Artykuł metodologiczny

Wewnątrzkomórkowa cytometria fosfoflowa ostrej białaczki szpikowej Ksenotransplantacje pochodzące od pacjentów

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68244

⸱

6 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Centre, 2Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Montreal, 3Lady Davis Institute for Medical Research, 4Department of Medicine, McGill University, 5Gerald Bronfman Department of Oncology, McGill University, 6Department of Medicine, University of Montreal

W tym artykule

Podsumowanie

W tym miejscu opisano metodę opartą na cytometrii fosfoprzepływowej do analizy sygnalizacji za szlakami mTORC1, JAK / STAT5 i MAPK w ostrych ludzkich komórkach białaczki szpikowej ksenoprzeszczepowanych myszom i uzyskanych z aspiratów szpiku kostnego. Poziomy p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 i p-ERK1/2 są jednocześnie mierzone za pomocą spektralnego cytometru przepływowego nowej generacji o wysokiej czułości.

Streszczenie

Aby dostosować się do zatwierdzonych metod leczenia i przeciwstawić się im, komórki ostrej białaczki szpikowej (AML) aktywują określone szlaki molekularne, które prowadzą do zmian w ekspresji genów, poziomie i aktywności białek. W tym protokole opisano podejście mające na celu zbadanie celów fosforylowanych poniżej sygnalizacji onkogennej w AML: p-STAT5 (Tyr694), p-4EBP1 (Thr37/46), p-RPS6 (Ser240/244) i p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204). Metoda ta umożliwia ocenę, w jaki sposób te szlaki – główne regulatory utrzymania łodygi, unikania odporności, syntezy białek i adaptacji do stresu oksydacyjnego i metabolicznego – są modulowane przez jeden lub więcej testowanych związków w komórkach szpiku kostnego pobranych od żywych myszy przez aspirację przed i po fazie leczenia. Ta minimalnie inwazyjna metoda zachowuje integralność komórek i zmniejsza stres w porównaniu z technikami miażdżenia kości, które mogą wywołać uszkodzenia i potencjalnie wpłynąć na wyniki eksperymentów. Aby zoptymalizować wewnątrzkomórkowe barwienie przeciwciał do analizy cytometrii przepływowej, opracowano protokół wykorzystujący utrwalanie paraformaldehydu i przepuszczalność metanolu. Takie podejście zapewnia wysoką precyzję barwienia i minimalizuje szum tła, umożliwiając niezawodne wykrywanie wewnątrzkomórkowych markerów sygnalizacyjnych. Jedną z głównych zalet tego protokołu jest opracowanie wieloparametrycznego panelu przeciwciał, pozwalającego na jednoczesną ocenę czterech szlaków w tej samej próbce. Korzystając z spektralnego cytometru przepływowego nowej generacji o wysokiej czułości, zaobserwowano dynamiczne zmiany w aktywacji szlaku w zależności od warunków leczenia w porównaniu z poziomami wyjściowymi sprzed leczenia u tych samych myszy. Metodologia ta umożliwia precyzyjną analizę in vivo modulacji szlaku sygnałowego w próbkach szpiku kostnego ksenoprzeszczepu pobranych od pacjenta bez konieczności eutanazji zwierząt, dostarczając cennych informacji na temat mechanizmów adaptacyjnych komórek AML i może pomóc w ocenie strategii terapeutycznych mających na celu ukierunkowanie na te szlaki w celu przezwyciężenia oporności.

Wprowadzenie

Ostra białaczka szpikowa (AML) jest agresywnym nowotworem hematologicznym charakteryzującym się nagromadzeniem niedojrzałych mieloidalnych komórek progenitorowych w szpiku kostnym i krwi obwodowej. Zakłóca to normalną hematopoezę, prowadząc do zagrażającej życiu cytopenii i powikłań ogólnoustrojowych. Chociaż postępy w chemioterapii, terapiach celowanych i przeszczepianiu krwiotwórczych komórek macierzystych poprawiły wyniki leczenia niektórych pacjentów, ogólnie rzecz biorąc, wskaźniki 5-letniego przeżycia utrzymują się na poziomie około 30%, z gorszym rokowaniem u pacjentów starszych lub z niekorzystnym profilem genetycznym1. Istotnym wyzwaniem w leczeniu AML jest częste pojawianie się lekooporności, która przyczynia się do nawrotu choroby i niepowodzenia leczenia2. Podkreśla to znaczenie głębszego zrozumienia mechanizmów molekularnych i komórkowych napędzających postęp i oporność terapeutyczną AML.

Aby sprostać temu wyzwaniu, przedstawiono nową metodę aspiracji szpiku kostnego w połączeniu z multipleksową wewnątrzkomórkową cytometrią fosfoprzepływową, oferując potężne narzędzie do badania wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych w modelach ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z AML (PDX) (Figura 1A, B). Chociaż aspiracja szpiku kostnego w modelach PDX została już wcześniej opisana3, protokół ten został zoptymalizowany w celu zachowania komórek białaczkowych do analizy fosfoprzepływu. Ogólnym celem tej metody jest zapewnienie minimalnie inwazyjnej procedury, która ma zastosowanie podłużnie podczas progresji białaczki i odpowiedzi terapeutycznej z rozdzielczością pojedynczej komórki. Umożliwiając wielokrotne pobieranie próbek od tego samego zwierzęcia, technika ta zapewnia dokładniejsze odwzorowanie ewolucji choroby w trakcie leczenia. Uzasadnieniem rozwoju tej techniki jest potrzeba dynamicznej oceny sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w komórkach AML o wysokiej rozdzielczości. Tradycyjne metody, takie jak Western blotting, wymagają dużej liczby komórek, braku rozdzielczości pojedynczej komórki i multipleksowania4. W przeciwieństwie do tego, cytometria fosfoprzepływowa zachowuje heterogeniczność komórkową i umożliwia wykrywanie wielu fosforylowanych białek sygnałowych w różnych subpopulacjach białaczki5, oferując kluczowe informacje na temat aktywacji szlaku w odpowiedzi na leczenie AML.

Kluczowe znaczenie dla biologii AML mają szlaki sygnałowe, które regulują proliferację komórkową, przeżycie i adaptację metaboliczną, w tym kinazę białkową aktywowaną mitogenem (MAPK), mechanistyczny cel kompleksu rapamycyny 1 (mTORC1) oraz szlaki sygnałowe kinazy/przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji 5 (JAK / STAT5). Poza ich rolą w proliferacji i przetrwaniu komórek białaczkowych, szlaki te są również krytycznie zaangażowane w kluczowe procesy onkogenne, takie jak utrzymanie łodygi, unikanie odporności oraz adaptacja do stresu oksydacyjnego i metabolicznego4. Oprócz promowania wzrostu i przeżycia komórek, wzajemne oddziaływanie między tymi szlakami koordynuje krytyczne procesy, takie jak transkrypcja, translacja i metabolizm komórkowy, umożliwiając komórkom AML utrzymanie wzrostu i oparcie się sygnałom apoptozy, nawet w obliczu interwencji terapeutycznych 6,7 (Figura 1A).

Szlak MAPK, który obejmuje kluczowe efektory, takie jak p-ERK1/2 (kinaza 1/2 regulowana sygnałem zewnątrzkomórkowym), odgrywa kluczową rolę w integracji sygnałów zewnątrzkomórkowych, takich jak czynniki wzrostu i cytokiny, w celu regulacji proliferacji i przeżycia komórek. Aktywacja ERK1 / 2 zachodzi poprzez kaskadę RAS (Rat Sarcoma)-RAF (Rapid Accelerated Fibrosarcoma)-MEK (MAPK / ERK Kinase)-ERK, w której RAS-GTP rekrutuje RAF, prowadząc do sekwencyjnej fosforylacji MEK1 / 2, a następnie ERK1 / 2 w Thr202 / Tyr204. Po fosforylacji ERK1/2 dimeryzuje i przemieszcza się do jądra, gdzie fosforyluje czynniki transkrypcyjne, takie jak MYC (homolog onkogenu wirusa mielocytomatozy), ELK1 (białko ETS Like-1) i AP-1 (białko aktywatora-1), promując proliferację komórek, blok różnicowania i przeżycie8. W AML mutacje w FLT3 (kinaza tyrozynowa podobna do FMS 3), RAS lub KIT często powodują konstytutywną aktywację ERK 9,10 (Figura 1A).

Mutacje w FLT3, RAS lub KIT powodują również regulację w górę sygnalizacji mTORC1, co umożliwia wzrost AML i oporność terapeutyczną poprzez wspieranie procesów onkogennych, takich jak przeprogramowanie metaboliczne, modulacja syntezy białek, biogeneza rybosomów i autofagia11. Poprzez regulację translacji mRNA, mTORC1 ułatwia produkcję białek onkogennych i innych czynników niezbędnych do progresji AML. Kluczową grupą substratów mTORC1 są białka wiążące 4E-BP (eukariotyczny czynnik inicjacji 4E). W stanie hipofosforylacji 4E-BP wiążą się z eIF4E (eukariotyczny czynnik inicjacyjny 4E), hamując translację zależną od czapeczki. Fosforylacja 4E-BP1 w Thr37/46 przez mTORC1 powoduje uwalnianie eIF4E, umożliwiając inicjację translacji dla kluczowych onkogennych mRNA, takich jak MYC, CCND1 (cyklina D1) i MCL-1 (białaczka szpikowokomórkowa 1), promując w ten sposób proliferację białaczki i przeżycie 8,12. Dodatkowo, fosforylacja RPS6 w Ser240/244, w której pośredniczy S6K1 (kinaza rybosomalna kinaza S6 beta-1) za mTORC1, zwiększa biogenezę rybosomów i translację mRNA, zwiększając syntezę białek niezbędnych do adaptacji metabolicznej, odporności na stres i szybkiej proliferacji 8,13. Warto zauważyć, że aktywność mTORC1 jest ściśle związana z adaptacją metaboliczną, krytyczną strategią przeżycia stosowaną przez komórki AML w warunkach stresu terapeutycznego 13,14,15 (Figura 1A).

Szlak JAK/STAT5 jest kolejną kluczową osią sygnalizacyjną w AML, szczególnie w przypadkach mutacji wpływających na receptory cytokin lub mediatory sygnałowe, takie jak JAK2, FLT3 i CALR (kalretykulina)16,17. STAT5 jest aktywowany w odpowiedzi na sygnalizację cytokin przez receptory, takie jak FLT3 i JAK2. Po związaniu liganda, związane kinazy janusowe (JAK) fosforylują STAT5 w Tyr694. Fosforylowany STAT5 dimeryzuje i przemieszcza się do jądra, gdzie wiąże się ze specyficznymi sekwencjami DNA w celu regulacji transkrypcji genów zaangażowanych w przeżycie, proliferację i różnicowanie komórek8. W AML konstytutywna aktywacja STAT5, często z powodu mutacji w FLT3 lub JAK2, prowadzi do trwałej ekspresji genów, które promują leukemogenezę18 (Figura 1A).

Poza ich indywidualnym wkładem, szlaki te zbiegają się, aby regulować zarówno transkrypcję, jak i translację, kształtując proteom komórek AML w sposób, który sprzyja przetrwaniu i odporności. W szczególności translacja mRNA staje się kluczowym czynnikiem w patofizjologii AML, ponieważ umożliwia szybką produkcję białek onkogennych i czynników odpowiedzi na stres, które umożliwiają komórkom AML przystosowanie się do wyzwań środowiskowych i uniknięcie skutków terapii celowanych. Rozregulowanie maszynerii translacyjnej, takiej jak eukariotyczne czynniki inicjacji (eIF) lub białka rybosomalne, jest związane z opornością na leczenie i złym rokowaniem w AML19. Szczegółowe badanie roli szlaków MAPK, mTORC1 i JAK/STAT5 w regulacji transkrypcji i translacji jest niezbędne do uzyskania kompleksowego zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw progresji i oporności na AML. Takie spostrzeżenia mają kluczowe znaczenie dla identyfikacji nowych biomarkerów odpowiedzi na leczenie i projektowania nowych strategii terapeutycznych, które są ukierunkowane na te szlaki w celu przezwyciężenia oporności. Ten artykuł zawiera protokół specjalnie zaprojektowany do badania tych sieci sygnalizacyjnych w modelach ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z AML (PDX).

Jedną z kluczowych zalet tego protokołu jest integracja aspiracji szpiku kostnego z wewnątrzkomórkową cytometrią fosfoflową, co pozwala na dynamiczną i minimalnie inwazyjną ocenę aktywacji szlaku sygnałowego w modelach ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z AML (PDX). Jest to szczególnie cenne w monitorowaniu stanu aktywacji kluczowych szlaków, takich jak MAPK, mTORC1 i JAK/STAT5 w odpowiedzi na terapie celowane. Połączenie tych technik umożliwia uzyskanie wszechstronnej i wysokiej rozdzielczości wiedzy na temat biologii AML, co ostatecznie pomaga w opracowaniu skuteczniejszych strategii terapeutycznych.

Protokół

Poniższe eksperymenty zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu McGill (CIHR PJT-186019) oraz Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej Żydowskiego Szpitala Ogólnego (11-047). W tym protokole samcom myszy NOD-scid IL2Rg^null-3/GM/SF (NSGS) (NSGS) w wieku od 8 tygodni do 6 miesięcy i ważących 20-30 g przeszczepiono wcześniej komórki AML pochodzące od pacjenta. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Aspiracja szpiku kostnego

UWAGA: Należy przestrzegać środków ostrożności związanych z używaniem igieł.

  1. Analgezja okołooperacyjna: 1-4 godziny przed aspiracją szpiku kostnego wstrzyknąć myszom podskórnie (s.c.) 0,1 mg/kg buprenorfiny o powolnym uwalnianiu. Zapewnia to analgezję do 72 godzin po zabiegu.
  2. Przygotować obszar operacyjny pod kapturem z przepływem laminarnym za pomocą podkładki chirurgicznej, trymera do włosów, lampy grzewczej i całego niezbędnego materiału do aspiracji szpiku kostnego (strzykawki 25 G, 1,5 ml probówki mikrowirówkowe zawierające 0,5 ml PBS na lodzie, waciki 70% izopropanolu). Zabezpieczyć stożek nosowy do inhalacji izofluranu za pomocą taśmy klejącej (Rysunek 2A).
  3. Przygotować dwie strzykawki 25 G dla każdego aspiratu, jedną do nakłucia kości ("sucha igła") i drugą, której piasta została przepłukana PBS w celu aspiracji ("przepłukana igła").
  4. Znieczulenie myszy za pomocą inhalacji izofluranu dostarczanej przez certyfikowany waporyzator, zgodnie z instrukcjami producenta i wytycznymi weterynaryjnymi. Lokalne procedury mogą się różnić. Dla porównania, protokół ten był zgodny ze standardowymi procedurami operacyjnymi Uniwersytetu McGill dotyczącymi znieczulenia myszy20.
  5. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak reakcji na uszczypnięcie stopy i rozluźnienie mięśni. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu, gdy zwierzę jest pod narkozą. Stale monitoruj częstość oddechów podczas znieczulenia.
  6. Ogol całą nogę, na której zostanie wykonane aspiracja, za pomocą trymera do włosów. Zdezynfekuj miejsce aspiracji (kość udową) za pomocą podkładki antyseptycznej nasączonej alkoholem izopropylowym (ryc. 2B).
  7. Odsłonić powierzchnię stawową kości udowej, w której znajduje się miejsce nakłucia, zginając kolano i unieruchamiając nogę za pomocą ręki niedominującej. Połóż kciuk na kości piszczelowej, palec wskazujący na kości udowej, a palec środkowy, stabilizując wszystko po zewnętrznej stronie dwóch kości (ryc. 2C).
    UWAGA: Zapewnij bardzo stabilne ułożenie nogi za pomocą ręki niedominującej, aby zapobiec jakiemukolwiek ruchowi nogi podczas aspiracji, który może prowadzić do awarii lub kontuzji. Jeśli unieruchomienie nogi nie jest stabilne, zmień pozycję ręki i spróbuj ponownie przed jakimkolwiek nakłuciem.
  8. Podczas unieruchamiania ręką niedominującą należy ponownie zdezynfekować obszar kolana alkoholem izopropylowym (ryc. 2C), aby odsunąć pozostałe włosy i poprawić wizualizację struktury kostnej.
  9. Użyj pierwszej suchej strzykawki 25 G, aby utworzyć otwór w powierzchni stawowej kości udowej, umieszczając ją na środku stawu udowego i obracając bez użycia siły (Rysunek 2D, E). Upewnij się, że igła strzykawki jest całkowicie wyrównana (odchylenie 0°) z osią podłużną kości udowej, aby prawidłowo wprowadzić się do szpiku.
    UWAGA: Utrzymuj to ustawienie, aby zapewnić płynne wejście bez powodowania niepotrzebnych uszkodzeń otaczających tkanek. Gdy igła wchodzi w środek kości udowej, niewielki spadek oporu wskazuje na udaną penetrację do jamy szpiku (ryc. 2F). Na tym etapie należy unikać wywierania nadmiernej siły na igłę, ponieważ może to spowodować utratę prawidłowego ustawienia, złamanie lub uraz. Stosując ruch wiercenia obrotowego, istnieje większe prawdopodobieństwo, że igła podąży ścieżką najmniejszego oporu i prawidłowo wejdzie do jamy udowej. Igła prawidłowo umieszczona wewnątrz kości udowej powinna pozostać w pozycji pionowej nawet po wyjęciu trzymającej ją ręki.
  10. Po dostaniu się do szpiku należy stopniowo wyjmować strzykawkę, obracając ją (Rysunek 2G) i włożyć drugą przepłukaną strzykawkę do otworu utworzonego przez pierwszą igłę (Rysunek 2H,I).
    UWAGA: Używana jest druga strzykawka, ponieważ pierwsza jest często blokowana przez kość podczas wiercenia.
  11. Zastosować podciśnienie do strzykawki włożonej do kości udowej, delikatnie obracając i stopniowo wyjmując strzykawkę. Około 10-20 μl szpiku kostnego powinno być widoczne w pioście strzykawki (ryc. 2J).
    UWAGA: W razie potrzeby delikatnie ponownie wsuń igłę w kość, aby zoptymalizować ekstrakcję szpiku.
  12. Przenieść szpik kostny, przepłukując zawartość strzykawki do schłodzonej probówki wirówkowej zawierającej 500 μl PBS (ryc. 2K). Trzymaj się lodu i przejdź do kroków 2-3 tak szybko, jak to możliwe.
  13. Delikatnie uciskaj miejsce wkłucia przez 30 sekund wacikiem izopropanolowym, aby zatrzymać krwawienie (ryc. 2L).
  14. Umieść mysz w czystej klatce regeneracyjnej ogrzanej za pomocą podgrzewającej lampy. Monitoruj oddech i mobilność, dopóki zwierzę nie obudzi się i nie odzyska pełnej sprawności, zanim umieścisz je we wspólnych klatkach z resztą myszy. Sprawdź, czy nie ma oznak krwawienia.

2. Barwienie żywych/martwych i markerów powierzchniowych

UWAGA: Utrzymuj komórki na lodzie przez cały czas trwania procedury. Przed rozpoczęciem etapu 2 i 3 przygotować wzorcowe mieszaniny roztworów barwiących przeciwciała (dla etapu 2.4 i etapu 2.7), chroniąc je przed światłem w temperaturze 4 °C. Przygotować świeży 1,6% roztwór formaldehydu (krok 3.1) i 100% roztwór metanolu, utrzymując temperaturę -20 °C (krok 3.6).

  1. Policz żywotne komórki za pomocą oranżu akrydynowego/jodku propydyny (AO/PI) z licznikiem komórek21.
  2. Przenieś odpowiednią objętość dla 1 miliona komórek do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Jeżeli objętość jest niewystarczająca, należy pobrać całą objętość. Połączyć pozostałe komórki i podwielokrotność do 3 probówek z kontrpróbami (po 1 M każda) do barwienia izotypowego i 1 probówki do kontroli niebarwionej.
  3. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C. Delikatnie zassać i wyrzucić supernatant za pomocą systemu aspiracji próżniowej.
  4. Dodać 200 μl na próbkę roztworu do barwienia komórek fluorescencyjnych rozcieńczonego w stosunku 1/100 w PBS, aby oznaczyć martwe komórki. Delikatnie zawiesić komórki za pomocą pipety. Zrób to samo z dodatkowymi probówkami do barwienia kontrolnego izotypu.
  5. Inkubować na lodzie przez 10 minut, chroniąc przed światłem.
  6. Odwirować komórki przy stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Delikatnie zassać i odrzucić supernatant za pomocą systemu próżniowego.
  7. Dodać 100 μl na próbkę przeciwciała hCD45-BUV395 rozcieńczonego w stosunku 1/100 w PBS zawierającym 2% płodowej surowicy bydlęcej, aby oznaczyć ludzkie komórki krwiotwórcze. Zrób to samo z dodatkowymi probówkami zachowanymi do kontroli izotypu.
  8. Inkubować na lodzie przez 15 minut, chroniąc przed światłem. Przejdź natychmiast do kroku 3.

3. Utrwalenie i przepuszczalność

  1. Przygotuj świeży 1,6% roztwór formaldehydu/PBS: Dla każdej próbki wymieszaj 29,5 μl 37% roztworu podstawowego formaldehydu + 970,5 μl PBS (na wszelki wypadek uwzględnij dodatkową objętość). Przechowywać 1,6% roztwór formaldehydu/PBS w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Z formaldehydem należy obchodzić się w kapturze chemicznym i utylizować zgodnie z instytucjonalnymi przepisami bezpieczeństwa.
  2. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i odrzucić supernatant za pomocą systemu próżniowego.
  3. Zawiesić w 1 ml 1,6% roztworu formaldehydu/PBS.
  4. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
  5. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i odrzucić supernatant za pomocą systemu próżniowego.
  6. Dodać 1 ml 100% metanolu schłodzonego w temperaturze -20 °C bezpośrednio do probówki.
  7. Próbki inkubować w temperaturze -20 °C przez 30 minut, chroniąc je przed światłem.
    UWAGA: W tym momencie możliwe jest przechowywanie stałych i przepuszczalnych komórek w temperaturze -80 °C przez okres do jednego miesiąca przed analizą.

4. Barwienie fosforopływowe

UWAGA: Następujący panel przeciwciał zwalidowano za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w następujące lasery: 320 nm, 355 nm, 405 nm, 488 nm, 561 nm, 637 nm i 808 nm. Panel ten powinien zostać ponownie zweryfikowany, jeśli używane są różne cytometry z różnymi konfiguracjami lasera i detektora.

  1. Przygotować roztwór wzorcowy przeciwciał z następującymi rozcieńczeniami w dostępnym w handlu buforze barwiącym (tabela 1), obliczając objętość 50 μl dla każdej próbki. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.
  2. W przypadku płukania (kroki 4.8, 4.10) należy przechowywać PBS na lodzie (2 ml na każdą próbkę).
  3. Przygotować drugi roztwór mieszaniny wzorcowej dla kontrolnych prób technicznych w buforze barwiącym (tabela 1), obliczając objętość 50 μl dla każdej próbki. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem. W celu zapewnienia odtwarzalności technicznej zaleca się co najmniej dwie próbki kontrolne izotypu.
  4. Odwirować komórki z etapu 3.7 przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i odrzucić supernatant za pomocą systemu próżniowego.
    UWAGA: Po utrwaleniu i przepuszczalności komórki mogą wydawać się bardziej przezroczyste.
  5. Dodać 50 μl roztworu mieszaniny przeciwciał (krok 4.1) lub roztworu mieszaniny kontrolnej izotypu (krok 4.2). Delikatnie zawiesić komórki za pomocą pipety.
  6. Wszystkie próbki należy inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
  7. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i odrzucić supernatant za pomocą systemu próżniowego.
  8. Przemyć 1000 μl PBS, delikatnie ponownie mieszając pipetą.
  9. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i odrzucić supernatant za pomocą systemu próżniowego.
  10. Wykonaj drugie płukanie 1000 μl PBS, delikatnie ponownie mieszając pipetą.
  11. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i odrzucić supernatant za pomocą systemu próżniowego.
  12. Zawiesić próbki w 200 μl PBS. Przenieść do probówek lub płytek FACS w celu analizy za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 3).
  13. Przygotować jednobarwne kontrole kompensacyjne z kulkami, inkubując 0,1 μl każdego przeciwciała z kulkami kompensacyjnymi, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).

Wyniki

Projekt eksperymentalny ma na celu monitorowanie stanu fosforylacji wybranych białek w różnych punktach czasowych, na przykład 1 dzień przed rozpoczęciem wstępnego przygotowania oraz 15 dni po rozpoczęciu leczenia. Wartość bazowa ta służy jako krytyczna kontrola do weryfikacji wiarygodności późniejszych zmian w aktywacji szlaków sygnałowych po zastosowaniu leczenia. Po piętnastu dniach leczenia przeprowadza się drugie porównanie, aby ocenić modulację szlaków u myszy leczonych w stosunku do kontroli traktowanych nośnikiem (Rycina 4). To dwuetapowe podejście pozwala na odróżnienie efektów indukowanych leczeniem od zmienności bazowej.

W badaniu tym wykorzystano mysi model PDX AML. Myszy przeszczepiono komórkami AML pochodzącymi od pacjenta, które charakteryzowały się następującymi mutacjami: DNMT3AMR882H z frakcją allelu wariantowego (VAF) 48 %, NPM1W288fs VAF 36%, FLT3ITD VAF 10% oraz IDH2R140Q VAF 44%. Po przeszczepieniu wyczekano trzech tygodni na wzrost guza przed rozpoczęciem leczenia. Myszy PDX z przeszczepioną mutacją FLT3 leczono przez piętnaście dni zgodnie z jednym z trzech schematów: placebo, gilteritinib (15 mg/kg dziennie) lub kombinacją venetoclax (50 mg/kg dziennie), 5-azacytydyna (2,5 mg/kg dziennie) i cedarizudyna (3 mg/kg dziennie) (Rysunek 4A).

W odniesieniu do uzyskanych wyników warto wspomnieć, że leczenie schematem opartym na wenetoklaksie doprowadziło do znaczącego zwiększenia fosforylacji STAT5 oraz RPS6, co sugeruje, że szlaki te przyczyniają się do oporności na terapię (Rysunek 4E). Z kolei gilteritynib, lek celujący w FLT3, nie zmniejszył stanu fosforylacji efektorów zmutowanego białka FLT3. Możliwe jest, że w badanej próbce AML obecność dodatkowych mutacji wtórnych poza FLT3-ITD (np. IDH2) przyczynia się do aktywacji tych szlaków lub że dwutygodniowe leczenie prowadzi do selektywnej eliminacji komórek AML o obniżonym poziomie sygnalizacji. Ponieważ wszystkie analizowane fosfoprotein są bramkowane z tej samej populacji komórek, możliwe jest porównanie aktywacji fosfoprotein. W tym eksperymencie najsilniejsza korelacja w barwieniu fosfoprotein wydaje się występować pomiędzy p-STAT5 a p-RPS6 (Rysunek uzupełniający 1A), z których oba są zwiększone w tej grupie eksperymentalnej po leczeniu (Rysunek 4E). Wydaje się, że istnieje słabsza zależność pomiędzy p-STAT5 a p-ERK (Rysunek uzupełniający 1B). Co istotne, wielkość komórek (oceniana za pomocą FSC-A) nie jest głównym czynnikiem wpływającym na ogólną pozytywność p-STAT5, co podkreśla, że pozytywność barwienia nie jest jedynie wynikiem wielkości komórek (Rysunek uzupełniający 1C). Taki schemat eksperymentalny umożliwia kompleksową ocenę wpływu tych terapii na modulację szlaków sygnalizacyjnych.

Schemat sygnalizacji komórkowej z szlakiem fosforylacji, metodą analizy przepływowej widmowej i procesem szpiku kostnego.
Rysunek 1: Wizualizacja docelowych szlaków sygnalizacyjnych i strategia ich analizy. (A) Przegląd szlaków sygnalizacyjnych obejmujących p-STAT5 (Tyr694), p-4EBP1 (Thr37/46), p-RPS6 (Ser240/244) i p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204). W szlaku p-STAT5 białko JAK ulega autofosforylacji, co zwiększa jego aktywność katalityczną, a następnie fosforyluje specyficzne reszty tyrozyny, tworząc miejsca dokowania dla białek STAT. Fosforylowane STAT5 (Tyr694) tworzy homodimery i translokuje się do jądra, gdzie wiąże się ze specyficznymi elementami odpowiednimi dla STAT w regionach promotorowych genów docelowych. W kaskadzie RAS-RAF-MEK-ERK autofosforylacja receptora FLT3 lub innych receptorowych kinaz tyrozynowych (RTK) po związaniu liganda prowadzi do wymiany GDP na GTP w białku RAS, co aktywuje RAS. Aktywowane RAS-GTP rekrutuje białko RAF do błony plazmatycznej, gdzie RAF ulega zmianie konformacyjnej i staje się aktywny. RAF następnie fosforyluje i aktywuje MEK1/2, kinazę o podwójnej specyficzności, która z kolei fosforyluje ERK w resztach Thr202/Tyr204. Aktywowane ERK1/2 translokuje się do jądra, gdzie fosforyluje specyficzne czynniki transkrypcyjne. ERK1/2 jest również w stanie, poprzez pośrednie szlaki sygnalizacyjne, zwiększyć aktywność mTORC1 i fosforylować eIF4E w określonych miejscach w celu zwiększenia aktywności translacji. Aktywowane przez składniki odżywcze i czynniki wzrostu poprzez FLT3 i inne RTK, mTORC1 fosforyluje cele poniżej w kaskadzie, takie jak S6K1 i 4E-BP1. S6K1 z kolei fosforyluje RPS6, co usprawnia funkcję rybosomów i aktywuje translację. Hiperfosforylacja 4E-BP1 uwalnia eIF4E, umożliwiając montaż kompleksu inicjującego translację eIF4F i aktywację translacji zależnej od czapeczki. Wszystkie te szlaki są silnie zaangażowane w AML, przyczyniając się do adaptacji nabytych poprzez zwiększenie proliferacji komórek, metabolizmu oraz oporności na sygnały apoptotyczne. (B) przedstawia główne etapy protokołu aspiracji szpiku kostnego i sprzężonego barwienia wewnątrzkomórkowego metodą phosphoflow. Aby zobaczyć większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Schemat procedury in vivo, wstrzyknięcie strzykawką u znieczuplonej myszy w celu analizy eksperymentalnej.
Rycina 2: Wizualizacja kluczowych etapów procedury aspiracji szpiku kostnego. Obszar chirurgiczny i niezbędne materiały są przygotowane pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Po znieczuleniu przez inhalację izofluranem (A), powierzchnia stawowa kości udowej jest przygotowywana do aspiracji (B,C). Kość udowa jest nakłuwana pierwszą strzykawką skierowaną w stronę środka kości udowej (D). Kluczowe jest unikanie wywierania silnego nacisku na igłę i zamiast tego zastosowanie obrotowego ruchu wiercenia; jest to zazwyczaj wystarczające, aby igła przebiła powierzchnię kości i podążyła ścieżką jamistości kości udowej. Następnie szpik kostny jest aspirowany drugą strzykawką przez miejsce nakłucia (I,J). Po przeniesieniu aspiratu szpiku kostnego do probówki do mikrocentryfugi (K), wywierany jest delikatny nacisk, aby zatrzymać krwawienie w tym obszarze (L), a mysz jest umieszczana w ciepłej i czystej klatce w celu rekonwalescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat bramkowania cytometrii przepływowej i histogramy; analiza populacji komórek, próbka vs kontrola izotypowa.
Rycina 3: Schemat analizy strategii bramkowania, uwzględniający kontrole izotypowe. (A) przedstawia strategie bramkowania dla żywych komórek, wykluczenie dubletów oraz komórek AML dodatnich pod kątem hCD45. (B) pokazuje sygnały dla każdej fosfobiałka w kolorze brązowym oraz kontrole izotypowe w kolorze czarnym (dwie powtórki biologiczne). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza próbek AML PDX; wykresy cytometrii przepływowej; wykresy słupkowe ekspresji białek sygnałowych; efekty leków
Rysunek 4: Schemat wykrywania i analizy wewnątrzkomórkowych fosfobiałek po immunobarwieniu żywych komórek AML szpiku kostnego. (A) Myszy NSG-SGM3 z przeszczepionymi komórkami AML od pacjenta otrzymywały nośnik (kontrola), venetoclax, 5-azacytydynę i cedazurydynę (vene/aza/CDZ) lub gilteritynib. Po 15 dniach przetworzono aspiraty szpiku kostnego (BM). (B) przedstawia strategię bramkowania dla analizy żywych komórek AML (np. hCD45/Zombie-NIR dodatnich) 15 dni po leczeniu. (C,D) przedstawiają normalizację sygnału dla każdego z zaznaczonych przeciwciał fosfospecyficznych w 10 000 komórkach AML wyizolowanych z myszy leczonych venetoclaxem/5-azacytydyną/cedazurydyną lub nośnikiem (B) lub gilteritynibem lub nośnikiem (C). Krzywe reprezentują sygnały w komórkach AML wyizolowanych z myszy kontrolnej leczonej nośnikiem (jasnoniebieski), vene/aza/CDZ (czerwony) lub gilteritynibem (fioletowy). (E) Histogram przedstawia zmiany wartości średnich intensywności barwienia dla każdego przebadanego fosfobiałka w żywych ludzkich komórkach AML CD45+ od trzech myszy oraz SD. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Gwiazdki wskazują istotne różnice w intensywnościach barwienia ocenione za pomocą analizy ANOVA z wartościami p poniżej 0,05 (*) i 0,01 (**). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

PrzeciwciałoFluorochromRozcieńczanie
p-RPS6 (Ser240/244)AF5941/50
p-4EBP1 (Thr37/46)AF4881/50
p-STAT5 (Tyr694)PE1/100
p-Erk1/2 (Thr202/Tyr204)AF6471/100
Kontrolny króliczy IgGAF5941/50
Kontrola IgG królikaAF4881/50
Kontrola IgG królikaPE1/100
Kontrola IgG królikaAF6471/100

Tabela 1: Lista zoptymalizowanych rozcieńczeń przeciwciał.

Rycina uzupełniająca 1: Porównanie p-STAT5, p-RPS6, p-ERK1/2 oraz FSC-A w reprezentatywnej próbce PDX AML. Rycina przedstawia przykład zależności między p-STAT5, p-ERK i p-RPS6 u myszy „E9” w 15. dniu leczenia venetoklaksem/5-azacytydyną/cedazurydyną (wynik z Ryciny 4C). W tej próbce najsilniejsza korelacja w barwieniu fosfoprotein wydaje się występować między p-STAT5 a p-RPS6 (A), z których oba są zwiększone w tej grupie eksperymentalnej po leczeniu (Rycina 4E). Wydaje się, że zależność między p-STAT5 a p-ERK jest słabsza (B). Co ważne, wielkość komórek (oceniana za pomocą FSC-A) nie ma istotnego wpływu na całkowitą pozytywność p-STAT5, co podkreśla, że pozytywne barwienie nie jest jedynie wynikiem wielkości komórek (C). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Kroki krytyczne
Zastosowanie technik immunologicznych w badaniu złożonych szlaków sygnałowych poprzez specyficzne wykrywanie fosfoprotein wymaga ścisłej kontroli zmiennych eksperymentalnych22, skrupulatnego przygotowania próbki i stosowania technik uzupełniających do walidacji. Integracja tych praktyk zapewnia odtwarzalność, precyzję i solidność danych, co ostatecznie przyczynia się do bardziej wiarygodnych wniosków biologicznych. Wysiłki te nie tylko zwiększają rygor naukowy metody, ale także poszerzają jej zastosowanie w złożonych badaniach nad sygnalizacją komórkową i regulacją. Właściwe znieczulenie i delikatne obchodzenie się z nim mają kluczowe znaczenie dla zminimalizowania stresu fizjologicznego, który może znacząco zmienić wyniki eksperymentów, szczególnie w badaniach koncentrujących się na odpowiedziach immunologicznych lub szlakach sygnałowych. Zapewnienie odpowiednich protokołów przeciwbólowych dodatkowo pomaga w utrzymaniu dobrostanu zwierząt, jednocześnie zapobiegając stresowi związanemu z bólem, który może zakłócać dane. Zachowanie warunków aseptycznych podczas zabiegu jest niezbędne, aby zapobiec infekcjom, które mogą prowadzić do reakcji zapalnych i potencjalnie zafałszować wyniki eksperymentalne. Wiąże się to ze sterylizacją sprzętu, używaniem czystych rękawiczek i dokładną dezynfekcją miejsca aspiracji.

Fosforylowane białka są wysoce podatne na defosforylację przez fosfatazy podczas manipulacji próbkami biologicznymi22,23. Aby zachować stany fosforylacji podczas przetwarzania, niezbędne jest natychmiastowe utrwalenie. Przetestowano dwie różne metody utrwalania/przepuszczalności: zestaw cytofix/cytoperm oraz powszechną metodę formaldehydu/metanolu opisaną w protokole. Wśród nich metoda oparta na metanolu zapewniła czystsze wyniki z jaśniejszymi sygnałami fluorescencyjnymi, co czyni ją preferowanym wyborem. Po utrwaleniu próbki mogą być przechowywane krótkotrwale w temperaturze -20 °C lub długotrwale w temperaturze -80 °C. W eksperymentach utrwalone próbki przechowywane przez okres do trzech miesięcy w temperaturze -80 °C dały spójne wyniki. W przypadku barwienia przeciwciał inkubacja przez noc może zwiększyć dokładność, szczególnie w przypadku subtelnych zmian fosforylacji, chociaż zależy to od konkretnego eksperymentu i efektów badanego leku. Krótsza, trwająca 1 godzinę inkubacja była również testowana na lodzie, chronionym przed światłem, co w niektórych przypadkach dało zadowalające wyniki. Aby zapewnić dokładną ocenę szumu tła, zaleca się stosowanie kontroli izotypu jako punktu odniesienia dla wiązania niespecyficznego, jak pokazano na rysunku 3.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów z techniką
Aby rozwinąć biegłość techniczną, stażyści w naszej grupie ćwiczą technikę wprowadzania igły na uśpionych myszach, gdzie prawidłowe umieszczenie można potwierdzić przez sekcję. Procedura na żywych zwierzętach jest wykonywana najbardziej efektywnie przez dwóch operatorów, z których jeden może skupić się na aspiracjach, podczas gdy asystent jest dedykowany do zadań związanych z monitorowaniem zwierząt i obsługą próbek. W rzadkich przypadkach, gdy nie jest możliwe uzyskanie aspiracji po kilku próbach, zaleca się przerwanie zabiegu, ponieważ ryzyko kontuzji wzrasta z każdą próbą. Równie ważne jest monitorowanie zwierząt po zabiegu. Obserwacja oznak infekcji, bólu lub stresu zapewnia dobre samopoczucie myszy i wiarygodność badania. Warunki mieszkaniowe powinny sprzyjać rekonwalescencji, z odpowiednią ściółką i odżywianiem, aby zminimalizować zewnętrzne czynniki stresogenne.

W przypadku analizy metodą cytometrii przepływowej zaleca się jednoczesne przetwarzanie wszystkich utrwalonych i zakonserwowanych próbek z różnych dni aspiracji szpiku kostnego. Różnice w rehydratacji i barwieniu próbki spowodowane różnicami w dniach obsługi lub operatorach mogą wpływać na czułość fluorescencji wykrywaną przez cytometr. Aby zapewnić spójne wyniki, zoptymalizuj ustawienia napięcia cytometru, aby utrzymać wszystkie barwione próbki w zakresie wykrywania przed kontynuowaniem. Białko p-4EBP1 sprzężone z Alexa Fluor 488 wykazuje najwyższą jasność spośród markerów w tym panelu, co czyni je wiarygodnym odniesieniem do ustawiania maksymalnego zakresu wykrywania. Chociaż panel przeciwciał przedstawiony w tym protokole nie wymagał regulacji kompensacji, może się to różnić w zależności od zastosowanego spektralnego cytometru przepływowego.

Ograniczenia
Jednym z głównych ograniczeń tej techniki jest liczba komórek pobieranych podczas aspiracji szpiku kostnego. Aby zapewnić wiarygodne wyniki, konieczne jest wybarwienie wystarczającej liczby komórek, aby przeanalizować co najmniej około 10 000 komórek na próbkę. Analizowanie zbyt małej liczby komórek może prowadzić do znacznych różnic między próbkami, co wpływa negatywnie na dokładność i możliwość interpretacji danych. Zapewnienie odpowiedniej liczby komórek ma kluczowe znaczenie dla solidnych i powtarzalnych badań mechanistycznych.

Do analizy danych stosuje się strategię bramkowania zilustrowaną na rysunku 3A . Po pierwsze, po wykluczeniu dubletów, interesujące komórki są identyfikowane za pomocą ludzkiego przeciwciała CD45 sprzężonego z BUV395. Następnie bramkowanie dla żywych komórek odbywa się za pomocą Zombie NIR. Na koniec oblicza się medianę intensywności fluorescencji (MFI) dla każdej fosfoproteiny (ryc. 3B). Wszystkie komórki analizowane pod kątem wszystkich fosforylowanych białek bramkowano przy użyciu tej samej strategii, zapewniając spójność i porównywalność w populacjach komórek AML.

Innym ograniczeniem tej metody jest możliwość wystąpienia szumu tła, który może wynikać z niespecyficznego wiązania przeciwciał, niewystarczającego mycia, autofluorescencji komórek lub niewłaściwej przepuszczalności. Może to wpłynąć na specyficzność sygnału i zmniejszyć dokładność analizy cytometrii fosfoprzepływowej. Dla użytkowników, którzy napotykają te problemy, zalecany jest dodatkowy etap prania w celu zmniejszenia szumów tła, a odczynniki blokujące Fc mogą być używane w celu zminimalizowania niespecyficznego wiązania. Ponadto fluorescencja martwych komórek może zakłócać wyniki, co sprawia, że niezbędne jest stosowanie barwników żywotności. Co ważne, aby analiza była dokładna, liczba analizowanych komórek nie powinna być mniejsza niż 500 komórek AML, aby zapewnić wiarygodne i powtarzalne wyniki. Ważne jest również, aby upewnić się, że podczas barwienia używana jest podobna liczba komórek, aby zachować spójność we wszystkich próbkach. Pomimo tych ograniczeń staranna optymalizacja kontroli i strategii bramkowania może zwiększyć niezawodność metody.

Znaczenie tej techniki
Technika aspiracji szpiku kostnego została już opublikowana3; Jednak w tym protokole zawarto zaktualizowaną technikę z wyjaśnieniem podkreślającym dwie zalety: lepsze unieruchomienie i zastosowanie podejścia dwuigłowego w celu zwiększenia precyzji i spójności aspiracji szpiku kostnego, zapobiegając wszelkim problemom z zablokowaniem igły fragmentami kości. W przypadku badań podłużnych aspiracja kości udowej może być wykonywana wielokrotnie, co stanowi potężną metodę śledzenia zmian biologicznych w czasie u poszczególnych zwierząt. Zaleca się co najmniej miesięczny okres rekonwalescencji między aspiracjami na tej samej kości udowej, aby umożliwić wystarczające gojenie kości i regenerację szpiku kostnego. W przypadku stosowania przeciwległej kości udowej wystarczy krótszy odstęp wynoszący jeden tydzień, aby upewnić się, że mysz wyzdrowiała po skutkach znieczulenia i znieczulenia bez wprowadzania nadmiernego stresu lub zmienności fizjologicznej.

Podsumowując, ta połączona technika aspiracji szpiku kostnego i cytometrii przepływowej dostarcza cennych informacji na temat kluczowych szlaków sygnałowych, w tym JAK/p-STAT5, mTORC1/p-4EBP1, mTORC1/p-RPS6 i MEK/p-ERK1/2. Szlaki te odgrywają znaczącą rolę w oporności na leczenie w AML. Technika ta pozwala na wielokrotne pobieranie próbek od tego samego zwierzęcia, umożliwiając monitorowanie w czasie rzeczywistym postępu choroby i odpowiedzi na terapię na poziomie pojedynczej komórki.

Cytometria fosfoprzepływowa wychwytuje zdarzenia fosforylacji i zachowuje niejednorodność komórkową 4,23,24. To sprawia, że jest to szczególnie cenne dla zrozumienia dynamicznych odpowiedzi komórkowych na terapię w określonych subpopulacjach białaczkowych.

Przyszłe zastosowania
Protokół ten stanowi cenne narzędzie do badania mechanizmów leżących u podstaw adaptacji leczenia i pojawiania się oporności w AML, torując drogę do głębszego wglądu i potencjalnych postępów terapeutycznych. Przyszłe badania mogą zintegrować to podejście z transkryptomiką lub proteomiką pojedynczych komórek, aby dokładniej przeanalizować mechanizmy molekularne napędzające oporność i postęp choroby25. Ponadto zastosowanie tej metody do innych nowotworów hematologicznych lub stanów zapalnych może poszerzyć jej wpływ w badaniach translacyjnych.

Dzięki udoskonaleniu tego protokołu i wyeliminowaniu jego ograniczeń, podejście to może stać się standardową metodą badania sygnalizacji fosfoproteinowej w chorobach hematologicznych, ostatecznie pomagając w opracowaniu skuteczniejszych strategii terapeutycznych. Podsumowując, protokół ten stanowi cenne narzędzie do badania mechanizmów leżących u podstaw adaptacji leczenia i pojawiania się oporności w AML, torując drogę do głębszego wglądu i potencjalnych postępów terapeutycznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez granty przejściowe dla LH i FEM z Fundacji Cole'a oraz granty z Białaczki i Chłoniaka z Kanady i Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (PJT-186019) dla LH i FEM. FEM jest naukowcem klinicznym FRSQ Junior 2, a LH jest naukowcem FRSQ Junior 2. VG jest stypendystką Fundacji Cole'a. Rysunek 1 został stworzony za pomocą BioRender w ramach umowy licencyjnej. Wykresy cytometrii przepływowej zostały wygenerowane przy użyciu oprogramowania FlowJo. Specjalne podziękowania dla dr Colina Crista i Victorii Richard za udzielenie dostępu do ich placówki chirurgii zwierząt.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawki 1 ml 25G x 5/8 TW BD Nauki biologiczne#309626Strzykawki do aspiracji szpiku kostnego
Probówki do mikrowirówek o pojemności 1,7 mlFroggaBio powiedział:#LMCT1,7 mldAby podzielić na porcje komórki odzyskane przez aspirację szpiku kostnego
BD Horizon Brilliant Bufor do bejcBD Nauki biologiczne#563794Do procesów barwienia
BuprenorfinaFidelis Zdrowie ZwierzątEthiqa XRAnalgezja dla myszy
CellDrop FL bez ograniczeńFroggaBio powiedział:#CellDrop FL- UNLTDDla liczby komórek
D-PBS (Sieć Demokratyczna)Żubr Inc.#311-425-CLPożywka dla komórek odzyskanych przez aspirację szpiku kostnego
Wirówka Eppendorf 5427 RMillipore Sigma#EP5429000260
Płodowa surowica bydlęca inaktywowana termicznie Premium CAŻubr Inc.#090-450Do procesów barwienia
Roztwór formaldehyduMillipore Sigma#F1635Przenikanie komórek
ludzkie przeciwciało CD45 [HI30] BD Nauki biologiczne#563792Przeciwciało sprzężone z BUV395
Analizator komórek spektralnych ID7000SonyAnalizator spektralnego cytometru przepływowego
Izofluran 99,9% płynMcKesson powiedział:#803250Znieczulenie dla myszy
Isospire (izofluran) Wziewny środek znieczulającyDechra (Głuch)Znieczulenie dla myszy
Żywy/martwy AO/PIFroggaBio powiedział:CD-AO/PI-1.5Dla liczby komórek
Żywy/martwy Zombie NIRBioLegend+B6:C12#423106Do spektralnej cytometrii przepływowej
Roztwór metanoluMillipore Sigma#179957Utrwalanie komórek
Przeciwciało P-4EBP1 (Thr37/46) [236B4]Technologia sygnalizacji komórkowej#2846Przeciwciało sprzężone z Alexa Fluor 488
Przeciwciało p-Erk1/2 (Thr202/Tyr204) [197G2]Technologia sygnalizacji komórkowej#13148Przeciwciało sprzężone z Alexa Fluor 647
Przeciwciało p-RPS6 (Ser240/244) [D68F8]Technologia sygnalizacji komórkowej#9468Przeciwciało sprzężone z Alexa Fluor 594
Przeciwciało p-STAT5 (Tyr694) [D47E7]Technologia sygnalizacji komórkowej#14603Przeciwciało sprzężone z PE
Kontrola IgG królika [DA1E]Technologia sygnalizacji komórkowej#2975Przeciwciało sprzężone z Alexa Fluor 488
Kontrola IgG królika [DA1E]Technologia sygnalizacji komórkowej#2985Przeciwciało sprzężone z Alexa Fluor 647
Kontrola IgG królika [DA1E]Technologia sygnalizacji komórkowej#8760Przeciwciało sprzężone z Alexa Fluor 594
Kontrola IgG królika [DA1E]Technologia sygnalizacji komórkowej#5742SPrzeciwciało sprzężone z PE
Chusteczki odkażająceWielka Kanada#UCDWPR-9022Dezynfekcja do aspiracji szpiku kostnego

Bibliografia

  1. Ferrara, F., Schiffer, C. A. Acute myeloid leukaemia in adults. Lancet. 381 (9865), 484-495 (2013).
  2. Döhner, H., et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood. 129 (4), 424-447 (2017).
  3. Chung, Y. R., Kim, E., Abdel-Wahab, O. Femoral bone marrow aspiration in live mice. J Vis Exp. (89), e51660(2014).
  4. Haas, A., Weckbecker, G., Welzenbach, K. Intracellular Phospho-Flow cytometry reveals novel insights into TCR proximal signaling events. A comparison with Western blot. Cytometry A. 73 (9), 799-807 (2008).
  5. Perbellini, O., Cavallini, C., Chignola, R., Galasso, M., Scupoli, M. T. Phospho-specific flow cytometry reveals signaling heterogeneity in t-cell acute lymphoblastic leukemia cell lines. Cells. 11 (13), 2072(2022).
  6. Kornblau, S. M., et al. Simultaneous activation of multiple signal transduction pathways confers poor prognosis in acute myelogenous leukemia. Blood. 108 (7), 2358-2365 (2006).
  7. Perl, A. E. The role of targeted therapy in the management of patients with AML. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2017 (1), 54µ65(2017).
  8. Márton, A., et al. The roles of phosphorylation of signaling proteins in the prognosis of acute myeloid leukemia. Pathol Oncol Res. 30, 1611747(2024).
  9. Levis, M. FLT3 mutations in acute myeloid leukemia: what is the best approach in 2013. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 220-226 (2013).
  10. Roux, P. P., Topisirovic, I. Signaling pathways involved in the regulation of mRNA translation. Mol Cell Biol. 38 (12), e00070-e00118 (2018).
  11. Nepstad, I., Hatfield, K. J., Grønningsæter, I. S., Reikvam, H. The PI3K-Akt-mTOR signaling pathway in human Acute Myeloid Leukemia (AML) Cells. Int J Mol Sci. 21 (8), ijms21082907(2020).
  12. Jia, X., Zhou, H. Phospho-eIF4E: A new target for acute myeloid leukemia. Curr Protein Pept Sci. 22 (4), 328-335 (2021).
  13. Ghosh, J., Kapur, R. Role of mTORC1-S6K1 signaling pathway in regulation of hematopoietic stem cell and acute myeloid leukemia. Exp Hematol. 50, 13-21 (2017).
  14. Park, H. J., et al. Therapeutic resistance in acute myeloid leukemia cells is mediated by a novel ATM/mTOR pathway regulating oxidative phosphorylation. Elife. 11, 79940(2022).
  15. Oki, T., et al. Imaging dynamic mTORC1 pathway activity in vivo reveals marked shifts that support time-specific inhibitor therapy in AML. Nat Commun. 12 (1), 245(2021).
  16. Lee, H. J., Daver, N., Kantarjian, H. M., Verstovsek, S., Ravandi, F. The role of JAK pathway dysregulation in the pathogenesis and treatment of acute myeloid leukemia. Clin Cancer Res. 19 (2), 327-335 (2013).
  17. Liu, A. C. H., et al. Targeting STAT5 signaling overcomes resistance to IDH Inhibitors in acute myeloid leukemia through suppression of stemness. Cancer Res. 82 (23), 4325-4339 (2022).
  18. Sung, P. J., Sugita, M., Koblish, H., Perl, A. E., Carroll, M. Hematopoietic cytokines mediate resistance to targeted therapy in FLT3-ITD acute myeloid leukemia. Blood Adv. 3 (7), 1061-1072 (2019).
  19. Song, P., Yang, F., Jin, H., Wang, X. The regulation of protein translation and its implications for cancer. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 68(2021).
  20. This Standard Operating Procedure (SOP) describes methods for anesthetizing mice. , McGill University. https://www.mcgill.ca/research/files/research/110-mouse_anesthesia-2024-06-17.pdf (2024).
  21. Tech Team Tips: Preparing a Sample with AO/PI. , DeNovix. https://www.denovix.com/webinars/tech-team-tips-preparing-a-sample-with-ao-pi (2021).
  22. Suni, M. A., Maino, V. C. Flow cytometric analysis of cell signaling proteins. Methods Mol Biol. 717, 155-169 (2011).
  23. Krutzik, P. O., Irish, J. M., Nolan, G. P., Perez, O. D. Analysis of protein phosphorylation and cellular signaling events by flow cytometry: techniques and clinical applications. Clin Immunol. 110 (3), 206-221 (2004).
  24. Chen, W., Luu, H. S. Immunophenotyping by multiparameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 1633, 51-73 (2017).
  25. Perez, O. D., Nolan, G. P. Phospho-proteomic immune analysis by flow cytometry: From mechanism to translational medicine at the single-cell level. Immunol Rev. 210, 208-228 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wewnątrzkomórkowe barwienie przeciwciałamispektralna cytometria przepływowaaspiracja szpiku kostnegomodulacja szlaku sygnałowegoutrwalanie parafomaldehydempermeabilizacja metanolemmultiparametryczny panel przeciwciał
Wewnątrzkomórkowa cytometria fosfoflowa ostrej białaczki szpikowej Ksenotransplantacje pochodzące od pacjentów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.