Artykuł metodologiczny

Mikrowzorowane elastomery magneto-reologiczne do wywoływania zmian w ustawieniu kardiomiocytów

DOI:

10.3791/68271

⸱

10 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Cardiovascular Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware, 4Nemours/Alfred I. duPont Hospital for Children

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy dynamiczną i odwracalną platformę do testowania sztywności wykonaną z ultramiękkiego silikonowego elastomeru (polidimetylosiloksan, PDMS) z osadzonymi cząstkami żelaza. Ten nowatorski test nadaje się do badania pojawiających się czasowo zależnych zmian fizycznych w fenotypach komórek, w tym naprowadzania kontaktowego. Tutaj mierzymy wyrównanie kardiomiocytów noworodków szczurów po usztywnieniu macierzy za pomocą magnetyki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnały związane z podłożem, takie jak mechaniczne i topograficzne, mają głęboki wpływ na odpowiedź komórkową. Jednak wiele badań podstawowych wykorzystuje efekty statyczne lub izolowane. Kierunek i skala czasowa tych mechanicznych efektów na wyłaniające się odpowiedzi komórkowe pozostają w dużej mierze niezbadane. Narzędzia do badania, jak bodźce związane z substratem zmienne w czasie napędzają procesy fizjologiczne i patologiczne, mogą odblokować kolejny poziom mechanobiologicznej wiedzy. Tutaj używamy mikrowzorowanych magnetoreologicznych elastomerów (MRE), które mogą szybko sztywnieć i mięknąć w odpowiedzi na zewnętrzne pole magnetyczne, co pozwala na bardziej rygorystyczne badanie wpływu stymulacji mechanicznej (sztywność) i stymulacji kontaktowej (topograficznej) na orientację i ustawienie kardiomiocytów noworodków u szczurów. Integrując dynamiczną kontrolę sztywności mechanicznej, którą można dostrojić i odwrócić czasowo, możemy rygorystycznie testować wpływ obciążenia poprzez (1) wstępne kondycjonowanie w identycznych warunkach oraz (2) ostrą zmianę biomechaniki in vitro , aby prawidłowo naśladować klinicznie istotną fenomenologię, taką jak zawał mięśnia sercowego. Takie podejście pozwala nam badać wpływ obciążenia na odpowiedzi komórkowe w bardziej realistyczny i kontrolowany sposób.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność serca do efektywnego pompowania krwi zależy od architektury i właściwości mechanicznych (sztywności) mięśnia sercowego, gdzie precyzyjna organizacja komórek i tkanek jest niezbędna dla skoordynowanego skurczu i ogólnej funkcji. Mięśnie sercowe składają się głównie z kardiomiocytów (CM), które u dorosłych wykazują wydłużoną, niemal pręcikowatą morfologię, z sarkomerami (kurczliwymi jednostkami CM) ułożonymi wzdłuż długości komórki. Natomiast CM pochodzące z pluripotentnych komórek macierzystych płodu lub indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) różnią się istotnie od CM dorosłych. Mają one zwykle bardziej zaokrąglony kształt, pojedyncze jądro, nieuporządkowaną lub nieuporządkowaną strukturę sarkomeryczną oraz nieregularną częstotliwość bicia. Strukturalne podobieństwo organizacji mięśnia sercowego in vivo pozwala na synchronizację skurczu i przenoszenia siły; Jest to kluczowe i niezbędne dla odtworzenia naturalnego mięśnia sercowego poprzez model in vitro. Aby wygenerować CM o cechach strukturalnych podobnych do dojrzałego mięśnia sercowego, wcześniejsze badania wykazały skuteczne strategie przyspieszające dojrzewanie, w tym manipulację sztywnością podłoża 1,2, stosowanie naprężeń mechanicznych3, stosowanie wskazówek kontaktowych 4,5 lub elektryczne stymulowanie 6,7.

Od dawna wiadomo, że sztywność środowiska zewnątrzkomórkowego wpływa na komórki. W całym ludzkim ciele występuje ogromna różnorodność sztywności, od setek pascali (Pa) w mózgu po dziesiątki gigapaskali (GPa) w kości 8,9,10. Stwierdzono, że podczas rozwoju tkanki zmieniają sztywność, a ta zmiana reguluje różnicowanie i dojrzewanie na poziomie komórkowym do fenotypów dorosłych niezbędnych do normalnej funkcji 11,12,13,14. Zmiany sztywności również powiązano ze stanami chorobowymi oraz postępem określonych patologii15, 16, 17, 18. Konkretnie, sztywność mięśnia sercowego zmienia się wraz z rozwojem i postępem chorób; na przykład zdrowy mięśniec sercowy ma moduł sprężystości ~10 kPa, w przeciwieństwie do niewydolnego serca, które ma moduł sprężystości 35-70 kPa lub więcej19. Dodatkowo liczne badania in vitro wykazały, że kardiomiocyty hodowane na podłożu podobnym do naturalnej sztywności mięśnia sercowego miały lepszą organizację sarkomerów20, generowały optymalny skurcz 1,19 oraz miały najdłuższy czas trwania potencjału czynnościowego21.

Dodatkowo coraz częściej wiadomo, że komórki in vivo są narażone na złożone różnorodne sygnały topograficzne w swoim mikrośrodowisku, które kształtują i funkcję. Te wskazówki topograficzne występują w różnych rozmiarach i geometriach, od losowego rozmieszczenia integrin na poziomie molekularnym po mikronowe wyrównanie komórek w tkankach mięśniowych 22,23. Podobnie jak inne mechaniczne regulatory, topografia jest istotna dla morfologii komórki, takiej jak rozprzestrzenianie się, wydłużanie, ustawienie, ruchliwość, różnicowanie oraz apoptoza 24,25,26. Wraz z wprowadzeniem syntetycznych substratów hodowlanych opracowano metody tworzenia kontrolowanej topografii powierzchniowej dla hodowli komórek i tkanek 27,28,29. Na przykład mikrowzorowane nano- i mikrorowki zostały wykorzystane do prowadzenia kontaktu dla komórek ssaków, tak aby komórki mogły orientować i przebudowywać swój cytoszkielet, aby podążać za strukturami topograficznymi podłoża hodowlanego.

Wprowadzamy tutaj metodę hodowli in vitro, która integruje zarówno naprowadzanie strukturalne (sygnał kontaktowy), jak i mechaniczne (sztywność) z wykorzystaniem wzorzystego elastomera magnetoreologicznego (MRE), czyli materiału do regulacji usztywnienia lub zmiękczenia poprzez regulację siły pola magnetycznego 17,30,31,32. Umieszczając magnesy blisko podłoża hodowlanego, sztywność można zwiększyć, a stopień usztywnienia można modyfikować poprzez zmianę odległości między próbką a magnesem. Natomiast sztywność można zmniejszyć przez całkowite usunięcie magnesu. To podejście zapewnia solidną, dynamiczną i kontrolowaną metodę odwzorowania warunków mechanicznych podobnych do in vivo, podczas gdy mikrowzorowanie powierzchniowe wprowadza anizotropię, umożliwiając tworzenie większej liczby substratów biomimetycznych 2D do hodowli komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie wzorzystego znaczka PDMS

UWAGA: Stempel PDMS jest niezbędny ze względu na swoją elastyczność, umożliwiając łatwą manipulację i precyzyjny kontakt podczas przygotowania wzorowanej powierzchni MRE. Elastyczność znaczka umożliwia także łatwe usuwanie z warstwy MRE PDMS bez uszkodzenia wzoru, zapewniając zarówno dokładny przekaz wzoru, jak i zachowanie powierzchni MRE.

  1. Przygotuj 10 g 10:1 (baza: środek utwardzający) 184 PDMS.
  2. Wlej 5 g z 184 PDMS do szalki Petriego o średnicy 35 mm i odgazuj w suszarce przez ~5-10 minut, aż wszystkie bąbelki znikną.
  3. Pozwól 184 PDMS częściowo utwardzić w piekarniku w 60 °C przez 30 minut.
  4. Gdy 184 PDMS częściowo utwardzą się 5 minut, dodaj cienką warstwę dodatkowych 184 PDMS do siatki dyfrakcyjnej i odgazuj w suszarce na ~5 minut.
  5. Wyjmij z piekarnika naczynie o średnicy 35 mm z częściowo utwardzonym 184 PDMS.
  6. Przełóż siatkę dyfrakcyjną za pomocą PDMS na częściowo utwardzone 184 PDMS w talerzu 35 mm.
    UWAGA: Upewnij się, że siatka dyfrakcyjna jest skierowana w dół do częściowo utwardzonych 184 PDMS w talerzu 35 mm.
  7. Delikatnie dociśnij kratkę dyfrakcyjną, aż niewielka ilość 184 PDMS otoczy kratkę.
  8. Użyj pozostałych nieutwardzonych 184 PDMS, aby wypełnić naczynie otaczające rusztę, aby utrzymać się na miejscu podczas utwardzania.
  9. Włóż naczynie z siatką dyfrakcyjną do piekarnika ustawionego na 60 °C na 1,5 godziny.
  10. Po pełnym utwardzeniu 184 PDMS wyjmij z piekarnika naczynie o średnicy 35 mm z siatką dyfrakcyjną.
  11. Skalpelem nacinaj siatkę dyfrakcyjną.
  12. Nałóż niewielką ilość alkoholu izopropylowego (IPA), aby przeniknąć pod kratę dyfrakcyjną.
  13. Zdejmij kratkę z 184 PDMS w kierunku równoległym do wzorców.
  14. Usuń nadmiar 184 PDMS, pozostawiając tylko fragment wzorzysty.
  15. Przytnij znaczek 184 PDMS do potrzebnego rozmiaru.
    UWAGA: W tym badaniu używa się znaczka o wymiarach 1 cm × 1 cm dla tych urządzeń.

2. Powłoka powierzchniowa znaczka PDMS

UWAGA: Zabieg silanowy tworzy powłokę powierzchniową, która zapobiega niepożądanemu przyleganiu warstw PDMS podczas tłoczenia, zapewniając płynne rozdzielenie i zachowując jakość przenoszenia wzoru.

  1. Leczenie silanem (preferowana metoda)
    1. Umieść wyprodukowany stempel 184 PDMS w czyścicielu plazmowymO2 , z powierzchnią wzorzystą skierowaną do góry. Traktuj powierzchnię PDMS 45 W plazmyO2 przez 30 sekund.
      UWAGA: Po zdjęciu z czyszczenia plazmowego natychmiast przykryj znaczki pokrywką (lub pokrywką), aby upewnić się, że na czyszczonych pieczątkach nie osiadają żadne zanieczyszczenia.
    2. Włóż znaczki 184 PDMS do osuszacza w okapie spalinowym.
    3. Zerwij pokrywkę rurki mikrowirówki.
    4. Umieść pokrywkę rurki mikrowirówki obok znaczków 184 PDMS w suszarce.
    5. Dodaj 20 μL trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktyl) silanu do pokrywy rurki mikrowirówki.
      UWAGA: Ten związek chemiczny jest niebezpieczny dla zdrowia i dlatego należy go stosować wyłącznie w okapach chemicznych.
    6. Zamknij osuszacz i odkurzaj.
    7. Pozwól silanowi pokrywać stemple od 1 godziny do noclegu.

3. Przygotowanie elastomerów magnetoreologicznych

UWAGA: Aby uzyskać regulowane i odwracalne MRE, precyzyjny stosunek cząstek karbonylu żelaza do elastomeru, połączony z zastosowaniem pola magnetycznego, umożliwia regulację sztywności w zakresie wartości. Poprzez zmianę frakcji cząstek, modułu elastomu bazowego oraz siły pola magnetycznego, sztywność materiału można precyzyjnie dostosować do określonych wymagań.

  1. Przygotowanie MRE w zakresie łagodniejszym zakresem dynamicznym (patrz Tabela 1 , przykłady wag)
    1. Zmierz pożądaną ilość rozcieńczalnika silikonowego i Eco elastomer część B i mieszaj przy 2500 obr./min w mikserze szybkostycznym przez 1 minutę.
    2. Dodaj do roztworu elastomer Eco i cząstki żelaza karbonylowego i mieszaj z prędkością 2500 obr./min w mikserze szybkoprzyswojowym przez 1 minutę.
      UWAGA: Kolejność mieszania jest kluczowa, aby zapewnić pożądany czas polimeryzacji.
    3. Używając pipety transferowej z odciętą końcówką, dodaj 5 g MRE do nowej 35 mm miski Petriego i odgazuj w suszarce przez ~5 minut, a następnie pozwól częściowo utwardzić w piekarniku w 60 °C przez ~10 minut.
      UWAGA: Zapewnienie prawidłowego poziomowania piekarnika i suszarki jest kluczowe dla uzyskania płaskiej próbki, co jest kluczowe dla łatwości obrazowania.
    4. Po 5 minutach użyj pipety transferowej, aby dodać dodatkowy nieutwardzony MRE, aby pokryć powierzchnię znaczka 184 PDMS. Włóż powłokę do osuszacza, aby odgazowała na 5 minut.
      UWAGA: Uważaj, aby nie używać zbyt dużo MRE, ponieważ jeśli zakryje krawędzie znaczka, utrudnie się zdjęcie po pełnym utwardzeniu MRE. Pamiętaj też, aby oznaczyć kierunek wzoru na każdym kroku, aby podczas wyjmowania stemple z MRE można było go pociągnąć równolegle do wzorów.
    5. Wyjmij MRE z piekarnika i użyj kleszczy, aby ostrożnie przesuwać powlekany stempel. Przełóż go twarzą do dołu na częściowo utwardzone MRE i lekko dociśnij. Włóż MRE i powlekany stempel z powrotem do piekarnika w 60 °C na kolejne 25 minut.
    6. Gdy jest całkowicie utwardzony, użyj skalpela, aby naciąć MRE na dole znaczka, prostopadle do wzorów.
    7. Nałóż niewielką ilość IPA na wycięty obszar wokół stempelu.
      UWAGA: IPA powinna wsiąkać w przecięcie i zacząć się poruszać pod stempelem.
    8. Za pomocą kleszczy ściągnij stempel z MRE w kierunku równoległym do wzorów.
  2. Sztywniejsze przygotowanie MRE do zakresu dynamicznego (patrz tabela na przykład wagi)
    1. Przygotuj 30:1 184 PDMS.
      UWAGA: Zrób więcej, bo część zostaje przyklejona do pojemnika do mieszania.
    2. Dodaj pożądaną ilość 527 PDMS części A i części B, następnie cząstki karbonylu żelaza i proporcje 30:1 184 PDMS na podstawie przykładu w tabeli.
    3. Mieszaj go przy 2500 obr./min w mikserze szybkoprędkościowym przez 1 minutę.
    4. Używając pipety transferowej z odciętą końcówką, dodaj 5 g MRE do nowej szalki Petriego o średnicy 35 mm i odgazuj w suszarce przez ~5 minut, a następnie pozwól częściowo utwardzić w piekarniku w 60 °C przez ~40 minut.
    5. Po 5 minutach użyj pipety transferowej, aby dodać dodatkowy nieutwardzony MRE, aby pokryć powierzchnię stempla PDMS. Włóż powłokę do osuszacza, aby odgazowała na 5 minut.
      UWAGA: Uważaj, aby nie używać zbyt dużo MRE, ponieważ jeśli zakryje krawędzie znaczka, utrudnie się zdjęcie po pełnym utwardzeniu MRE. Pamiętaj też, aby oznaczyć kierunek wzoru na każdym kroku, aby podczas wyjmowania stemple z MRE można było go pociągnąć równolegle do wzorów.
    6. Wyjmij MRE z piekarnika.
    7. Użyj kleszczy, aby ostrożnie przesunąć powlekany stempel, odwróć go do dołu na częściowo utwardzone MRE i lekko dociskaj.
    8. Włóż MRE z powlekanym stempelem na górnej pretce do piekarnika w 60 °C na noc.
    9. Gdy wszystko się całkowicie utwardziło, użyj skalpela, aby wyciąć MRE na dole znaczka, prostopadle do wzorów.
    10. Nałóż IPA na miejsce cięcia wokół stempelu.
      UWAGA: IPA powinna wsiąkać w przecięcie i zacząć się poruszać pod stempelem.
    11. Za pomocą kleszczy ściągnij stempel z MRE w kierunku równoległym do wzorów.
Zakres sztywnościMateriałyPrzykładowa waga
Delikatniej10–80 kPaEco (A+B)11,25 g (A)11,25 g (B)
Rozcieńczalnik silikonowy22,5 g
Cząstki żelaza45 g
Sztywniejsi60–120 kPa527 PDMS (A+B)18,75 g (A)18,75 g (B)
Cząstki żelaza37,5 g
184 PDMS (Baza+Cure)14,5 g (Bazowy)0,5 g (Utwardzanie)

Tabela 1: Przykładowe wagi wszystkich materiałów do produkcji zarówno miękkich, jak i sztywniejszych MRE. Wagi w tabeli dotyczą produkcji łącznie 90 g materiału MRE. Przygotowanie mniejszych można osiągnąć poprzez mieszanie wszystkich składników w tych samych stosunkach co przykładowe wagi w tabeli.

4. Przygotowanie hodowli komórkowej

UWAGA: Przygotowanie hodowli komórkowej obejmuje wybór odpowiedniej linii komórkowej, przygotowanie pożywek hodowlanych z niezbędnymi składnikami odżywczymi i czynnikami wzrostu oraz zapewnienie warunków sterylnych zapobiegających skażeniu. Komórki są powlekane w naczyniach hodowlanych i inkubowane w optymalnych warunkach (zwykle 37 °C przy kontrolowanym stężeniuCO2). Regularne monitorowanie, zmiany podłoża i przepuszczanie są wykonywane w celu utrzymania zdrowego wzrostu komórek.

  1. Sterylizuj powierzchnię MRE, myjąc ją 70% etanolem 3 razy i pozwól trzeciemu myciu poczekać 20 minut.
  2. Umyj powierzchnię MRE 3 razy sterylną solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), dodając objętość na tyle, by całkowicie pokryć naczynie, a następnie zasysaj całą ciecz.
  3. Powierzchnię MRE pokryj fibronektyną (10 μg/mL) w PBS przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, aby wspomóc przyczepność komórek do urządzenia.
  4. Umyj powierzchnię MRE 3 razy PBS, podobnie jak w kroku 4.1.2.
  5. Nasiać noworodkowe kardiomiocyty szczurów z gęstością 20 000 komórek/cm2.
  6. Dodawaj magnesy do urządzeń czasowo, aby usztywnić matrycę podczas hodowli komórek.
    UWAGA: Należy uważać przy umieszczaniu urządzeń z magnesami w inkubatorze. Urządzenia muszą być umieszczone w dużych odstępach, aby magnesy nie oddziaływały ze sobą. Badanie zaleca stosowanie inkubatorów wyłożonych stalą nierdzewną zamiast inkubatorów wyłożonych miedzią, ponieważ interakcje są mniejsze.

5. Barwienie i obrazowanie

  1. Obrazowanie stałokomórkowe
    UWAGA: Obrazowanie stałokomórkowe obejmuje kilka kluczowych kroków w celu wizualizacji konkretnych komponentów komórkowych. Po pierwsze, komórki są utrwalane, aby zachować ich strukturę. Następnie błona komórkowa jest przepuszczana, aby umożliwić przenikanie barwnika, a następnie następuje etap blokujący zapobieganie niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał lub barw z niepożądanymi miejscami, takimi jak inne białka czy zanieczyszczenia komórkowe. Komórki są następnie barwione barwnikami lub przeciwciałami wymierzonymi w określone cząsteczki, a nadmiar barwy usuwa się przez mycie. Na koniec zabarwione komórki są obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej do analizy struktur komórkowych.
    1. Umyj raz 1x PBS, dodając objętość na tyle, by całkiem zakryć naczynie, a następnie opróżnij cały płyn.
    2. Napraw komórki, używając 4% (v/v) paradehydu przez 10 minut.
    3. Umyj trzy razy 1x PBS (podobnie jak krok 5.1.1).
    4. Dodaj 0,1% Triton X (w 1x PBS) i inkubuj przez 5 minut, aby przeniknąć.
    5. Umyj trzy razy 1x PBS (podobnie jak krok 5.1.1).
    6. DodajNH 4Cl(50 mM w 1x PBS) i inkubuj przez 15 minut, aby się schłodzić.
    7. Umyj trzy razy 1x PBS (podobnie jak krok 5.1.1).
    8. Dodaj bufor blokujący (5% BSA w 1x PBS) i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
    9. Połącz pierwotne przeciwciało przeciw α-aktyninie w stosunku 1:200 z 5% BSA (w 1x PBS).
      UWAGA: Dokładnie wymieszaj przeciwciała.
    10. Dodaj do próbki roztwór przeciwciał pierwotnych.
      UWAGA: Dodaj tyle, by pokryć całą próbkę.
    11. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Rozważ umieszczenie próbki na kołysce z wolną prędkością, aby ułatwić mieszanie roztworów.
    12. Umyj trzy razy 1x PBS (podobnie jak krok 5.1.1).
    13. Rozcieńcz przeciwciało wtórne (555 Alexa Fluor kozi przeciwmyszy) w 1x PBS (1:2000).
      UWAGA: Przeciwciała wtórne są światłoczułe (fluorofory). Gdy nie są bezpośrednio używane, upewnij się, że są zakryte i chronione przed światłem.
    14. Dodaj do próbki roztwór przeciwciał wtórnych.
    15. Inkubuj w RT przez 2 godziny.
    16. Umyj trzy razy 1x PBS (podobnie jak krok 5.1.1).
    17. Dodaj DAPI (1 μg/mL w sterylizowanej wodzie dejonizowanej) i inkubuj przez 5-10 minut w ciemności.
    18. Obrazuj komórki za pomocą pionowego mikroskopu z soczewką zanurzającą 20x.
    19. Zrób 50 zdjęć na każde urządzenie.
    20. Przetwarzaj obrazy za pomocą wtyczki ImageJ o nazwie Directionality.
      UWAGA: Opcje kierunkowości: W tym badaniu zastosowano n = 45 pojemników, w zakresie od 0° do 176°, aby zapobiec efektowi owijania. Zastosowano metodę lokalnego gradientu, a wybrano tabelę wyświetlania. Wyjście w kierunku odpowiada średniemu kątowi wektora (wskazującemu kąt wyrównania), natomiast wyjście wartości oznacza średnią długość wektora (wskazującą stopień wyrównania).
  2. Obrazowanie żywych komórek
    UWAGA: Obrazowanie żywych komórek umożliwia śledzenie dynamicznych procesów komórkowych w czasie rzeczywistym, jednocześnie utrzymując komórki w ich naturalnym, żywym stanie. Technika ta polega na użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w komorę inkubacyjną do rejestrowania obrazów lub filmów o wysokiej rozdzielczości komórek podczas ich wzrostu, dzielenia się lub reagowania na bodźce. Umożliwia badanie zachowań i interakcji komórkowych w czasie oraz dostarcza cennych informacji o funkcjonowaniu i dynamice komórek.
    1. Inkubuj komórki w stosunku SiR-aktyny 1:1000 z pożywką hodowlową przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    2. Aspiruj medium i zastąp je 1:2000 (SiR-actin: Media).
      UWAGA: To rozcieńczenie ma na celu zmniejszenie toksyczności komórek podczas przedłużonych obrazów na żywo.
    3. Zbieraj obrazy immunofluorescencji co 15 minut przez 5 godzin na pionowym mikroskopie z komorą inkubacyjną, zautomatyzowaną sceną i soczewką 20x z zanurzeniem.
      UWAGA: W eksperymencie obrazowania z żywymi komórkami magnes został dodany zaraz po umieszczeniu MRE w systemie obrazowania na żywo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ultramiękkie silikonowe magnetoreologiczne elastomery (MRE) mają elastyczne moduły, które można precyzyjnie dostroić poprzez zastosowanie pola magnetycznego. Pozwala to na szybkie, dwukierunkowe korekty w zakresie fizjologicznym, z precyzyjną kontrolą zarówno szybkości, jak i skali zmian (Rysunek 1). Mechanika żelu została oceniona poprzez pomiar modułu sprężystości zgodnie z opisaną wcześniejszą ilością i skreślono, że średni moduł sprężystości wynosi 36,3 ± 5,2 kPa przy użyciu magnesu oraz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika ta została rygorystycznie przetestowana, ale staranna uwaga na kilka kroków jest niezbędna do udanego eksperymentu.

W tym protokole używamy komercyjnej siatki dyfrakcyjnej jako głównej formy do wzorowania. Jednak alternatywne formy wzorowane – takie jak silikon czy formy mikroprodukowane SU8 – mogą być również stosowane do tworzenia szerokiej gamy wzorów w różnych rozmiarach33,35. Niektóre komercyjnie dostępne materiały PDMS s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te były częściowo wspierane przez Delaware Center for Musculoskeletal Research COBRE (P20 GM139760), dzięki grantom od National Institute of General Medical Science od National Institutes of Health oraz stanu Delaware. Chcielibyśmy wyrazić szczere podziękowania Sagarowi Doshi z Centrum Materiałów Kompozytowych (CCM) oraz Ashice Singh z laboratorium Dhong na Uniwersytecie Delaware za ich nieocenione wsparcie umożliwiające nam korzystanie z ich laserowych mikroskopów konfokalnych oraz za zapewnienie wiedzy niezbędnej do charakterystyki powierzchni naszych materiałów. Ich wkład znacząco podniósł jakość naszej pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
555 Alexa Fluor przeciwciało przeciwmysie przeciw mysim  ThermoFisher ScientificA-21422https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Mouse-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-21422
Obiektyw zanurzany 20xZeiss421452-9800-000https://www.micro-shop.zeiss.com/zh/us/shop/objectives/421452-9800-000/Objective-W-Plan-Apochromat-20x-1.0-DIC-M27-75mm
Anteny 35 mmThermoFisher Scientific130180https://www.thermofisher.com/search/results?query=130180&focusarea=Search%20All
Przeciwciało pierwotne przeciwciało antyalfa-aktyninaabcamEP2528Yhttps://www.abcam.com/en-us/products/primary-antibodies/alpha-actinin-actn1-antibody-ep2528y-ab81265?srsltid=AfmBOoq4HwHixqCheQwwq
VVbjJ3ogKUmZxa4GtG
3SyllFzWvb5XPnwgB
Mikrosfery karbonylowo-żelazne w proszkuchemicalstore.comCIPMShttps://ironpowders.com/types-of-iron-powder/cipms-carbonyl-iron-powder/
Bejca DAPIThermoFisher ScientificD1306https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D1306
SuszarkaFisher Scientific08-642-7https://www.fishersci.com/shop/products/nalgene-transparent-polycarbonate-classic-design-desiccator/086427#?keyword=
Siatka dyfrakcyjnaLaboratoria ThorGR2550-45031https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=GR2550-45031
Ecoflex Gel część A i BSmooth OnEcoflex  ŻELhttps://www.smooth-on.com/products/ecoflex-gel/
Rozszerzony zestaw plazmowy do produkcji stołowejSigma AldrichZ561657-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z561657
Fibronektyna z osocza bydłaSigma AldrichF1141https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f1141
Flacktek DAC150 SpeedMixer FlacktekDAC150https://flacktek.com/products/small-flacktek/
Oprogramowanie ImageJNIHhttps://imagej.net/ij/download.html
Alkohol izopropylowyAmazonhttps://www.amazon.com/Isopropyl-Alcohol-Grade-Anhydrous-gallon/dp/B01M6YK5I4/ref=sr_1_1_sspa?dib=eyJ2IjoiMSJ9.xiBzaAiE5lSJqXz
ZhS_JhDh8zEHgkMzrbsyosvyBpS
Jjufk90Gt79vk1jOZxq_mG3GKeN8
KT1ulag3ZuMSbWoEOCQUy6txx
uGz4709PyUY5YWyeR2GS0PBNx
dbmEdWvgmCYiDBLf8E2prhImZW
l98MoWlVDU4lg1BtcHTTSOwdg87
5l6Ia3YLPs_0alILBXFsizwwnJodR
8D60ZggK5AHBfCfPadXgfJ-9hUE7
uIto.V3Vf62Lnprtq2u5PRO
SbUFHnPOj1FvD7np7uBge6NuU&
dib_tag=se& hvadid=598724400239
& hvdev=c& hvlocphy=9007460& hvn
ETW=G& hvqmt=e& hvrand=1609157
209668794739& hvtargid=kwd-3203
62094308& hydadcr=5273_13
227703& Słowa kluczowe=izopropyl+alkohol+
amazon& mcid=9f9d3252906531
3ea89ab7766d9c244c& qid=1740
675756& sr=8-1-spons& sp_csd=d2l
kZ2V0TmFtZT1zcF9hdGY& PSC=1
MagnesCMS MagneticsND05578-45Nhttps://www.magnet4sale.com/n45-neodymium-disc-magnet-1-1-2x1-4-35-lb-pull-strong-magnet/
Mikroskop pionowy Nikon Eclipse 80iNikonEclipse 80i
PiekarnikFisher Scientific15-103-0503https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-isotemp-general-purpose-heating-drying-ovens/p-4935382
Rozcieńczalnik silikonowySmooth OnRozcieńczalnik silikonowyhttps://www.smooth-on.com/products/silicone-thinner/
SiR Actin StainCytoszkieletCY-SC001https://www.cytoskeleton.com/sir-actin
Sylgard 184 PDMS (baza + środek utwardzający)Kleje Ellsworth2065622https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-3.9-kg-kit/
Sylgard 527 PDMS część A & BKleje Ellsworth1696742https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-527-silicone-dielectric-gel-clear-0.9-kg-kit/
Pipety transferoweFisher Scientific13-711-5AMMDhttps://www.fishersci.com/shop/products/transfer-pipette-32/137115AMMD?searchHijack=true&searchTerm=13
-711-5AMMD& searchType=
RAPID& matchedCatNo=13
-711-5AMMD
Trichloro – (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktyl) silan Sigma Aldrich448931https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/448931

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacot, J. G., McCulloch, A. D., Omens, J. H. Substrate stiffness affects the functional maturation of neonatal rat ventricular myocytes. Biophys J. 95 (7), 3479-3487 (2008).
  2. Körner, A., Mosqueira, M., Hecker, M., Ullrich, N. D. Substrate stiffness influences structural and functional remodeling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Front Physiol. 12, 710619(2021).
  3. Dou, W., et al. A microdevice platform for characterizing the effect of mechanical strain magnitudes on the maturation of iPSCcardiomyocytes. Biosens Bioelectron. 175, 112875(2021).
  4. Abadi, P. P. S. S., et al. Engineering of mature human induced pluripotent stem cellderived cardiomyocytes using substrates with multiscale topography. Adv Funct Mater. 28 (19), 1707378(2018).
  5. Ahn, H., et al. Hierarchical topography with tunable micro and nanoarchitectonics for highly enhanced cardiomyocyte maturation via multiscale mechanotransduction. Adv Healthc Mater. 12 (12), 2202371(2023).
  6. Chan, Y. C., et al. Electrical stimulation promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. J Cardiovasc Transl Res. 6 (6), 989-999 (2013).
  7. Hirt, M. N., et al. Functional improvement and maturation of rat and human engineered heart tissue by chronic electrical stimulation. J Mol Cell Cardiol. 74, 151-161 (2014).
  8. Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3 (3), 299-306 (2007).
  9. Swift, J., et al. Nuclear laminA scales with tissue stiffness and enhances matrixdirected differentiation. Science. 341 (6149), 1240104(2013).
  10. Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear mechanics and mechanotransduction in health and disease. Curr Biol. 23 (24), R1113-R1121 (2013).
  11. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).
  12. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  13. Hazeltine, L. B., et al. Effects of substrate mechanics on contractility of cardiomyocytes generated from human pluripotent stem cells. Int J Cell Biol. 2012, 508294(2012).
  14. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  15. Deng, B., Zhao, Z., Kong, W., Han, C., Shen, X., Zhou, C. Biological role of matrix stiffness in tumor growth and treatment. J Transl Med. 20 (1), 540(2022).
  16. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 63-73 (2009).
  17. Vite, A., et al. Extracellular stiffness induces contractile dysfunction in adult cardiomyocytes via cellautonomous and microtubuledependent mechanisms. Basic Res Cardiol. 117 (1), 41(2023).
  18. Stowers, R. S., et al. Matrix stiffness induces a tumorigenic phenotype in mammary epithelium through changes in chromatin accessibility. Nat Biomed Eng. 3 (12), 1009-1019 (2019).
  19. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heartlike elasticity: scarlike rigidity inhibits beating. J Cell Sci. 121 (22), 3794-3802 (2008).
  20. Rodriguez, A. G., Han, S. J., Regnier, M., Sniadecki, N. J. Substrate stiffness increases twitch power of neonatal cardiomyocytes in correlation with changes in myofibril structure and intracellular calcium. Biophys J. 101 (10), 2455-2464 (2011).
  21. Boothe, S. D., et al. The effect of substrate stiffness on cardiomyocyte action potentials. Cell Biochem Biophys. 74 (4), 527-535 (2016).
  22. Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).
  23. Martínez, E., Engel, E., Planell, J. A., Samitier, J. Effects of artificial micro and nanostructured surfaces on cell behaviour. Ann Anat. 191 (1), 126-135 (2009).
  24. Ravichandran, R., Liao, S., Ng, C. C., Chan, C. K., Raghunath, M., Ramakrishna, S. Effects of nanotopography on stem cell phenotypes. World J Stem Cells. 1 (1), 55(2009).
  25. Brunetti, V., et al. Neurons sense nanoscale roughness with nanometer sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (14), 6264-6269 (2010).
  26. Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S. G., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: I. Simple step cues. Development. 99 (3), 439-448 (1987).
  27. Nguyen, A. T., Sathe, S. R., Yim, E. K. F. From nano to micro: topographical scale and its impact on cell adhesion, morphology and contact guidance. J Phys Condens Matter. 28 (18), 183001(2016).
  28. DowellMesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1 (2), 78-90 (2004).
  29. Loesberg, W. A., et al. The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion. Biomaterials. 28 (27), 3944-3951 (2007).
  30. Corbin, E. A., et al. Tunable and reversible substrate stiffness reveals a dynamic mechanosensitivity of cardiomyocytes. ACS Appl Mater Interfaces. 11 (23), 20603-20614 (2019).
  31. Bouhrira, N., Vite, A., Margulies, K. B. Distinct cytoskeletal regulators of mechanical memory in cardiac fibroblasts and cardiomyocytes. Basic Res Cardiol. 119 (2), 277-289 (2024).
  32. Lee, B. W., et al. Adult human cardiomyocyte mechanics in osteogenesis imperfecta. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 325 (4), H814-H821 (2023).
  33. Cao, Z., Ball, J. K., Lateef, A. H., Virgile, C. P., Corbin, E. A. Biomimetic substrate to probe dynamic interplay of topography and stiffness on cardiac fibroblast activation. ACS Omega. 8 (6), 5406-5414 (2023).
  34. Clark, A. T., et al. Magnetic field tuning of mechanical properties of ultrasoft PDMSbased magnetorheological elastomers for biological applications. Multifunct Mater. 4 (3), 035001(2021).
  35. Kim, Y., Kwon, C., Jeon, H. Genetically engineered phage induced selective H9c2 cardiomyocytes patterning in PDMS microgrooves. Materials. 10 (8), 973(2017).
  36. Fujiwara, Y., Deguchi, K., Miki, K., Nishimoto, T., Yoshida, Y. A method for contraction force measurement of hiPSCderived engineered cardiac tissues. Methods Mol Biol. 2320, 171-180 (2021).
  37. Dirar, Q., et al. Activation and degranulation of CART cells using engineered antigenpresenting cell surfaces. PLoS One. 15 (9), e0238819(2020).
  38. Kim, C., Kim, H., Park, H., Lee, K. Y. Controlling the porous structure of alginate ferrogel for anticancer drug delivery under magnetic stimulation. Carbohydr Polym. 223, 115045(2019).
  39. Fan, D., et al. Recent advances of magnetic nanomaterials in bone tissue repair. Front Chem. 8, 745(2020).
  40. GonzalezRico, J., et al. Tuning the cell and biological tissue environment through magnetoactive materials. Appl Sci. 11 (18), 8746(2021).
  41. AntmanPassig, M., Shefi, O. Remote magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Lett. 16 (4), 2567-2573 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Elastomery magnetoreologicznesztywno mechanicznasubstraty mikrowzorowanekardiomiocyty noworodk w szczuradynamiczna sztywno substratuwskaz wki topograficznepami mechanicznastemplowanie PDMSpowlekanie fibronektyn

Powiązane artykuły