Szybkie wykrywanie antygenu kałowego zakażenia Helicobacter pylori w oparciu o technologię wykrywania kanapek z podwójnym przeciwciałem

Podsumowanie

W tym badaniu opracowano technikę wykrywania kanapek opartą na podwójnych przeciwciałach w celu szybkiego wykrywania antygenów kałowych zakażonych Helicobacter pylori.

Streszczenie

Helicobacter pylori może być pasożytniczy w błonie śluzowej żołądka, co może powodować szereg chorób żołądkowo-jelitowych po zakażeniu i jest ściśle związane z zapaleniem żołądka, wrzodem żołądka i rakiem żołądka. Wysokie rozpowszechnienie zakażenia H. pylori w regionach o słabej infrastrukturze medycznej i nieodpowiednich obszarach sanitarnych pozostaje poważnym problemem dla zdrowia publicznego. W związku z tym opracowanie szybkich, prostych i opłacalnych metod badań przesiewowych w celu wykrywania H. pylori w warunkach ograniczonych zasobów ma ogromne znaczenie.

W tym badaniu przeprowadziliśmy badania przesiewowe w społeczności w wiosce Shitan w prowincji Guangdong, odległym i słabo rozwiniętym obszarze charakteryzującym się stałą populacją około 300 mieszkańców o ogólnie niskim poziomie wykształcenia. Zastosowaliśmy test kanapkowy z podwójnym przeciwciałem do wykrywania antygenu kałowego H. pylori , metody wybranej ze względu na jej potencjalne zastosowanie w warunkach o niskich zasobach. W sumie zapisano 261 uczestników z wioski, a ich próbki kału zostały przeanalizowane przy użyciu tej techniki. W celu walidacji porównawczej te same próbki poddano ilościowej analizie łańcuchowej reakcji polimerazy (qPCR). W porównaniu z wynikami qPCR czułość i swoistość wykrywania antygenu H. pylori w kale wynosiły 60,24% i 80,08%. Wyniki wykazały silną zgodność między metodą wykrywania antygenu kałowego a qPCR (Kappa = 0,630). W badaniu tym systematycznie wyjaśniono zasady, procedury, metodologie i zastosowania kliniczne wykrywania antygenu kałowego w przypadku zakażenia H. pylori , mając na celu zbadanie technologii kanapek z podwójnym przeciwciałem na bazie lateksu oraz ustanowienie nowych strategii i praktycznych wytycznych dotyczących jej pomocniczej diagnozy.

Wprowadzenie

Helicobacter pylori (H. pylori, Hp) to mikroaerofilna, spiralna bakteria Gram-ujemna¹. Ze względu na swoją zdolność do kolonizacji i przewlekłego infekowania ludzkiego żołądka², patogen ten został zidentyfikowany jako główny czynnik etiologiczny w rozwoju gruczolakoraka żołądka ^3,4. W 2015 roku ~4,4 miliarda ludzi na świecie cierpiało z powodu zakażenia H. pylori ⁵. Częstość występowania zakażenia H. pylori wykazuje znaczne zróżnicowanie geograficzne, przy czym kraje rozwijające się doświadczają znacznie wyższych wskaźników w porównaniu z krajami rozwiniętymi. Warto zauważyć, że w krajach o niskich dochodach i wśród niektórych wrażliwych populacji wskaźnik infekcji może sięgać nawet 75%⁶.

Chociaż tradycyjne metody wykrywania, takie jak gastroskopia, są dokładne, ich zastosowanie w badaniach przesiewowych na dużą skalę i rutynowych obserwacjach jest ograniczone ze względu na ich inwazyjność, wysoki koszt i niską akceptację pacjentów⁷. Dlatego poszukiwanie nieinwazyjnych, prostych i szybkich metod diagnostycznych stało się ważnym kierunkiem badań współczesnej medycyny klinicznej. Głównym celem nieinwazyjnej diagnostyki H. pylori jest dokładne, bezpieczne i wygodne wykrycie, czy pacjent jest zakażony H. pylori bez badania endoskopowego. Mocznikowy test oddechowy (UBT), test antygenu kałowego H. pylori (FAT)⁸ i test serologiczny⁹ są popularnymi technikami nieinwazyjnymi.

Wśród nich UBT jest najmniej inwazyjną i najdokładniejszą dostępną procedurą¹⁰. Czułość i swoistość UBT są wyższe niż 95%¹¹. Spośród dostępnych nieinwazyjnych metod diagnostycznych wykazano, że UBT jest najdokładniejsza i najbardziej wiarygodna, jak wykazano w badaniu walidacyjnym przeprowadzonym w Iraku, UBT może być zalecany jako pierwszy wybór ze względu na jego wyższą skuteczność w porównaniu z innymi metodami¹². Jednak UBT ma również swoje wady, takie jak wysoki koszt i potrzeba analizy spektrometrii mas, co ogranicza zastosowanie w warunkach zdalnych lub o ograniczonych zasobach¹³.

Opracowanie szybkiej, nieinwazyjnej i opłacalnej metody diagnostycznej wykrywania zakażenia H. pylori jest niezwykle potrzebne, szczególnie w regionach o ograniczonych zasobach. W tym badaniu opracowaliśmy technologię szybkiego wykrywania antygenu kałowego H. pylori w oparciu o technologię wykrywania kanapek z podwójnym przeciwciałem, która może szybko, skutecznie i tanio wykryć antygen H. pylori w próbkach kału. Technologia ta oferuje znaczące korzyści, w tym przystępność cenową, nieinwazyjność, łatwość obsługi i możliwość dostosowania do odległych obszarów. Stawiamy hipotezę, że metoda kanapkowa z podwójnym przeciwciałem do wykrywania antygenu kałowego H. pylori wykaże czułość i swoistość porównywalną z qPCR, pozycjonując ją jako realne narzędzie do nieinwazyjnej diagnozy klinicznej.

Kompleksowo omówiliśmy zasady, procedury, mocne strony metodologiczne i kliniczne zastosowanie wykrywania antygenu kałowego w przypadku zakażenia H. pylori . Aby potwierdzić jego praktyczność, przeprowadziliśmy dochodzenie epidemiologiczne i badania przesiewowe w wiosce Shitan w mieście Qingyuan w prowincji Guangdong w Chinach, która jest odległym i słabo rozwiniętym obszarem ze stałą populacją około 400 osób i ograniczonym poziomem wykształcenia. Nasze wyniki pokazują, że zaprojektowana tutaj technologia szybkiego wykrywania antygenu H. pylori w kale może być ukończona w ciągu 20 minut. Podkreśla się, że szybkie wykrycie antygenu H. pylori w kale jest potencjalnym i obiecującym narzędziem do szybkiej i wiarygodnej diagnozy zakażenia H. pylori na odległych i zacofanych obszarach.

Protokół

To badanie przekrojowe zostało zatwierdzone przez Komisję Bioetyczną Prowincjonalnego Szpitala Ludowego w Guangdong (numer zgody: KY2024-445-01), a dane osobowe wszystkich uczestników badania były ściśle poufne podczas badania. Wszyscy uczestnicy podpisali pisemną świadomą zgodę przed eksperymentami. Mieszkańcy wioski Shitan w mieście Qingyuan w prowincji Guangdong w 2024 roku zostali wybrani jako obiekty badawcze i nie było żadnych ograniczeń co do wieku i płci. Opisany poniżej test kanapkowy z podwójnym przeciwciałem (eksperyment jakościowy) został wykonany przez profesjonalny personel medyczny i techniczny zgodnie z instrukcją. Do badań wybrano całą stałą populację wsi, niezależnie od tego, czy była zdrowa, czy miała objawy, czy też jakiekolwiek istniejące choroby związane z chorobami przewodu pokarmowego.

1. Selekcja pacjentów

1. Wyklucz pacjentów, jeśli w ciągu ostatniego 1 miesiąca stosowali inhibitory pompy protonowej lub bizmut, blokery receptora_H2 lub antybiotyki.
2. Poproś wszystkich uczestników o anonimowe wypełnienie kwestionariusza. Treść kwestionariusza obejmuje pięć pytań: Czy regularnie jesz trzy posiłki? Czy pijesz alkohol? Czy znasz H. pylori? Czy uważa Pan/Pani, że konieczne jest przeprowadzenie inspekcji H. pylori ? Czy rozumiesz negatywne konsekwencje zakażenia H. pylori ?

2. Procedura wykrywania antygenu zakażenia H. pylori w kale

UWAGA: Algorytm badania antygenu kału H. pylori został opracowany w celu zapewnienia dokładności i wiarygodności wyników, z uwzględnieniem prostoty i higieny. Cały proces podzielony jest na pięć etapów: pobieranie próbki, przetwarzanie próbki, przechowywanie próbki, wykrywanie i interpretacja wyników. Działający schemat blokowy i schemat ideowy wykrywania próbki pokazano na rys. 1 i rys. 2.

1. Pobieranie próbek
   UWAGA: Do pobierania próbek należy używać pojemników specyficznych dla antygenu H. pylori . Próbek nie należy mieszać z wodą, moczem, środkami dezynfekującymi i ściekami.
   1. Po zakończeniu defekacji zdjąć górną pokrywę specjalnego pojemnika, aby wyjąć pręt do pobierania próbek.
   2. Wkładać pręt do pobierania próbek w sposób ciągły w pięciu różnych pozycjach stołka w celu pobrania próbek, upewniając się, że gwintowany koniec pręta do pobierania próbek jest całkowicie włożony do stołka.
   3. Po zakończeniu pobierania próbek włożyć pręt do pobierania próbek z powrotem do probówki z odczynnikiem; Objętość próbki wynosi łącznie ~5-50 mg.
2. Przetwarzanie próbek
   1. Potrząsaj probówką z odczynnikiem z boku na bok przez ~10 s, aby dokładnie wymieszać próbkę kału w rozcieńczalniku (główne składniki: kwas etylenodiaminotetraoctowy, hydrat tetrasodu 0,018 g/ml i chlorek sodu 0,01 g/ml).
3. Przechowywanie próbek
   1. Zbadać próbki jak najszybciej po ich pobraniu; przechowywać je w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 6 godzin i w warunkach chłodniczych (nie dłużej niż 72 godziny w temperaturze 2–8 °C i nie dłużej niż 6 miesięcy w stanie zamrożonym w temperaturze od -25 °C do -15 °C), jeśli jest to konieczne, aby spowolnić degradację antygenu i aktywność mikrobiologiczną.
      UWAGA: Próbki można wielokrotnie zamrażać i rozmrażać do 3 razy, a zarówno schłodzone, jak i zamrożone próbki należy przywrócić do temperatury pokojowej przed badaniem.
4. Wykrywanie próbek
   1. Otwórz białą pokrywę na pokrywie probówki z odczynnikiem i trzymaj probówkę z odczynnikiem w pozycji pionowej.
   2. Dociśnij pokrywę do najniższego punktu, tak aby próbka przepływała po karcie testowej, przechodząc przez obszar wykrywania (T) i obszar kontroli jakości (C) pokryty mysim przeciwciałem anty-Hp.
5. Interpretacja wyników
   1. Odczekaj 10-20 minut, aby dowolny antygen H. pylori w próbce, jeśli jest związany z przeciwciałem, utworzył makroskopową reakcję chromogenną w obszarze wykrywania. Zwykle pojawia się jako czerwona lub fioletowa linia, która kontrastuje z linią w obszarze kontroli jakości.
   2. Obecność lub brak reakcji barwy i głębia koloru są związane ze stężeniem antygenu H. pylori w próbce. Porównaj karty kolorów, aby szybko i dokładnie zinterpretować wyniki (patrz rysunek 3).

3. Ekstrakcja DNA

1. Umieść odpowiednią ilość kału w probówce, dodaj roztwór PBS i dokładnie wymieszaj, wstrząsając. Mieszaninę odwirować przy 12 000 × g przez 5-10 minut, a następnie ostrożnie zebrać 200 μl supernatantu do dalszej ekstrakcji.
2. Na podstawie liczby próbek przygotuj równą liczbę probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Do każdej probówki dodać kolejno 20 μl proteinazy K (20 mg/ml), 10 μl kulek magnetycznych, 200 μl supernatantu próbki i 200 μl buforu do lizy A. Dokładnie wymieszać, odwracając probówki, a następnie inkubować w metalowej łaźni w temperaturze 55 °C przez 10 minut.
3. Po zakończeniu pirolizy umieść probówkę wirówkową na ramie magnetycznej, odstaw i pozwól na adsorpcję przez 1 minutę na kulkach. Po całkowitym sklarowaniu cieczy w probówce należy wyrzucić supernatant i starać się unikać naruszania kulek magnetycznych.
4. Wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego i umieść je na stojaku na probówki wirówkowe o pojemności 1.5 ml. Za pomocą pipety dodaj 500 μl buforu płuczącego E do każdej probówki, dokładnie mieszaj przez 1 minutę, a następnie włóż probówki z powrotem do stojaka magnetycznego. Odstawić probówki na 1 minutę, po sklarowaniu wyrzucić supernatant i unikać zasysania kulek magnetycznych.
5. Powtórzyć proces mycia, dodając 500 μl buforu płuczącego W2 do każdej probówki. Dokładnie mieszaj przez 1 min, umieść probówki na stojaku magnetycznym i odstaw na 1 min. Po sklarowaniu roztworu należy ostrożnie wyrzucić supernatant, upewniając się, że kulki magnetyczne pozostają nienaruszone.
6. Dodać 100 μl eluentu, wymieszać i inkubować w temperaturze 55 °C przez 5 minut.
7. Umieść probówki na stojaku magnetycznym i odstaw je na 2 minuty. Gdy roztwór się sklaruje, ostrożnie przenieś wyluzowany kwas nukleinowy do nowej probówki wirówkowej, unikając zasysania kulek magnetycznych.
8. Ocenić czystość wyekstrahowanego DNA, mierząc absorbancję przy 260 nm (A₂₆₀) i 280 nm (A₂₈₀). Oblicz stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ , który powinien być idealnie większy niż 1,8 dla DNA o wysokiej czystości.

4. qPCR do wykrywania H. pylori i oporności na antybiotyki

UWAGA: Przeprowadziliśmy qPCR w celu wykrycia zakażenia H. pylori poprzez amplifikację genu mocznika . Wszystkie produkty negatywnej kontroli jakości to sterylna, oczyszczona woda. Produktem pozytywnej kontroli jakości w zestawie do wykrywania kwasów nukleinowych H. pylori są inaktywowane standardowe kulki H. pylori (ATCC 43504). A_{C T} ≤ 30 z typową krzywą w kształcie litery S jest uważany za dodatni.

1. W zależności od liczby próbek, które mają być badane, wyjmij liofilizowany preparat H. pylori z zestawu i szybko go odwiruj, aby liofilizowany proszek pozostał na dnie probówki.
2. Ostrożnie otworzyć pokrywę liofilizowanego preparatu; pobrać kwas nukleinowy z próbki, która ma być poddana badaniu; dodać 25 μl próbki kwasu nukleinowego do preparatu liofilizowanego; i szczelnie przykryj rurkę.
3. Wstrząśnij i równomiernie wymieszaj odczynnik PCR przez 8-10 s, a następnie szybko wiruj przez 3-5 s.
4. Dla każdej próbki na 32-dołkowej płytce należy przygotować 25 μl mieszaniny reakcyjnej PCR (liofilizowany proszek [zawierający enzym Taq (5 U/μL), trifosforan dezoksyrybonukleozydu (2,5 mmol/l), enzym UNG (2 U/μl), mocznik do przodu (5'-ACATTGCGAGCGGGACAG-3') i do tyłu (5'-CGCCCAATCTCACTTTATCG-3') starterów (40 μmol/L)]) oraz 25 μl (2,5 μg) wyekstrahowanego DNA.
5. Uruchom 32-dołkową płytkę qPCR na maszynie qPCR. Zaprogramować termocykler: 42 °C i 95 °C (oba na jeden cykl) na 2 minuty każdy; 95 °C przez 10 s i 65 °C przez 45 s (dwa kroki to jeden cykl) przez 10x; 95 °C przez 10 s i w temperaturze 58 °C przez 45 s (dwa kroki to jeden cykl) przez 35 cykli.
6. Przeanalizuj dane za pomocą specjalnego oprogramowania do qPCR i pozwól urządzeniu automatycznie wybrać progi linii bazowej.

5. Analiza statystyczna

1. Użyj testu chi-kwadrat do analizy danych eksperymentalnych w celu oceny spójności między tą metodą a wynikami qPCR i porównaj dodatni wskaźnik badań przesiewowych tej technologii z danymi dotyczącymi dodatniego wskaźnika infekcji H. pylori na szerszą skalę (np. w całym kraju). Rozważ różnice istotne statystycznie przy P < 0,05.

Wyniki

Badanie ankietowe
Do badania zakwalifikowano łącznie 261 uczestników, w tym 144 kobiety i 117 mężczyzn, w wieku od 4 do 99 lat. Średni wiek badanych wynosił 48,30 ± 17,61 lat. W grupie znajdowało się 17 osób niepełnoletnich (0-17 lat), 202 dorosłych (18-64 lata) oraz 42 uczestników w wieku starszym (>64 lata). Wyniki ankiety przedstawiono w Tabeli 1. Większość (90,8%) badanych uważała, że przeprowadzenie przesiewowego badania w kierunku H. pylori jest konieczne.

Dyskusja

H. pylori stanowi jedną z najbardziej rozpowszechnionych infekcji bakteryjnych na całym świecie¹⁵. Wyniki kwestionariusza ujawniły, że 55,2% populacji nie miało świadomości na temat H. pylori, podczas gdy 90,8% uważało, że konieczne jest przeprowadzenie badań przesiewowych w kierunku H. pylori. Wyniki te podkreślają znaczenie wdrażania programów badań przesiewowych przeciwko H. pylori na obszarach znajdujących się w niekorzystnej sytuacji ekonomicznej i odległyc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do ekstrakcji DNA	Jiangsu mole biotechnology co., ltd	20230223	Żaden
H. pylori zestaw do wykrywania antygenu kałowego	Hangzhou nuohui zdrowa technologia co., ltd	20213401126	Żaden
Zestaw do wykrywania kwasów nukleinowych H. pylori	Jiangsu mole biotechnology co., ltd	20230226	Żaden
Ilościowy PCR fluorescencji w czasie rzeczywistym	Szanghaj Hongshi technologia leczenia medycznego co., ltd	20183221659	Żaden
Statystyczne rozwiązania produktowe i usługowe	Firma IBM	Żaden	Żaden