Zwalidowany test immunochemiczny do kompleksowego określenia receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 uwalnianego z komórek i związanego z komórkami

Podsumowanie

Prezentujemy zwalidowany test ELISA z użyciem nowych przeciwciał monoklonalnych anty-HER2. Test ten umożliwia precyzyjne określenie ilościowe związanego z komórkami i uwolnionego białka HER2 z komórek hodowanych in vitro i innych próbek, w tym krwi i tkanek.

Streszczenie

Receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2) jest dobrze znanym markerem raka. Stał się bardzo skutecznym celem diagnostycznym i terapeutycznym, zwłaszcza w przypadku raka piersi i innych typów nowotworów wykazujących ekspresję HER2. W klinice stosuje się złoty standard immunohistochemicznych metod diagnostycznych wykorzystujących swoiste przeciwciała anty-HER2 do pomiaru poziomu ekspresji receptora związanego z błoną. Rozpuszczalna domena zewnątrzkomórkowa (ECD) HER2, która jest uwalniana z komórek wykazujących nadekspresję, krąży we krwi i może odzwierciedlać ekspresję tkankową receptora. Istnieje potrzeba dokładnych i zwalidowanych testów w celu skorelowania stężenia krążącego białka HER2 z objawami klinicznymi choroby.

Nasz zespół opracował i zatwierdził nowatorski test immunoenzymatyczny (ELISA) do ilościowego oznaczania domeny ECD HER2 związanej z błoną i uwolnionej z komórek. W teście wykorzystuje się dwa unikalne przeciwciała monoklonalne specyficzne dla HER2 opracowane wcześniej. Zakres ilościowy obejmuje stężenie HER2 od 1,56-100 ng/ml, które jest oczekiwane dla komórek nowotworowych hodowanych in vitro i wykazuje czułość na poziomie 0,5 ng/ml. Zadowalająca precyzja i dokładność testu wewnątrz- i międzytestowego oraz dokładność sprawiają, że ma ona zastosowanie do oznaczania ilościowego HER2 w różnych typach próbek biologicznych, w tym w pożywce do hodowli komórkowych, surowicy i tkance guza stałego. W tym miejscu skupiamy się na kompleksowym określeniu receptorów związanych i wydzielanych przez komórki nowotworowe hodowane in vitro. W pracy przedstawiono krok po kroku protokół oznaczania ilościowego białka HER2, który można wykorzystać do badania różnych linii komórkowych, krwi i tkanek.

Wprowadzenie

Sukces nowoczesnych terapii często odnosi się do medycyny precyzyjnej, która opiera się na dokładnej identyfikacji pacjentów wrażliwych na terapię¹. Wśród tych terapii znajdują się leki anty-HER2 ukierunkowane na receptor z nadekspresją na różnych nowotworach, w tym piersi, endometrium, żołądka, płuc i innych. Dostępnych jest kilka leków ukierunkowanych na HER2 z potwierdzonymi korzyściami u pacjentów z nowotworami HER2-dodatnimi, w tym HER2-low type². Potwierdzenie statusu HER2-dodatniego ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji potencjalnych pacjentów, którzy odpowiedzieli na leczenie; Pozostaje jednak wyzwaniem, zwłaszcza w grupie HER2-low.

Złoty standard metod w warunkach klinicznych, rutynowo stosowanych do testowania HER2, obejmuje immunohistochemiczną (IHC) ekspresję białka i amplifikację genu HER2 metodą fluorescencji in situ (FISH). Dodatkowo test Oncotype DX służy do ekspresji mRNA HER2. Biopsja tkanek wymagana w przypadku tych metod sprawia, że określenie kwalifikacji pacjenta do odpowiedniego leczenia i jego potencjalnej odpowiedzi na leczenie jest niepewne. Pomimo zaktualizowanych wytycznych Amerykańskiego Towarzystwa Onkologii Klinicznej (ASCO) i College of American Pathologists (CAP) z 2018 r. w celu zmniejszenia zmienności między jednostkami testowymi, zgodność HER2 pozostaje przedmiotem poprawy³.

HER2 jest protoonkogenem należącym do rodziny receptorów naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), którego nadekspresja i aktywacja w stanach patologicznych prowadzi do agresywnego wyniku lub przyczynia się do złego rokowania⁴. HER2 jest białkiem modułowym o masie 185 kDa zakotwiczonym w błonie komórkowej, które zawiera cytoplazmatyczną kinazę tyrozynową i domenę zewnątrzkomórkową (ECD). HER2 ECD może być wydalany z komórek, aby zostać uwolniony do macierzy zewnątrzkomórkowej⁵ jako białko wolne od komórek, dalej krążące we krwi. Zwiększona ekspresja HER2 może być odzwierciedlona przez wyższy poziom krążącego ECD, co stanowi cenny marker predykcyjny i prognostyczny ^6,7, zastępczy marker odpowiedzi na leczenie⁸, lub jako metoda uzupełniająca IHC w celu identyfikacji pacjentów kwalifikujących się do leczenia anty-HER2⁹. Wyzwaniem pozostaje jednak ustalenie korelacji między ekspresją HER2 w guzie a ogólnoustrojowym poziomem receptora we krwi, który mógłby mieć znaczenie kliniczne.

Uwolniony HER2 ECD może być określony ilościowo za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA)¹⁰. Test ELISA kanapkowy to podejście, które wykorzystuje dwa specyficzne przeciwciała wiążące różne epitopy na tym samym antygenie docelowym. Umożliwia dokładny pomiar rozpuszczonych białek w łatwo dostępnym materiale biologicznym na bazie krwi i płynu (tzw. płynna biopsja). Pomimo obecności testów zatwierdzonych przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA), istnieją kontrowersje co do użyteczności diagnostyki HER2 ECD⁵ oraz wartości granicznej dla podwyższonego poziomu HER2 we krwi. Potrzebne są dalsze badania z wykorzystaniem zwalidowanych metod i jednolicie akceptowanych progów, aby potwierdzić stosowalność testów¹¹.

Kluczowymi składnikami każdego testu ELISA są wychwytywanie (unieruchomienie na płytce i określenie specyficzności i czułości testu) oraz wykrywanie przeciwciał (dodanych po nałożeniu próbek) przeciwciała (Rysunek 1). W niniejszym raporcie przedstawiamy protokół ELISA oparty na niedawno opracowanych nowych przeciwciałach monoklonalnych (mAb) anty-HER2 ECD, które zostały wygenerowane, oczyszczone na kolumnie powinowactwa i dokładnie scharakteryzowane, oraz prezentują unikalne sekwencje¹². Opracowany test ELISA, który wykorzystuje te niestandardowe przeciwciała, wykazuje swoją przydatność do dokładnej kwantyfikacji białka HER2 związanego z błoną komórkową i uwalnianego do pożywki hodowlanej w celu kompleksowej oceny statusu receptora. Test może być wykorzystany w testach przedklinicznych oraz do wspierania trwających badań. Wydajność testu została następnie przetestowana na próbkach biologicznych różnego pochodzenia, w tym na homogenatach surowicy i tkanki¹², aby pokazać potencjał w rozwoju badań, diagnostyki i nowatorskich metod leczenia anty-HER2 w przyszłości.

Protokół

1. Hodowla ludzkich komórek nowotworowych

1. Hodowla linii MDA-MB-231, SK-BR-3 i SK-OV-3 w zmodyfikowanej pożywce Eagle firmy Dulbecco zawierającej 4,5 g/l ᴅ-glukozy (DMEM-HG), uzupełnionej 2 mM ʟ-glutaminą i 10% (v/v) inaktywowanym termicznie FBS. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO_{2 .}
2. Gdy kultura osiągnie ~80% konfluencji, odłącz komórki przez trypsynizację i zbierz je do oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
3. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i komórek nasiennych do eksperymentu na 12-dołkowych płytkach o gęstości 3 × 10⁵ komórek/na studzienkę w 1 ml pożywki wzrostowej. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO₂,
   UWAGA: Wysiewaj po jednym dołku na każdy punkt czasowy eksperymentu. W dalszej analizie wykorzystana zostanie zarówno pożywka pohodowlana, jak i lizaty komórkowe.

2. Pobieranie i przygotowanie próbek

1. Z 24-godzinnej hodowli zebrać pożywkę hodowlaną z jednego dołka każdej linii komórkowej do probówki o pojemności 1,5 ml.
2. Odwirować pobrane próbki w temperaturze 10 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C w celu dalszego określenia wydzielanego poziomu ECD HER2.
3. Umyj pozostałe komórki na płytce 1 ml zimnego PBS, delikatnie odessać i wyrzucić PBS.
4. Dodać 200 μl buforu RIPA (uzupełnionego o 1% inhibitora proteazy) do każdej studzienki i inkubować przez 5 minut. Zeskrobać komórki za pomocą skrobaka do komórek i wymieszać przez kilkakrotne pipetowanie w celu homogenacji lizatu.
5. Zebrać zlizowane komórki do nowej probówki i powoli odessać do strzykawki o pojemności 2 ml za pomocą igły (G21 / 0,8 mm × 40 mm). Powtórz etap aspiracji 5-10 razy, aby dalej rozpadać komórki.
6. Odwirować pobrane próbki przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C w celu dalszego oznaczania frakcji komórkowej białka HER2.
7. Powtórz pobieranie pożywki hodowlanej i materiału komórkowego, postępując zgodnie z etapami przygotowania dla pozostałych punktów czasowych - 48 h i 72 h hodowli.

3. Wykonywanie testu ELISA kanapkowego do oznaczania HER2

1. Przygotuj.
   1. Bufor powlekający: Przygotować 0,1 M roztwór NaHCO₃ rozpuszczając 0,42 g NaHCO₃ w 50 ml wody destylowanej i dokładnie wymieszać. Doprowadzić pH do 9,6 za pomocą 3 M NaOH.
   2. Bufor blokujący: Przygotuj 5% beztłuszczowego mleka mlecznego (NFDM) w PBS, dodając 0,5 g mleka w proszku do 10 ml PBS i dokładnie wymieszaj.
   3. Bufor do mycia: Przygotuj sól fizjologiczną buforowaną fosforanami za pomocą Tween 20 (PBST), dodając 0,5 ml 0,05% Tween-20 do 1000 ml PBS i wymieszaj (unikaj nadmiernego pienienia).
2. Biotynyluj przeciwciało wykrywające.
   1. Biotynylan 50-200 μg wykrywania przeciwciała anty-HER2 (klon 70.21.73.67) przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do znakowania biotyny zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Wiarygodność i powtarzalność procesu biotynylacji opierają się na pomiarze końcowego stężenia białka w otrzymanym przeciwciałie i porównaniu partii między partiami produktu.
3. Pokryj talerz.
   1. Rozcieńczyć przeciwciało wychwytujące anty-HER2 (klon 70.27.58) do stężenia 1 μg/ml w buforze powlekającym. Aby pokryć jedną płytkę, użyj 6,5 ml roztworu przeciwciał wychwytujących.
   2. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 μl roztworu przeciwciała wychwytującego (przygotowanego w kroku 3.3.1) do każdego dołka na 96-dołkowej płytce ELISA.
      UWAGA: Unikaj najbardziej zewnętrznych dołków płyty (np. A1, H12), aby zmniejszyć zmienność spowodowaną efektem krawędzi. Najbardziej zewnętrzne studzienki powinny być wypełnione wodą destylowaną, aby zapewnić stabilne warunki reakcji.
   3. Przykryj płytkę folią uszczelniającą.
   4. Inkubować płytkę przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C.
   5. Po inkubacji O/N umieścić płytkę w temperaturze pokojowej (RT) na poziomej wytrząsarce do mikropłytek (20-30 obr./min przy kącie nachylenia 4°-6°) na 1 godzinę.
   6. Za pomocą myjki do mikropłytek odessać roztwór powlekający i trzykrotnie umyć płytkę buforem do przemywania (3 x 300 μl PBST na studzienkę).
4. Zablokuj płytę .
   1. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 μl buforu blokującego (5% NFDM w PBS) do każdej powlekanej studzienki, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania.
   2. Przykryj płytkę folią uszczelniającą.
   3. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej.
   4. Za pomocą myjki do mikropłytek odessać roztwór powlekający i trzykrotnie umyć płytkę buforem do przemywania (3 x 300 μl PBST na studzienkę).
5. Przygotuj krzywą kalibracyjną i kontrolę dodatnią (Rysunek 2).
   1. Przygotować roboczy roztwór wzorcowy antygenu HER2, dodając 2 μl roztworu podstawowego o stężeniu 1 mg/ml do 1998 μl PBS w celu uzyskania stężenia HER2 0,001 mg/ml (1000 ng/ml).
   2. Rozcieńczyć roboczy roztwór wzorcowy (WSS) przez dodanie 200 μl roztworu do 1800 μl PBS w celu otrzymania roztworu wzorcowego 1 (STD 1).
   3. Przygotuj kolejne sześć wzorców (STD 2-STD 7) przez seryjne rozcieńczenia STD 1 w PBS (Rysunek 2).
      1. STD 2: Dodaj 500 μl STD 1 do 500 μl PBS i dokładnie wymieszaj, aby przygotować 50 ng / ml.
      2. STD 3: Dodaj 500 μl STD 2 do 500 μl PBS i dokładnie wymieszaj, aby przygotować 25 ng/ml.
      3. STD 4: Dodaj 500 μl STD 3 do 500 μl PBS i dokładnie wymieszaj, aby przygotować 12,5 ng/mL.
      4. STD 5: Dodaj 500 μl STD 4 do 500 μl PBS i dokładnie wymieszaj, aby przygotować 6,25 ng/ml.
      5. STD 6: Dodaj 500 μl STD 5 do 500 μl PBS i dokładnie wymieszaj, aby przygotować 3,125 ng / ml.
      6. STD 7: Dodaj 500 μl STD 6 do 500 μl PBS i dokładnie wymieszaj, aby przygotować 1,5625 ng/ml.
      7. STD 8: Dodaj 500 μl PBS, aby przygotować 0 ng/mL.
   4. Kontrola pozytywna: Rozcieńczyć STD 1 przez dodanie 100 μl roztworu STD 1 do 900 μl PBS w celu uzyskania roztworu HER2 o stężeniu białka 10 ng/ml.
6. Przygotuj próbki do eksperymentów ze spajkami i odzyskiwaniem.
   1. Przygotować próbki matrycy (PBS, lizaty komórkowe i pożywka hodowlana) wzbogacone o znane stężenie białka HER2. Rozcieńczone lizaty komórkowe w stosunku 1:2000 przez dodanie 2,5 μl odpowiedniego lizatu komórkowego do 5 ml PBS w celu uzyskania matrycy próbki o poziomie HER2 poniżej poziomu LOD metody.
   2. Użyj WSS (1000 ng/ml) i STD1 (100 ng/ml) do pobrania próbek z matrycą.
   3. Dla każdej matrycy należy przygotować 6 próbek o stężeniach 0, 2, 5, 10, 30 i 50 ng/ml.
   4. Aby przygotować 0 ng/ml, dodać 400 μl PBS/pożywki/lizatu komórkowego.
   5. Aby przygotować 2 ng/ml, dodaj 8 μl STD1 do 392 μl PBS/pożywki/lizatu komórkowego i dokładnie wymieszaj.
   6. Aby przygotować 5 ng/ml, dodaj 20 μl STD1 do 380 μl PBS/pożywki hodowlanej/lizatu komórkowego i dokładnie wymieszaj.
   7. Aby przygotować 10 ng/ml, dodaj 4 μl WSS do 396 μl PBS/pożywki/lizatu komórkowego i dokładnie wymieszaj.
   8. Aby przygotować 30 ng/ml, dodaj 12 μl WSS do 388 μl PBS/pożywki/lizatu komórkowego i dokładnie wymieszaj.
   9. Aby przygotować 50 ng/ml, dodaj 20 μl WSS do 380 μl PBS/pożywki/lizatu komórkowego i dokładnie wymieszaj.
7. Dodaj próbkę, ślepą i standardową.
   1. Za pomocą pipety jednokanałowej dodać 100 μl wzorców, ślepą próbę (PBS) i badane próbki (lizaty komórkowe i pożywkę hodowlaną) do odpowiednich studzienek.
      UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie każdej próbki w trzech egzemplarzach.
   2. Przykryj płytkę folią uszczelniającą.
   3. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej.
   4. Za pomocą myjki do mikropłytek odessać roztwór powlekający i trzykrotnie umyć płytkę buforem do przemywania (3 x 300 μl PBST na studzienkę).
8. Wykryj wiązanie przeciwciał.
   1. Rozcieńczyć biotynylowane przeciwciało wykrywające (klon 70.21.73.67) w PBS do stężenia roboczego 1 μg/ml. Na jedną płytkę należy użyć 6,5 ml roztworu roboczego wykrywającego przeciwciała.
   2. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 μl roztworu roboczego przeciwciała wykrywającego do każdej studzienki.
   3. Przykryj płytkę folią uszczelniającą.
   4. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej.
   5. Za pomocą myjki do mikropłytek odessać roztwór powlekający i trzykrotnie umyć płytkę buforem do przemywania (3 x 300 μl PBST na studzienkę).
9. Dodać koniugat Avidin-HRP.
   1. Rozcieńczyć dostępny w handlu koniugat Awidyna-HRP w stosunku 1:40 000, dodając 1 μl koniugatu enzymatycznego do 40 ml PBST.
   2. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 μl rozcieńczonego koniugatu do każdego dołka.
   3. Przykryj płytkę folią uszczelniającą.
   4. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej.
   5. Za pomocą myjki do mikropłytek odessać roztwór powlekający i trzykrotnie umyć płytkę buforem do przemywania (3 x 300 μl PBST na studzienkę).
10. Reakcja kolorymetryczna
    1. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 μl substratu 3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyny (TMB) do każdego dołka.
    2. Przykryj płytkę folią uszczelniającą.
    3. Inkubować płytkę przez 1-5 minut w temperaturze 37 °C z dala od światła i monitorować rozwój koloru.
    4. Gdy kolor osiągnie oczekiwany poziom, dodaj 100 μl roztworu zatrzymującego, aby zakończyć reakcję.
       UWAGA: Oczekiwany poziom odpowiada intensywnemu niebieskiemu kolorowi w studzienkach zawierających próbki o wysokim stężeniu analitu.
11. Pozyskiwanie i analizowanie danych.
    1. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
    2. Korzystając z 4-parametrycznej krzywej kalibracyjnej, oblicz stężenie próbki na podstawie równania krzywej.

Rysunek 1: Schemat ideowy opracowanego przepływu pracy testu ELISA typu sandwich anty-HER2. Przegląd kluczowych etapów procedury testu ELISA typu sandwich. Obejmują one etapy krytyczne (wyróżnione czerwoną ramką), takie jak powlekanie płytki wychwytującym przeciwciałem anty-HER2 70.27.58, dodawanie próbek (wzorce krzywych, ślepa, eksperymentalne próbki lizatów komórkowych lub pożywki hodowlanej) oraz wiązanie wykrywającego przeciwciała anty-HER2 70.21.73.67. Test kończy się detekcją sygnału i analizą danych, w której sygnał kolorymetryczny jest oznaczany ilościowo za pomocą czytnika mikropłytek w celu określenia stężenia docelowego antygenu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schemat przedstawiający przygotowanie roztworów wzorcowych krzywej kalibracyjnej. Seryjne rozcieńczenia białka rekombinowanego HER2 przygotowuje się w celu wygenerowania krzywej kalibracyjnej w zakresie stężeń 1,56-100 ng/ml (fiolki STD 1-STD 7). Ponadto uwzględniono ujemną próbkę kontrolną bez białka HER2 (STD 8). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Walidacja testu ELISA typu sandwich
Nowo opracowany test wymaga procedury walidacji. Ważnymi parametrami walidacji są liniowość, precyzja i granice wykrywalności, tj. dolna granica wykrywalności (LLOD) i górna granica wykrywalności. W poprzednim artykule przeprowadziliśmy dokładną walidację metody. Liniowość testu ELISA przetestowano przy użyciu próbek próbnych dla niskich (2, 5, 10 ng/ml), średnio-wysokich (30 ng/ml) i znacznie podwyższonych (50 ng/ml) stężeń antygenu rozcieńczonego w PBS i innych m...

Dyskusja

Wśród krytycznych elementów w konstruowaniu testu ELISA typu sandwich znajdują się przeciwciała wychwytujące, które są unieruchomione na płytce i przyczyniają się do swoistości i czułości testu. W prezentowanym teście wykorzystaliśmy jako przeciwciało wychwytujące nowe białko monoklonalne (HER2/70.27.58) wygenerowane i scharakteryzowane we własnym zakresie. Przeciwciało miało unikalną sekwencję CDR (region określający komplementarność) i w oparciu o powinowactwo prezentowało czułość ED50 przy 0,0922 nM^1...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do etykietowania biotyny-NH2	Abnova	KA0003
Blotting Grade, mleko w proszku, o niskiej zawartości tłuszczu	Roth	T145.1
Szkiełka do liczenia komórek do licznika komórek TC10/TC20, dwukomorowe	Bio-Rad	145-0011
Płytki do hodowli komórkowych	Biologix	07-6012
Skrobaki do komórek	Biologix	70-1250
Wirówka	Ohaus	30130868
Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II - Telstar Bio II Advance 6	Telstar	N/A
Przezroczyste 96-dołkowe płytki płaskodenne	Termo Fisher	442404
Bezpieczne dla kultur inkubatory CO2 - Touch 190S	Leec	N/A
Sultlenek dimetylu	Sigma Aldrich	D2650
DMEM - wysoka glukoza	Sigma Aldrich	D0822
Czytnik płytek ELISA	BioTek	800TSUVI
surowica bydlęca	PAN Biotech	P30-19375
Suszarka laboratoryjna z wymuszonym obiegiem	BINDER	9090-0018
HRP-Avidin	Thermo Fisher	43-4423
Ludzkie białko Her2 / ErbB2, Fc Tag, premium klasa	AcroBIOSYSTEMS	HER2-H5253
Myjka mikropłytkowa do mycia immunologicznego	Bio-Rad	170-7009
Roztwór L-glutaminy	Sigma Aldrich	G7513
mAb a-HER2 (klon 70.21.73.67)	SDS Optic	BIO-ABH-2
mAb a-HER2 (klon 70.27.58)	SDS Optic	BIO-ABH-1
MDA-MB-231 Linia komórkowa	ATCC	HTB-26
NaHCO3	POCH	810530115
NaOH	POCH	BA0981118
Koktajl inhibitorów proteazy	Sigma Aldrich	P8340
Bufor RIPA	Sigma Aldrich	R0278
ROTI Fair PBS	Roth	1111.2
SK-BR-3 [SKBR3] Linia komórkowa	ATCC	HTB-30
SK-OV-3 [SKOV-3; SKOV3] Linia komórkowa	ATCC	HTB-77
Roztwór zatrzymujący 1x	Abcam	ab210900
TC20 Automatyczny licznik komórek	Bio-rad	1450102
podłoże TMB 1x	Abcam	ab210902
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
Vortex	Ohaus	30392117
Wytrząsarka o ruchu falowym	Ohaus	30391968