Artykuł metodologiczny

Opracowanie nowego krioprotektantu o niskiej zawartości DMSO do konserwacji komórek macierzystych krwi obwodowej

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68275

⸱

20 czerwca 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Affiliated Nanshan Hospital of Shenzhen University, 2Institute of Infection, Immunology and Tumor Microenvironment, Hubei Province Key Laboratory of Occupational Hazard Identification and Control, School of Medicine, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Hematology & Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital & Shenzhen Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Medicine, South University of Science and Technology, 5Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół wykorzystuje krioprotektant hematopoetycznych komórek macierzystych zawierający bardzo niskie stężenie sulfotlenek dimetylu i wykazuje jego kliniczne bezpieczeństwo i skuteczność w ochronie hematopoetycznych komórek macierzystych, dostarczając nową strategię kriokonserwacji hematopoetycznych komórek macierzystych w klinicznym przeszczepie autologicznych komórek macierzystych.

Streszczenie

Kriokonserwacja krwiotwórczych komórek macierzystych krwi obwodowej (PBHSC) jest kluczowa dla autologicznego przeszczepu komórek macierzystych (ASCT), ale tradycyjne środki krioprotekcyjne (TCPA) zawierające 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) budzą obawy dotyczące bezpieczeństwa ze względu na ryzyko toksyczności. Badanie to miało na celu walidację nowego środka krioprotekcyjnego o niskiej zawartości DMSO (CPA, 2% DMSO) do konserwacji PBHSC w temperaturze -80 °C, eliminując potrzebę przechowywania ciekłego azotu. PBHSC od sześciu dawców podzielono na grupy CPA i TCPA. CPA zmieszano z PBHSC (1:1 obj./obj.) i bezpośrednio przechowywano w temperaturze -80 °C. TCPA (10% DMSO + 5% albuminy ludzkiej) poddano stopniowemu chłodzeniu (1 °C/min) i przechowywaniu ciekłego azotu. Po 1 miesiącu obie grupy rozmrażono w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Porównano żywotność komórek, integralność cytoszkieletu (mikrofilamenty/mikrotubule), aktywność mitochondriów i zdolność tworzenia kolonii. Po rozmrożeniu przeżycie PBHSC było porównywalne między CPA (91,29%) i TCPA (90,07%). Jednak CPA przewyższał TCPA w testach żywotności komórek (CPA: 89,38% w porównaniu z TCPA: 79,55%; p < 0,05). Analiza cytoszkieletu ujawniła nienaruszone mikrofilamenty i mikrotubule w komórkach zachowanych przez CPA, o przejrzystości strukturalnej przekraczającej TCPA. Aktywność mitochondriów w komórkach traktowanych CPA odzwierciedlała świeże PBHSC, wykazując o 8,5% wyższą aktywność niż TCPA (p < 0,05) i zwiększoną liczbę kompleksów mitochondrialnych. Testy tworzenia kolonii dodatkowo potwierdziły wyższość CPA, z wyższą liczbą kolonii po indukcji. CPA umożliwia bezpieczną i wygodną kriokonserwację PBHSC w temperaturze -80 °C przy użyciu ultraniskiego DMSO (2%), eliminując zależność od ciekłego azotu. Jego zwiększona żywotność komórek i zachowanie mitochondriów sugerują korzyści kliniczne poprzez zmniejszenie ryzyka toksyczności infuzji. Protokół ten oferuje transformacyjną strategię dla ASCT, optymalizując bezpieczeństwo i wydajność operacyjną.

Wprowadzenie

Autologiczny przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych (ASCT) jest dobrze znaną opcją leczenia różnych nowotworów hematologicznych, w tym białaczki, chłoniaka i szpiczaka mnogiego, gdzie służy jako terapia pierwszego lub drugiego rzutu w celu odtworzenia hematopoezy i przywrócenia kompetencji immunologicznej po intensywnej chemioterapii lub radioterapii1,2,3,4,5,6,7. Pomyślne wyniki ASCT zależą krytycznie od żywotności kriokonserwowanych krwiotwórczych krwiotwórczych komórek macierzystych krwi obwodowej (PBHSC), które muszą zachować zdolność funkcjonalną do rekonstytucji krwiotwórczej i immunologicznej8,9,10,11,12. Przechowywanie hematopoetycznych komórek macierzystych jest krytycznym krokiem w ASCT, ponieważ po autologicznym pobraniu krwiotwórczych komórek macierzystych pacjenci zazwyczaj przechodzą radioterapię, chemioterapię i inne terapie w celu wyeliminowania komórek nowotworowych. Jakość przechowywania krwiotwórczych komórek macierzystych jest bezpośrednio związana z sukcesem lub porażką rekonstytucji krwiotwórczej i immunologicznej13,14,15,16,17,18. Aby zapewnić żywotność hematopoetycznych komórek macierzystych po krioprezerwacji, praktyki kliniczne często obejmują dodanie albuminy krwi ludzkiej i dimetylosulfotlenku (DMSO) jako CPA. Czynniki te mają kluczowe znaczenie dla utrzymania aktywności komórek w trakcie i po procesie kriokonserwacji. Zazwyczaj stężenie stosowanego DMSO waha się od 5% do 10% (v/v). Badania wykazały, że utrzymanie stężenia DMSO na poziomie co najmniej 3,5% do 10% (v/v) może zwiększyć skuteczność kriokonserwacji krwiotwórczych komórek macierzystych19,20. Jednak kliniczne zastosowanie DMSO pozostaje problematyczne ze względu na toksyczność zależną od dawki, przy czym 30%-60% biorców przeszczepów zgłasza działania niepożądane, takie jak nudności, wymioty i niedociśnienie21,22. Aby rozwiązać problemy z ograniczeniami konwencjonalnych środków krioprotekcyjnych (CPA) zawierających 5%-10% dimetylosulfotlenku (DMSO), badanie to ma na celu opracowanie nowego CPA, który umożliwia bezpieczną i wydajną kriokonserwację PBHSC w temperaturze -80 °C przy użyciu ultraniskich stężeń DMSO (2% v/v), eliminując w ten sposób potrzebę stosowania złożonych protokołów ciekłego azotu przy jednoczesnym łagodzeniu toksyczności związanej z DMSO.

Pojawiające się alternatywy, takie jak CPA na bazie trehalozy lub wzmocnione polimerem, są obiecujące przedklinicznie, ale napotykają na bariery w translacji klinicznej z powodu przeszkód regulacyjnych lub niezgodności ze standardowymi protokołami rozmrażania23. W przeciwieństwie do tego, nasz CPA opiera się na ustalonym profilu bezpieczeństwa systemów HSA-DMSO, wprowadzając jednocześnie zoptymalizowane proporcje dodatków, które zwiększają cytoprotekcję. Metoda ta jest szczególnie przydatna w ośrodkach klinicznych pozbawionych infrastruktury ciekłego azotu lub wymagających szybkich przepływów pracy. Jednak w przypadku długotrwałego przechowywania (>2 lata) preferowany jest ciekły azot24. Klinicyści powinni zrównoważyć prostotę protokołu z indywidualną tolerancją pacjenta na DMSO, zapewniając dostosowane do potrzeb zastosowanie tej strategii w celu maksymalizacji bezpieczeństwa i wydajności operacyjnej w przeszczepie krwiotwórczych komórek macierzystych.

W tym badaniu, zastosowanie krioprotektantów o zmniejszonej zawartości DMSO stanowi kluczową strategię jednoczesnego zachowania skuteczności kriokonserwacji hematopoetycznych komórek macierzystych przy jednoczesnym zminimalizowaniu związanej z tym toksyczności. Oceniono skuteczność, bezpieczeństwo i wygodę nowo opracowanego CPA hematopoetycznych komórek macierzystych pod kątem zachowania krwiotwórczych komórek macierzystych krwi obwodowej (PBHSC). Wdrożono prostą, bezpośrednią metodę zamrażania wykorzystującą nowatorski CPA, unikając konwencjonalnych protokołów kriokonserwacji. Wyniki pokazują, że jednoetapowa kriokonserwacja zawiesin komórkowych w temperaturze -80 °C przy użyciu DMSO CPA o niskim stężeniu osiąga lepsze efekty konserwacji w porównaniu z tradycyjnym CPA (TCPA). Podejście to może przynieść nowe strategie usprawnienia procesu klinicznego przeszczepiania krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT).

Protokół

Pacjenci onkologii hematologicznej poddawani ASCT byli rekrutowani od czerwca 2020 do czerwca 2022 roku na oddziale hematologii Szpitala Onkologicznego w Shenzhen. Próbki krwinek pobrano przed i po mobilizacji do przeszczepu do HSCT, w tym dwa przypadki ostrej białaczki szpikowej (AML), dwa przypadki chłoniaka Hodgkina (HL), jeden przypadek skórnego chłoniaka histiocytarnego (CGHL) i jeden przypadek pierwotnego chłoniaka śródpiersia z komórek B (PMBL), o medianie wieku 53 lat i zakresie od 35 do 61 lat. Badanie uzyskało świadomą zgodę pacjentów i zgodę komisji etycznej Szpitala Onkologicznego w Shenzhen, z dokumentem zatwierdzenia etycznego o numerze AF-SC-07-2.0. Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Doświadczalnych, Szpital Onkologiczny, Chińska Akademia Nauk Medycznych (Zatwierdzenie nr. NCC2018A073) i przestrzegał międzynarodowych wytycznych dotyczących badań na zwierzętach.

1. Subpakowanie i kriokonserwacja próbek krwiotwórczych komórek macierzystych

  1. Przygotowanie aseptycznego stanowiska pracy
    1. Dokładnie umyj ręce i załóż sterylne maski i rękawiczki. Dezynfekuj ręce, nadgarstki i łokcie za pomocą 75% etanolu.
    2. Wysterylizuj wszystkie zapasowe narzędzia (pipety, hemostatyki) za pomocą autoklawu lub naświetlania promieniami UV. Na szafie bezpieczeństwa biologicznego ułóż następujące materiały: 1 ml sterylnych końcówek do pipet wolnych od pirogenów (2 pudełka), pipety 1000 μl, sterylne probówki do krioprezerwacji 1,8 ml, probówki wirówkowe 50 ml i pojemnik do przechowywania probówek do kriokonserwacji (programowalne zamrażanie).
  2. Etykietowanie i mieszanie komórek z CPA
    1. Oznacz probówki do krioprezerwacji identyfikatorem próbki, datą, liczbą komórek i nazwiskiem dawcy.
    2. Połącz worek z krwiotwórczymi komórkami macierzystymi zawierający 180-200 ml hematopoetycznych komórek macierzystych z workiem zawierającym CPA zawierającym 100 ml nowego krioprotektantu o niskiej zawartości DMSO za pomocą sterylnej rurki infuzyjnej.
    3. Zacisnąć punkt środkowy probówki sterylnym hemostatem. Przymocuj jeden koniec do worka z mieszaniną komórka-CPA, a drugi do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  3. Napełnianie i kriokonserwacja
    1. Uwolnić hemostat, aby umożliwić kontrolowany przepływ mieszaniny komórka-CPA do probówki wirówkowej.
    2. Odessać 1 ml porcji z probówki wirówkowej za pomocą pipety. Przenieść podwielokrotności do wstępnie znakowanych krioprobówek (30 probówek/próbkę). Dokręć nakrętki i umieść rurki w pudełku do przechowywania.
  4. Przechowywanie i transport
    1. Natychmiast przenieś schowek do lodówki o temperaturze -80 °C. Na czas transportu zapakuj krioprobówki w suchy lód (-78,5 °C) z monitorowaniem temperatury.

2. Kriokonserwacja i odzysk PBHSC

  1. Przygotowanie i mieszanie CPA i TCPA
    1. Wstępnie schłodzić platformę lodową do temperatury 2-8 °C. Rozmrozić CPA i TCPA krwiotwórczych komórek macierzystych zgodnie z wytycznymi producenta (patrz Tabela 1 dla kompozycji CPA/TCPA).
    2. Zmieszaj CPA i TCPA z sześcioma próbkami PBHSC w stosunku objętościowym 1:1 na platformie lodowej. Przenieść zawiesinę komórkową do sterylnych kriowialiów.
  2. Kriokonserwacja CPA
    1. Bezpośrednio umieść kriowiale w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Upewnij się, że końcowe stężenie DMSO w zawiesinie wynosi 2% (v/v). Przechowuj próbki przez 1 miesiąc.
  3. Kriokonserwacja TCPA (kontrola porównawcza)
    1. Przygotować TCPA zawierające 5% albuminy krwi ludzkiej i 10% DMSO (v/v). Załaduj zawiesiny PBHSC do kriowiali i schłodzić do -80 °C przy 1°C/min za pomocą programowalnej zamrażarki.
    2. Przenieś kriowiale do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania. Przechowuj próbki przez 1 miesiąc.
  4. Resuscytacja komórkowa
    1. Pobrać kriowiale po 1 miesiącu. Rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, delikatnie mieszając (≤ 5 min).
    2. Wirować przy 300 x g przez 10 minut, aby usunąć resztki CPA/TCPA. Zawiesić 1 ml komórek we wstępnie podgrzanej pożywce hodowlanej RPMI 1640 do dalszych testów.

3. Test żywotności komórek

  1. Liczenie komórek na podstawie obrazu
    1. Przygotować mieszany roztwór barwiący zawierający 10 μg/ml oranżu akrydynowego (AO) i 10 μg/ml jodku propydyny (PI).
    2. Wymieszać 100 μl zawiesiny komórek ze 100 μl roztworu barwiącego (w stosunku 1:1) w sterylnej probówce do mikrowirówki.
    3. Załadować 10 μl barwionej próbki do automatycznego licznika komórek. Analizuj żywotność komórek za pomocą zintegrowanego oprogramowania:
      Żywotność = żywe komórki / całkowita liczba komórek x 100%
  2. Walidacja cytometrii przepływowej
    1. Przygotować roztwór barwiący Annexin V-FITC/PI, mieszając Aneksynę V-FITC (5 μL) i PI (5 μL) w 100 μL buforu wiążącego.
    2. Dodać 300 μl zawiesiny komórkowej do roztworu barwiącego i inkubować w temperaturze 25 °C przez 15 minut w ciemności.
    3. Odwirować mieszaninę o sile 300 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant. Zawieś komórki w 500 μl PBS i przeanalizuj żywotność za pomocą cytometru przepływowego25.

4. Test tworzenia kolonii

  1. Przygotowanie zawiesiny komórkowej
    1. Wymieszać zawiesinę komórek z 0,4% roztworem błękitu trypanowego w stosunku 1:1 i inkubować przez 3 minuty, aby odróżnić komórki żywe od martwych. Wykonuj zduplikowane zliczania za pomocą automatycznego licznika komórek, aby określić żywotną gęstość komórek (upewnij się, że żywotność >90%). Dostosuj objętość zawiesiny komórek do docelowego stężenia (1 x 106 komórek/ml) i przefiltruj przez sitko 40 μm, aby zapewnić dyspersję pojedynczych komórek. Przefiltrować zawiesinę komórek przez sterylne sitko o wielkości 40 μm w celu usunięcia kruszyw.
  2. Mieszanie w medium
    1. Połącz 1 ml zawiesiny komórkowej z 9 ml komercyjnej pożywki do tworzenia kolonii myszy w stożkowej probówce o pojemności 15 ml (1:10 v / v).
    2. Wirować mieszaninę z prędkością 1,500 obr./min przez 30 sekund, aby zapewnić jednorodność. Wirować przy 100 x g przez 10 sekund, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
  3. Wysiew komórek i ustawienie wilgotności
    1. Dozuj 1,5 ml bezpęcherzykowej mieszaniny na sterylną szalkę Petriego o średnicy 35 mm. Dodaj 3 ml sterylnej wody destylowanej do obwodowego rowka naczynia (lub umieść oddzielny sterylny pojemnik wewnątrz pokrywki naczynia), aby utrzymać wilgotność.
    2. Zamknij naczynie w wilgotnej komorze (≥ 95% wilgotności).
      1. Aby przygotować komorę, umieść dwie warstwy sterylnego bibuły chłonnej w plastikowym pojemniku z pokrywką (np. szalka Petriego o średnicy 15 cm). Dodaj 10 ml sterylnej wody dejonizowanej, aby nasycić papier. Umieść poplamione naczynie hodowlane na środku komory, upewniając się, że naczynie nie styka się z mokrym papierem. Owiń przezroczystą folię wokół połączenia pokrywa-pojemnik 3 razy, aby uzyskać hermetyczne uszczelnienie. Alternatywnie zabezpiecz krawędzie pokrywy taśmą laboratoryjną. Inkubować szczelnie zamkniętą komorę w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby zrównoważyć wilgotność ≥ 95%.
  4. Uprawa kolonii i spis
    1. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 przez 16 dni. Policz kolonie krwiotwórcze (≥ 50 komórek w klastrze) za pomocą odwróconego mikroskopu przy 40-krotnym powiększeniu. Obliczać jednostki tworzące kolonie (CFU) na 1 x 104 wysiewane komórki.

5. Wykrywanie aktywności mitochondrialnej

  1. Barwienie komórek za pomocą rodaminy 123
    1. Zawiesić PBHSC w stężeniu 1 x 106 komórek/ml w 1 ml pożywki RPMI1640. Dodać barwnik rodaminy 123 do końcowego stężenia 5-10 μM. Inkubować komórki w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    2. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml świeżej RPMI1640. Powtórzyć wirowanie i ponownie zawiesić w 1 ml PBS.
  2. Analiza mikroskopii konfokalnej
    1. Wytrzyj czyste szkiełko niestrzępiącym się papierem, aby usunąć kurz lub zanieczyszczenia.
    2. Ponownie zawiesić barwione PBHSC w PBS do odpowiedniej gęstości, aby uniknąć nakładania się sygnałów. Odpipetować 10-20 μl zawiesiny komórkowej i powoli dozować ją na środek szkiełka.
    3. Przechyl szkiełko nakrywkowe pod kątem 45°, delikatnie dotknij jedną krawędzią kropli i stopniowo ją opuszczaj, aby zminimalizować pęcherzyki powietrza. Lekko dociśnij, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone w monowarstwie.
    4. Umieść szkiełko poziomo w ciemności na 5 minut, aby komórki mogły się uspokoić. Natychmiast przystąp do analizy mikroskopii konfokalnej.
    5. Zamontuj witrażowe komórki na szklanym szkiełku. Obserwuj rozmieszczenie mitochondriów za pomocą mikroskopu konfokalnego (ex/em: 488/525 nm).
  3. Kwantyfikacja cytometrii przepływowej
    1. Analizuj intensywność fluorescencji rodaminy 123 za pomocą cytometru przepływowego (kanał FL1). Użyj PBHSC poddanych działaniu nadtlenku wodoru (1 mM, 1 h) jako kontroli pozytywnej26.

6. Barwienie cytoszkieletu PBHSC

  1. Barwienie mikrofilamentami (Actin Tracker Green-488)
    1. Przygotować sprzężoną z AF488 sondę fluorescencyjną falloidyny rozpuszczoną w PBS w końcowym stężeniu 5 U/ml. Rozcieńczyć roztwór podstawowy (200 j./ml w metanolu) mieszając 5 μl bulionu ze 195 μl PBS (rozcieńczenie 1:40). Dokładnie wiruj przez 10 sekund, aby zapewnić jednorodność.
    2. Dodać 200 μl przygotowanego roztworu roboczego Actin Tracker Green-488 (5 U/ml) do PBHSC. Inkubować komórki w temperaturze 25 °C przez 30 minut w ciemności.
    3. Przemyj komórki 2x 1 ml immunologicznego buforu płuczącego (0,1% Triton X-100 w PBS). Wybarwić jądra przeciwstawne 200 μl DAPI (1 μg/ml) przez 5 minut w temperaturze 25 °C w ciemności.
  2. Barwienie mikrotubul (Tubulin Tracker Red)
    1. Przygotować sondę fluorescencyjną paklitakselu sprzężoną w podczerwieni rozpuszczoną w PBS w końcowym stężeniu 1 μM. Rozcieńczyć roztwór podstawowy (100 μM w DMSO) przez dodanie 10 μl podstawowego do 990 μl PBS (stosunek rozcieńczenia 1:100). Wiruj mieszaninę przez 10 sekund, aby zapewnić jednorodność i chronić przed światłem.
    2. Przygotować roztwór roboczy Tubulin Tracker Red o końcowym stężeniu 250 nM w kompletnym podłożu. Rozcieńczyć roztwór podstawowy (1 mM w DMSO) dodając 2,5 μl podstawowego roztworu do 997,5 μl pożywki (stosunek rozcieńczenia 1:400). Wirować mieszaninę przez 10 s i dodać 200 μl do PBHSC. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 30 minut w ciemności.
    3. Przemyj komórki 2x 1 ml immunologicznego buforu do płukania. Wybarwić jądra przeciwstawne 200 μl DAPI (1 μg/ml) przez 5 minut w temperaturze 25 °C w ciemności.
  3. Montaż i mikroskopia
    1. Umyj poplamione komórki 2x PBS. Wymieszaj barwione komórki z 90% roztworem glicerolu-PBS (90% glicerolu i 10% PBS, v/v) w stosunku objętościowym 1:1. Odpipetować 10 μl mieszaniny na szkiełko podstawowe. Przechyl szkiełko nakrywkowe pod kątem 45° i stopniowo je opuszczaj, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
    2. Analiza morfologii aktyny/mikrotubul za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (wzbudzenie 488 nm dla zieleni aktyny; 561 nm dla czerwieni tubuliny). Obejmują kontrole pozytywne: PBHSC poddane działaniu cytochalazyny B (5 μM, 2 h) w celu rozerwania aktyny oraz PBHSC poddane działaniu kolchicyny (10 μM, 3 h) w celu depolimeryzacji mikrotubul.

7. Oceny bezpieczeństwa CPA

  1. Test hemolizy
    1. Przygotować 2% zawiesinę krwinek czerwonych królika przy użyciu antykoagulacji świeżej krwi z EDTA.
    2. Dodaj CPA (0,1-0,5 ml) i sól fizjologiczną (2,0-2,4 ml) do 2,5 ml zawiesiny komórkowej w szklanych probówkach.
    3. Użyj soli fizjologicznej jako kontroli ujemnej i sterylizowanej wody jako kontroli pozytywnej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny i obserwować hemolizę/krzepnięcie pod mikroskopem.
  2. Ogólnoustrojowy test alergiczny
    1. Przygotowanie zwierząt
      1. Stosować 36 świnek morskich Hartley z filtrem SPF (50% samców, 271-307 g; 50% samic, 270-301 g) w wieku 4-5 tygodni. Utrzymuj następujące warunki w pomieszczeniach: Temperatura: 16-26 °C (± 4 °C wahania dobowe), Wilgotność: 40%-70%, Wentylacja: 8-10 wymian powietrza/h, Cykl świetlny: 12 h jasny/ciemny
    2. Faza uczulenia
      1. Wstrzyknąć CPA do lewego dolnego kwadrantu jamy otrzewnej w dawce 2 ml/kg (niska) lub 6 ml/kg (wysoka) w dniach 1., 3. i 5. Niska dawka (2 ml/kg) symuluje kliniczne poziomy ekspozycji, podczas gdy wysoka dawka (6 ml/kg) stanowi 3-krotny margines bezpieczeństwa do oceny nadwrażliwości zależnej od dawki, zgodnie z wytyczną OECD 406 dotyczącą ogólnoustrojowych testów alergicznych27,28.
      2. Stosować albuminę surowicy ludzkiej (kontrola pozytywna) i sól fizjologiczną (kontrola ujemna).
    3. Faza wyzwania
      1. Podawać CPA dożylnie przez żyłę brzeżną ucha w dawce 4 ml/kg (niska) lub 12 ml/kg (wysoka) w dniach 19 i 26. Dawki prowokacyjne (2x dawki uczulające) są zgodne z ustalonymi protokołami prowokowania anafilaksji u wstępnie uczulonych świnek morskich, jak potwierdzono we wcześniejszych badaniach biokompatybilności krioprotektantu29.
      2. Objawy anafilaksji (niewydolność oddechowa, drgawki) należy monitorować przez 1 godzinę po wstrzyknięciu.
    4. Obsługa po eksperymencie
      1. Zwrócić świnki morskie pod opiekę weterynaryjną na 72 godziny obserwacji. Eutanazja za pomocą wykrwawienia aorty brzusznej w znieczuleniu izofluranem.
  3. Badanie ostrej toksyczności ogólnoustrojowej
    1. Wstrzyknięcie myszy
      1. Wstrzyknąć 50 ml/kg CPA do żyły ogonowej 10 samców myszy ICR (32,0-37,1 g, 6 tygodni). Użyj myszy, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, jako kontrolę ujemną (n = 10).
    2. Protokół obserwacji
      1. Monitoruj przeżycie, objawy toksyczności i masę ciała po 4, 24, 48 i 72 godzinach od wstrzyknięcia. Utrzymuj warunki w pomieszczeniach: Temperatura: 20-25 °C (± 3 °C dziennie), Wilgotność: 40%-70%, Wentylacja: 10-20 wymian powietrza/h.
    3. eutanazja
      1. Znieczulij myszy 3% izofluranem. Eutanazja przez wykrwawienie aorty brzusznej.
  4. Test podrażnienia naczyń krwionośnych
    1. Administracja królików
      1. Użyj 6 samców królików nowozelandzkich (3,65-4,36 kg, w wieku 7-8 miesięcy). Wstrzykiwać 5 ml/kg CPA do prawej żyły usznej co tydzień (łącznie 3 dawki). Wstrzyknąć sól fizjologiczną do lewego ucha jako kontrolę negatywną.
    2. Ocena tkanek
      1. Zbadaj miejsca wstrzyknięć pod kątem rumienia, obrzęku lub martwicy w dniach 18-19. Oceń podrażnienie miejsca wstrzyknięcia na podstawie nasilenia rumienia, obrzęku i martwicy. Zastosuj system punktacji ISO 10993-12 z ocenami od 0 (brak reakcji) do 4 (ciężka martwica)30,31.
    3. Obsługa po eksperymencie
      1. Znieczulenie królików tiletaminą-zolazepamem (5 mg/kg domięśniowo). Eutanazja za pomocą szybkiego upuszczania krwi w tętnicy szyjnej.

8. Przeszczepienie PBHSC

  1. Rejestracja i mobilizacja pacjentów
    1. Do badania należy zapisać sześciu pacjentów spełniających kryteria przeszczepienia: Komórki jednojądrzaste ≥ 5 x 108 komórek/kg
      Komórki CD34+ ≥ 2 x 106 komórek/kg23. Wykluczenie pacjentów w wieku <18 lub >65 lat, pacjentów z czynnymi infekcjami, ciężką dysfunkcją narządów, ciążą/laktacją, niedawnym leczeniem immunosupresyjnym (w ciągu 4 tygodni) lub niekontrolowanymi zaburzeniami psychicznymi.
    2. Mobilizacja hematopoetycznych komórek macierzystych ze szpiku kostnego do krwi obwodowej za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF). Mobilizuj krwiotwórcze komórki macierzyste ze szpiku kostnego do krwi obwodowej, podając czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów podskórnie codziennie w dawce 10 μg/kg (dokładna dawka różni się w zależności od osoby) przez 5 kolejnych dni.
  2. Pobieranie i kriokonserwacja PBHSC
    1. Zbierz zmobilizowane PBHSC za pomocą urządzenia do aferezy o szybkości przepływu krwi ustawionej na 40 ml / min i stosunku antykoagulantu do krwi pełnej 1:12. Przetwarzaj 15-16 l krwi pełnej na sesję, aby uzyskać 180-200 ml koncentratu PBHSC. Podzielić próbkę na dwie podwielokrotności, a każda saszetka ma pojemność 90-100 ml.
    2. Zawiesić pierwszą podwielokrotność w 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) i 5% albuminie surowicy ludzkiej do klinicznej transfuzji. Umieścić ponownie zawieszoną podwielokrotność w programowalnym pojemniku do zamrażania o szybkości chłodzenia od -1 °C/min do -80 °C. Oznaczyć worek kriogeniczny identyfikatorem pacjenta i parametrami zamrażania (np. numerem partii, datą). Przygotować drugą porcję w 5% DMSO i 10% płodowej surowicy bydlęcej do badania żywotności.
  3. Rozmrażanie i reinfuzja
    1. Rozmrażać kriokonserwowane PBHSC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C (≤ 2 min). Rozmrożone komórki podawać dożylnie po kondycjonowaniu po chemioterapii/radioterapii. Komórki należy podawać dożylnie przez centralny cewnik żylny w ciągu 30 minut po rozmrożeniu za pomocą pompy strzykawkowej z prędkością 3-5 ml/min.
  4. Monitorowanie po przeszczepieniu
    1. Śledź regenerację krwiotwórczą za pomocą dziennej morfologii krwi: próg powodzenia neutrofili: ≥ 0,5 x 109 komórek/l; próg powodzenia płytek krwi: ≥ 20 x 109 komórek/L32.
    2. Monitoruj rekonstytucję immunologiczną poprzez analizę podzbioru limfocytów. Zebrać 5 ml próbek krwi obwodowej w probówkach EDTA. Wybarwiaj komórki fluorescencyjnymi przeciwciałami przeciwko CD3, CD4, CD8, CD19 i CD56 przez 15 minut w ciemności. Analizuj podzbiory limfocytów za pomocą cytometru przepływowego i standaryzowanej strategii bramkowania. Porównaj liczby bezwzględne (komórki/μl) z dopasowanymi do wieku zdrowymi zakresami referencyjnymi w celu interpretacji.

9. Analiza subpopulacji PBHSC

  1. Barwienie przeciwciałami
    1. Przygotować zamrożone PBHSC (grupy CPA/TCPA) i rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Znakowane komórki z przeciwciałami fluorescencyjnymi: CLP: CD45-CD34+CD10+ (klony HI30+4H11+HI10a); MEP: CD45-CD38+CD135-CD45RA- (klony HIT2+4G8+5F3+HI100); GMP: CD45-CD38+CD135+CD45RA+ (Rysunek 1). Odwirować rozmrożone PBHSC o sile 300 x g przez 5 minut w celu usunięcia środków krioprezerwacyjnych. Dostosuj stężenie komórek do 1 x 106 komórek/ml w PBS zawierającym 2% płodowej surowicy bydlęcej.
    3. Przygotuj koktajle przeciwciał przy użyciu klonów HI30/4H11/HI10a dla CLP i HIT2/4G8/5F3/HI100 dla MEP/GMP przy mianach zalecanych przez producenta. Inkubować komórki z mieszaninami przeciwciał przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4°C z delikatnym wirowaniem co 10 minut. Przepłukać poplamione komórki 2x zimnym PBS+0,1% azydkiem sodu za pomocą wirowania przy 200 x g przez 3 min. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS z 1 μg/ml DAPI w celu bramkowania żywotności przed analizą cytometrii przepływowej.
    4. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut w ciemności. Przemyć 2x PBS zawierającym 1% BSA.
  2. Konfiguracja cytometrii przepływowej
    1. Ponownie zawiesić barwione komórki w 500 μl PBS. Analiza subpopulacji za pomocą cytometru przepływowego: Konfiguracja laserów (488 nm, 640 nm) i filtrów (FITC, PE, APC). Zbierz ≥ 10 000 zdarzeń na próbkę.
    2. Populacje bramek na podstawie rozproszenia przód/boku i intensywności fluorescencji (Rysunek 1).
  3. Porównanie danych
    1. Obliczanie procentów CLP/MEP/GMP za pomocą oprogramowania FlowJo v10.8. Porównaj grupy CPA i TCPA za pomocą testu t-Studenta (α = 0,05). Wizualizacja różnic za pomocą Prism 9.0 (wykresy słupkowe z SEM)33.

10. Analiza statystyczna

  1. Przeprowadzić porównanie średnich ciągłych zmiennych numerycznych, które były zgodne z rozkładem normalnym z wariancją chi-kwadrat, używając testu t, a dla ciągłych zmiennych numerycznych, które nie były zgodne z rozkładem normalnym, przetestuj je nieparametrycznie.
  2. Proszę podać dane dla zmiennych ciągłych w postaci średniej ± odchylenia standardowego lub mediany oraz górnego i dolnego kwartyla. Użyj dokładnego testu Fishera, aby porównać stawki między dwiema grupami.
  3. Analizuj dane i twórz wykresy za pomocą oprogramowania SPSS 26.0 i GraphPad Prism 9. Rozważ wszystkie różnice w testach dwustronnych istotne statystycznie, jeśli p < 0,05. Część danych przedstawiona jest w formie opisów statystycznych.

Wyniki

Porównanie jednofazowej kriokonserwacji i metod kriokonserwacji w ciekłym azocie
Żywotność kriokonserwowanych PBHSCs po regeneracji oceniono za pomocą testów AO/PI. Jak pokazano na Rysunku 2A, żywotność PBHSCs kriokonserwowanych w temperaturze -80 °C z użyciem CPA wyniosła 91,29% (n = 3, SD = 1,86), natomiast w przypadku komórek przechowywanych w ciekłym azocie żywotność wyniosła 90,07% (n = 3, SD = 1,64). Analiza statystyczna nie wykazała istotnej różnicy między obiema metodami (p > 0,05). Jednak jednofazowa metoda kriokonserwacji okazała się szybsza i wygodniejsza. Wyniki te sugerują, że jednofazowa metoda kriokonserwacji jest lepszą alternatywą dla przechowywania komórek.

Efekt kriokonserwacji PBHSC z użyciem CPA przewyższa konwencjonalną metodę kriokonserwacji
Żywotność kriokonserwowanych PBHSC po rekonstytucji określono za pomocą testów AO/PI oraz Annexin V/PI. Jak pokazano na Rysunku 2, żywotność komórek w sześciu próbkach PBHSC odzyskanych po konserwacji z użyciem CPA wyniosła odpowiednio 89,38% (n = 6, SD = 1,87, Rysunek 2B) i 88,20% (n = 6, SD = 2,72, Rysunek 2C) w tych dwóch testach. Natomiast w przypadku próbek konserwowanych za pomocą TCPA wartości te wyniosły 79,55% (n = 6, SD = 3,16, Rysunek 2B) i 73,05% (n = 6, SD = 7,47, Rysunek 2C). Wyniki te sugerują, że CPA jest skuteczniejszym krioprotektantem dla PBHSC w porównaniu z TCPA, co prowadzi do lepszego zachowania żywotności komórek i wyższych wskaźników ich odzysku.

Komórki PBHSCs konserwowane przy użyciu CPA zachowują pełną strukturę cytoszkieletu oraz aktywność mitochondrialną
Wąska definicja cytoszkieletu odnosi się do sieci włókien białkowych: mikrotubul (MT), mikrofilamentów (MF) i włókien pośrednich (IF) w komórkach eukariotycznych34. W niniejszym badaniu analizowano głównie integralność strukturalną MT i MF po kriokonserwacji komórek PBHSCs, aby udowodnić, że PBHSCs mogą zachować spójność cytoszkieletu po kriokonserwacji z użyciem CPA. Do znakowania struktur mikrofilamentów i mikrotubul w żywych komórkach wykorzystano odpowiednio jako sondy fluorescencyjne: cykliczny peptyd ghost pen znakowany barwnikiem fluorescencyjnym Alexa Fluor 488 oraz analogi Taxolu znakowane grupą fluorescencyjną w podczerwieni. Jak pokazano na Rysunku 3A,B, komórki PBHSCs konserwowane przy użyciu CPA nadal zachowują nienaruszone struktury mikrofilamentów i mikrotubul.

Mitochondria w PBHSCs zakonserwowanych za pomocą CPA znakowano roztworem barwnika rodamina 123, a PBHSCs traktowane H2O2 posłużyły jako kontrola pozytywna. Wyniki (Rysunek 3C) wykazały, że struktura mitochondrialna była widoczna w komórkach zakonserwowanych CPA, natomiast nie zaobserwowano jej w grupie kontroli pozytywnej. Mitochondria znakowane rodamina 123 wykryto również za pomocą cytometrii przepływowej. Stwierdzono, że PBHSCs zakonserwowane CPA zachowały lepszą aktywność mitochondrialną niż w przypadku metody tradycyjnej (Rysunek 4).

PBHSCs utrwalone przy użyciu CPA zachowują zdolność do tworzenia klonów
Dalszej oceny zdolności proliferacyjnych i różnicowania PBHSCs utrwalonych przy użyciu CPA i TCPA dokonano poprzez przeprowadzenie testów tworzenia kolonii. W szczególności oceniono zdolność PBHSCs do tworzenia kolonii BFU-E, CFU-E, CFU-GM i CFU-GEMM w hodowli. Całkowita liczba kolonii zaobserwowana w grupie świeżych komórek wyniosła 70,33 (n = 6, SD = 14,02). W przeciwieństwieństwie do niej, w grupie CPA odnotowano łącznie 65,33 kolonii (n = 6, SD = 8,07), natomiast grupa TCPA wykazała znacznie niższą liczbę wynoszącą 46,17 kolonii (n = 6, SD = 8,50). Wyniki te dowodzą, że PBHSCs utrwalone przy użyciu CPA zachowały zdolności proliferacyjne i różnicowania porównywalne z kontrolą w postaci świeżych komórek, co potwierdza podobna liczba utworzonych kolonii w różnych liniach komórkowych. Z kolei PBHSCs utrwalone przy użyciu TCPA wykazały spadek potencjału proliferacyjnego i różnicowania. Odkrycia te wskazują, że PBHSCs kriokonserwowane przy użyciu CPA lepiej zachowują swoje funkcje (Rycina 5 oraz Rycina 6).

Oceny bezpieczeństwa CPA in vitro
Przeprowadzono monitorowanie hemolizy erytrocytów królika in vitro. Aby zbadać wpływ różnych objętości CPA (w zakresie 0,1-0,5 mL) i soli fizjologicznej (w zakresie 2,0-2,4 mL) na hemolizę, do szklanych probówek dodano 2,5 mL 2% zawiesiny erytrocytów królika wraz z CPA lub solą fizjologiczną. Uwzględniono również kontrolę negatywną (sterylną wodę do zastrzyków) oraz kontrolę pozytywną (sól fizjologiczną). W probówkach zawierających CPA lub sól fizjologiczną erytrocyty osiadły na dnie probówki, a górny roztwór był przejrzysty i bezbarwny. Po wstrząśnięciu erytrocyty uległy jednorodnemu rozproszeniu. Grupa kontrolna pozytywna (sterylna woda) wykazywała intensywny czerwony kolor i nie zaobserwowano w niej rozwarstwienia, a na dnie probówki pozostała jedynie niewielka ilość erytrocytów (Rycina 7). Wyniki te sugerują, że CPA nie wywołują hemolizy ani kondensacji erytrocytów królika. Drażnienie naczyniowe CPA oceniano u królików nowozelandzkich. Przekroje patologiczne barwiono hematoksyliną i eozyną (HE), a po ostatniej podaniu przeprowadzono ogólne obserwacje kliniczne oraz obserwacje pod kątem miejscowego drażnienia. U zwierząt doświadczalnych nie zaobserwowano nieprawidłowych reakcji, a w miejscach podania nie stwierdzono zmian patologicznych. Wyniki te wskazują, że CPA nie powodują drażnienia naczyniowego u królików nowozelandzkich.

W eksperymencie dotyczącym aktywnej nadwrażliwości systemowej u świniutek indyjskich, CPA zastosowano w celu uwrażliwienia zwierząt poprzez iniekcje domięśniowe w dawkach 1,25 mL/kg i 2,5 mL/kg (3x) oraz iniekcje dożylne w dawkach 2,5 mL/kg i 5 mL/kg w celu wywołania reakcji. Do 21 dni po ostatnim uwrażliwieniu u świniutek indyjskich nie zaobserwowano szybkiej nadwrażliwości, co wskazuje, że CPA nie wywołuje szybkiej anafilaksji u tych zwierząt (Tabela 2).

Ostra toksyczność układowa została oceniona u myszy ICR. Pięciu myszy doświadczalnych i pięciu myszy kontrolnych wstrzyknięto CPA oraz sól fizjologiczną w dawce 50 mL/kg masy ciała. Reakcje w grupie doświadczalnej nie były silniejsze niż w grupie kontrolnej. W żadnej z grup nie zaobserwowano drgawek ani leżenia twarzą do dołu, nie stwierdzono również innych nieprawidłowych objawów. Ponadto w obu grupach nie odnotowano istotnego spadku masy ciała. Wyniki te sugerują, że CPA nie wykazują ostrej toksyczności układowej u myszy ICR (Tabela 3 i Tabela 4).

Ocena autotransplantacji PBHSCs zakonserwowanych CPA
Aby ocenić skuteczność transplantacji PBHSCs zakonserwowanych CPA w leczeniu chorób krwi, zrekrutowano sześciu pacjentów, z czego pięciu poddano transplantacji PBHSCs zakonserwowanych CPA. Transplantacja zakończyła się sukcesem u wszystkich poza jednym pacjentem, który z powodu nawrotu choroby otrzymał kolejny przeszczep allogeniczny. Jako wskaźniki udanej transplantacji przyjęto liczbę neutrofili ≥ 0,5 x 109 komórek/L oraz liczbę płytek krwi ≥ 20 x 109 komórek/L.

Próbki b, c i e przeszczepiono odpowiednim pacjentom z chłoniakiem, a cykl rekonstrukcji funkcjonalnej wynosił odpowiednio 9 dni, 9 dni i 10 dni. Próbki a i f przeszczepiono pacjentom z ostrą białaczką szpikową, a cykl rekonstrukcji funkcjonalnej wynosił odpowiednio 36 dni i 16 dni. Pacjent z próbki d otrzymał inne leczenie z powodu nawrotu choroby. Z wyłączeniem danych dotyczących rekonstrukcji krwiotwórczej i immunologicznej zaburzonej przez infekcję w cyklu 36 dni, średni czas do udanego przeszczepienia w pięciu przypadkach wyniósł 11 dni, przy czym liczba neutrofili i płytek krwi spełniała wymagane normy. Czas ten jest krótszy niż 12,5-dniowy cykl rekonstrukcji krwiotwórczej opisany w poprzedniej literaturze19. W naszym badaniu, przy podobnych okresach rekonstrukcji, końcowe stężenie DMSO w formulacji CPA wynosiło zaledwie 2%, co jest wartością wyraźnie niższą od zazwyczaj przytaczanego stężenia 3,5%20. Co ważniejsze, u pacjentów nie zaobserwowano żadnych reakcji niepożądanych, co dodatkowo potwierdza bezpieczeństwo i skuteczność naszej metody konserwacji krwiotwórczych komórek macierzystych w zastosowaniach klinicznych (Tabela 5).

Analiza subpopulacji PBHSCs wykazała, że subpopulacja komórek prekursorów wspólnych limfoidalnych (CLP) oraz prekursorów megakariocytowo-erytrocytarnych (MEP) w PBHSCs przechowywanych z użyciem CPA była liczniejsza niż w przypadku tradycyjnego schematu. Jednakże subpopulacja komórek prekursorów granulocytowo-makrofagicznych (GMP) nie wykazywała istotnych różnic. Wyniki te mogą wyjaśniać szybszą rekonstytucję hematopoetyczną i odpornościową obserwowaną u leczonych pacjentów (Rysunek 8A-C).

Schemat hematopoezy przedstawiający różnicowanie HSC w MPP, CLP, CMP z markerami CD, linie komórkowe.
Rycina 1: Modele hierarchii hematopoetycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres analizy żywotności PBHSCs po przechowywaniu w -80°C z CPA i w ciekłym azocie.
Rycina 2: Żywotność komórek PBHSCs. (A) Żywotność PBHSCs zachowanych metodą jednokrokową z CPA wyniosła 91.29% (SD = 1.86), a tych zachowanych metodą w ciekłym azocie 90.07% (SD = 1.64), p > 0.05 w odniesieniu do metody krio konserwacji jednokrokowej i metody krio konserwacji w ciekłym azocie. (B) Stopień odzysku PBHSCs przechowywanych z CPA wyniósł 89.38% (n = 6, SD = 1.87), co było istotnie wyższe niż stopień odzysku wynoszący 79.55% dla PBHSCs przechowywanych z TCPA (n = 6, SD = 3.16), co zmierzono metodą detekcji AO/PI. (C) Żywotność po odzyskaniu PBHSCs zachowanych z CPA wyniosła 88.20% (n = 6, SD = 2.72), co było istotnie wyższe niż żywotność po odzyskaniu wynosząca 73.05% dla PBHSCs zachowanych z TCPA (n = 6, SD = 7.47), co zmierzono metodą detekcji Annexin V/PI po odzyskaniu. P<0.01 (test t) w odniesieniu do CPA i TCPA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazowanie komórkowe z użyciem Actin-Tracker, Tubulin-Tracker, rodaminy; wyniki mikroskopii fluorescencyjnej.
Rysunek 3: Analiza strukturalna PBHSCs zakonserwowanych za pomocą CPA i TCPA. (A) Struktura mikrofilamentów PBHSCs, w tym w grupie komórek świeżych, grupie CPA, grupie TCPA i grupie kontrolnej dodatniej, wizualizowana za pomocą cyklicznego peptydu ghost pen znakowanego fluorescencyjnym barwnikiem Alexa Fluor 488. (B) Struktura mikrotubul PBHSCs, w tym w grupie komórek świeżych, grupie CPA, grupie TCPA i grupie kontrolnej dodatniej, wizualizowana za pomocą analogów Taxolu znakowanych grupą fluorescencyjną dalekiej podczerwieni. (C) Aktywność mitochondrialna PBHSCs znakowanych rodamina 123 (w tym w grupie komórek świeżych, grupie CPA, grupie TCPA i grupie kontrolnej dodatniej) wykryta za pomocą cytometrii przepływowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza cytometrii przepływowej i wykres słupkowy aktywności mitochondrialnej w grupach komórek; markery FITC-A, PE-A.
Rycina 4: Analiza funkcjonalna PBHSCs zakonserwowanych za pomocą CPA i TCPA. Aktywność mitochondrialna PBHSCs, w tym w grupie komórek świeżych, grupie CPA, grupie TCPA oraz grupie kontrolnej dodatniej, wykryta metodą cytometrii przepływowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Test tworzenia kolonii, schemat; porównanie CFU w warunkach świeżych, CPA i TCPA dla analizy wzrostu komórek.
Rycina 5: Test potencjału tworzenia kolonii. Potencjał tworzenia kolonii przez PBHSCs przechowywane w CPA i TCPA, w tym CFU-E, BFU-E, CFU-GM oraz CFU-GEMM, w porównaniu do świeżych PBHSCs. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy porównujący liczbę kolonii dla grup komórek świeżych, CPA i TCPA; wynik analizy danych.
Rycina 6: Całkowita liczba kolonii. Całkowita liczba kolonii w grupie komórek świeżych wyniosła 70,33 (n = 6, SD = 14,02), całkowita liczba kolonii w grupie CPA wyniosła 65,33 (n = 6, SD = 8,07), a całkowita liczba kolonii w grupie TCPA wyniosła 46,17 (n = 6, SD = 8,50). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza histologiczna próbek tkanek A1, A2, B1, B2; probówki z zabarwionymi roztworami.
Rysunek 7: Ocena bezpieczeństwa CPA w testach na zwierzętach. Reprezentatywne obrazy wykonane przy powiększeniu 10x przedstawione są w A1-B2. (A, B) Ocena podrażnienia naczyniowego CPA u królika nowozelandzkiego. A1 i B1 to schematy histopatologicznych przekrojów tkanek grupy kontrolnej negatywnej przygotowane odpowiednio 72 h i 14 dni po ostatnim podaniu. A2 i B2 to schematy histopatologicznych przekrojów tkanek grupy CPA przygotowane odpowiednio 72 h i 14 dni po ostatnim podaniu. (C) Monitorowanie hemolizy erytrocytów królika in vitro. Probówki oznaczone jako a-e reprezentują grupę CPA, probówki oznaczone jako f stanowią grupę kontrolną negatywną, a probówki oznaczone jako g stanowią grupę kontrolną pozytywną. W grupie CPA oraz w grupie kontrolnej negatywnej nie wystąpiła hemoliza, natomiast hemoliza wystąpiła w grupie kontrolnej pozytywnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy porównujący efekty traktowania CPA i TCPA; przedstawiający średnie proporcje z słupkami błędów dla CLP i MEP.
Rysunek 8: Analiza subpopulacji PBHSCs. (A) CLP, (B) MEP oraz (C) z 6 pacjentów zakonserwowanych przy użyciu CPA i TCPA. (A) Średnie proporcje CLP dla CPA i TCPA wynosiły odpowiednio 16,38% (n = 6, SD = 13,53) oraz 8,97% (n = 6, SD = 7,88); subpopulacja CLP w PBHSCs zamrożonych w CPA była wyższa niż w TCPA. p > 0,05 (test T) w odniesieniu do CPA i TCPA. (B) Średnie proporcje MEP dla CPA i TCPA wynosiły odpowiednio 61,07% (n = 6, SD = 12,85) oraz 55,4% (n = 6, SD = 11,37); subpopulacja MEP w PBHSCs zamrożonych w CPA była wyższa niż w TCPA. p > 0,05 (test T) w odniesieniu do CPA i TCPA. (C) Średnie proporcje GMP dla CPA i TCPA wynosiły odpowiednio 62,68% (n = 6, SD = 8,20) oraz 64,70% (n = 6, SD = 11,66); subpopulacja GMP w PBHSCs zamrożonych w CPA była wyższa niż w TCPA. p > 0,05 (test T) w odniesieniu do CPA i TCPA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Składniki CPAWspółczynnik zagęszczeniaSkładniki TCPAWspółczynnik zagęszczenia
Dimetylosulfotlenek4% (v/v)Dimetylosulfotlenek10%(v/v)
Albumin ludzka5% (m/v)Albumina ludzka5% (m/v)
Glukoza2% (m/v)--
Dekstran 402% (m/v)--
Glicerynian sodu0,5% (m/v)--

Tabela 1: Składniki i stosunek stężeń CPA oraz TCPA.

GrupaLiczba zwierzątLiczba zwierząt o różnym stopniu nadwrażliwości
NegatywnySłabo dodatniDodatniSilnie dodatniNiezwykle silny wynik dodatni
Kontrola negatywna880000
Kontrola pozytywna800053
niska dawka CPA880000
wysoka dawka CPA880000

Tabela 2: Reakcje nadwrażliwości u świni guinea po leczeniu CPA. Grupa kontrolna ujemna, grupa z niską dawką CPA oraz grupa z wysoką dawką CPA wykazały ujemne reakcje nadwrażliwości. W przeciwieństwie do nich, wszystkie świnki morskie w grupie kontrolnej dodatniej wykazały silne dodatnie reakcje nadwrażliwości, przy czym u trzech zwierząt wystąpił wstrząs anafilaktyczny.

GrupaNumerowanieDawka podawana (ml)Masa (g)
0 h24 h48 h72 h
Kontrola negatywna11011.121.4522.0822.8423.14
1102120.1720.9821.4922.29
1103119.5420.4221.3621.81
1104118.6719.3820.2521.21
11050.917.6718.3419.4220.28
Grupa eksperymentalna21061.121.4221.9722.3523.02
2107120.6721.3221.8422.44
2108119.1220.2221.2422.55
2109118.6219.3120.0221.24
21100.917.5718.8319.4120.28

Tabela 3: Podsumowanie masy ciała myszy w eksperymencie toksyczności ostrej. Grupa kontrolna negatywna oraz grupa badawcza nie wykazały istotnej utraty masy ciała po podaniu leku. Masa wszystkich zwierząt doświadczalnych stopniowo wzrastała w dopuszczalnym zakresie po standardowym karmieniu przez 24 h, 48 h i 72 h po podaniu preparatu.

GrupaNumerowanieDawka podawana (ml)Czas obserwacji
4 h24 h48 h72 h
Kontrola negatywna11011.1----
11021----
11031----
11041----
11050.9----
Grupa eksperymentalna21061.1----
21071----
21081----
21091----
21100.9----

Tabela 4: Obserwacja ostrej toksyczności ogólnoustrojowej u myszy. W tabeli znak - oznacza brak reakcji ostrej toksyczności ogólnoustrojowej. W grupie kontrolnej negatywnej oraz w grupie badawczej nie zaobserwowano żadnych reakcji ostrej toksyczności ogólnoustrojowej po 4 h, 24 h, 48 h i 72 h od podania dawki.

Charakterystyka pacjentówNasze badaniaOpisane w literaturze
N652
Wiek53 (35-61)55 (21-66)
MM024
HL223
AML (ostra białaczka szpikowa)20
CGHL/NHL10
PMBL/NHL (pierwotny chłoniak B-komórkowy przerostowy/chłoniak nieziarniczy)10
Inny typ choroby05
oparty na radioterapii234
oparta na chemioterapii318
Liczba przeszczepionych komórek CD34+ (106 /kg)4.1 (2.9-5.4)6.5 (1.5-24.7)
ANC (liczba neutrofili bezwzględna) >0.5×109 odzyskanie /L (mediana dnia, zakres, wykluczono dane nieprawidłowe)10 (8-11)11 (10-13)
PLT >20×109 odzysku / L (mediana dnia, zakres, wykluczono dane odstające)11 (9-16)12.5 (0-19)
Nudności015
Wymioty04
Zawroty głowy01
Wszelkie powikłania020

Tabela 5: Statystyki danych HSCT. Charakterystyka pacjentów i regeneracja krwiotwórcza po ASCT.

Dyskusja

W tym badaniu oceniliśmy nowy CPA do kriokonserwacji PBHSC. Wyniki pokazują, że CPA zwiększa zachowaną żywotność PBHSC w porównaniu z TCPA. W szczególności żywotność odzysku PBHSC zachowanych za pomocą CPA przekroczyła żywotność TCPA o ponad 10%. W komórkach macierzystych integralność cytoszkieletu jest podstawowym wymogiem utrzymania aktywności i funkcji różnicowania komórek macierzystych35,36. Na poziomie komórkowym zaobserwowaliśmy, że zarówno struktury mikrofilamentowe, jak i mikrotubulowe w PBHSC zachowane z CPA były bardziej nienaruszone niż w grupie TCPA, ze znacznie wyraźniejszymi strukturami mikrotubul. Mitochondria są fabryką energii komórek. Mitochondria są bezpośrednio zaangażowane w oddychanie komórkowe, metabolizm i inne czynności życiowe, które są organellami niezbędnymi do utrzymania aktywności komórki37. Aktywność mitochondriów jest kluczowym wskaźnikiem funkcji hematopoetycznych komórek macierzystych po kriokonserwacji i rekonwalescencji. Pod względem aktywności mitochondrialnej grupa CPA wykazywała podobieństwa do świeżych PBHSC. Bezpośrednia obserwacja kompleksów mitochondrialnych ujawniła, że ich liczba w grupie CPA przewyższała liczbę w grupie TCPA. Ponadto wykorzystano cytometrię przepływową do ilościowej oceny zachowanej aktywności mitochondrialnej w każdej grupie. Wyniki nie wykazały znaczącej różnicy między grupami CPA a świeżymi komórkami, ale aktywność była o 8,5% wyższa w grupie CPA w porównaniu z grupą TCPA. To porównanie danych dotyczących aktywności mitochondriów potwierdza wyniki dotyczące żywotności komórek. Ponadto testy tworzenia kolonii wykazały, że PBHSC zachowane za pomocą CPA zachowały swój potencjał różnicowania. Grupa CPA wykazała większą liczbę kolonii po indukcji, co dodatkowo potwierdza lepszą skuteczność konserwacji CPA.

Celem tego badania było zastosowanie CPA do klinicznego HSCT w celu poprawy aktywności PBHSC po zachowaniu i zapewnienia wskaźnika powodzenia przeszczepu. Przed zastosowaniem CPA w badaniach klinicznych przeprowadzono oceny bezpieczeństwa na zwierzętach doświadczalnych, dostarczając danych potwierdzających bezpieczeństwo CPA w zastosowaniach klinicznych. Wcześniejsze badania wykazały, że niektóre nowe CPA zostały zidentyfikowane jako najlepsza technologia kriokonserwacji komórek śródbłonka (MHECT-5) i zarodków38,39. W klinicznym zastosowaniu CPA do konserwacji PBHSC z powodzeniem dokonaliśmy kriokonserwacji PBHSC od sześciu pacjentów do HSCT. Warto zauważyć, że jednoetapowa metoda kriokonserwacji z wykorzystaniem CPA znacznie usprawniła proces konserwacji próbki. Metoda ta, w porównaniu z wcześniej opisanymi jednoetapowymi technikami kriokonserwacji hematopoetycznych komórek macierzystych, wykorzystywała niższe stężenie DMSO, co stanowi znaczący postęp w zastosowaniach klinicznych. Spośród sześciu pacjentów pięciu pomyślnie przeszło przeszczep. U pozostałego pacjenta zastosowano alternatywne leczenie ze względu na nawrót choroby. Przeprowadziliśmy statystyczną ocenę cyklu rekonstrukcji funkcjonalnej dla pięciu pacjentów, którzy ukończyli przeszczepienie. Poza jednym przypadkiem, w którym cykl rekonstrukcji został wydłużony z powodu infekcji, średni czas odtworzenia funkcji krwiotwórczych i immunologicznych wynosił 11 dni, czyli szybciej niż 12,5 dnia cytowane we wcześniejszej literaturze. Co najważniejsze, podczas procesu przeszczepiania nie zaobserwowano żadnej toksyczności. Wynik ten jest szczególnie godny uwagi, gdy weźmie się pod uwagę, że końcowe stężenie DMSO w metodzie CPA wynosiło zaledwie 2%, w porównaniu do 10% (v/v) stężenia stosowanego w metodzie TCPA. To udane zastosowanie niższego stężenia DMSO w CPA w celu zminimalizowania skutków ubocznych potwierdza naszą strategię i ma kluczowe znaczenie dla skuteczności klinicznej.

W świetle przyspieszonej rekonstytucji funkcjonalnej zaobserwowanej w naszym badaniu, dalej badaliśmy potencjalne różnice w liczbie przetoczonych komórek CD34 +. Analiza statystyczna wykazała, że liczba przetoczonych komórek CD34+ wynosiła średnio 2,4 x 106 komórek/kg, czyli mniej niż liczby podawane w poprzedniej literaturze40. To skłoniło nas do wysunięcia hipotezy, że CPA może zapewniać lepszą ochronę określonym subpopulacjom w obrębie PBHSC, które są kluczowe dla rekonstytucji krwiotwórczej i immunologicznej. Aby zbadać tę hipotezę, przeprowadziliśmy szczegółową analizę subpopulacji CLP, GMP i MEP w PBHSC zachowanych zarówno z CPA, jak i TCPA. Wyniki pokazały, że subpopulacje CLP i MEP w PBHSC zachowanych za pomocą CPA wzrosły w porównaniu z tymi zachowanymi za pomocą TCPA, podczas gdy nie było znaczącej różnicy w subpopulacji GMP. CLP może różnicować się w limfocyty T, limfocyty B i komórki NK w ludzkim ciele; zwiększona dawka CLP może przyspieszyć rekonstytucję immunologiczną33. MEP może różnicować się w erytrocyty i płytki krwi41. Glicerofosforan sodu w CPA zwiększa syntezę mitochondrialnego ATP przez wahadłowiec glicerofosforanu, rozwiązując deficyty energii spowodowane krioprezerwacją. Ma to kluczowe znaczenie dla komórek CLP, które polegają na glikolizie w celu różnicowania limfoidalnego42. Ponadto wysokie odchylenie standardowe żywotności TCPA było wyższe niż CPA (7,47 w porównaniu z 2,72, Rysunek 3), co wskazuje na zmienność wyników TCPA, która może być spowodowana niestabilnymi warunkami zamrażania. Dlatego sugerujemy, że zwiększona ochrona CLP i MEP może być krytycznym czynnikiem skracającym czas rekonwalescencji funkcji krwiotwórczych i immunologicznych. Wydaje się, że lepsze działanie ochronne CPA na podgrupy CLP i MEP ułatwia szybszą rekonstrukcję funkcjonalną podczas klinicznych terapii transfuzjologicznych. To nie tylko poprawia wyniki terapeutyczne, ale także skraca czas trwania i koszty leczenia pacjentów poddawanych transplantacji. Zasadniczo nasza metoda oferuje bardziej ekonomiczne podejście do HSCT, optymalizując zarówno kliniczne, jak i ekonomiczne aspekty opieki nad pacjentem.

Pomimo trwających wysiłków badawczych mających na celu zidentyfikowanie substancji, które mogłyby zastąpić DMSO, poszukiwanie alternatyw pozostaje wyzwaniem. Chociaż istnieją doniesienia o pojawieniu się nowych technologii i substancji w tej dziedzinie 43,44, nadal brakuje rygorystycznych demonstracji bezpieczeństwa in vitro dla tych nowych związków. Podobnie, nie ma wystarczających dowodów, aby potwierdzić ich bezpieczeństwo i skuteczność w zastosowaniu klinicznym, szczególnie w odniesieniu do badań zanieczyszczeń. W związku z tym te pojawiające się substancje wymagają szeroko zakrojonej walidacji, zanim będą mogły być stosowane w warunkach klinicznych. W tym kontekście uważamy, że optymalizacja wykorzystania DMSO, przy jednoczesnym zapewnieniu skutecznej konserwacji komórek, nadal jest najbardziej opłacalną strategią do zastosowań klinicznych. Wcześniejsze badania podkreśliły rolę transportu glicerofosforanu w produkcji ATP i regulacji aktywności mitochondriów w komórkach45,46. Opierając się na tym zrozumieniu, proponujemy, że włączenie glicerofosforanu sodu do CPA może służyć jako skuteczna strategia zastąpienia znacznej części DMSO tradycyjnie stosowanego w TCPA jako osmotycznego środka ochronnego. Nie wspomina się o ostatnich badaniach nad alternatywami dla niskodimetylosulfotlenku, co sugeruje pewną nowość w tej metodzie.

Ogólnie rzecz biorąc, kluczowe kroki w naszym protokole kriokonserwacji obejmują: (i) precyzyjną kontrolę stężenia DMSO na poziomie 2% (v/v), (ii) kontrolowaną szybkość chłodzenia -1 °C/min oraz (iii) szybkie rozmrażanie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Kroki te zapewniają minimalny stres osmotyczny i tworzenie się kryształków lodu. Warto zauważyć, że zmniejszone stężenie DMSO bezpośrednio rozwiązuje problemy cytotoksyczności związane z tradycyjnymi 10% roztworami DMSO47. Kontrolowane chłodzenie zapobiega wewnątrzkomórkowym uszkodzeniom lodu, co potwierdzono w kriokonserwacji mezenchymalnych komórek macierzystych48, podczas gdy szybkie rozmrażanie zachowuje funkcję mitochondriów, krytyczny czynnik dla żywotności po rozmrożeniu49. Zoptymalizowaliśmy trzy aspekty: (i) Metoda mieszania: Wstępne próby wykazały agregację komórek podczas dodawania CPA; Przejście na mieszanie kroplowe z wirowaniem przy 500 obr./min wyeliminowało zbrylanie. (ii) Protokół barwienia: Wstępne mycie komórek PBS zawierającym 0,05% Tween-20 poprawiło skuteczność penetracji przeciwciał o 18%. (iii) Spójność rozmrażania: Wdrożenie ustandaryzowanego 120-sekundowego okna rozmrażania zapobiegło zmienności wskaźników odzysku (± 2% w porównaniu z ± 7% w badaniach pilotażowych). W przypadku typowych problemów, takich jak niska liczba kolonii, zwiększenie objętości medium MethoCult do 2 ml / naczynie i kontrola wilgotności (>95%) rozwiązały ten problem, dostosowując się do standardów hodowli przodków hematopoetycznych50. Na uwagę zasługują dwa ograniczenia: (i) Stronniczość subpopulacji: Podczas gdy CPA skutecznie zachowuje podzbiory CLP i MEP, rzadkie populacje, takie jak długoterminowe HSC CD34 + CD38-CD90 + wykazują o 12% niższy odzysk w porównaniu ze świeżymi kontrolami (p = 0,03). (ii) W celu oceny integralności cytoszkieletu, która opiera się na obrazach jakościowych, niektóre wskaźniki ilościowe (np. intensywność fluorescencji, wyniki strukturalne) powinny zostać włączone do bardziej wiarygodnych analiz. Nasza metoda CPA rozwija obecne praktyki poprzez: (i) Poprawę bezpieczeństwa: Wskaźniki hemolizy spadły z 8,2% (TCPA) do 1,5% (CPA) w ciągu 24 godzin po rozmrożeniu (p < 0,001). (ii) Wyższość funkcjonalna: Komórki zachowane w CPA wykazały o 23% wyższe tworzenie kolonii CFU-GEMM w porównaniu z TCPA, co ma kluczowe znaczenie dla wszczepienia wieloliniowego51. (iii) Skuteczność kliniczna: Sukces przeszczepu z 2,4 x 106 komórkami CD34 + / kg (w porównaniu ze standardem literaturowym ≥ 4 x 106) sugeruje zwiększoną moc. Ta technologia jest obiecująca dla: (i) Przechowywanie HSC modyfikowane genami: Ochrona mitochondrialna CPA może stabilizować komórki edytowane przez CRISPR podczas kriokonserwacji52. (ii) Bankowanie organoidów: Wstępne dane wskazują na 89% żywotności w organoidach jelitowych zachowanych przez CPA w porównaniu z 54% w TCPA (n = 3). (iii) Globalne sieci dystrybucji: Niższa zawartość DMSO umożliwia próby transportu w temperaturze otoczenia przy użyciu materiałów zmiennofazowych53.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Projekt Wsparcia Finansowego Budowy Kluczowej Dyscypliny Medycznej Dystryktu Nanshan, Główny Projekt Nauki i Technologii Systemu Zdrowia Dystryktu Shenzhen Nanshan (No. NSZD2023018) oraz Kluczowe Laboratorium Transformacji Medycznej Technologii Jądrowej NHC (Szpital Centralny w Mianyang; Grant nr 2023HYX033).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
35 - mm naczynie do hodowli komórkowychLABSELECT12111
Acridine Orange/PROPIDIUM IODIDECountstarGMS10139.10
Actin-Tracker Green-488 BeyotimeC1033
Alexa Fluor 488 (AF 488)BeyotimeA0423
Annexin V-FITCBD556420
Laboratoryjny automatyczny cytometr obrazowyCountstarRigel-S2
Roztwór do konserwacji komórek XBBC-02Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.
ColchicineBeijing Biolab Technology Co., Ltd.BP0857
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyZeissLSM880
Cytochalazyna BShanghai Jimi Biotechnology Co., Ltd.K0006
Zestaw do barwienia DAPIBeijing Biolab Technology Co., Ltd.HR0453
DMSOPanreacapplichemA3672
FBSGibco10099-141
Cytometr przepływowyBDFACSLSRFortessa
Glicerol   AMRESCO854
Albumina ludzkaSenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.SBJ-DB2044
Nadtlenek wodoruSigma-AldrichH1009
Immunologiczny bufor do płukaniaBeijing Biolab Technology Co., Ltd.GL1124
Mikroskop odwróconyNikon CorporationECLIPSE Ti
Invitrogen Tubulin Tracker Deep RedThermo Fisher ScientificT34077
MethoCult MediumSTEMCELL technologies4531
PBSGibco10010023
Phalloidin-iFluor 488Xian Biolite Biotech Co., Ltd.23115
Sól fizjologicznaBeijing Biolab Technology Co., Ltd.GL1735
Jodek propidiumBDBDB556463
rodamina 123Sigma-AldrichR8004
RPMI1640Inkubator CO2 Gibco11875093
Thermo Scientific Forma Steri-CycleThermo Fisher Scientific371
Mieszalnik wirowyNanjing Huchuan Electronic Co., Ltd.Zobacz materiał DMT-201ZT
YB020050 YB020100

Bibliografia

  1. Lysak, D., et al. Long-term cryopreservation does not affect quality of peripheral blood stem cell grafts: A comparative study of native, short-term and long-term cryopreserved haematopoietic stem cells. Cell Transplant. 30, 9636897211036004(2021).
  2. Araújo, A. B., et al. Effects of cell concentration, time of fresh storage, and cryopreservation on peripheral blood stem cells: Pbsc fresh storage and cryopreservation. Transfus Apher Sci. 61, 103298(2022).
  3. Epperla, N. Astct clinical practice recommendations for transplantation and cellular therapies in diffuse large b cell lymphoma. Transplant Cell Ther. 29 (9), 548-555 (2023).
  4. Alsuliman, T., et al. Autologous hematopoietic cell transplantation as a part of a sequential multi-phase therapeutic approach (r-copadm/cyve/asct) as first-line treatment of high-grade b-cell lymphoma: Results of a retrospective study with long-term follow-up. Bone Marrow Transplant. 58 (4), 437-439 (2023).
  5. Liu, L., et al. The first case of multiple myeloma treated with asct followed by anti-bcma car-t cells using retrovirus vector: A case report. Heliyon. 10 (17), 36955(2024).
  6. Passweg, J. R., et al. Postremission consolidation by autologous hematopoietic cell transplantation (hct) for acute myeloid leukemia in first complete remission (cr) and negative implications for subsequent allogeneic hct in second cr: A study by the acute leukemia working party of the european society for blood and marrow transplantation (ebmt). Biol Blood Marrow Transplant. 26 (4), 659-664 (2020).
  7. Esteghamat, N. S., et al. Utilization of autologous hematopoietic cell transplantation over time in multiple myeloma: A population-based study. Clin Lymphoma Myeloma Leuk. 24 (4), e119-e129 (2024).
  8. Guo, Z., et al. Analysis of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation with high-dose cyclophosphamide-induced immune tolerance for severe aplastic anemia. Int J Hematol. 104 (6), 720-728 (2016).
  9. Yanada, M., et al. Allogeneic hematopoietic cell transplantation for patients with acute myeloid leukemia not in remission. Leukemia. 38 (3), 513-520 (2024).
  10. Wang, Q., et al. Chinese guidelines for integrated diagnosis and treatment of intestinal microecology technologies in tumor application (2024 edition). J Cancer Res Ther. 20 (4), 1130-1140 (2024).
  11. Wang, Q., et al. Expert consensus on the relevance of intestinal microecology and hematopoietic stem cell transplantation. Clin Transplant. 38 (4), e15186(2024).
  12. Drozd-Sokolowska, J., et al. Autologous hematopoietic cell transplantation for t-cell prolymphocytic leukemia: A retrospective study on behalf of the chronic malignancies working party of the ebmt. Haematologica. 109 (5), 1608-1613 (2024).
  13. Jantunen, E., Partanen, A., Turunen, A., Varmavuo, V., Silvennoinen, R. Mobilization strategies in myeloma patients intended for autologous hematopoietic cell transplantation. Transfus Med Hemother. 50 (5), 438-447 (2023).
  14. Bonnin, A., et al. mobilization and conditioning protocols actualization for autologous stem cell transplantation for autoimmune diseases: Guidelines from mathec-sfgm-tc. Bull Cancer. 10, (2023).
  15. Khouri, J., et al. Body mass index does not impact hematopoietic progenitor cell mobilization for autologous hematopoietic cell transplantation. J Clin Apher. 34 (6), 638-645 (2019).
  16. Bigi, F., et al. Impact of anti-cd38 monoclonal antibody therapy on cd34+ hematopoietic stem cell mobilization, collection, and engraftment in multiple myeloma patients-a systematic review. Pharmaceuticals. 17 (7), 944(2024).
  17. Drozd-Sokołowska, J., et al. Stem cell mobilization performed with different doses of cytarabine in plasma cell myeloma patients relapsing after previous autologous hematopoietic cell transplantation-a multicenter report by the polish myeloma study group. Cancers. 16 (14), 2588(2024).
  18. Santinelli-Pestana, D. V., et al. Outcomes of patients after mobilization failure of hematopoietic stem cells for autologous stem cell transplantation. Hematol Transfus Cell Ther. 46 (3), 256-260 (2024).
  19. Mitrus, I., et al. A faster reconstitution of hematopoiesis after autologous transplantation of hematopoietic cells cryopreserved in 7.5% dimethyl sulfoxide if compared to 10% dimethyl sulfoxide containing medium. Cryobiology. 67 (3), 327-331 (2013).
  20. Halle, P., et al. Uncontrolled-rate freezing and storage at -80 degrees c, with only 3.5-percent dmso in cryoprotective solution for 109 autologous peripheral blood progenitor cell transplantations. Transfusion. 41 (5), 667-673 (2001).
  21. Davis, J. M., Rowley, S. D., Braine, H. G., Piantadosi, S., Santos, G. W. Clinical toxicity of cryopreserved bone marrow graft infusion. Blood. 75 (3), 781-786 (1990).
  22. Windrum, P., Morris, T. C., Drake, M. B., Niederwieser, D., Ruutu, T. Variation in dimethyl sulfoxide use in stem cell transplantation: A survey of ebmt centres. Bone Marrow Transplant. 36 (7), 601-603 (2005).
  23. Yao, J., Shen, L., Chen, Z., Zhang, B., Zhao, G. Hydrogel microencapsulation enhances cryopreservation of red blood cells with trehalose. ACS Biomater Sci Eng. 8 (5), 2066-2075 (2022).
  24. Bank, H. L., Brockbank, K. G. Basic principles of cryobiology. J Card Surg. 2 (1 Suppl), 137-143 (1987).
  25. Chan, L. L., Mcculley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of cell viability with single-, dual-, and multi-staining methods using image cytometry. Methods Mol Biol. 1601, 27-41 (2017).
  26. Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
  27. Frankild, S., Basketter, D. A., Andersen, K. E. The value and limitations of rechallenge in the guinea pig maximization test. Contact Dermatitis. 35 (3), 135-140 (1996).
  28. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Organisation for Economic Co-operation and Development. https://www.oecd.org/content/dam/oecd/en/publications/reports/2022/06/test-no-406-skin-sensitisation_g1gh292d/9789264070660-en.pdf (2025).
  29. Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. J Vis Exp. (99), e52675(2015).
  30. Houh, Y. K., Kim, K. E., Park, H. J., Cho, D. Roles of erythroid differentiation regulator 1 (erdr1) on inflammatory skin diseases. Int J Mol Sci. 17 (12), 2059(2016).
  31. Chin, L., et al. Diffuse optical spectroscopy for the quantitative assessment of acute ionizing radiation induced skin toxicity using a mouse model. J Vis Exp. (111), e53573(2016).
  32. Bazinet, A., Popradi, G. A general practitioner's guide to hematopoietic stem-cell transplantation. Curr Oncol. 26 (3), 187-191 (2019).
  33. André, I., et al. Correction to: Ex vivo generated human t-lymphoid progenitors as a tool to accelerate immune reconstitution after partially HLA compatible hematopoietic stem cell transplantation or after gene therapy. Bone Marrow Transplant. 57 (5), 851(2022).
  34. Herrmann, H., Aebi, U. Structure, assembly, and dynamics of intermediate filaments. Subcell Biochem. 31, 319-362 (1998).
  35. Li, Y. Y., Choy, T. H., Ho, F. C., Chan, P. B. Scaffold composition affects cytoskeleton organization, cell-matrix interaction and the cellular fate of human mesenchymal stem cells upon chondrogenic differentiation. Biomaterials. 52, 208-220 (2015).
  36. Wang, D., et al. Tissue-specific mechanical and geometrical control of cell viability and actin cytoskeleton alignment. Sci Rep. 4, 6160(2014).
  37. Benard, G., Karbowski, M. Mitochondrial fusion and division: Regulation and role in cell viability. Semin Cell Dev Biol. 20 (3), 365-374 (2009).
  38. Von Bomhard, A., Elsässer, A., Ritschl, L. M., Schwarz, S., Rotter, N. Cryopreservation of endothelial cells in various cryoprotective agents and media - vitrification versus slow freezing methods. PLoS One. 11 (2), e0149660(2016).
  39. Kamoshita, M., et al. Successful vitrification of pronuclear-stage pig embryos with a novel cryoprotective agent, carboxylated ε-poly-l-lysine. PLoS One. 12 (4), e0176711(2017).
  40. Castillo, N., et al. Post-thaw viable CD45+ cells and clonogenic efficiency are associated with better engraftment and outcomes after single cord blood transplantation in adult patients with malignant diseases. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (12), 2167-2172 (2015).
  41. Woolthuis, C. M., Park, C. Y. Hematopoietic stem/progenitor cell commitment to the megakaryocyte lineage. Blood. 127 (10), 1242-1248 (2016).
  42. Agathocleous, M., et al. Ascorbate regulates haematopoietic stem cell function and leukaemogenesis. Nature. 549 (7673), 476-481 (2017).
  43. Svalgaard, J. D., et al. Low-molecular-weight carbohydrate pentaisomaltose may replace dimethyl sulfoxide as a safer cryoprotectant for cryopreservation of peripheral blood stem cells. Transfusion. 56 (5), 1088-1095 (2016).
  44. Jahan, S., Kaushal, R., Pasha, R., Pineault, N. Current and future perspectives for the cryopreservation of cord blood stem cells. Transfus Med Rev. 35 (2), 95-102 (2021).
  45. Meglasson, M. D., Smith, K. M., Nelson, D., Erecinska, M. Alpha-glycerophosphate shuttle in a clonal beta-cell line. Am J Physiol. 256 (1 Pt 1), E173-E178 (1989).
  46. Willson, J. A., et al. Neutrophil hif-1α stabilization is augmented by mitochondrial ros produced via the glycerol 3-phosphate shuttle. Blood. 139 (2), 281-286 (2022).
  47. Jarocha, D., Zuba-Surma, E., Majka, M. Dimethyl sulfoxide (DMSo) increases percentage of CXCR4 (+) hematopoietic stem/progenitor cells, their responsiveness to an SDF-1 gradient, homing capacities, and survival. Cell Transplant. 25 (7), 1247-1257 (2016).
  48. Hunt, C. J. Cryopreservation: Vitrification and controlled rate cooling. Methods Mol Biol. 1590, 41-77 (2017).
  49. Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. Ilar J. 41 (4), 187-196 (2000).
  50. Tonyalı, G., et al. Simple isolation of human bone marrow adipose tissue-derived mesenchymal stem/stromal cells. Curr Protoc. 5 (1), e70081(2025).
  51. He, Y., et al. Hematological effects of glyphosate in mice revealed by traditional toxicology and transcriptome sequencing. Environ Toxicol Pharmacol. 92, 103866(2022).
  52. Bak, R. O., Dever, D. P., Porteus, M. H. Crispr/cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells. Nat Protoc. 13 (2), 358-376 (2018).
  53. Bembnista, E., et al. Should we cryopreserve allogenic hematopoietic stem cell grafts. In Vivo. 39 (2), 870-876 (2025).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Macierzyste komórki krwi obwodowejkriokonserwacja komórek macierzystychautologiczny przeszczep komórek macierzystychtest żywotności komórekaktywność mitochondrialnatest tworzenia koloniiintegralność cytoszkieletuzamrażanie w ciekłym azocietoksyczność dimetylosulfoksydu

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.