Artykuł metodologiczny

Identyfikacja gatunków prątków za pomocą metody mikromacierzy DNA

DOI:

10.3791/68234

⸱

24 czerwca 2025

 ,  ,  ,  , 
1Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy metodę mikromacierzy DNA do identyfikacji gatunków prątków , która poprawi dokładność diagnostyczną i skuteczność powiązanych chorób do użytku klinicznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W pracy przedstawiono metodę chipowania mikromacierzy DNA przeznaczoną do dokładnej identyfikacji gatunków Mycobacterium . Wykorzystując zasady asymetrycznej amplifikacji i hybrydyzacji PCR, metoda ta jest ukierunkowana na 17 powszechnych prątków, w tym te z kompleksu Mycobacterium tuberculosis i różne prątki niegruźlicze. Ma zastosowanie do szerokiej gamy próbek klinicznych, takich jak plwocina, ropa, płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, płyn mózgowo-rdzeniowy i płyn nakłuwczy od pacjentów podejrzanych o choroby prątków. Test polega na amplifikacji sekwencji docelowych w genomie Mycobacterium poprzez asymetryczny PCR, a następnie hybrydyzację z sondami na chipie mikromacierzy. Unikalny układ sond (powtarzane 5x w mikroukładzie 12 rzędów x 10 kolumn) oraz zastosowanie sond sterujących zwiększają jego niezawodność. Badania kliniczne z udziałem 1 724 próbek wykazały wysoką wydajność. Metoda osiągnęła 100% swoistość kliniczną, czułość i ogólną zgodność w porównaniu z wynikami sekwencjonowania, z wyjątkiem dwóch rzadkich próbek prątków niegruźliczych, które wykraczają poza zakres wykrywania. Ta metoda mikromacierzy DNA oferuje znaczną poprawę w porównaniu z tradycyjnymi technikami diagnostycznymi, skracając czas diagnozy i zapewniając bardziej kompleksowe wykrywanie, a tym samym ma ogromny potencjał w diagnostyce i leczeniu chorób prątków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium, rodzaj bakterii, obejmuje zróżnicowaną grupę organizmów o znaczącym wpływie na zdrowie ludzi i zwierząt. Mycobacterium tuberculosis, czynnik wywołujący gruźlicę (TB), jest od dawna globalną plagą zdrowotną. Pomimo dziesięcioleci wysiłków w zakresie profilaktyki i leczenia, gruźlica pozostaje poważnym zagrożeniem dla zdrowia publicznego, odpowiedzialnym za oszałamiającą liczbę rocznych zgonów i nowych zakażeń na całym świecie 1,2. Prątki niegruźlicze (NTM) są również coraz częściej uznawane za ważne patogeny, zwłaszcza w określonych populacjach pacjentów i środowiskach.

Dokładna identyfikacja gatunków Mycobacterium jest podstawą skutecznego zarządzania chorobą 3,4. Tradycyjne metody diagnostyczne mają nieodłączne ograniczenia. Techniki oparte na kulturze, na których historycznie polegano, są notorycznie czasochłonne. Proces izolacji i hodowli prątków może trwać od tygodni do miesięcy, podczas których pacjenci mogą doświadczyć postępu choroby i potencjalnego przeniesienia na inne osoby. Co więcej, niektóre gatunki prątków są niezwykle trudne do hodowli, co prowadzi do wyników fałszywie ujemnych oraz opóźnionego lub nieprawidłowego leczenia 5,6.

Barwienie kwasoodporne, inna powszechnie stosowana metoda, może zidentyfikować prątki na podstawie ich unikalnych właściwości ściany komórkowej, które są odporne na odbarwienie. Brakuje mu jednak specyficzności, która pozwoliłaby na rozróżnienie różnych gatunków prątków , zapewniając jedynie szerokie wskazanie na obecność prątków7. Metody molekularne, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), pojawiły się jako alternatywy dla przezwyciężenia niektórych z tych wad. PCR może wykrywać DNA prątków szybciej niż metody hodowlane, umożliwiając szybszą diagnozę. Jednak konwencjonalne testy PCR zazwyczaj są ukierunkowane na ograniczoną liczbę genów i mogą nie zapewniać kompleksowej identyfikacji gatunków, zwłaszcza gdy mamy do czynienia z blisko spokrewnionymi gatunkami Mycobacterium 5.

Technologia mikromacierzy DNA zrewolucjonizowała dziedziny mikrobiologii i diagnostyki. Oferuje możliwość jednoczesnej analizy wielu celów genetycznych, zapewniając bardziej wszechstronny i szczegółowy obraz populacji drobnoustrojów 8,9. Niedawne badania w tej dziedzinie jeszcze bardziej naświetliły potencjał i znaczenie zaawansowanych technik molekularnych w identyfikacji prątków. Na przykład badanie przeprowadzone przez Wanga i wsp.10 wykazało zwiększoną czułość i swoistość zmodyfikowanego chipa mikromacierzy DNA w wykrywaniu rzadkich gatunków Mycobacterium w warunkach klinicznych. Ich odkrycia podkreśliły wartość ciągłej optymalizacji technologii mikromacierzy. Inne badanie przeprowadzone przez Wanga i współpracownikówkoncentrowałosię na integracji danych z mikromacierzy DNA z wynikami klinicznymi u pacjentów z gruźlicą. Wyniki dostarczyły informacji na temat wartości prognostycznej dokładnej identyfikacji gatunków Mycobacterium oraz potencjału medycyny spersonalizowanej.

Zasada testowania
Ten zestaw wykorzystuje technologię chipów mikromacierzy DNA w połączeniu z zasadami amplifikacji i hybrydyzacji asymetrycznej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu identyfikacji gatunków Mycobacterium . Zestaw zawiera chip do identyfikacji gatunku Mycobacterium oraz asymetryczne odczynniki do amplifikacji PCR. Chip jest przymocowany do specyficznych dla gatunku sond do wykrywania i identyfikacji gatunków Mycobacterium . Cele wykrywania obejmują 17 klinicznie powszechnych gatunków lub grup, takich jak kompleks Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium avium, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium terrae, Mycobacterium chelonae i Mycobacterium abscessus, Mycobacterium phlei, Mycobacterium nonchromogenicum, Mycobacterium marinum i Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium aurum, Mycobacterium szulgai i Mycobacterium malmoense, Mycobacterium xenopi i Mycobacterium smegmatis.

Wykrycie tych 17 gatunków prątków ma kluczowe znaczenie dla dokładnej diagnozy klinicznej i dostosowanego do potrzeb leczenia pacjenta. Kompleks Mycobacterium tuberculosis (MTBC) jest traktowany priorytetowo ze względu na jego rolę w gruźlicy, co wymaga natychmiastowej izolacji i terapii wielolekowej w celu ograniczenia transmisji i rozwiązania problemu oporności na leki. Gatunki z grupy Mycobacterium avium-intracellulare complex (MAC), takie jak M. avium i M. intracellulare, atakują głównie osoby z obniżoną odpornością (np. HIV/AIDS) lub osoby z przewlekłą chorobą płuc, wymagające długotrwałych schematów opartych na makrolidach. Szybko rosnące prątki (RGM), takie jak M. abscessus i M. fortuitum , są znane z oporności na antybiotyki i często powodują poważne infekcje skóry, tkanek miękkich lub płuc, co wymaga agresywnych kombinacji chirurgii i ukierunkowanych antybiotyków (np. amikacyny, makrolidów). Gatunki środowiskowe, takie jak M. gordonae lub M. smegmatis , są częstymi zanieczyszczeniami, ale mogą powodować infekcje oportunistyczne w określonych kontekstach, co wymaga starannej korelacji klinicznej, aby uniknąć niepotrzebnego leczenia. Patogeny, takie jak M. marinum (związany z narażeniem wodnym) i M. ulcerans (powodujący wrzód Buruli) mają odrębne nisze epidemiologiczne, które kierują oceną historii narażenia. Rzadkie, ale klinicznie istotne gatunki (np . M. szulgai, M. malmoense) naśladują gruźlicę i wymagają schematów specyficznych dla danego gatunku. Dokładna identyfikacja ma kluczowe znaczenie, ponieważ czas trwania leczenia, wybór leku (np. wrażliwość na ryfampicynę u M. kansasii w porównaniu z wewnętrzną opornością u NTM) i rokowanie różnią się drastycznie. Diagnostyka molekularna i testy wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe są niezbędne do optymalizacji wyników, szczególnie w populacjach z obniżoną odpornością lub złożonych infekcjach.

Po pierwsze, sekwencje docelowe w genomie Mycobacterium są amplifikowane za pomocą asymetrycznego PCR. Następnie amplifikowane produkty są hybrydyzowane z sondami na chipie. Jeśli docelowy prątek jest obecny w próbce, amplifikowane produkty specyficznie zwiążą się z odpowiednimi sondami na chipie. Wreszcie, skanując sygnały hybrydyzacji na chipie, można określić gatunek Mycobacterium w próbce.

Za pomocą technologii mikromacierzowania chipów genowych na podłożu mocowane są specjalne sondy do wykrywania wyżej wymienionych genów oraz różne sondy kontrolne. Każda sonda detekcyjna i sonda sterująca są powtarzane 5x, tworząc mikromacierz 12 rzędów x 10 kolumn. Układ sond pokazano na rysunku 1. Każdy chip zawiera cztery identyczne mikromacierze, a każda mikromacierz może wykryć jedną próbkę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Pierwszego Szpitala Quanzhou Stowarzyszonego z Uniwersytetem Medycznym Fujian (Zatwierdzenie nr 2024-K035). Przed pobraniem próbek klinicznych uzyskano świadomą zgodę od wszystkich pacjentów. Pacjenci zostali poinformowani o celu badania, związanych z nim procedurach oraz o prawie do wycofania się w dowolnym momencie bez wpływu na ich opiekę medyczną.

1. Wymagania dotyczące próbek

UWAGA: Podczas pobierania próbek od pacjentów z klinicznie podejrzaną gruźlicą i chorobami prątków niegruźliczych (NTM) do testów za pomocą tego zestawu, należy wykonać następujące kroki:

  1. Pobrać od pacjentów próbki, takie jak plwocina, ropa lub wydzielina, płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, płyn do nakłuwania (w tym płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn opłucnowy i otrzewnowy, płyn osierdziowy, płyn stawowy i żółć) oraz mocz.
    1. W przypadku próbek plwociny:
      1. Poinstruuj pacjenta, aby rano przepłukał usta czystą wodą, a następnie odkrztusił głęboką plwocinę do sterylnego pojemnika do przechowywania próbek, zamknął go i wysłał do testu.
      2. Dodaj 1-2x objętość 4% NaOH, wstrząśnij i równomiernie wymieszaj.
      3. Po 15-20 minutach dodać równą objętość buforu fosforanowego o pH 6,8 i równomiernie wymieszać.
      4. W temperaturze pokojowej odwirować przy 2 000 × g przez 15 minut i odrzucić supernatant. Dodać 1 ml 0,9% NaCl za pomocą pipety i dokładnie wymieszać; Służy do wykrywania.
    2. Dla próbek ropy lub wydzieliny:
      1. Spłucz powierzchnię sterylną solą fizjologiczną. Zbierz ropę lub wydzielinę sterylnym wacikiem, zapieczętuj ją i wyślij do testów.
      2. Dodaj 3x objętość 4% NaOH i dokładnie wstrząśnij, aby dobrze wymieszać.
      3. Odstawić w temperaturze pokojowej na 20 minut (w tym czasie wstrząsnąć ręcznie 2x), odwirować w temperaturze 2 000 × g w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie wyrzucić supernatant. Dodaj 1 ml 0,9% NaCl za pomocą pipety i równomiernie wymieszaj; Służy do wykrywania.
    3. W przypadku płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego:
      1. Wstrzyknąć 10-20 ml soli fizjologicznej przez chronioną rurkę do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (PBAL).
      2. Zbierz próbkę do sterylnej butelki przez odsysanie podciśnieniowe i wyślij ją do testu.
    4. Dla płynu mózgowo-rdzeniowego:
      1. Pobrać co najmniej 2 ml próbki z zachowaniem zasad aseptyki.
      2. Wirować przy 2 000 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant. Dodać 1 ml 0,9% roztworu chlorku sodu za pomocą pipety, dokładnie wymieszać i użyć do testów.
    5. W przypadku próbek moczu:
      UWAGA: Zaleca się użycie pierwszej pełnej ilości moczu rano lub moczu w środku i późno w nocy. Mocz można również pobrać przez cewnikowanie.
      1. Pobrać próbkę do sterylnego pojemnika i odstawić pobraną próbkę moczu na 4-5 godzin.
      2. Wirować przy 2 000 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant. Dodać 1 ml 0,9% roztworu chlorku sodu za pomocą pipety, dokładnie wymieszać i użyć do testów.
  2. Przechowywanie próbek
    UWAGA: Próbki na podłożu stałym nie powinny być przechowywane w stanie zamrożonym, ponieważ zamrożenie może wpłynąć na kolejne operacje.
    1. Próbki znajdujące się w ciekłym podłożu należy przechowywać w temperaturze -70 °C nie dłużej niż 5 lat.
    2. Wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze 2–8 °C nie dłużej niż 2 miesiące.
  3. Transport próbek
    1. Podczas transportu próbek testowych należy pamiętać o użyciu zamkniętego pojemnika, który spełnia wymogi bezpieczeństwa biologicznego w warunkach dozwolonych przez przepisy.

2. Przygotowanie do eksperymentu

  1. Przygotowanie roztworów do mycia wiórów
    UWAGA: Przygotuj roztwór do mycia wiórów I i roztwór do mycia wiórów II w zależności od liczby wiórów. Objętość powinna być taka, aby wióry można było całkowicie zanurzyć podczas prania. Wymieszaj je równomiernie i zrównoważ do temperatury pokojowej (10-30 °C). Końcowe stężenie SSC wynosi 2x, a końcowe stężenie SDS wynosi 0,2%.
    1. Aby przygotować roztwór do płukania wiórów I, wymieszaj 20x SSC, wodę destylowaną (lub wodę oczyszczoną) i 10% SDS w stosunku 10:88:2 w kolejności, aby przygotować roztwór do płukania wiórów I. Na przykład, przygotowując całkowitą objętość 600 ml, najpierw odmierz 60 ml 20x SSC i 528 ml wody destylowanej (lub wody oczyszczonej) i umieść je w zlewce o pojemności 1 l i równomiernie wymieszaj za pomocą mieszadła. Następnie dodaj 12 ml 10% SDS i ponownie równomiernie wymieszaj.
    2. Aby przygotować roztwór do płukania wiórów II: Końcowe stężenie SSC wynosi 0,2x. Wymieszaj 20x SSC i wodę destylowaną (lub wodę oczyszczoną) w stosunku 1:99, aby uzyskać roztwór do płukania wiórów II. Biorąc za przykład przygotowanie całkowitej objętości 600 ml, odmierz 6 ml 20x SSC i 594 ml wody destylowanej (lub wody oczyszczonej) i umieść je w zlewce o pojemności 1 l i równomiernie wymieszaj.
      UWAGA: Jeśli w 10% roztworze SDS wytrąci się biały kłaczkowaty, podgrzej go w temperaturze 50 °C, dokładnie wymieszaj, a następnie przygotuj bufor do przemywania mikromacierzy. Jeśli w Wash Buffer I wydobędą się białe kłaczkowate osady, podgrzej go w temperaturze 50°C, dokładnie wymieszaj, zrównoważ do temperatury pokojowej przed użyciem.
  2. Przygotuj 350 ml mieszaniny lodu i wody.
  3. Przygotuj wodę destylowaną (lub wodę oczyszczoną).

3. Przygotowanie przyrządów i materiałów

  1. Wybór i konfiguracja instrumentów
    1. Zidentyfikuj i przygotuj skaner chipów z mikromacierzą, upewniając się, że jest skalibrowany i gotowy do użycia.
    2. Skonfiguruj przyrząd do ekstrakcji kwasów nukleinowych, sprawdzając jego funkcje i ładując niezbędne odczynniki.
    3. Umieść pudełko do hybrydyzacji chipa mikromacierzy genowej w odpowiednim miejscu i potwierdź jego prawidłowy stan pracy.
  2. Przygotowanie narzędzi do pipetowania
    1. Zbierz mikropipety o parametrach 0,1-10 μl, 2-20 μl i 20-200 μl wraz z odpowiadającymi im czystymi i sterylnymi końcówkami do pipet. Upewnij się, że mikropipety są dokładnie skalibrowane, a końcówki są prawidłowo dopasowane.
  3. Rozmieszczenie wyposażenia pomocniczego
    1. Przygotować łaźnię wodną o stałej temperaturze i ustawić ją na wymaganą temperaturę (50 °C).
    2. Ustaw mikrowirówkę zdolną do odwirowania probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i sprawdź jej ustawienia równowagi i prędkości.
    3. Na stojakach na probówki wirówkowe należy uporządkować czyste i sterylne probówki wirówkowe (200 μl i 1,5 ml) oraz opcjonalnie czyste i sterylne paski ośmiodołkowe (200 μl).
  4. Gotowość sprzętu do obsługi próbek
    1. Umieść wytrząsarkę o stałej temperaturze w dogodnym miejscu i ustaw odpowiednie parametry wytrząsania.
    2. Odłóż na bok dwa pojemniki do mycia frytek i upewnij się, że są czyste i suche.
    3. Ułóż stojaki na szkiełka i wirówkę, a pod ręką miej pojemnik do wirowania i suszenia wiórów.
  5. Przygotowanie wzmacniacza PCR
    1. Włącz wzmacniacz PCR i zaprogramuj go zgodnie z protokołem eksperymentalnym, upewniając się, że jest gotowy do przeprowadzenia reakcji amplifikacji.

4. Ekstrakcja kwasów nukleinowych

UWAGA: Wykonaj operację w obszarze przygotowania próbki i wykonaj następujące kroki:

  1. Preparat
    1. Dodać 80 μl roztworu do ekstrakcji kwasów nukleinowych do probówki do ekstrakcji kwasów nukleinowych i dodać 1 ml 0,9% NaCl.
  2. Pobieranie izolowanych próbek
    1. Aby rozpocząć pobieranie próbek, należy zbadać źródło próbek, czy pochodzą one z podłoża stałego, czy płynnego.
    2. Aby pobrać próbki pożywki stałej, użyj sterylnej pętli inokulacyjnej, aby wybrać widoczną kolonię z odpowiedniej pożywki stałej. Jeśli bakterie rozrosły się, pokrywając całe podłoże, wybierz odpowiednią ilość trawnika bakteryjnego. Ostrożnie umieść go w probówce do ekstrakcji kwasów nukleinowych zawierającej roztwór do ekstrakcji kwasów nukleinowych, uważając, aby w jak największym stopniu nie wybierać stałego podłoża.
    3. W przypadku próbek z ciekłym podłożem należy odessać 10-20 μl zawiesiny bakteryjnej o zmętnieniu równym lub większym niż 1 wzorzec McFarlanda. Wstrzyknąć go do probówki do ekstrakcji kwasów nukleinowych zawierającej roztwór do ekstrakcji kwasów nukleinowych.
      UWAGA: Po pobraniu próbki, niezależnie od tego, czy pochodzi ona z podłoża stałego, czy ciekłego, próbki są gotowe do kolejnej operacji ekstrakcji kwasami nukleinowymi.
  3. Ekstrakcja kwasów nukleinowych
    1. Po dodaniu próbek poddanych wstępnej obróbce lub wyizolowaniu próbek z kroku 1.1 wspomnianego powyżej, użyj przyrządu do szybkiej ekstrakcji kwasów nukleinowych do ekstrakcji kwasów nukleinowych. Wyekstrahowane kwasy nukleinowe należy umieścić w temperaturze -20 °C w celu tymczasowego przechowywania.
      UWAGA: Jako wskaźnik wydajności ekstrakcji, automatyczny ekstraktor może ekstrahować próbki z ładunkiem wirusowych kwasów nukleinowych większym niż 100 kopii/ml. Okres czasowego składowania nie powinien przekraczać 2 miesięcy.

5. Amplifikacja PCR

  1. Przygotowanie systemu reakcyjnego PCR
    1. W obszarze przechowywania i przygotowania odczynników należy przygotować probówki wirówkowe o pojemności 200 μl lub paski ośmiodołkowe w zależności od liczby próbek, które mają być badane, i wcześniej zaznaczyć numery próbek. Wyjmij odczynniki do amplifikacji PCR z zestawu, pozwól im się rozmrozić i stopić w naturalny sposób, delikatnie wstrząśnij i równomiernie wymieszaj, a następnie szybko odwiruj, aby odczynniki zebrały się na dnie probówek.
    2. W zależności od liczby próbek, podwielokrotność odczynników do amplifikacji PCR rozdać na 200 μl probówek wirówkowych lub ośmiodołkowych pasków w objętości 18 μl na probówkę. Szczelnie zamknij nakrętki probówek, a następnie przenieś je do obszaru przygotowania mieszaniny do reakcji amplifikacji i amplifikacji.
    3. Dodać 2 μl matrycowego DNA (DNA próbki, która ma być badana (tj. supernatant w probówce do ekstrakcji kwasów nukleinowych), produktów kontroli dodatniej lub produktów kontroli ujemnej) w obszarze przygotowania próbki. Upewnij się, że całkowita objętość każdego układu reakcyjnego PCR osiągnie 20 μl.
      UWAGA: Używaj produktów kontroli dodatniej i produktów kontroli ujemnej za każdym razem podczas amplifikacji. Produkt kontroli dodatniej może być stosowany do kontroli jakości w procesach amplifikacji i hybrydyzacji PCR, a produkt kontroli ujemnej może być stosowany do monitorowania środowiska i procesu operacyjnego.
  2. Wzmocnienie
    1. Umieść probówki wirówkowe lub ośmiodołkowe paski zawierające odczynniki w przyrządzie do amplifikacji PCR. Upewnij się, że przyrząd jest wstępnie nagrzany do wymaganej temperatury. Przeprowadzić reakcję amplifikacji PCR zgodnie z następującym programem cykli termicznych: wstępna denaturacja w temperaturze 94 °C przez 600 s (1 cykl); 35 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 30 s, wyżarzania w temperaturze 60 °C przez 30 s i przedłużania w temperaturze 72 °C przez 40 s; końcowe przedłużenie w temperaturze 72°C przez 420 s (1 cykl); utrzymywać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony (1 cykl).

6. Hybrydyzacja chipów

UWAGA: Przed zakończeniem reakcji amplifikacji PCR należy wykonać następujące czynności:

  1. Ustawić temperaturę łaźni wodnej o stałej temperaturze na 50 °C i podgrzać ją.
  2. Przygotowanie frytek
    1. Dodaj 200 μl wody destylowanej (lub wody oczyszczonej, jak pokazano na rysunku 2A) na dno pudełka do hybrydyzacji chipów mikromacierzy genowej. Umieść wspornik między dwiema kolumnami pozycjonującymi wewnątrz pudełka.
    2. Ostrożnie umieść chip przednią stroną do góry na wsporniku i przykryj chip szkiełkiem nakrywkowym czterema występami skierowanymi w dół (jak pokazano na rysunku 2B).
      UWAGA: Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe jest prawidłowo umieszczone, tak aby jego koniec pokrywał się z etykietą na końcu chipa.
  3. Przygotowanie, denaturacja i chłodzenie mieszaniny reakcyjnej hybrydyzacji
    1. Przygotować probówki wirówkowe o pojemności 200 μl lub paski ośmiodołkowe w zależności od liczby próbek i odpowiednio je oznaczyć.
    2. Wyjąć bufor hybrydyzacyjny z zestawu i podgrzać go w temperaturze 50 °C, aż do całkowitego stopienia. Po dokładnym wymieszaniu szybko odwiruj go w mikrowirówce. Porcję 9 μl buforu hybrydyzacyjnego do każdej przygotowanej probówki wirówkowej o objętości 200 μl lub ośmiodołkowego paska. Następnie dodaj 6 μl odpowiedniego produktu PCR do każdej probówki, co daje całkowitą objętość 15 μl na mieszaninę reakcji hybrydyzacji.
    3. Podgrzać mieszaninę do reakcji hybrydyzacji (łącznie z buforem do hybrydyzacji i produktem PCR) do temperatury 95 °C (w przyrządzie do PCR lub łaźni wodnej) i poddać jej denaturacji przez 5 minut. Wyjąć mieszaninę reakcyjną hybrydyzacji, która została poddana zabiegowi denaturacji w poprzednim kroku i natychmiast zanurzyć ją w mieszaninie lodowato-wodnej na 3 minuty.
  4. Reakcja hybrydyzacji
    1. Wyjmij mieszaninę reakcyjną hybrydyzacji z łaźni lodowej, pipetuj ją 2x w górę i w dół za pomocą mikropipety, aby równomiernie wymieszać. Po zniknięciu białego osadu kłaczkowego (jeśli występuje) dodać 13,5 μl mieszaniny reakcji hybrydyzacji przez otwór załadowczy szkiełka nakrywkowego (jak pokazano na rysunku 2C), szybko przykryć pudełko do hybrydyzacji i zamknąć je (jak pokazano na rysunku 2D). Zapisz numer chipa, położenie mikromacierzy i odpowiadający mu numer próbki.
      UWAGA: Do każdej mikromacierzy można dodać tylko jedną próbkę.
    2. Natychmiast umieścić zamknięte pudełka do hybrydyzacji poziomo w łaźni wodnej o stałej temperaturze, która została wstępnie podgrzana do 50 °C. Uruchom stoper na 120 minut po włożeniu wszystkich pudełek do hybrydyzacji.
      UWAGA: Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas procesu ładowania. Na wszystkich etapach od początku ładowania do wysuszenia wiórów należy unikać bezpośredniego wystawienia cieczy na mikromacierze chipów przez długi czas, aby zapobiec nadmiernemu wzrostowi tła chipa z powodu wysychania i zakłócania interpretacji wyników.
  5. Mycie i suszenie frytek
    1. Po zakończeniu reakcji hybrydyzacji wyjmij pudełka do hybrydyzacji poziomo, zdemontuj je i wyjmij wióry do mycia. Natychmiast umieścić frytki na ruszcie do szkiełków w pojemniku (takim jak zlewka) wypełnionym roztworem do mycia wiórów I, który został zrównoważony do temperatury pokojowej (10-30 °C). Myj je z prędkością 80-100 obr./min na wytrząsarce o stałej temperaturze przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    2. Umyj frytki roztworem do mycia wiórów II zrównoważonym do temperatury pokojowej z prędkością 80-100 obr./min na wytrząsarce o stałej temperaturze przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    3. Umieścić frytki w wirówce i wirować w temperaturze 100 × g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Zeskanuj je po wyschnięciu.
      UWAGA: Nie pozwól, aby wióry kolidowały lub ocierały się o siebie.

7. Skanowanie chipów i interpretacja wyników

UWAGA: Użyj skanera chipów z mikromacierzą i odpowiedniego oprogramowania do odczytywania sygnałów i interpretowania wyników. Zapoznaj się również z Tabelą 1 , aby zapoznać się z nieprawidłowymi wynikami i rozwiązywaniem problemów. Wykonaj następujące czynności, aby rozpocząć pracę (zapoznaj się z instrukcją obsługi skanera i oprogramowania).

  1. Włącz skaner i odpowiednie oprogramowanie, a następnie kliknij przycisk Sterowanie laserem , aby nagrzać się przez 10 minut.
  2. Wprowadź różne typy informacji związanych z próbkami, takie jak numer próby.
  3. Po zakończeniu podgrzewania skanera kliknij przycisk Wysuń i równomiernie umieść chip na małym wsporniku. Delikatnie i poziomo wepchnij chip do otworu w komorze skanera i kliknij przycisk Załaduj .
  4. Wprowadź numer chipa, kliknij, aby wybrać obszar wykrywania (mikromacierz 1-4), a następnie kliknij Wybierz próbkę , aby wybrać odpowiednie próbki dla każdej mikromacierzy. Następnie kliknij przycisk Rozpocznij wykrywanie , aby przeprowadzić skanowanie chipów. Wyniki skanowania zostaną wyświetlone na ekranie i automatycznie zapisane.
  5. Po zeskanowaniu jednego układu powtórz kroki 7.3 i 7.4, aby zeskanować następny chip. Postępuj zgodnie z tą procedurą, aż wszystkie chipy zostaną zeskanowane.
  6. Strona Zapytanie o dane służy do wykonywania operacji wykonywania zapytań o dane i drukowania.
  7. Po wykonaniu wszystkich operacji najpierw wyłącz laser, następnie wyjdź z oprogramowania, a na końcu wyłącz skaner.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pozytywne wyniki
W przypadku sond z rodzaju Mycobacterium (kontrola wewnętrzna, IC) i Mycobacterium tuberculosis ich dodatnie wartości wyników określa się metodą Charakterystyki Operacyjnej Odbiornika (ROC). W przypadku sond używanych do wykrywania pozostałych 16 NTM ich dodatnie wartości wyników są określane metodą percentyla.

Eksperymentalna kontrola jakości
Wynikiem wykrycia produktu kontroli dodatniej powinien być »kompleks Myco...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona w tym artykule metoda mikromacierzy DNA może bezpośrednio wykrywać kwasy nukleinowe w próbkach klinicznych (w tym plwocinie, ropie, płynie z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych, płynie mózgowo-rdzeniowym i płynie do nakłuwania) od pacjentów z podejrzeniem gruźlicy i prątków niegruźliczych i może znacznie skrócić czas potwierdzenia diagnozy. Metoda chipowania mikromacierzy DNA przedstawiona w tym badaniu stanowi znaczący postęp w identyfikacji gatunków Mycobacterium . Ma ona kilka zalet w porównaniu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez projekt Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Fujian (2024J011521) oraz projekt planu nauki i technologii Quanzhou (2024NY006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań (NaCl)FuZhou HAIWANGFUYAOH35020289
Aparatura do amplifikacji Applied BiosystemsThermo Fisher Naukowy96-dołkowy termocykler Veriti
CapitalBio LuxScan10K/BCapitalBioSkaner LuxScan10K/B
CapitalBio Zmywarka ślizgowa 24 CapitalBioPodkładka ślizgowa 24 
  Wirówka Eppendorf powiedział:5424RMaX.speed 15000 min-1
Bufor hybrydyzacyjny
Chip i osłona mikromacierzy genowej HybSet
Zestaw do identyfikacji gatunków MycobacteriumCapitalBio301030
Kontrole negatywne, kontrole dodatnie
Ekstraktor kwasów nukleinowychTIANLONG (Prowincja Tianlong)GeneRotex 96 powiedział:
Odczynnik do amplifikacji PCR
Bufor fosforanowy o pH 6,8Biotechnologia ShangHai yuanyePrzekaźnik Przemysłowy R20029-10
pipety i końcówkiThermo Scientific0,1 - 10 μ L, 2 - 20 μ L oraz 20 - 200 μ L, 100-1000 μ L
qEx-DNA/RNA Zestaw do ekstrakcji lub oczyszczania kwasów nukleinowychTIANLONG (Prowincja Tianlong)qEx-DNA/RNA
SDSCapitalBio441060
Wodorotlenek sodu (NaOH)XILONGS  NaukowyXK13-011-00027
SSCCapitalBio441050
termostatyczna łaźnia wodnaSURUIHH-W600

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Primm, T. P., Lucero, C. A., Falkinham, J. O. III Health impacts of environmental mycobacteria. Trends Genet. 38 (8), 821-830 (2004).
  2. Sawyer, J., et al. Mycobacterium bovis and its impact on human and animal tuberculosis. Trends Genet. 39 (8), 587-592 (2023).
  3. Zhao, Q., et al. The impact of DNA microarray chip technology on the diagnosis and management of non-tuberculous mycobacterial infections in immunocompromised patients. Antimicrob Agents Chemother. 65 (12), e01500-e01500 (2021).
  4. Liu, S., et al. DNA microarray-based detection of drug-resistant Mycobacterium strains: a single-center experience. Clin Microbiol Infect. 26 (10), 1400-1407 (2020).
  5. Li, J., et al. Comparative evaluation of DNA microarray and next-generation sequencing for Mycobacterium identification. Int J Infect Dis. 118, 250-258 (2022).
  6. Chen, K., et al. Optimizing probe design for DNA microarray-based Mycobacterium identification: a computational biology approach. BMC Microbiol. 19 (2), 120-129 (2019).
  7. Michelet, L., Boschiroli, M. L. Mycobacterium uberis. Microorganisms. 8 (11), 1701(2020).
  8. Imran, M., et al. DNA microarray technology for the detection and identification of Mycobacterium species: a review. J Microbiol Biotechnol Res. 6 (2), 275-285 (2020).
  9. Garcia-Sanchez, L., et al. Advances in DNA microarray technology for Mycobacterium detection and characterization. J Mol Diagn. 24 (5), 650-662 (2022).
  10. Wang, L., et al. Machine learning analysis of SERS fingerprinting for the rapid determination of Mycobacterium tuberculosis infection and drug resistance. Comput Struct Biotechnol J. 26 (20), 5364-5377 (2022).
  11. Wang, X., et al. Integration of DNA microarray data with clinical outcomes in tuberculosis patients: implications for personalized medicine. Mol Diagn. 16 (3), 150-160 (2024).
  12. Wang, X., et al. Rapid identification of Mycobacterium tuberculosis complex and common non-tuberculous Mycobacteria by DNA microarray chip. BMC Microbiol. 21 (1), 242(2021).
  13. Smith, J. D., et al. DNA microarray insights into Mycobacterium epidemiology and control strategies. J Clin Microbiol. 60, e02033-e02121 (2022).
  14. Garcia, L. M., et al. Tracking Mycobacterial spread via DNA microarray: a community-based study. PLoS One. 18 (3), e0282123(2023).
  15. Li, H., et al. Economic evaluation of DNA microarray chip technology in Mycobacterium diagnosis. Diagnostics. 11 (12), 2235(2021).
  16. Wang, Z., et al. Cost-benefit analysis of implementing DNA microarray chip for Mycobacterium detection in clinical settings. J Med Econ. 25 (1), 113-122 (2022).
  17. Liu, Y., et al. False positives and false negatives in DNA microarray chip detection of Mycobacteria: a comprehensive analysis. Microb Pathog. 149, 104671(2020).
  18. Chen, L., et al. Validation and improvement of DNA microarray chip for Mycobacterium identification: coping with genetic variants. Front Cell Infect Microbiol. 11, 627923(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Asymetryczna PCRzasady hybrydyzacjikompleks Mycobacterium Tuberculosispr tki niejadaczowemateria klinicznydiagnostyka molekularnahybrydyzacja sond

Powiązane artykuły