stopniu zależeć od progu odcięcia stosowanych nanomembran oraz ogólnej czystości warunków laboratoryjnych. Należy wziąć pod uwagę, że podczas analizy mniejszych cząstek z wykorzystaniem membran o niższym progu odcięcia (np. < 8 µm), względna liczba analizowanych cząstek oraz zanieczyszczeń tła o podobnej wielkości wzrośnie wykładniczo, co wymaga zastosowania bardziej rygorystycznej kontroli jakości22. Choć żaden poziom zanieczyszczeń nie jest w pełni akceptowalny, dopóki warunki są ściśle kontrolowane i osiągnięto wysoki stopień spójności, nadal możliwe jest przeprowadzanie rzetelnych analiz mikroplastików środowiskowych lub innych interesujących analiz.

Filtracja próbki
Aby uzyskać rzetelną analizę multimodalną, niezbędna jest prawidłowa filtracja próbki, co zilustrowano na przykładzie kaskady danych na Rysunku 3. Taka filtracja pozwoli uzyskać dobrze rozproszone cząstki na powierzchni nanomembrany (np. przy pokryciu około jednej trzeciej powierzchni membrany). Słabo rozproszone cząstki, jak w przypadku agregacji (duże skupiska nakładających się cząstek), utrudniają stosowanie zarówno manualnych, jak i zautomatyzowanych metod liczenia cząstek, ponieważ nakładające się obiekty nie są łatwo i pewnie rozróżnialne. Takie dane są zazwyczaj wykluczane z analizy, co może prowadzić do utraty cennych informacji. Dobrze rozproszone cząstki, przedstawione na Rysunku 4A,B, gwarantują, że analizy spektroskopowe lub ilościowe nie będą utrudnione przez nakładające się na siebie cząstki o różnym składzie, co mogłoby prowadzić do wyników trudniejszych do dokładnej interpretacji, identyfikacji i ilościowego oznaczenia.

Barwienie Nile Red i błękitem trypanowym
Reprezentatywne obrazy optymalnego barwienia cząstek fluorescencyjnych przedstawiono na Rysunku 3B na dysku filtra SiN z progiem odcięcia 20 µm. Niedostateczne wypłukanie barwnika NR lub TB z powierzchni nanomembrany może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich. Pozostałości barwnika utrzymujące się na powierzchni membrany z powodu niewystarczającego płukania mogą zostać błędnie zinterpretowane jako zabarwione cząstki. Sygnałem świadczącym o niewystarczającym płukaniu jest fluorescencja obszarów nanomembrany pozbawionych cząstek lub wykrywalnych pozostałości/filmów z przefiltrowanej próbki podczas obserwacji, co pokazano na Rysunku 5A. Po wykonaniu zdjęć, o ile dysk filtra był przechowywany w czystych warunkach, można przeprowadzić ponowne płukanie, umieszczając pojedynczy dysk filtra nanomembranowego z powrotem w aparaturze do filtracji próżniowej (bez uszczelek), włączając próżnię i filtrując kolejną objętość Ultrapure 99% IPA (dla NR) lub wody Ultrapure (dla TB) na nanomembranę dysku filtra. Należy zapisać całkowitą objętość użytego dodatkowego medium płuczącego. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy wykonać zdjęcia mikroskopowe całej powierzchni nanomembrany przed ponownym płukaniem, aby uwzględnić wszelkie zanieczyszczenia, które mogły powstać w wyniku tego etapu.

Spektroskopia Ramana
Spektroskopia Ramana przeprowadzona na niepowlekanych płytkach SiN może generować wyraźny pik w zależności od długości fali lasera, a pik ten może maskować sygnały o niskiej liczności w obszarze liczby falowej około 520 cm-123. Jeśli analizowane widma Ramana są wystarczająco oddalone od piku tła krzemu lub azotku krzemu, zastosowanie niepowlekanych dysków filtrujących SiN powinno przynieść odpowiednie wyniki spektroskopowe. W niniejszym raporcie w potokach B i C zastosowano dyski filtrujące Au-SiN. Powłoka złota w Au-SiN maskuje immanentny pik krzemu, co pozwala na bardziej niezawodne zbieranie widm o niskiej liczności w pobliżu lub przy liczbie falowej 520 cm-1. Ponadto Au-SiN można wykorzystać w spektroskopii IR, jeśli spektroskopia Ramana jest niedostępna. Zawsze należy rozpoczynać od najniższych ustawień mocy (tj. intensywności lasera) urządzenia, a następnie stopniowo ją zwiększać, ponieważ niektóre analizowane cząstki mogą być kruche, np. cząstki utlenione, i mogą zostać uszkodzone lub zniszczone przez laser.

Podczas analizy wybranych cząstek za pomocą spektroskopii Ramanowskiej kluczowe jest określenie wiarygodności uzyskanego widma. Niektóre cząstki mogą ulegać autofluorescencji, a fluorescencja ta wprowadza szum do pomiaru widmowego, co może maskować lub utrudniać interpretację sygnału cząstki. Szum ten przybiera formę pasma o wysokiej intensywności, które obejmuje szeroki zakres liczb falowych, zacierając podstawowe dane. Prawidłowe widma, przedstawione na Rysunku 3C oraz Rysunku 4C,D, nawet przed korekcją linii bazowej, wykazują wyraźnie zdefiniowane piki w węższych zakresach liczb falowych. Jeśli nie pojawią się piki, które są co najmniej trzykrotnie większe od jakiegokolwiek z sygnałów otaczających, prawdopodobne jest, że zebrane widma stanowią szum tła lub że do analizy danej cząstki wymagane są inne ustawienia instrumentu. Należy upewnić się, że dla każdej próbki wybrano odpowiednią długość fali lasera. Lasery o krótszej długości fali, takie jak laser 532 nm, nie radzą sobie wystarczająco z sygnałem generowanym przez fluorescencję. Laser o większej długości fali, taki jak laser 782 nm lub 830 nm, może w wystarczającym stopniu zignorować fluorescencję, aby uzyskać widmo. W zależności od rodzaju próbki różne lasery będą odpowiednie dla różnych typów cząstek i, jeśli to możliwe, mogą być one wymieniane podczas gromadzenia danych na pojedynczym dysku filtrów.

Aby określić skład cząsteczek, ich zebrane widma porównuje się z widmami w bazie danych widm referencyjnych. Niezawodna identyfikacja widma danej cząsteczki daje współczynnik Pearsona (r) większy niż 70% (r > 0,70). Suboptymalne dane Ramanowskie przedstawiono na Ryc. 5B, gdzie r < 0,70. Wyniki identyfikacji MP są przydatne w określaniu potencjalnych źródeł zanieczyszczenia MP. Aby wyświetlić wyniki identyfikacji cząsteczek, można przedstawić obraz i widma analizowanej cząsteczki, jak pokazano na Ryc. 3C oraz Ryc. 4C.

Skaningowa mikroskopia elektronowa
Zarówno dyski filtrujące SiN, jak i Au-SiN są kompatybilne z SEM bezpośrednio po wychwyceniu cząstek metodą filtracji. Jeśli dyski filtrujące SiN nie zostaną pokryte warstwą Au lub Pt przed badaniem SEM i po wychwyceniu cząstek, niektóre z nich mogą ulec łatwiejszemu „naładowaniu” przez wiązkę jonizującą SEM, co może spowodować świecenie cząstek lub ich bardzo wysoką jasność na obrazach. Taka jasność/świecenie może utrudniać wizualizację ze względu na słaby kontrast, np. maskując morfologię cząstki. Aby temu zapobiec, należy przed SEM przeprowadzić mikroskopię optyczną/fluorescencyjną oraz spektroskopię Ramana, aby oznaczyć wszelkie trudne do analizy lub małe cząstki budzące zainteresowanie do późniejszej analizy SEM/EDX, a następnie pokryć nanomembranę Au lub Pt zgodnie z opisem w sekcji 7 protokołu i przeprowadzić badanie SEM/EDX.

Powlekanie SiN lub Au-SiN złotem (Au) lub platyną (Pt) po przechwyceniu cząstek i przed analizą SEM pomaga zapobiegać efektowi gromadzenia ładunków podczas obrazowania, ponieważ cząstki nie są już podatne na jonizację pod warstwą naniesionego metalu. Powłoka ta poprawia kontrast i rozdzielczość, co pozwala na lepsze zrozumienie morfologii danej cząstki, jak pokazano na Rycini 3D (włókno vs fragment) lub morfologii powierzchni, takich jak wżery i szczeliny na utlenionych cząstkach. Powlekanie cząstek metalem przed analizą SEM trwale uniemożliwia ich dalszą analizę za pomocą spektroskopii lub obrazowania fluorescencyjnego, pozostawiając możliwość wykonania jedynie analiz SEM/EDX. Z tego względu powlekanie cząstek i przeprowadzanie SEM/EDX powinno być ostatnim etapem procesu, jeśli jest to planowane.

Pomiary EDX można przeprowadzać na przechwyconych cząstkach zarówno przed, jak i po napylaniu metalu. EDX pozwala określić dokładny skład pierwiastkowy danej cząstki lub obszaru, co stanowi doskonałe uzupełnienie w przypadku cząstek mniejszych niż granica detekcji analizy Ramanowskiej lub składów pierwiastkowych, które mogą być trudne do analizy przy użyciu określonych długości fal laserów Ramanowskich, takich jak metale, stopy, cząstki nasycone wodą oraz cząstki silnie fluorescencyjne pod wpływem dostępnych wiązek laserowych. W niniejszym badaniu cząstki pokryto warstwą Au o grubości 6 nm. Obrazowanie SEM wykonano przy powiększeniu od 200x do 3 000x, przy mocy wiązki 20 kV i ogniskowej 5 mm. Odpowiednie obrazy SEM wybranych cząstek przedstawiono na Rysunku 3D.

Reprezentatywne wyniki EDX przedstawiono na Rysunku 3F. Pierwiastki wykryte z udziałem masowym mniejszym niż 1% mogą być uznane za śladowe lub niewiarygodne, w zależności od czułości instrumentu; dlatego ustalono próg na poziomie 1%. Jeśli cząstki wybrane do analizy EDX były pokryte powłoką, wykrywalna ilość tej powłoki pojawi się w raporcie z analizy elementarnej. W przypadku użycia niepowlekanych dysków z filtra SiN, obserwowane będą sygnały Si i N, co pokazano na Rysunku 3F. Większość syntetycznych cząstek polimerowych będzie zawierać również pierwiastki C, H i O; niestety większość cząstek niesyntetycznych pochodzenia biologicznego składa się z tych samych pierwiastków, choć cząstki niesyntetyczne mogą zawierać także takie elementy jak S, co ma miejsce w przypadku białek. Ta zbieżność składu wyjaśnia, dlaczego metoda kontrastowania Nile Red i Trypan Blue jest użyteczna w rozróżnianiu cząstek syntetycznych od niesyntetycznych, jednak nie jest ona wyczerpującym narzędziem identyfikacyjnym, ponieważ Nile Red w pewnych przypadkach może barwić również cząstki niesyntetyczne. W celu potwierdzenia wyników należy stosować dodatkowe parametry analizy, takie jak sugerowane powyżej, w połączeniu z procedurami barwienia. Ponadto EDX może być użytecznym narzędziem do potencjalnej identyfikacji cząstek, które wykraczają poza granicę wykrywalności spektroskopii Ramanowskiej (np. nanoplastików o rozmiarach < 1 µm).

Proces równowagi statycznej podczas wychwytywania cząstek; schemat analizy Raman i SEM/EDX; układ filtracyjny.
Rysunek 1: Procedury SNAP. (A) Schematy procedur SNAP, charakteryzujących te same cząstki na tej samej nanomembranie za pomocą serii różnych technik analitycznych. Procedura A) pokazuje, że 1) cząstki zainteresowania wychwycone z próbek wody pitnej za pomocą filtracji próżniowej są 2) barwione Nile Red i Trypan Blue w celu rozróżnienia odpowiednio syntetycznych i niesyntetycznych cząstek polimerowych, a następnie 3) poddawane identyfikacji cząstek za pomocą spektroskopii Raman oraz 4) analizie SEM/EDX w celu określenia morfologii cząstek i identyfikacji pierwiastkowej. Procedura B) pokazuje 1) wychwytywanie cząstek na Au-SiN, a następnie 2) spektroskopię Raman. Procedura C) pokazuje 1) wychwytywanie cząstek na Au-SiN, a następnie analizę SEM/EDX. (B) Schemat dysku filtrującego i uszczelki silikonowej w układzie filtracyjnym w aparacie próżniowym, przedstawiający sekwencyjną filtrację przez 20 µm MPSN, a następnie 8.0 µm MSSN nanomembranę, rozdzielone uszczelkami silikonowymi. Skróty: SNAP = Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline; SEM = skaningowa mikroskopia elektronowa; EDX = spektroskopia rentgenowska z dyspersją energii; MPSN = mikroporowaty azotek krzemu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Regionalna mapa dystrybucji dostaw wody przedstawiająca źródła wody i oczyszczalnie.
Rysunek 2: Źródła poboru próbek wody pitnej. Regionalna mapa opublikowana przez Monroe County Water Authority przedstawiająca lokalizacje, z których pobrano każdą z czterech próbek wody pitnej w regionie Greater Rochester, NY. Próbki pochodziły z różnych powierzchniowych źródeł wody: jeziora Ontario (niebieski), jeziora Hemlock (zielony), obu jezior – Hemlock i Ontario (żółty) oraz jeziora Canandaigua (fioletowy). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces analizy cząstek: wychwytywanie, barwienie, spektroskopia Ramanowska, obrazowanie SEM, analiza EDX; wyniki na wykresie słupkowym.
Rysunek 3: Podsumowanie analiz przeprowadzonych w ramach SNAP Pipeline A na cząstkach wychwyconych z próbek wody pitnej. (A) Obraz w skali szarości wychwyconych cząstek z jednej reprezentatywnej próbki wody pitnej na membranie SiN o progu odcięcia 20 µm. (B) Obraz z nałożonymi sztucznymi kolorami cząstek poddanych przeciwbarwieniu, gdzie kolor czerwony reprezentuje Nile Red, a kolor niebieski Trypan Blue. (C) Referencyjne (czerwone) i zebrane (białe) widma Ramanowskie identyfikujące cząstkę zabarwioną Nile Red jako polietylen z wartością współczynnika korelacji Pearsona r = 0,97, wraz z reprezentatywnym obrazem analizowanej cząstki. (D) Mikrograf elektronowy dwóch różnych typów cząstek demonstrujący analizę morfologii włókna (panel górny) i fragmentu (panel dolny), oba przyjmujące barwnik Trypan Blue. (E) Ilościowe oznaczenie cząstek zabarwionych Nile Red, wychwyconych sekwencyjnie na nanomembranach o progach odcięcia odpowiednio 20 µm i 8 µm. (F) Podsumowanie analizy pierwiastkowej EDX losowo wybranego fragmentu oraz szczegóły analityczne wyników wraz z reprezentatywnym obrazem SEM analizowanej cząstki. Skróty: SNAP = Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline; SEM = skaningowa mikroskopia elektronowa; EDX = spektroskopia rentgenowska z dyspersją energii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia w ciemnym polu i analiza widm Ramana w filtracji mikroplastiku, wykresy ilościowe cząstek.
Rysunek 4: Podsumowanie analiz z Pipeline B systemu SNAP przeprowadzonych na cząstkach wychwyconych z próbek wody pitnej. Analiza widm Ramana trzech losowo wybranych cząstek z czterech próbek wody pitnej z gospodarstw domowych, wychwyconych na dyskach filtrujących Au-SiN MPSN 20 µm oraz MSSN 8,0 µm. Reprezentatywne obrazy w ciemnym polu całkowitego aktywnego obszaru membrany dla Au-SiN 20 µm i 8 µm przedstawiono odpowiednio w A i B. W tym trybie obrazowania cząstki są żółte, podczas gdy tło pozostaje ciemne, co ułatwia zautomatyzowane liczenie cząstek. Reprezentatywne widma Ramana cząstek syntetycznych i niesyntetycznych na Au-SiN (C) 20 µm i (D) 8,0 µm. Całkowita liczba cząstek dla Au-SiN (E) 20 µm i (F) 8,0 µm została pogrupowana w przedziały wielkości określone przez oprogramowanie do automatycznego wykrywania cząstek. Skróty: SNAP = Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline; SEM = skaningowa mikroskopia elektronowa; EDX = spektroskopia rentgenowska z dyspersją energii; MPSN = mikroporowaty azotek krzemu; MSSN = mikroszczelinowy azotek krzemu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza mikroplastiku, widma niebieskiego włókna i czerwonej cząsteczki, mikroskopia, porównanie danych spektralnych.
Rysunek 5: Nieoptymalne wyniki obrazowania fluorescencyjnego i spektroskopii Ramanowskiej. (A) Nieoptymalny obraz fluorescencyjny zabarwionych cząsteczek (panel lewy), w którym błona zatrzymała barwnik Nile Red, prawdopodobnie z powodu niewystarczającego płukania. Wybrano dwie cząsteczki do spektroskopii Ramanowskiej: włókno zabarwione Trypan Blue oraz fragment zabarwiony Nile Red (panel prawy). (B) Nieoptymalne wyniki spektroskopii Ramanowskiej, w których współczynnik Pearsona (r) jest mniejszy niż 70 % (r < 0,70). Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Tabela uzupełniająca S1: Właściwości krzemowych nanomembran w dyskach filtracyjnych. W tabeli przedstawiono właściwości membran w dyskach filtracyjnych SiN, w tym minimalną wielkość porów, procentową porowatość, grubość membran z powłoką Au i bez niej, powierzchnię czynną membrany oraz przepuszczalność gazu przez membranę przy zastosowaniu dodatniego ciśnienia o stałej, zadanej wartości. Próg odcięcia (tj. wielkość porów), porowatość, grubość i powierzchnia membrany zostały określone na podstawie pomiarów cech na obrazach SEM. Dane dotyczące przepuszczalności gazu podano jako średnia ± odchylenie standardowe (n = 10) dla dodatniego ciśnienia N 2 przy 103.42 kPa. Skróty: Au = złoto; Six Ny = nie stechiometryczny azotek krzemu. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S2: Liczba cząstek i parametry programu ParticleFinder. Wykonano mozaiki obrazów całej powierzchni membrany dla każdej próbki, a następnie przeanalizowano każdą mozaikę w celu ustalenia całkowitej liczby cząstek. W tabeli przedstawiono parametry oraz kolejność działań wykorzystanych do określenia całkowitej liczby cząstek dla obrazu każdej próbki, a także liczby cząstek w określonych frakcjach wielkości. Parametry różnią się w zależności od próbki, ze względu na rodzaj, ilość i kształt cząstek, a także specyficzną odblaskowość każdej membrany podczas obrazowania. Dane z tej tabeli zostały przedstawione na Rysunku 4. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Ograniczanie zanieczyszczenia mikrodrobinami plastiku jest coraz większym przedmiotem obaw; Pierwszym krokiem w celu złagodzenia skutków jest zidentyfikowanie obecności zanieczyszczeń. Uproszczona metoda przechwytywania i natychmiastowej analizy ma kluczowe znaczenie dla zaoszczędzenia czasu badaczy i zachowania poufnych wskaźników próbek. Niniejszy raport opisuje elastyczne przepływy pracy oparte na odmianach opracowanych przez nas metod SNAP do analizy takich MP w próbkach ciekłych, wykorzystując jeden substrat do wszystkich przeprowadzanych analiz. Próbka musi być przefiltrowana próżniowo w taki sposób, aby cząstki zostały wychwycone i odizolowane na nanomembranie krzemowej umieszczonej wewnątrz dysku filtrującego. Wystarczające ograniczenie zanieczyszczenia tła ma kluczowe znaczenie dla uzyskania miarodajnych wyników. Wszelkie cząstki zanieczyszczające na strzykawce dozującej lub szklanym lejku próżniowym podczas filtracji mogą zanieczyścić próbkę i być jednocześnie wychwytywane, dlatego staranne przestrzeganie protokołów kontroli jakości sekcji 1 ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych wyników. Zaleca się stosowanie kontroli wyłącznie na pożywkach w celu informowania badaczy o skażeniu tła specyficznym dla poszczególnych procesów i warunków laboratoryjnych. Opisany tutaj protokół opiera się na filtracji próżniowej próbki cieczy, a także na wychwytywaniu i izolowaniu cząstek z próbki na dwóch różnych odciętych dyskach filtracyjnych SiN. W przypadku wszystkich rurociągów wychwytywanie i izolowanie cząstek musi poprzedzać inne metody, ale wszystkie inne metody identyfikacji można przeprowadzić w kolejności najbardziej odpowiedniej dla badacza.

W tym badaniu wykorzystano dwa mikroskopy fluorescencyjne, aby wykazać powtarzalność wyników we wszystkich instrumentach. Instrukcje szczegółowo opisują zastosowanie aparatu Olympus BX61 do mikroskopii fluorescencyjnej ze względu na przewagę jego użycia i były obsługiwane zgodnie z instrukcjami przyrządu wykorzystującymi jasne pole do obrazowania w skali szarości, kanał TRITC (Ex. ~543 nm; Em. ~593 nm) do obrazowania cząstek barwionych NR oraz kanał Cy5 (Ex. ~649 nm; Em. ~667 nm) do obrazowania cząstek barwionych gruźlicą, w zależności od przypadku. Aby wyświetlić wyniki barwienia, zalecamy skonstruowanie nakładki obrazów kanałów (do przetwarzania obrazu używamy FIJI/ImageJ, zwanej dalej platformą analizy obrazu), w rozdzielczości 2 048 x 2 040 pikseli i 16-bitowej głębi. Obrazy całych nanomembran mogą być wyświetlane tak, jak na rysunku 4A,B lub jako wybrane obszary zainteresowania, jak pokazano na rysunku 3A,B.

Czerwień Nilowa jest powszechnie stosowana do barwienia syntetycznych polimerów MP, ale może barwić niesyntetyczne polimery ze źródeł biologicznych ze względu na swój lipofilowy i hydrofobowy charakter, potencjalnie wprowadzając fałszywie dodatnie wyniki, które zniekształcają wyniki kwantyfikacji MP 24,25,26. Etap barwienia przeciwstawnego błękitu trypanowego, jak opisano w sekcji 3 protokołu, jest zalecany, aby pomóc w różnicowaniu zdarzeń fałszywie dodatnich, ale nie jest to wyczerpujące rozwiązanie i należy go połączyć z dodatkowymi wskaźnikami analizy w celu potwierdzenia wyników. Fluorescencja cząstek w czerwieni nilowej jest problemem w analizie spektroskopii Ramana, ponieważ może znacznie zwiększyć sygnał tła. Jednak w tym badaniu przed spektroskopią Ramana za pomocą lasera o długości fali 830 nm zaobserwowaliśmy polimery czerwienią nilową i błękitem trypanowym i zaobserwowano niewielki szum, jak pokazano na rysunku 3.

Niektóre długości fal laserów odpowiednich do spektroskopii Ramana nie są w stanie zignorować fluorescencji barwionych cząstek, takich jak laser o długości fali 532 nm, a zatem mogą powodować znaczne trudności w prawidłowym oszacowaniu składu interesującej cząstki. Powlekanie cząstkami metalu po wychwyceniu jest przydatne do zwiększania kontrastu podczas obrazowania SEM, ale jest niezgodne z żadną późniejszą analizą spektroskopową lub fluorescencyjną. Zanotuj wszystkie żądane pomiary przed konfiguracją eksperymentalną, aby upewnić się, że przebieg procesu i rodzaje powłok są odpowiednio uwzględnione. Dyski filtrujące Au-SiN mogą być wykorzystywane do wszystkich wymienionych analiz, w których mikroskopia transmisyjna nie jest kluczowa dla przepływu pracy lub gdy stosowana jest spektroskopia Ramana lub IR.

Przedstawione tu metody, a także nanomembrany używane do wychwytywania i izolowania cząstek będących przedmiotem zainteresowania, mogą być modyfikowane w zależności od potrzeb poszczególnych badaczy. Nanomembrany nadają się do wielu analiz spektroskopowych, a badacz może zamienić filtrowane media na inne interesujące nas media próbne, w tym między innymi strawione tkanki zwierzęce27, farmaceutyki do wstrzykiwań i próbki oleju. Do tego badania wykorzystano dwa instrumenty do spektroskopii Ramana, a kroki instruktażowe szczegółowo opisują użycie instrumentu Ramana Horiba XploRA Plus, który zebrał i przetworzył wszystkie dane pokazane na rysunku 4. Ważne jest również, aby znać limit wielkości detekcji dla każdego mikroskopu Ramana, aby zapewnić, że cząstki będące przedmiotem zainteresowania mogą być odpowiednio analizowane za pomocą rozmiaru plamki laserów instrumentu. Aby wyświetlić wyniki identyfikacji cząstek za pomocą Ramana, widmo odniesienia i próbki oraz obraz analizowanej cząstki można przedstawić jak na rysunku 3C i rysunku 4C.

Sekcja 6 protokołu zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące identyfikacji cząstek przy użyciu biblioteki spektralnej o otwartym kodzie źródłowym. Planarne wychwytywanie cząstek na jednolicie płaskiej membranie, a także regularny układ porów membrany, umożliwia przewidywalne, zautomatyzowane obrazowanie. Zarówno grubość SiN 400 nm lub 1000 nm, jak i ich skład azotku krzemu zapewniają im doskonałą przezroczystość optyczną, ale mogą również zwracać intensywny pik krzemu w niektórych parametrach instrumentów spektroskopowych. Należy zachować ostrożność podczas stosowania gołego, niepokrytego metalem SiN z analizą Ramana. Pipik Si może funkcjonować jako sygnał kalibracyjny, ale intensywność piku może również maskować sygnały widm o niższej intensywności w tym samym obszarze liczby falowej, co sygnał Si. Takich pików Si nie zaobserwowano przy użyciu lasera 830 nm w tym badaniu.

Zastosowany tutaj ultracienki charakter SiN (o grubości 400 nm lub 1000 nm) i Au-SiN (o grubości 520 nm lub 1120 nm) zapewnił im doskonałe właściwości filtracyjne, optyczne i spektroskopowe. Membrany te muszą być jednak chronione przed uszkodzeniami fizycznymi, takimi jak nadmierna różnica ciśnień (tj. ≥-206 kPa), bezpośrednie dotykanie pęsetą lub palcami lub niewłaściwe umieszczenie uszczelki. Dysk filtracyjny mieszczący membrany chroni je i umożliwia łatwą obsługę przy normalnym użytkowaniu. Podczas manipulowania dyskami filtra należy dotykać tylko czarnego pierścienia zewnętrznego, a nigdy aktywnego obszaru membrany. Chociaż nie zostało to tutaj podane ilościowo, zbieranie wychwyconych cząstek na niewielkiej powierzchni membrany (odpowiednio 3 x 3 mm dla membran odcinających 20 μm i 3 x 0,7 x 3 mm dla membran odcinających 8,0 μm) potencjalnie skraca całkowity czas analizy próbki, skracając czas potrzebny na znalezienie i analizę cząstek będących przedmiotem zainteresowania. Ten "współczynnik koncentracji" jest wart przyszłych badań i może oferować unikalną korzyść z dysków filtrujących SiN dla badaczy. W połączeniu z wyższymi znormalizowanymi natężeniami przepływu w porównaniu z innymi powszechnie stosowanymi membranami do charakteryzacji MP15, zautomatyzowane procedury obrazowania cząstek, które wymagają jedynie zobrazowania stosunkowo mniejszego obszaru jednolicie płaskiego i ostrego SiN, mogą jeszcze bardziej skrócić całkowity czas analizy. Jednak wszelkie korzyści związane z hipotetycznym współczynnikiem stężenia nadal muszą zostać empirycznie wykazane poprzez porównanie całkowitych czasów przetwarzania (od filtracji do analizy obrazu) na konwencjonalnych i SiN dyskach filtracyjnych.

Heurystycznie wykazaliśmy użyteczność wariantów SNAP na lokalnych próbkach wody z kranu. Opisany tutaj protokół koncentruje się na wychwytywaniu MP ze źródeł wody pitnej w pobliżu Rochester w stanie Nowy Jork. Pobieranie próbek przebiegało w następujący sposób: dla każdego pobrania próbki co najmniej jeden litr wody został przepuszczony przez kran przed rozpoczęciem pobierania. Nowe, szczelnie zamknięte butelki z polipropylenu zostały zabrane do odkręconego kranu i otwarte bezpośrednio przed odbiorem. Butelki nie były spłukiwane wodą pitną przed przystąpieniem do odbioru. Każda próbka składała się z dwóch butelek o pojemności 500 ml pobranych bezpośrednio po drugiej. Każda próbka wody pochodziła z innego systemu rur w gospodarstwie domowym, a materiał rury nie był spójny podczas pobierania próbek. Zmienne, takie jak ilość niedawnego zużycia wody, czas poboru, wiek rur i wiek domu, z którego pochodziła próbka, nie mogły być kontrolowane w tym badaniu. Nie był to zatwierdzony protokół pobierania próbek. Każdy badacz powinien opracować i zatwierdzić własne procedury pobierania danych. Jednak w celu pełnego ujawnienia metod załączono powyższy opis. Dyski filtracyjne umożliwiają wielokrotną analizę na tym samym podłożu dla wielu metod analitycznych. Nie jest wymagane podpróbkowanie ani wiele próbek poza standardowymi powtórzeniami próbnymi. Wyeliminowanie konieczności podpróbkowania i wielokrotnego próbkowania zwiększa pewność przechwytywania informacji o celach o niskiej liczebności. Oprócz umożliwienia stosowania multimodalnych metod analizy, tarcze filtracyjne SiN zapewniają wyraźną przewagę nad innymi analogicznymi mediami filtracyjnymi ze względu na oszczędność czasu wynikającą z szybszej szybkości filtracji na jednostkę powierzchni15.

Oświadczenia

JR i JM są założycielami i udziałowcami SiMPore Inc. JR jest współwynalazcą wniosku patentowego umożliwiającego stosowanie filtrów z azotku krzemu, takich jak te przedstawione w tym badaniu.

Podziękowania

Peng Miao z Horiba Scientific hojnie wsparł tę publikację, wykorzystując i korzystając z wiedzy specjalistycznej swojego systemu spektroskopii Ramana XploRA Plus. Obrazowanie mikroskopem elektronowym przeprowadzono w Integrated Nanosystems Center (URnano) na Uniwersytecie w Rochester. Mikrofabrykację przeprowadzono w Laboratorium Wytwarzania Półprzewodników i Mikrosystemów (SMFL) w Rochester Institute of Technology.

Badania opisane w tej publikacji były częściowo wspierane przez National Institute of Environmental Health Sciences w ramach Nagrody nr R44ES031036 dla SiMPore, oraz przez Lake Ontario MicroPlastics Center (LOMP) w ramach National Institute of Environmental Health Sciences Award No. P01 ES035526 i National Science Foundation Award No. OCE-2418255 do Uniwersytetu w Rochester. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów jakiejkolwiek agencji finansującej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 L Szklana zlewkaPyrex1000-1L
1 L Szklana kolba próżniowaMillipore SigmaZ290459-1EA
100% bawełniany fartuch laboratoryjnyLandauLA-3172
100 ml szklany lejek filtracyjny Advantec311000https://www.sterlitech.com/glass-filter-holder-311000.html
99% alkohol izopropylowyOprogramowanie Fisher ScientificA416-20
APEXEDS EDAXEDX służące do wykonywania analizy EDX na wychwyconych cząstkach.
Denton Prep Spilling SystemDenton VacuumDESK II :293618089 System powlekania złotem
FIDŻI, platforma do analizy obrazuImageJV 1.54FFIJI (FIJI to po prostu ImageJ) - dystrybucja ImageJ 
Szklana butelka z zakrętkąCorning 1395-250
KimwipesKimtech06-666-11C
LabSpec6Horiba ScientificHoriba Oprogramowanie Ramana zawierające ParticleFinder i kaptur z
przepływem laminarnymAir ScienceVLF-72A
Mikroskop Olympus  / NikonBX61 / Ti2eDo mikroskopii optycznej można wykorzystać dowolny mikroskop o odpowiedniej fluorescencji. 
Filtry MPSN SiNSiMPore Inc.FD25-8.0-AU; FD25-8.0-NC
FD25-20.0-AU, FD25-20.0-NC
Monoject 60 mL strzykawkiCoviden8881560265
Nil Red w proszkuTCIN0659
Rękawice nitryloweAnsell Microflex19-167-17
OpenSpecy openanalysis.orgOpenSpecy Biblioteka spektralna
Open source PiekarnikVWR1310Gravity Piec konwekcyjny
P20 PipetaBrandtech705872
Końcówka do pipetPremium FiolkiGS 151140R
Fryta z podparcia polewowegoAdvantec311000Część zestawu
Instrument RamanaHoribaXplora PLUS
Korek gumowyAdvantec311000Część zestawu
Instrument SEMZiessAurigaAuriga Series, Modułowa stacja robocza z belką poprzeczną
Uszczelki silikonoweSiMPoreGASKET-25-RUszczelki PDMS odlewane bezbarwnie, grubość 0,8 mm
Wałek silikonowySanyue ( ASIN: B07XDTNPS3)Wałek silikonowy -  8 x 5 x 2 cale
Oprogramowanie SmartSEMZeissV8SEM używane do obsługi Zeiss Auriga
Butelka z rozpylaczemUlineS-7273
Filtry strzykawkowe Thermo ScientificCH2225-PES0,22 &mikro; M Filtry strzykawkowe Luer Lock, 25 mm 
Pompa strzykawkowaNew Era Pump Systems, Inc.NE-1000Opcjonalny, ale zalecany
Trypan Blue - 0,4%miliporów SigmaT8154-20ML
PęsetaSiMPoreK6TWZR
Pompa próżniowaWelch847-676-8800
Rurka próżniowaGraingerZUSA-HT-4037
ViewSharp

Bibliografia

  1. Simon, M., Van Alst, N., Vollertsen, J. Quantification of microplastic mass and removal rates at wastewater treatment plants applying focal plane array (fpa)-based fourier transform infrared (ft-ir) imaging. Water Res. 142, 1-9 (2018).
  2. Da Costa Filho, P. A., et al. Detection and characterization of small-sized microplastics (≥ 5 µm) in milk products. Sci Rep. 11 (1), 24046(2021).
  3. Koelmans, A. A., et al. Microplastics in freshwaters and drinking water: Critical review and assessment of data quality. Water Res. 155, 410-422 (2019).
  4. Fendall, L. S., Sewell, M. A. Contributing to marine pollution by washing your face: Microplastics in facial cleansers. Mar Pollut Bull. 58 (8), 1225-1228 (2009).
  5. Kwon, J. -H., et al. Microplastics in food: A review on analytical methods and challenges. Int J Env Res Public Health. 17 (18), 6710(2020).
  6. Mahon, A. M., et al. Microplastics in sewage sludge: Effects of treatment. Environ Sci Technol. 51 (2), 810-818 (2017).
  7. Hidalgo-Ruz, V., Gutow, L., Thompson, R. C., Thiel, M. Microplastics in the marine environment: A review of the methods used for identification and quantification. Environ Sci Technol. 46 (6), 3060-3075 (2012).
  8. Ragusa, A., et al. Plasticenta: First evidence of microplastics in human placenta. Environ Int. 146, 106274(2021).
  9. Schwabl, P., et al. Detection of various microplastics in human stool. Ann Intern Med. 171 (7), 453-457 (2019).
  10. Leslie, H. A., et al. Discovery and quantification of plastic particle pollution in human blood. Environ Int. 163, 107199(2022).
  11. De Frond, H., et al. Monitoring microplastics in drinking water: An interlaboratory study to inform effective methods for quantifying and characterizing microplastics. Chemosphere. 298, 134282(2022).
  12. Nutrition and Food Safety (NFS), Standards & Scientific Advice on Food Nutrition (SSA). Dietary and inhalation exposure to nano-and microplastic particles and potential implications for human health. , https://www.who.int/publications/i/item/9789240054608 (2022).
  13. Fries, E., et al. Identification of polymer types and additives in marine microplastic particles using pyrolysis-GC/MC and scanning electron microscopy. Environ Sci: Processes Impacts. 15 (10), 1949-1956 (2013).
  14. Primpke, S., et al. Critical assessment of analytical methods for the harmonized and cost-efficient analysis of microplastics. Appl Spectrosc. 74 (9), 1012-1047 (2020).
  15. Carter, J., et al. Comparative evaluation of filtration and imaging properties of analytical filters for microplastic capture and analysis. Chemosphere. 332, 138811(2023).
  16. Van Mourik, L., et al. STOTEN's minimum requirements for measurement of plastics in environmental samples. Sci Total Environ. 912, 168465(2024).
  17. Käppler, A., et al. Analysis of environmental microplastics by vibrational microspectroscopy: FTIR, Raman or both. Anal Bioanal Chem. 408, 8377-8391 (2016).
  18. Mikoliunaite, L., et al. The substrate matters in the Raman spectroscopy analysis of cells. Sci Rep. 5 (1), 13150(2015).
  19. Madejski, G. R., et al. Silicon nanomembrane filtration and imaging for the evaluation of microplastic entrainment along a municipal water delivery route. Sustainability. 12 (24), 10655(2020).
  20. Romanick, S. S., et al. Assessment of household settled dust via silicon nanomembrane analysis pipeline (SNAP). Environ Technol Innov. 38, 104106(2024).
  21. Cowger, W., et al. Microplastic spectral classification needs an open source community: Open specy to the rescue. Anal Chem. 93 (21), 7543-7548 (2021).
  22. Kooi, M., Koelmans, A. A. Simplifying microplastic via continuous probability distributions for size, shape, and density. Env Sci Technol Lett. 6 (9), 511-564 (2019).
  23. SpectraBase. , John Wiley & Sons, Inc. SpectraBase. https://spectrabase.com/spectrum/1uoQJ4M5hxj (2025).
  24. Erni-Cassola, G., Gibson, M. I., Thompson, R. C., Christie-Oleza, J. A. Lost but found with nile red: A novel method for detecting and quantifying small microplastics (1 mm to 20 µm) in environmental samples. Environ Sci Technol. 51 (23), 13641-13648 (2017).
  25. Shim, W. J., Song, Y. K., Hong, S. H., Jang, M. Identification and quantification of microplastics using Nile Red staining. Mar Pollut Bull. 113 (1-2), 469-476 (2016).
  26. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: A selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
  27. Cai, B., Andino, F. D. J., Mcgrath, J. L., Romanick, S. S., Robert, J. Ingestion of polyethylene terephthalate microplastic water contaminants by Xenopus laevis tadpoles negatively affects their resistance to ranavirus infection and antiviral immunity. Environ Pollut. 356, 124340(2024).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza mikroplastikówmikroplastiki w wodzie pitnejmultimodalna analiza cząstekspektroskopia Ramanowskaskaningowa mikroskopia elektronowaenergodyspersyjna spektroskopia rentgenowskabarwienie czerwienią nilowąkwantyfikacja cząstekprzygotowanie próbek
Multimodalna analiza mikroplastiku w wodzie pitnej przy użyciu rurociągu do analizy nanomembran krzemowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.