Ten protokół wprowadza szybką metodę ilościowego trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego. Skuteczność metody wykazano przy użyciu systemu tętnic łukowatych gardła w modelu zarodka pisklęcia, z siłami hemodynamicznymi określonymi ilościowo za pomocą obliczeniowej dynamiki płynów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybkie obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt w całej rozdzielczości do badań ilościowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W małych modelach zwierzęcych rozwoju i chorób sercowo-naczyniowych, specyficzne dla danego obiektu symulacje obliczeniowe przepływu krwi umożliwiają ilościową ocenę wskaźników hemodynamicznych, które są trudne do zmierzenia eksperymentalnie. Symulacje obliczeniowej dynamiki płynów rzuciły światło na kluczową rolę mechaniki w funkcjonowaniu układu sercowo-naczyniowego i postępie choroby. Uzyskanie wysokiej jakości obrazów wolumetrycznych zbiorników będących przedmiotem zainteresowania ma kluczowe znaczenie dla dokładności i powtarzalności wyników pomiarów morfologicznych i kwantyfikacji przepływu. W niniejszym badaniu zaproponowano szybką, opłacalną i dostępną metodę obrazowania naczyń krwionośnych małych zwierząt w pełnej rozdzielczości przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkuszy świetlnych. Zmodyfikowany protokół przygotowania próbki z arkusza świetlnego iDISCO+ (immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organs) obejmuje (1) znakowanie naczyń krwionośnych środkiem fluorescencyjnym, (2) konserwację próbki oraz (3) uczynienie próbki przezroczystą. W przeciwieństwie do klasycznego iDISCO+, który wykorzystuje barwienie immunohistochemiczne, autorzy znakują śródbłonek naczyniowy za pomocą znakowanej FITC poli-L-lizyny, niedrogiego niespecyficznego barwnika fluorescencyjnego, który jest wysoce odporny na fotowybielanie, w procesie zwanym "endomalowaniem". Szybkie etykietowanie skraca czas przygotowania próbki z około czterech tygodni do mniej niż 3 dni. Co więcej, zastosowanie minimalnie niebezpiecznego rozpuszczalnika, cynamonianu etylu (ECi) jako środka czyszczącego i roztworu do obrazowania, sprawia, że próbki są bezpieczniejsze w obsłudze i zgodne z szerszą gamą urządzeń do obrazowania. Proponowany protokół stosuje się do uzyskania wysoce rozdzielczych obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych układu sercowo-naczyniowego w zarodkach piskląt w okresie od 3 dnia (HH18) do dnia 8 (HH34). Badanie to dodatkowo pokazuje przydatność tej metody do ilościowego oznaczania naczyń krwionośnych poprzez rekonstrukcję 3D i obliczeniowe modelowanie hemodynamiczne zarodka pisklęcia dnia 5 (HH 26).
Wprowadzenie
Obrazowanie wolumetryczne jest niezbędne do dokładnych badań fizjologii i chorób sercowo-naczyniowych. Obrazowanie ilościowe pozwala na tworzenie stosów obrazów o wysokiej rozdzielczości z nienaruszonymi wymiarami wolumetrycznymi. Próbki muszą być zakonserwowane w celu zachowania ich morfologii i objętości światła in vivo, a także zobrazowane w jednolitej rozdzielczości o wysokiej rozdzielczości. Ze stosów obrazowania o wysokiej rozdzielczości użytkownik może generować trójwymiarowe renderingi naczyniowe o wysokiej wierności, które pozwalają na pełne wyświetlanie kształtów, struktury i połączeń naczyń krwionośnych1.
Struktury sercowo-naczyniowe posiadają skomplikowane trójwymiarowe cechy anatomiczne, których nie można dokładnie uchwycić podczas badania ich przez dwuwymiarową, niespójną soczewkę. Stereoskopowe obrazowanie morfologiczne szerokokątne i przekroje histologiczne są niewystarczające do uchwycenia złożonych zmian trójwymiarowych1,2,3. Obrazy mikro- i nanotomografii komputerowej są złotym standardem w ilościowym obrazowaniu wolumetrycznym małych zwierząt1,4, ale nie są powszechnie dostępne ani przyjęte wśród społeczności biologicznej. Ostatnie innowacje w oczyszczaniu tkanek i mikroskopii całych narządów/małych zwierząt pozwoliły na ilościowe zastosowanie technik oczyszczania całego wierzchowca i znakowania naczyń krwionośnych5,6,7. Oczyszczanie tkanek działa w celu homogenizacji rozpraszania światła w próbkach tkanek, zmniejszając w ten sposób opóźnienia w propagacji światła przez ośrodek poprzez zmniejszenie szansy na rozproszenie lub absorpcję światła. Wysoka przezroczystość wymaga rygorystycznego przetwarzania tkankowego, które może wpływać na antygenowość lub jasność znakowania sygnału fluorescencji8. Mikroskopia arkuszowa stała się szybkim, potężnym narzędziem do obrazowania, szeroko stosowanym przez biologów9, oferując wzrost prędkości o kilka rzędów wielkości w porównaniu z mikroskopami skaningowymi i zdolność do obrazowania próbek o wielkości powyżej 1 cm. Dzięki mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi (LSFM) laser oświetla przekrój próbki ze zwiększoną prędkością i głębokością w porównaniu z mikroskopią konfokalną; Z tego powodu metoda wymaga wysokiej przezroczystości próbki.
Tutaj autorzy adaptują najnowsze metody oczyszczania iDISCO+, łącząc je z endomalowaniem10 w modelu zwierzęcym zarodka pisklęcia, aby pokazać skuteczność metody od wczesnego do późnego rozwoju układu krążenia. iDISCO (immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organs) to metoda oczyszczania oparta na rozpuszczalniku organicznym, która, w przeciwieństwie do metod opartych na oczyszczaniu wodnym, nie podlega artefaktom obrazowania spowodowanym parowaniem rozpuszczalnika. iDISCO różni się od iDISCO+ tym, że etap odwadniania tetrahydrofuranu (iDISCO) jest zastępowany łagodniejszym odwodnieniem metanolu, po którym następuje etap ekstrakcji lipidów (iDISCO+). Do zalet metody oczyszczania iDISCO+ należą: znakowanie immunologiczne dużych dorosłych próbek i zarodków, niska kurczliwość tkanek i wysoka przezroczystość8,11. Co ważne, iDISCO+ pozwala na generowanie stosów obrazów o wysokiej rozdzielczości, rozszerzając tradycyjne techniki znakowania immunologicznego w celu uzyskania informacji na dużych próbkach narządów lub całym zarodku, zamiast ograniczać się do pobierania próbek z małych regionów, w których brakuje informacji na temat całej organizacji na poziomie tkanki, jak w przypadku tradycyjnej histologii9. Do wad iDISCO+ należy fakt, że genetycznie kodowane białka fluorescencyjne nie są zachowane11. Metoda znakowania tkanek endomalowania została po raz pierwszy wprowadzona jako wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w kierunku wad sercowo-naczyniowych przy użyciu serc zarodków piskląt HH31-HH36, które były perfundowane 0,5 mg / ml FITC-poli-L-lizyny w wierzchołku lewej komory. Barwnik pozostawiono do związania przez 4 minuty przed utrwaleniem i przechowywaniem10.
Obecne badanie wykazało, że to samo stężenie FITC-poli-L-lizyny może być stosowane dla szerszego zakresu zarodków (HH18 - HH34), ale okazało się, że idealny czas fiksacji waha się (od 5 do 10 minut), aby zapewnić jasno oznakowane naczynia. Użytkownicy obecnej techniki endo-DISCO mogą chcieć dostosować stężenie barwnika (zmniejszając się jednorazowo o 0,1 mg / ml), jeśli roztwór okaże się zbyt lepki, aby oznaczyć wszystkie pożądane naczynia, ale zachęca się ich do dostosowania czasu utrwalania i optymalizacji skurczu mięśni lewej komory przed dostosowaniem stężenia barwnika. Autorzy podjęli próbę endomalowania o stężeniu 0,1 mg / ml i odkryli, że chociaż barwnik łatwiej rozprzestrzeniał się przez małe naczynia, łatwiej był zmywany po perfuzji PFA. Autorzy wykazali, że stosy obrazowania o wysokiej rozdzielczości wygenerowane za pomocą obecnej techniki są wystarczającej jakości do obliczeniowego modelowania hemodynamicznego. Ścieżki przepływu krwi i odpowiadające im siły hemodynamiczne, w tym rozkład ciśnienia i naprężeń ścinających ściany, występują w złożonych, zlokalizowanych wzorcach, które można rozwiązać tylko za pomocą obliczeniowych symulacji przepływu1,12. Te siły biomechaniczne wpływają na zachowanie sąsiednich tkanek sercowo-naczyniowych i wywołują adaptację, wzrost i przebudowę naczyń krwionośnych13. Zrozumienie lokalnych wartości sił hemodynamicznych rzuca kluczowe światło na mechanistyczne regulatory funkcji układu sercowo-naczyniowego oraz inicjacji lub progresji choroby2.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Biuro ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi interpretuje politykę Publicznej Służby Zdrowia jako odnoszącą się do modelu piskląt jako "kręgowców" dopiero po wykluciu. Zarodki te są podobnie wyłączone spod jurysdykcji Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania (IACUC). Często zadawane pytania dotyczące Narodowych Instytutów Zdrowia można znaleźć pod adresem: http://grants.nih.gov/grants/olaw/faqs.htm#ApplicabilityofthePHSPolicy.
1. Pobieranie, etykietowanie i utrwalanie zarodków
- Fashion wciągnął szklane pręty kapilarne o średnicy wewnętrznej 0,75 do wyciętych mikroigieł za pomocą mikrokuźni1,12.
UWAGA: Wymagany rozmiar końcówki zależy od pożądanego wieku zwierzęcia/natężenia przepływu. Mikroigłę można alternatywnie przeciąć za pomocą kleszczy lub nożyczek do mikrodysekcji ze znacznie zmniejszoną precyzją. - Roztwór Tyrode'a należy rozgrzać do temperatury około 38°C.
- Rozpuścić poli-L-lizynę stałą FITC w roztworze Tyrode'a, aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 0,5 mg/ml.
UWAGA: To stężenie jest zoptymalizowane pod kątem znakowania tętnic zarodków piskląt. Optymalne stężenie dla innych typów tkanek może się różnić. Dodatkowy roztwór podstawowy należy przechowywać w temperaturze -20 °C. - Wypreparować zarodek ptaka (w zakresie od HH18 (dzień 3) do HH34 (dzień 8) w niniejszym badaniu kardiologicznym piskląt) z żółtka jaja kurzego, przecinając zarodek wokół zarodka nożyczkami z zakrzywioną końcówką i używając pipety transferowej lub szpatułki w celu przeniesienia zarodka na szalkę Petriego o średnicy 35 mm wypełnioną ciepłym roztworem Tyrode'a.
- Ostrożnie usuń błony kosmówkowe i omocznikowe otaczające zarodek i błonę osierdzia wokół serca za pomocą kleszczyków z cienką końcówką, wykonując małe (~0,1 mm) nacięcia w błonach i odciągając je od zarodka.
- Przenieś zarodek na nową, czystą szalkę Petriego wypełnioną ciepłym roztworem Tyrode'a, aby utrzymać bicie serca.
- Napełnij plastikową strzykawkę o pojemności 5 ml ciepłym roztworem Tyrode'a. Odciąć szeroki koniec plastikowej końcówki pipety o pojemności 0-20 μl i przymocować ją do płaskiej końcówki strzykawki. Strzykawka została teraz przedłużona do średnicy końcówki pipety o cienkiej średnicy.
- Zbuduj "linię iniekcyjną", podłączając segment silikonowej rurki o średnicy wewnętrznej 0,03 cala do nowo zabezpieczonego aparatu do strzykawki z końcówką pipety (krok 1.7). Przymocuj szklaną mikroigłę kapilarną do przeciwległego końca rurki.
- Zamontuj mikroigłę na uchwycie do mikroiniekcji podłączonym do mikromanipulatora. Oczyść silikonową rurkę i mikroigłę z pęcherzyków powietrza.
- Za pomocą mikromanipulatora wbij igłę w wierzchołek serca i perfunduj zarodek1,12, powoli wstrzykując roztwór Tyrode'a do serca. Kontynuuj perfuzję zarodka, aż zostanie w dużej mierze oczyszczony z krwi.
- Za pomocą mikromanipulatora odciągnąć igłę i linię iniekcyjną od miejsca wprowadzenia i ustawić igłę tak, aby nie została naruszona podczas przygotowywania kolejnej linii iniekcyjnej. Usunąć silikonową rurkę z igły i strzykawki.
UWAGA: Niektórzy użytkownicy mogą uznać za optymalne utrzymanie igły przymocowanej do serca, w takim przypadku użytkownik powinien usunąć silikonową rurkę między igłą a strzykawką, trzymając igłę na miejscu. - Wykonaj endomalowanie, aby oznaczyć śródbłonek naczyniowy zieloną fluorescencją.
- Za pomocą mikropipety załadować 20-40 μl roztworu podstawowego poli-L-lizyny FITC do silikonowej rurki, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków powietrza przed barierą dla cieczy FITC.
- Ponownie założyć strzykawkę wypełnioną roztworem Tyrode'a i za pomocą mikromanipulatora powoli wstrzyknąć lek w wierzchołek serca, w razie potrzeby ponownie wprowadzając igłę. Usunąć igłę po dyfuzji poli-L-lizyny FITC i zanim jakiekolwiek pęcherzyki powietrza dostaną się do serca.
- Pozwól poli-L-lizynie FITC siedzieć w zarodku przez 5-10 minut.
UWAGA: (opcjonalna kontrola jakości) Aby zweryfikować fluorescencję, zrób zdjęcie za pomocą fluorescencyjnego stereoskopu lub makroskopu. Zdjęcie może być wykorzystane do określenia czynnika odwodnienia po zakończeniu usuwania zarodków.
- Napełnij strzykawkę o pojemności 5 ml 4% paraformaldehydem (PFA) i podłącz ją do silikonowej rurki iniekcyjnej w celu wykonania trzeciego etapu wstrzykiwania.
- Perfekować zarodek1,12 z 4% PFA, aż wszystkie struktury sercowo-naczyniowe osiągną pełną objętość, a tkanka zacznie stawać się bardziej nieprzezroczysta.
- Delikatnie załaduj zarodek do fiolki o pojemności 2-5 ml wypełnionej wystarczającą ilością 4% PFA, aby pokryć próbkę. Uważaj, aby nie zdeformować nadmiernie zarodka.
UWAGA: Wybierz wystarczająco dużą fiolkę dla interesującej nas próbki, aby uniknąć zgniecenia lub deformacji próbki. - Inkubować zarodek przez noc w temperaturze 4 °C za pomocą shakera.
2. Odwodnienie i oczyszczanie zarodków
- Ostrożnie odpipetować 4% PFA.
UWAGA: Od tego momentu należy unikać bezpośredniego kontaktu z zarodkiem, aby zapobiec uszkodzeniu lub deformacji tkanek. - Aby umyć zarodek, należy go inkubować w świeżym roztworze buforu fosforanowego (PBS) w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie wstrząsając. Powtórz dwa dodatkowe razy, w sumie 3 prania.
- Rozpocznij odwadnianie zarodka w dygestorium. Ostrożnie odpipetować PBS i inkubować zarodek w stopniowanej serii 5 inkubacji metanolu w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę każda: stężenie metanolu 20%, 40%, 60%, 80% i 100%.
- Pozostaw zarodek w świeżym 100% metanolu w temperaturze pokojowej na noc.
UWAGA: (Opcjonalny punkt zatrzymania). Zarodki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C w 100% metanolu do późniejszego wykorzystania przez okres do 6 miesięcy. - W dygestoriach rozpocznij procedurę usuwania lipidów. Inkubować zarodek w DCM w proporcji 2:1 (objętość do objętości): roztwór metanolu w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, delikatnie wstrząsając.
UWAGA: DCM jest toksyczny i należy się z nim obchodzić w oparach. Należy zachować dodatkowe środki ostrożności podczas pracy z programem DCM. Podwójne rękawice mogą pomóc w zapewnieniu dodatkowej bariery. - Wyjmij cynamonian etylu (ECi) z 4 °C i pozostaw go w temperaturze pokojowej do rozmrożenia.
- Myj zarodki w świeżym 100% DCM w temperaturze pokojowej przez 15 minut, wstrząsając. Powtórz pranie 100% DCM, aby uzyskać w sumie 2 prania.
- Odpipetować DCM i inkubować zarodek w 100% ECi. Pozostawić zarodek w ECi do momentu, aż zniknie w ciągu około 1 godziny. W razie potrzeby delikatnie potrząśnij tubką.
- (Opcjonalny etap weryfikacji) Zbadaj jakość oczyszczania i barwienia naczyń za pomocą fluorescencyjnego stereoskopu lub makroskopu. Zrób zdjęcie zarodka, aby określić czynnik skalowania odwodnienia specyficzny dla etapu/wieku.
- Oczyszczony zarodek należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy, aż będzie gotowy do wykonania obrazu, chroniąc zarodek przed światłem.
3. Akwizycja danych
- Do obrazowania zarodków należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego z arkuszami światła. Przymocuj głowę optycznie oczyszczonego zarodka do szklanej kapilary za pomocą żelu superglue.
- Zamontuj szklaną kapilarnę do uchwytu próbki, napełnij komorę obrazowania ECi i opuść zarodek w komorze obrazowania.
- Dostosuj parametry i wykonaj obrazowanie.
4. Zastosowanie ilościowe: rekonstrukcja 3D i modelowanie dynamiki płynów obliczeniowo
UWAGA: W tych krokach, do oprogramowania open-source SimVascular14 ładowane są stosy obrazów o wysokiej rozdzielczości generowane przez arkusze świetlne do rekonstrukcji anatomicznej 3D i obliczeniowego modelowania dynamiki płynów. Szczegółowe samouczki znajdują się na stronie internetowej SimVascular (patrz tabela materiałów). Rekonstrukcja polega na tworzeniu linii ścieżek w naczyniach będących przedmiotem zainteresowania, tworzeniu segmentacji 2D wzdłuż linii ścieżek i łączeniu segmentacji wyciągniętych po profilach w model bryłowy 3D. Modelowanie komputerowe polega na przygotowaniu geometrii siatki, zdefiniowaniu warunków brzegowych i przeprowadzeniu symulacji.
- Utwórz nowy SVProject w obszarze Plik i prześlij stos obrazowania arkusza świetlnego o wysokiej rozdzielczości, klikając prawym przyciskiem myszy Obrazy, a następnie klikając dodaj/zamień obraz.
- Postępuj zgodnie z instrukcjami samouczka oprogramowania, aby zrekonstruować anatomię naczyniową in silico.
- Utwórz ścieżkę, klikając prawym przyciskiem myszy Ścieżki i wybierając opcję Utwórz ścieżkę. Umieść znaczniki ścieżki wzdłuż interesującego Cię statku. Powtórz te czynności dla każdego interesującego Cię naczynia.
- Dla każdej utworzonej ścieżki prześledź przekroje poprzeczne 2D naczynia, klikając prawym przyciskiem myszy Segmentacje i wybierając Utwórz grupę konturów. Wybierz ścieżkę statku i kliknij dwukrotnie nazwę jednostki w obszarze Segmentacja, aby rozpocząć ręczną segmentację.
- Po posegmentowaniu wszystkich statków utwórz model, klikając prawym przyciskiem myszy Modele, a następnie wybierając opcję Utwórz model. Wybierz typ PolyData, wprowadź nazwę modelu, kliknij Utwórz model bryłowy i wybierz wszystkie segmentacje, które powinny być częścią modelu.
- Połącz geometrię, uruchamiając siatkę Tetgen wbudowaną w SimVascular SVMesher. Zdefiniuj maksymalny rozmiar krawędzi i wykonaj tworzenie siatki zarówno powierzchniowej, jak i objętościowej.
UWAGA: Wybierz rozmiar oczek, który może rozwiązać drobne szczegóły geometryczne i zlokalizowane zmiany hemodynamiczne w naczyniu. Zacznij od przycisku Oszacuj globalny rozmiar siatki. Badanie konwergencji siatki może być konieczne przy finalizowaniu symulacji. - Skonfiguruj obliczeniową symulację przepływu krwi za pomocą SimVascular Solver. Utwórz pliki symulacji, klikając prawym przyciskiem myszy pozycję Symulacje i wybierając opcję Utwórz zadanie symulacji. Dostosuj podstawowe parametry i wybierz BC wlotu i wylotu dla określonych warunków brzegowych.
- Dostosuj parametry Solver, przejdź do zakładki Create Files and Run simulation (Utwórz pliki i uruchom symulację), wybierz plik siatki, kliknij przycisk Create Data Files for Simulation (Utwórz pliki danych dla symulacji).
- Uruchom symulację przy użyciu stacji roboczej o wysokiej wydajności lub superkomputera.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawiony tutaj protokół szybkiego obrazowania wysokorozdzielczego całych preparatów (Rysunek 1, Tabela 1) pozwala na uzyskanie wyraźnych obrysów światła naczyń, jak pokazano na Rysunku 2, Rysunku 3 i Rysunku 4, gdzie śródbłonek naczyń krwionośnych zarodka kurczego wykazuje fluorescencję GFP i jest zatem obrysowany na zielono w stadiach rozwoju zarodka od wczesnego do dojrzałego rozwoju serca (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Możliwość studiowania biologii w 3D ma kluczowe znaczenie dla dokładnego zrozumienia złożoności morfologicznej, struktury narządów wewnętrznych i połączeń naczyniowych. Dokładne i wiarygodne obrazy naczyń krwionośnych 3D mają również kluczowe znaczenie dla specyficznych dla danego tematu obliczeniowych symulacji hemodynamicznych, które często są jedynym wiarygodnym sposobem ilościowego określania kluczowych parametrów hemodynamicznych, takich jak naprężenie ścinające ścianę i rozkład ciśnienia. W tym miejscu autorzy prze...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została wsparta przez American Heart Association Career Development Award, Burroughs Wellcome Fund Career Award na Scientific Interface, Additional Ventures Single Ventricle Research Fund, oraz UCSD School of Medicine Microscopy Core (Grant P30 NS047101). Autorzy dziękują dr Bobby'emu Thompsonowi za wprowadzenie do endomalowania, UCSD School of Medicine Microscopy Core i Robertowi Porterowi (UCSD) za wsparcie eksperymentalne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| #5 kleszczy | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| #55-kleszcze | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Rurka silikonowa o średnicy wewnętrznej 0,03 cala | VWR | 32829-182 | |
| 20 μ Końcówki do pipet L | VWR | 76322-134 | |
| Szalka Petriego 35 mm | VWR | 10799-192 | |
| Plastikowa strzykawka 5 ml | VWR | BD 309646 | |
| Dichlorometan (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | Patrz karta charakterystyki. Przechowywany w szafce bocznej pod wyciągiem |
| Cynamonian etylu (ECi) | Sigma-Aldrich | 112372 | Przechowywany w temperaturze 4 stopni; C |
| Cienkie zakrzywione nożyczki | Narzędzia do nauki pięknej | 14061-09 | |
| FITC-poly-L-lizyna | Sigma-Aldrich | P3069 | Przechowywać pod kątem -20 & deg; C (proszek, roztwór podstawowy), 4º C (roztwór roboczy) |
| Mikroskop fluorescencyjny | EVIDENT SCIENTIFIC | MVX10 | |
| Szklane rurki kapilarne (0,75 mm ID) | Sutter Instrument | FG-GB100-75-10 | |
| Mikroskop Lightsheet | Zeiss | Z.1 | |
| Metanol | Sigma-Aldrich | M1775 | Patrz karta charakterystyki. Przechowywany w łatwopalnej szafce pod wyciągiem |
| Microforge | Narishige International USA, Inc. | MF2 | |
| Micromanipulator | World Percision Instrrument | M3301R | |
| Paraformaldehyd (PFA) 4% | Thermo Scientific | J19943. K2 | Patrz karta charakterystyki. Przechowywany w temperaturze -20 ° C (proszek), 4 ° C (4% roztwór roboczy) |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Cytiva | SH30256.01 | Przechowywany na stacjonarnym |
| oprogramowaniu open source | SimVascular | ||
| Tyrode' s Rozwiązanie | wykonane we własnym zakresie |
Bibliografia
- Lindsey, S. E., Butcher, J. T., Vignon-Clementel, I. E. Cohort-based multiscale analysis of hemodynamic-driven growth and remodeling of the embryonic pharyngeal arch arteries. Development. 145 (20), dev162578(2018).
- Lindsey, S. E., Vignon-Clementel, I. E., Butcher, J. T. Assessing early cardiac outflow tract adaptive responses through combined experimental-computational manipulations. Ann Biomed Eng. 49 (12), 3227-3242 (2021).
- Salman, H. E., et al. Effect of left atrial ligation-driven altered inflow hemodynamics on embryonic heart development: Clues for prenatal progression of hypoplastic left heart syndrome. Biomech Model Mechanobiol. 20 (2), 733-750 (2021).
- Henning, A. L., Jiang, M. X., Yalcin, H. C., Butcher, J. T. Quantitative three-dimensional imaging of live avian embryonic morphogenesis via micro-computed tomography. Dev Dyn. 240 (8), 1949-1957 (2011).
- Anbazhakan, S., et al. Blood flow modeling reveals improved collateral artery performance during the regenerative period in mammalian hearts. Nat Cardiovasc Res. 1 (8), 775-790 (2022).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2016).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369(2021).
- Rios Coronado, P. E., Red-Horse, K. Enhancing cardiovascular research with whole-organ imaging. Curr Opin Hematol. 28 (3), 214-220 (2021).
- Miller, C. E., et al. Confocal imaging of the embryonic heart: How deep. Microsc Microanal. 11 (3), 216-223 (2005).
- Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Lindsey, S. E., et al. Growth and hemodynamics after early embryonic aortic arch occlusion. Biomech Model Mechanobiol. 14 (4), 735-751 (2015).
- Humphrey, J. D. Constrained mixture models of soft tissue growth and remodeling-twenty years after. J Elast. 145 (1), 49-75 (2021).
- Updegrove, A., et al. SimVascular: An open-source pipeline for cardiovascular simulation. Ann Biomed Eng. 45 (3), 525-541 (2017).
- Kim, J. S., Min, J., Recknagel, A. K., Riccio, M., Butcher, J. T. Quantitative three-dimensional analysis of embryonic chick morphogenesis via microcomputed tomography. Anat Rec. 294 (1), 1-10 (2011).
- Zhang, D., Lindsey, S. Evaluation of high-resolution image accuracy for small animal vascular flow quantitation. Bull Am Phys Soc. , https://meetings.aps.org/Meeting/DFD24/Session/X03.8 (2024).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
