Artykuł metodologiczny

Nowy model wyspy do 3D badań interakcji śródbłonka i komórek β: znaczenie dla przesiewowego filtrów środków cytoprotekcyjnych

DOI:

10.3791/68220

⸱

17 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Regenerative Nanomedicine (RNM), UMR 1260, INSERM (French National Institute of Health and Medical Research), University of Strasbourg, 2Department of Emergency, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Research Center, CHU de Québec -Laval University, 4Department of Microbiology-Infectiology and Immunology, Faculty of Medicine, Laval University, 5Department of Diabetes and Nutrition Endocrinology, University Hospital of Strasbourg, 6Faculty of Medicine, University of Strasbourg, 7Faculty of Pharmacy, University of Strasbourg

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten zawiera szczegółową procedurę generowania stabilnych sferoidów wysetek trzustkowych myszy oraz szczegółowe metody barwienia, oczyszczania i montażu w 3D, dostosowane do ich niewielkich rozmiarów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę produkcji małych, stabilnych sferoidów, ich hodowli oraz obrazowania 3D, do badania interakcji komórek śródbłonka i β produkujących insulinę w modelu 3D wysepek trzustkowych. Sferoidy o pojemności 150-200 μm, odzwierciedlające najniższy zakres rozmiarów wysepek, zostały przygotowane z wybranego stosunku łączącego 1 komórkę śródbłonka wewnątrzwyspy (komórki MS-1) do 20 komórek wydzielających insulinę (β-TC-6). Szczegółowo opisano barwienie, oczyszczanie i montaż wyzwań małych sferoidów oraz ich zwalczanie przy użyciu agarozy o niskiej temperaturze topnienia oraz techniki oczyszczania CUBIC, a także kluczowe punkty umożliwiające efektywną analizę struktury 3D za pomocą różnych sond. Dane wskazują, że NTPDAZA-ektonukleotidaza 3 nie współlokalizuje się z insuliną w modelu sferoidalnym, co sugeruje różną dojrzałość i poziomy funkcjonalności β-TC6, a cały zabieg można również zastosować na izolowanych wysepkach trzustkowych, z wyraźnym sondowaniem naczyń wewnątrzwysepkowych. Wyniki te podkreślają skuteczność protokołu obrazowania 3D w ujawnianiu złożonej organizacji komórek trzustki oraz interakcji w modelu wysepki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeszczep wysepek trzustkowych często jest skomplikowany przez natychmiastową reakcję zapalną wywołaną przez krew (IBMIR), która znacząco uszkadza komórki śródbłonka wewnątrzwyspy (IEC), wpływając na perfuzję i funkcjonowanie przeszczepu. W dłuższej perspektywie u pacjentów opisana jest zmniejszona masa funkcjonalnych wysp oraz utrata niezależności insulinowej, 4 lata poprzeszczepie. Chociaż opracowano modele przeszczepów wysepek na mysach lub szczurach, ustandaryzowane modele do badania farmakologicznych celów wstępnego kondycjonowania wysepek, szczególnie istotne w kontekście uszkodzeń przeszczepów wywołanych cytokinami wywołanych przez IBMIR,nie mają 2. Rzeczywiście, konstrukcja sferoidalna jest szczególnie odpowiednia do identyfikacji nowych celów farmakologicznych oraz oceny cząsteczek cytoprotekcyjnych w przypadku dysfunkcji komórek wywołanej cytokinami. Ponadto oferuje alternatywne podejście ograniczające stosowanie modeli zwierzęcych cukrzycy typu 1 oraz przeszczepów wysepek.

Znalezienie odpowiednich warunków do barwienia, optycznego oczyszczania i montażu dla małych sferoidów o rozmiarze wysepek pozostaje wyzwaniem. W literaturze bardzo niewiele badań opisuje sposób radzenia sobie z małymi sferoidami i ich kluczowymi cechami strukturalnymi. Trudność wynika także z konieczności wyważenia penetracji tkanek, zachowania sygnału i integralności strukturalnej, przy jednoczesnym zachowaniu delikatnego charakteru tych miniaturowych struktur 3D. Ponadto konwencjonalne metody barwienia często mają trudności z uzyskaniem jednolitego oznaczania sferoidów. Problem ten jest pogłębiany przez gęstą organizację komórek, która może utrudniać dyfuzję odczynników ze względu na ograniczone przenikanie przeciwciał i barwników 3,4. Wreszcie, proces optycznego oczyszczania, kluczowy dla zmniejszenia tła rozpraszania światła i poprawy głębi obrazowania, musi być starannie zoptymalizowany, aby nie zakłócać struktury sferoidy ani nie zmieniać właściwości biologicznych5.

Montaż małych sferoidów do mikroskopii 3D stanowi kolejne wyzwanie. Tradycyjne nośniki montażowe mogą nie zapewniać odpowiedniego wsparcia dla tych delikatnych struktur, co może prowadzić do ich deformacji lub zapadania się podczas obrazowania. Ponadto dopasowanie współczynnika załamania światła wymagane do uzyskania optymalnej jakości obrazowania musi być precyzyjnie kontrolowane, aby zapewnić dokładną wizualizację na całej głębokości sferoidy 6,7. Rozwój protokołów dostosowanych do małych sferoidów jest dodatkowo utrudniony przez różnorodność typów komórek i warunków eksperymentalnych stosowanych w hodowlach sferoidalnych3. Wreszcie, potrzeba specjalistycznych podejść do utrzymania integralności populacji wielu komórek w trakcie procesu barwienia i oczyszczania jest kluczowa dla oceny odpowiedzi komórkowych.

Aby sprostać specyficznym wyzwaniom badania stresu wysepek wysepek wysyczek pośredniczonych przez IBMIR, zaprojektowano model sferoidy z 2000 komórek, łączący β komórkach IEC i wydzielanie insuliny przez myszy, z proporcją 1:20 komórek IEC do β podobną do obserwowanej w wysepce trzustkowej. Ponadto wcześniejsze eksperymenty wykazały, że struktura ta utrzymuje żywotność przez 96 godzin, co zapewnia fizjologicznie istotny model 3D do obserwacji krótkich (godzinny zakres) lub dłuższych odpowiedzi komórkowych wywołanych stresem (dni) oraz ich farmakologicznej modulacji. Model sferoidalny składa się z komórek śródbłonka śródwyspkowego MS-1 typu myszy, cech mikronaczyniowych wysepek oraz komórek wydzielających insulinę β komórek, β-TC-68. Został zaprojektowany tak, aby wiernie odwzorować najmniejszy zakres wymiarów wysepek trzustkowych (50-200 μm średnicy) oraz ich średnią liczbę komórek9.

Przedstawiono nowatorską metodę zbierania i barwienia specjalnie zoptymalizowaną do obsługi małych sferoidów (średnica 150-200 μm), umożliwiającą optymalną penetrację fluorescencjowych barwników i przeciwciał przez całą strukturę sferoidalną i minimalne tło. Protokół obejmuje procedurę montażu z wykorzystaniem agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMPA), która zapewnia delikatne wsparcie strukturalne dla delikatnych sferoidów, jednocześnie umożliwiając optymalne dopasowanie współczynnika załamania. LMPA to zmodyfikowana forma agarozy o obniżonej temperaturze żelowania (około 27 °C) i temperaturze topnienia (około 65 °C), która zachowuje integralność próbki podczas osadzania i tworzy optycznie przezroczystą matrycę z minimalną autofluorescencją 4,6. Wreszcie, metoda przezroczystych, niezakłóconych koktajli obrazowania mózg/ciało oraz analizy obliczeniowej (CUBIC)10 jest stosowana do optycznego oczyszczania, umożliwiając maksymalną wizualizację struktur wewnętrznych i zachowanie integralności delikatnych interakcji komórka-komórka 5,6,10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie ludzkiej tkanki trzustkowej oraz wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań rządu Francji (Dyrekcja Generalna ds. Badań i Innowacji, Jednostka Bioetyka) i zarejestrowane pod numerem DC-2019-3439. Uzyskano świadomą zgodę od prawnych opiekunów wszystkich podmiotów.

1. Przygotowanie sferoidów

UWAGA: Linia IEC MS-1 myszy oraz linia komórkowa β-trzustkowa β-TC6 były hodowane równocześnie, aby uzyskać odpowiednią ilość komórek do hodowli sferoidów. MS-1 hodowano w kolbach z przylegającymi komórkami T75 w podłożu DMEM o wysokiej glukozie zawierającej 4,5 g/l glukozy, z 5% surowicy płodowej bydła i 1% penicyliną/streptomycyną w wilgotnej atmosferze przy temperaturze 37 °C. Pobieranie przeprowadzano w konfluencji (2 dni) po odłączeniu przy użyciu trypsyny EDTA 1x i trzech płukań w roztworze Hank Balanced (HBSS). β-TC6 zostały wyhodowane w T75 dla trudno przylegających komórek w DMEM o wysokiej glukozie zawierającej 4,5 g/l glukozy, z 15% surowicy płodowej bydła i 1% penicyliną/streptomycyną w wilgotnej atmosferze w temperaturze 37 °C. Pobieranie przeprowadzono w zbiegu β-TC6 (10-dniowa hodowla) po odłączeniu przez trypsynę EDTA 1x oraz 3 płukania w roztworze Hank Balanced (HBSS).

  1. Przygotuj talerz do hodowli sferoidalnej
  2. Umyj płytkę 500 μL roztworu antyadhezyjnego dostarczonego przez producenta, aby zapobiec adhezji komórek i wspierać tworzenie sferoidów.
  3. Wiruj płytę w 1300 x g przez 5 minut w obrotowym wirniku kubełowym wyposażonym w uchwyty na płyty w temperaturze pokojowej.
  4. Obserwuj płytkę pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że w mikrodołkach nie pozostały żadne pęcherzyki. Jeśli tak, wiruj ponownie w 1300 x g przez 5 minut.
  5. Usuń płukanie antyprzylegające i umyj studnię 3 razy 1 ml ciepłego HBSS.
  6. Usuń HBSS i zastąp go 500 μL ciepłego medium sferoidalnego: DMEM High Glucose zawierający 4,5 g/L glukozy, 10% surowicy bydła płodowego oraz 1% penicyliny/streptomycyny.
  7. Utrzymuj płytę w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze podczas przygotowywania zawieszenia sferoidalnego.
  8. Inkubuj MS-1 i β-TC6 jednocześnie roztworem trypsyny i licz żywe komórki w każdej linii.
    UWAGA: Podczas zasiewania sferoidy tworzą się przy stosowaniu proporcji 1IEC do 20 β komórek typowych dla wysepek trzustkowych. Użyj płyty do hodowli sferoidów z 24 dołkami, z każdą studnią zawierającą 300 mikrodołków, które mogą zawierać jeden sferoid złożony z 2000 komórek, co daje łącznie 600 000 komórek na odwiert. W niniejszym badaniu pomiary wykazały identyczne objętości sferoidów zajmowane przez wybrane linie komórkowe β-TC6 i MS1 po hodowli 48h sferoidalnej.
  9. Wymieszaj obie linie komórkowe tak, aby odpowiadały proporcji 1 do 20 dla 24 dołków, a następnie zawiesz je w 24 mL medium sferoidalnego.
    UWAGA: Użyj pipety o pojemności 10 mL lub 25 mL w ruchu ssąc-przepływ, aby ujednolicić zawiesinę.
  10. Pipetą nałóż 1 mL na każdy odwór i kontynuuj ruch ssą-przepływ, aby równomiernie rozłożyć zawiesinę komórki w dołku.
  11. Wiruj płytę w 130 x g przez 5 minut w obrotowym wirniku kubełowym wyposażonym w uchwyty na płyty, w temperaturze pokojowej.
  12. Obserwuj płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone pomiędzy mikrodoły.
    UWAGA: Podczas tego etapu wirowania należy stosować wysokie tempo przyspieszania i hamowania (70%-90% skal przyspieszenia i hamowania), w przeciwnym razie grudki komórek przesuną się na bok mikrodołku.
  13. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C, 5%CO2.
  14. Monitoruj powstawanie i wzrost sferoidów za pomocą mikroskopu świetlnego.
    UWAGA: Sferoidy β-TC6 / MS-1 powinny zacząć się formować po 24 godzinach hodowli, osiągając kształt kuli po 48 godzinach. Żywotność można monitorować za pomocą trypanowego niebieskiego po rozbiciu sferoidów przez trypsynę w próbkach zduplikowanych i utrzymywała się przez 96 godzin (80%-90%).

2. Zbieranie i barwienie sferoidów

  1. Delikatnie zawiesz sferoidy pipetą P1000 w ich medium.
  2. Wyrzuć sferoidy w małe objętości w 15 mL Falcon i wirować w 130 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej
  3. Delikatnie zasysaj podłoże, unikając granulatu zawierającego sferoidy.
  4. Delikatnie umyj granulek 2 mL HBSS, aby uniknąć dysocjacji sferoidów, i wiruj w 130 x g przez 5 minut.
  5. Pod chemiczną pokrywą wyrzuć HBSS i ponownie zawiesijcie sferoidy w 1 mL roztworu 4% PFA przez noc w temperaturze 4 °C, aby utrwalić.
  6. Wiruj probówkę w 130 x g przez 5 minut, wyrzuć 4% roztwór PFA i przepłucz 3 razy 2 mL 1x PBS (przygotowanej w laboratoryjnej ultraczystej wodzie).
  7. Ponownie zawiesz dawkę po 2,5 ml HBSS.
  8. Rozdaj zawieszenie sferoidowe do płyty z 6 dołkami.
  9. Pod lupą lornetką ręcznie wybierz 20 do 30 sferoidów pipetą P200 i umieść je w probówce o pojemności 1,5 mL.
    UWAGA: Każda probówka o pojemności 1,5 mL to stan barwienia zawierający od 20 do 30 sferoidów. Poniżej 20 zebranych sferoidów trudno je dostrzec, gdy są następnie ponownie zawieszane.
  10. Wyrównaj objętości probówek 1,5 mL i wiruj w 800 x g przez 5 minut.
    UWAGA: Od tego momentu wszystkie etapy aspiracji roztworu wykonywane są z pomocą lupy. Bardzo trudno jest dostrzec sferoidy pod sztucznym światłem. Zawsze wykonuj kolejne kroki w ciągu dnia, trzymając rurki przed światłem dziennym. Wszystkie roztwory są zasyssane z końcówką P1000, na której końcu znajduje się końcówka P10.
  11. Usuń jak najwięcej HBSS bez ponownego zawieszenia sferoidów.
  12. Ponownie zawiesić sferoidy w 400 μL roztworu hartującego (0,5 M glicyny w 1x PBS (pH 7-7,4)), aby uniknąć przyszłych szumów tła spowodowanych pozostałymi aldehydami z wiązania PFA. Inkubuj w 37 °C przez 2 godziny.
  13. Wiruj w 800 x g przez 5 minut i odklejaj roztwór chłodzący.
  14. Ponownie zawiesz 400 μL buforu penetracyjnego (0,2% Triton X-100, 0,3 M glicyny, 20% DMSO w 1x PBS). To pomoże poprawić penetrację przeciwciał i sond jądrowych. Inkubuj w 37 °C przez 2 godziny.
    UWAGA: Od tego etapu sferoidy same osiadają i nie przylegają już do ściany rury. Wirowanie nie jest już konieczne, jeśli objętości są delikatnie zasysane bez zakłócania osadu sferidalnego. Jeśli to konieczne, wiruj w 800 x g przez 5 minut.
  15. Usuń bufor penetracyjny i inkubuj w 400 μL bufora blokującego (0,2% Triton X-100, 1% BSA, 10% DMSO, 5% surowica kozi w 1x PBS) przez noc w temperaturze 37 °C.
  16. Usuń bufor blokujący i inkubuj przez noc w 37 °C w 300 μL roztworu przeciwciał pierwotnych (0,2% Tween 20, 1% BSA, 5% DMSO, 5% surowica kozi w 1x PBS).
    UWAGA: Stosowane główne przeciwciała to: anty-CD31 (końcowe stężenie 2,2 μg/mL), anty-Integrin β1 (1,43 μg/mL), anty-Insulina (0,66 μg/mL) oraz anty-mysie NTPDase311 (rozcieńczenie 1:1000) (patrz Tabela materiałów). Kontrolne IgG odpowiednich identycznych izotypów powinny być walidowane na tej samej strukturze, aby uzyskać pozytywne znakowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
  17. Roztwór przeciwciał pierwotnych wyrzuć i przemyć 3 razy 400 μL buforu do mycia (0,2% Tween 20, 1% BSA w 1x PBS). Potrząsaj przez 5 minut między myciami.
  18. Inkubuj 300 μL roztworu przeciwciał wtórnych (DAPI (2 μg/mL), 0,2% Tween 20, 1% BSA, 5% DMSO, 5% surowica kozia w 1x PBS) przez noc w temperaturze 37 °C. Chronić rurki folią aluminiową.
    UWAGA: DAPI zawsze należy dodawać do warunków barwienia, ponieważ ułatwia to wykrywanie sferoidów podczas mikroskopu i pomaga uniknąć wybielania różnych fluoroforów/barwników. Wszystkie przeciwciała wtórne mają końcowe stężenie 2 μg/mL (patrz Tabela Materiałów).
  19. Roztwór przeciwciał wtórnych wyrzuć i przemyć 3 razy 400 μL z dodatkowego buforu płukania: 0,2% Tween 20, 1% BSA w 1x PBS. Ostatnie pranie i przechowywanie tub w temperaturze 37 °C do montażu tego samego dnia.

3. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotowanie optycznego roztworu oczyszczającego
    UWAGA: Roztwór optycznego czyszczenia stosuje procedurę CUBIC10 i został przygotowany zgodnie z propozycją Gunasingha i in.4. Proporcje składników podaje się w procentach masy końcowego roztworu (w/w), ponieważ Quadrol/N,N,N′,N′-Tetrakis(2-hydroksypropyl) etylendiamina jest zbyt lepka, by ją pipetować i musi być zważona.
    1. W szklanej butelce waż 9% (w/w) N,N,N,N,N′-Tetrakis (2-hydroksypropyl) etylendyminy, 22% (w/w) mocznika, 44% (w/w) sacharozy, 0,1% (w/w) Triton X-100 oraz 24,9% (w/w) laboratoryjnej ultraczystej wody.
      UWAGA: Do czyszczenia płyty z 24 dołkami potrzebne jest około 60 g roztworu.
    2. Dodaj magnetyczny pręt dostosowany do średnicy butelki.
    3. Podgrzej i wymieszaj roztwór do 56 °C. Trzymaj szklaną butelkę kontrolną napełnioną wodą na tej samej płycie, aby monitorować wzrost temperatury.
    4. Kontroluj prędkość mieszania, aby utrzymać gładki wir cieczy i mieszaj roztwór aż wszystkie związki całkowicie się rozpuszczą. Roztwór powinien być całkowicie płynny i przezroczysty. Może to zająć nawet godzinę.
    5. Trzymaj w temperaturze pokojowej, chroniony przed światłem.
      UWAGA: Roztwór oczyszczający musi być przygotowany co najmniej 24 godziny przed optycznym klarowaniem, aby umożliwić odgazowanie roztworu i wyeliminowanie wszelkich bąbelków, które mogą zawierać. Aby uniknąć wprowadzenia bąbelków, nigdy więcej nie potrząsaj roztworem. Nigdy nie przechowuj w chłodni.
  2. Przygotowanie roztworu LMPA o stężeniu 2%
    1. Waż 0,5 g LMPA na precyzyjnej wagi i umieść ją w kolbie Erlenmeyera o pojemności 100 mL.
      UWAGA: Nie bierz mniejszej ilości Erlenmeyera, ponieważ istnieje ryzyko oparzeń, jeśli się przela.
    2. Rozpuszczać w 25 mL 1x PBS w temperaturze pokojowej.
    3. Dokładnie wmieszaj proszek do 1x PBS, delikatnie mieszając kolbkę Erlenmeyera.
      UWAGA: W kolejnym kroku niezbędne jest użycie sprzętu ochronnego: rękawiczek i maseczki na oczy i twarz, aby chronić przed rozpryskami i oparzeniami.
    4. Podgrzej kolbę Erlenmeyera w mikrofalówce.
    5. Obserwuj, kiedy roztwór zaczyna wrzeć (obecność bąbelków w cieczy) i usuń go natychmiast przed przekroczeniem wrzenia.
    6. Delikatnie wymieszaj Erlenmeyera, aby wtopić proszek.
      UWAGA: Nie mieszaj zbyt mocno, bo płyn może się przelać/przegotować i rozpryskiwać.
    7. Wróć Erlenmeyera do mikrofalówki, powtarzaj, aż LMPA całkowicie się rozpuści.
    8. Usuń Erlenmeyera i zanim LMPA się zastygnie, szybko zaniedbać 1 mL roztworu LMPA o pojemności 1,5 mL. Przechowuj w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Proces ten jest czasochłonny. Przygotuj roztwór wcześniej i przechowuj go na późniejsze użycie.

4. Montaż i optyczne oczyszczanie

  1. Nagrzej wirówkę płytową do 40 °C, wykonując długi cykl przygotowania płyty próbki.
    UWAGA: żele LMPA w temperaturze 30 °C. Nie uruchamiaj wirówki poniżej 40 °C. Jeśli wirówka na to pozwala, podnieś temperaturę do 50 °C.
  2. Upłynnij aliquoty o wartości 2% LMPA w kąpieli wodnej lub podgrzewaczu rurkowym w temperaturze 70 °C przez 5 do 10 minut.
  3. Obniż i utrzymuj temperaturę 2% LMPA na poziomie 55 °C.
  4. Delikatnie połóż płytkę obrazującą na podgrzewaczu do płyty, podgrzanym do 50 °C.
    UWAGA: Uważaj, aby nie złamać ani nie porysować delikatnego polimeru używanego jako podstawa do studni.
  5. Uważaj, żeby płyta była gorąca, zanim dodasz 2% LMPA. Na tym etapie nie może się to zgrać.
  6. Pipeta włóż 200 μL 2% LMPA do każdego otworu. Okryj całe dno podpór, aby uzyskać pierwszą cieczą podstawę, która pozwala na bardziej płynne rozłożenie sferoidów.
  7. Usuń bufor płukający z rurek, ponownie zawiesij sferoidy w 300 μL 2% LMPA i pipetuj je bezpośrednio do studni. Zawsze stosuj delikatną respensję, aby uniknąć powstawania bąbelków.
  8. Przykryj płytę folią aluminiową, aby chronić fluorofory.
  9. Szybko zważ płytkę bez folii aluminiowej i odłóż ją do podgrzewacza.
  10. Przygotuj płytkę z 24 dołkami, dodając wodę dla równowagi.
  11. Szybko usuń płytkę z folią aluminiową z podgrzewacza, aby chronić fluorofory sprzężone z przeciwciałami wtórnymi. Trzymaj w ręku, nie kładz na zimnej powierzchni.
  12. Usuń folię aluminiową i umieść ją w wirówce płytowej.
  13. Wiruj w 1000 x g przez 15 minut w 40 °C. Sprawdź temperaturę wirnika, która powinna być w temperaturze pokojowej.
  14. Podczas wirowania przygotuj tackę na lód: spłaszcz lód, aby płytka mogła być położona na płaskiej powierzchni.
  15. Zdejmij talerz i połóż go na lodzie, przykrywając tacę lub talerz folią aluminiową. Zostaw talerz na lodzie na 10 minut.
  16. Wyjmij płytkę z lodu i zostaw ją w aluminium, aby ustabilizowała się w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  17. Pipetą napij 1 do 1,5 ml roztworu oczyszczającego na dołek, przykryj folią aluminiową i pozostawij do optycznie przezroczystej temperatury pokojowej, chronionej przed światłem, przez co najmniej 48 godzin.
    UWAGA: Nigdy nie przechowuj talerza w temperaturze 4 °C. LMPA może się kurczyć, odłączyć od dna odwiertu i unosić się w roztworze oczyszczającym. Zdjęcie w ciągu tygodnia od wyczyszczenia.

5. Obrazowanie

  1. Użyj konfokalnego mikroskopu dyskowego z obrotowym obracaniem, wybierz (co najmniej) obiektyw 30x.
  2. Zachowaj roztwory oczyszczające, ponieważ pomagają one ujednolicić współczynniki załamania i ułatwiają obrazowanie 3D.
  3. Znajdź sferoidy, wybierając kanał DAPI, aby uniknąć wybielania pozostałych fluoroforów.
  4. Pobieranie obrazów za pomocą funkcji stosu Z. Wybierz górę i dół sferoidu i odstaw optycznych przekrojów co 10 μm.
    UWAGA: Akwizycja i analiza obrazów zostały wykonane na platformie obrazowania CRBS, PIC-STRA UMS 38, Inserm, Unistra.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ocenić skuteczność oznakowania i optycznego czyszczenia, kilka modeli poddano temu samemu protokołowi, a następnie zostało naprawionych (Rysunek 1). Sferoidy o stosunkach 1 IEC do 20 β-komórek oraz 1 IEC do 50 β-komórek hodowano zgodnie z opisaną powyżej metodą. Warto zauważyć, że stosunek 1 IEC do 20 β komórek przybliża stosunek ludzkiej wysepki trzustkowej. Użycie trypanowego niebieskiego do barwienia uszkodzonych sferoidów potwierdziło, że utrzymują one żywotne komórki (80-90% żywych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano model sferoidalny wykorzystujący MS-1 mysie komórki IEC oraz β myszy β-TC6, naśladujący trójwymiarową strukturę wysepek trzustkowych. Model ten nadaje się do analizy dysfunkcji IEC wywołanej stresem w ciągu 72 godzin oraz jej wpływu na żywotność i funkcjonowanie β komórek, ze znaczeniem dla badań nad transplantacją wysepek. Co ważne, sferoid zbudowany z komórek myszy był jednorodny i posiadał odpowiednią linię śródbłonkową wewnątrzwyspy.

Znaczącym osiągnięciem jest opracowanie i wal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni Pascalowi Kesslerowi z platformy obrazowania PICSTRA za ekspercką pomoc w mikroskopii dyskowej obrotowej oraz ekstrakcji surowych danych etykietowania ze stosu Z. Autorzy pragną wyrazić uznanie za dar oczyszczonych ludzkich wysepek od dr. W. Bietigera, dr. A. Langloisa i dr. K. Bouzakriego z Europejskiego Centrum Badań nad Cukrzycą (CEED, Strasburg, Francja)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
µ-płytka 24 dołka ID 14 mm IBIDI82426
AggreWell 800 (24 odwierty)StemCell34815
Roztwór antyadherencyjny StemCell7010
Przeciwciało przeciw CD31 [P2B1]abcamab24590Końcowe stężenie 2,2&mikro; g/mL
Anti-Integrin i beta; 1 Przeciwciało, klon MB1.2MerckMAB1997 Końcowe stężenie 1,43&mikro; g/mL
Kolba do hodowli komórek, T-75, powierzchnia, powierzchnia : Komórka+, nakrętka filtraSarstedt83.3911.302β-kultura TC6
Kolba do hodowli komórek, T-75, powierzchnia: Standardowa, dwupozycyjna zakrętkaSarstedt83.3911.02Kultura MS-1
Dihydrochlorek DAPIThermofisher,D1306Końcowa koncentracja 2&mikro; g/mL
Dimetylsulfotlenek SigmaD8418-250ML
DMEM, wysoki poziom glukozy, GlutaMAX i trade; Suplement, piruwinianThermofischer scientific31966047
Dulaglutyd
DulaglutydLillyPen Trulicity 1,5 mg
Serum bydlęce płodoweBiowestS1810-500
GlycineSigmaG7126-1KG
przeciwciało przeciwkozie przeciw koziemu świnkowi IgG (H+L) o silnej krzyżowej adsorbcji, Alexa Fluor™ 555ThermofischerA21435Końcowa koncentracja 2&mikro; g/mL
przeciwciało przeciwwtórne przeciwciało przeciw myszom kozie (H+L) – wysoce krzyżowo adsorbowane przeciwciało wtórne, Alexa Fluor™ 488Thermofischer  A-11029Końcowa koncentracja 2&mikro; g/mL
przeciwciało przeciwtorowe przeciwko kozom antykróliczym (H+L) – wysoce krzyżowo adsorbowane przeciwciało wtórne, Alexa Fluor™ 633ThermofischerA-21071Końcowa koncentracja 2&mikro; g/mL
przeciwciało przeciwwtórne przeciwciało przeciw IgG (H+L) przeciwciału przeciw współzazębianym przeciwko kozom, Alexa Fluor™ 555ThermofischerA21434Końcowa koncentracja 2&mikro; g/mL
Serum koziegoSigmaS26-100ML
HBSS bez wapnia i magnez  & Fenol RedCorning21-022-CV
Insulina (C27C9) Królik mAbSygnalizacja komórkowa3014SKońcowe stężenie 0,66&mikro; g/mL
Odizolowana ludzka wysepka trzustkowa Centrum Europy i Eacute; en d'Etude du Diabete (CeeD)Miły prezent od dr Karima Bouzakriego. Stopień kliniczny, izolowany zgodnie z wytycznymi.
Niska temperatura żelowania AgarozaMerckA9414-10G
Ogniwa MS-1ATCCCRL-2279
Roztwór paraformaldehydu, 4% w PBS 1xFischer scientific15670799
PBS 10xEuromedexET330-ARozcieńczony 1x w laboratoryjnej ultraczystej wodzie
Penicylina-StreptomycynaPAN BiotechP06-07100
Poliklonalne przeciwciała anty-mysie świnki morskie NTPDase3 mN3-1CI4; mN3-2C(I4,I5); mN3-3C(I4,I5)  https://ectonucleotidases-ab.com/Antibodies.phpRozcieńczenie 1:1000
Quadrol/N,N,N′,N′-Tetrakis (2-hydroksypropyl) etylendiamina  Sigma122262-1L
Wirujący dysk Olympus IXplore SPIN Olympus Scientific Solutions
Sacharoza dla biologii molekularnejSigmaS0389-1KG 
Triton X-100 Laboratoryjna Jakość BiologicznaEuromedex2000-A
Trypsyna/EDTA (10x)PAN BiotechP10-025100
Tween-20Euromedex//
MocznikSigmaU-5128
β-komórki TC6ATCCCRL-11506

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langlois, A., Pinget, M., Kessler, L., Bouzakri, K. Islet transplantation: Current limitations and challenges for successful outcomes. Cells. 13 (21), 1783(2024).
  2. Li, X., Meng, Q., Zhang, L. The fate of allogeneic pancreatic islets following intraportal transplantation: Challenges and solutions. J Immunol Res. 2018, 1-13 (2018).
  3. Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Front Mol Biosci. 7, 20(2020).
  4. Gunasingh, G., Browning, A. P., Haass, N. K. Rapid optical clearing for semi-high-throughput analysis of tumor spheroids. J Vis Exp. 2022 (186), e64103(2022).
  5. Paysan, J. The art of tissue clearing. , John Wiley & Sons Ltd. West Sussex. (2021).
  6. Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnol Bioeng. 116 (10), 2742-2763 (2019).
  7. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369(2021).
  8. Poitout, V., et al. Morphological and functional characterization of βTC-6 cells: An insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
  9. Ionescu-Tirgoviste, C., et al. A 3D map of the islet routes throughout the healthy human pancreas. Sci Rep. 5 (1), 14634(2015).
  10. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  11. Munkonda, M. N., et al. Characterization of a monoclonal antibody as the first specific inhibitor of human NTP diphosphohydrolase-3: partial characterization of the inhibitory epitope and potential applications. FEBS J. 276 (2), 479-496 (2009).
  12. Sbat, N. Study of the endothelial-to-mesenchymal transition of intra-islet endothelial cells in mice and its pharmacological modulation: Relevance for pancreatic islet transplantation. , Université Paris Cité. https://theses.hal.science/tel-03873595 (2021).
  13. Barillaro, M., Schuurman, M., Wang, R. β1-integrin: A key player in controlling pancreatic beta-cell insulin secretion via interplay with SNARE proteins. Endocrinology. 164 (1), bqac179(2023).
  14. Lavoie, E. G., et al. Identification of the ectonucleotidases expressed in mouse, rat, and human Langerhans islets: potential role of NTPDase3 in insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 299 (4), E647-E656 (2010).
  15. Giuliani, A. L., Sarti, A. C., Di Virgilio, F. Ectonucleotidases in acute and chronic inflammation. Front Pharmacol. 11, 619458(2021).
  16. Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-3 antibody targets adult human pancreatic β cells for in vitro and in vivo analysis. Cell Metab. 29 (3), 745-754.e4 (2019).
  17. Syed, S. K., et al. Ectonucleotidase NTPDase3 is abundant in pancreatic β-cells and regulates glucose-induced insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (10), E1319-E1326 (2013).
  18. Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868(2012).
  19. Rane, T. D., Armani, A. M. Two-photon microscopy analysis of gold nanoparticle uptake in 3D cell spheroids. PLoS One. 11 (12), e0167548(2016).
  20. Alzeeb, G., et al. Gastric cancer multicellular spheroid analysis by two-photon microscopy. Biomed Opt Express. 13 (5), 3120(2022).
  21. Diosdi, A., et al. Single-cell light-sheet fluorescence 3D images of tumour-stroma spheroid multicultures. Sci Data. 12 (1), 492(2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model sferoid w wyspkowychinterakcja z kom rkami r db onkainterakcja z kom rkami betaobrazowanie 3Dwyspki trzustkowescreening cytoprotekcyjnyhodowla sferoid wklarowanie CUBICkom rki wydzielaj ce insulinagaroza niskotopliwa

Powiązane artykuły