Artykuł metodologiczny

Indukowana niebieskim światłem półlosowa mutageneza na specyficznym egzogennym DNA w szczepie Escherichia coli BL21

DOI:

10.3791/68283

⸱

20 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory, Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, 2Department of Emergency Medicine, Mount Sinai Hospital, 3NNHS, 2024 International Genetically Engineered Machine Team, Luoyang Central Hospital, 4USC Alfred E. Mann School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Southern California

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony protokół opisuje uproszczone metody rozpoznawania dowolnego egzogennego DNA przy jednoczesnym generowaniu mutacji tylko na tych egzogennych DNA w Escherichia coli.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologie mutagenezy są szeroko stosowane w hodowli wariacyjnej, ukierunkowanej ewolucji i inżynierii białek. Jednak większość metod może indukować tylko losowe mutacje genomowego DNA, które są niekontrolowane, prowadząc do deformacji, a nawet śmiertelnych skutków. W tym przypadku, wykorzystując fuzję trzech systemów: edytora zasad cytozyny (CBE), indukowanych niebieskim światłem elementów p-Mag / n-Mag i rozszczepionej polimerazy RNA T7, ta opisana metoda obejmuje kontrolowany niebieskim światłem, specyficzny dla regionu DNA, półlosowy system mutagenezy.

System ten może mutować cytozynę do tyminy na DNA, zaczynając od promotora T7, a kończąc na terminatorze T7. Każdy egzogenny gen znajdujący się za promotorem T7 może być potencjalnie zmutowany. Narzędzia te zostały również zaprojektowane w dwóch częściach, aby system mógł być sterowany za pomocą niebieskiego światła. Pierwsza część została stworzona przez fuzję CBE z n-Mag i genem polimerazy RNA N-terminal-T7. Druga część polegała na fuzji p-Mag z polimerazą RNA C-terminal-T7. W niebieskim świetle te dwie części zostały połączone, aby działać jako generator mutacji w DNA między promotorem T7 a terminatorem T7. Bez niebieskiego światła p-Mag jest odłączany od n-Mag, uwalniając CBE od edycji DNA.

Celem tego protokołu jest wygenerowanie specyficznych dla regionu losowych mutacji w Escherichia coli z kontrolą światła niebieskiego i dalsza walidacja zmutowanych plazmidów. System można dostosować do systemu ewolucji in vivo , w którym można wybrać funkcję interesującego genu i zebrać pożądane mutacje do dalszych badań.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Losowe mutacje i dobór naturalny są kluczowymi siłami napędzającymi ewolucję, która wygenerowała dużą zmienność genetyczną między gatunkami. Proces ewolucyjny został wykorzystany jako potężne narzędzie do inżynierii białek o zoptymalizowanych lub nowatorskich funkcjach1. Szacuje się, że naturalne tempo mutacji w wyniku replikacji DNA wynosi około jednej na 109 zasad na podział komórki u wielu prokariontów i eukariontów2. Niskie wskaźniki naturalnych mutacji sprawiają, że generowanie dużej różnorodności genetycznej w laboratoriach jest niepraktyczne. Badania koncentrowały się na opracowaniu metod, które zwiększają tempo mutacji, aby objąć jak najwięcej miejsc w danym genie w rozsądnym czasie.

Opracowano wiele systemów w celu osiągnięcia wyższych wskaźników mutacji w laboratoryjnych badaniach ewolucji 3,4,5,6,7,8,9,10. Systemy ewolucji in vitro wykorzystują podatny na błędy PCR, mutagenezę saturacji ukierunkowaną na miejsce lub projektowanie bibliotek obliczeniowych w celu wprowadzenia mutacji w genach będących przedmiotem zainteresowania1. Biblioteki DNA są przekształcane w komórki gospodarza, w których produkty białkowe są badane lub selekcjonowane. Etapy mutagenezy i selekcji w ewolucji in vitro nie są sprzężone, co ogranicza wydajność i skalę populacji, które można wygenerować11. Systemy ewolucji in vivo przezwyciężyły ograniczenia, wprowadzając systemy mutacji do komórek i sprzęgając etapy mutagenezy i selekcji, aby umożliwić ciągłą ewolucję. Wcześniejsze metody mutagenezy in vivo wykorzystywały mutageny chemiczne 3,4 i szczepy mutatorowe 5,6. Jednak metody te cierpią z powodu niskich wskaźników mutacji, braku kontroli oraz wąskiego lub nierównego spektrum mutacji12. W ramach ostatnich badań opracowano nowatorskie i ulepszone systemy ewolucji in vivo, reprezentowane przez OrthoRep, ortogonalny system replikacji DNA podatny na błędy 7,8; MutaT7, fuzja deaminazy cytydyny zpolimerazą 9 RNA T7; i EvolvR, fuzja nickazy Cas9 z podatną na błędy polimerazą DNA10. Metody te mają różne komórki gospodarza, kontekst docelowy i łatwość implementacji.

Polimeraza RNA T7 (T7 RNAP), kluczowy składnik systemu MutaT7, została szeroko przebadana i opracowana w dziedzinie biologii syntetycznej. Fragmenty RNAP T7 były współwyrażane na różnych poziomach w różnych punktach czasowych w celu zbudowania alokatora zasobów13. Zbudowany został podzielony RNAP T7 z C-końcowymi fragmentami o różnej specyficzności promotora w celu utworzenia bramki logicznej AND14. Zdolność fragmentów RNAP T7 do łączenia się w celu odtworzenia funkcjonalnej polimerazy doprowadziła do opracowania bioczujników aktywowanych światłem i małymi cząsteczkami, w których dimeryzacja partnerów interakcji połączonych z każdym z N- i C-zakończeń T7 RNAP generuje wyjście transkrypcyjne15. Rozszczepiony RNAP T7 został również połączony z domenami n-Mag i p-Mag w celu zbudowania indukowanej światłem kontroli ekspresji genów w Escherichia coli16. Po aktywacji niebieskiego światła domeny magnetyczne ulegają dimeryzacji, zbliżając przestrzennie dwie domeny rozszczepionego T7 RNAP w celu przeprowadzenia funkcji polimerazy. System ten umożliwia precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę ekspresji genów przy niskiej ekspresji podstawowej i dużym zakresie dynamiki.

W artykule przedstawiono protokół budowy kontrolowanego przez niebieskie światło, in vivo, półlosowego systemu mutagenezy (ryc. 1). Jest zbudowany na deaminazie rAPOBEC1 połączonej z n-Mag-N-T7 RNAP. Koekspresja p-Mag-C-T7 RNAP z tego samego plazmidu umożliwia kontrolę polimerazy za pomocą światła niebieskiego i czynności edycji zasady. System łączy w sobie podstawowe możliwości edycji rAPOBEC1 ze sterowanym światłem podzielonym T7 RNAP. Został on zwalidowany u E. coli przy użyciu białka zielonej fluorescencji (GFP) jako genu docelowego, gdzie jego intensywność jest wybierana przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). W porównaniu z oryginalnym systemem MutaT7, nasz system sterowany niebieskim światłem wprowadza półlosowe mutacje w genie docelowym poprzez modulację interwału światła. Zamiast przekształcać całą cytozynę w zasady uracylu w genie docelowym, generuje większy profil mutacji poprzez edycję podzbioru nukleotydów poprzez kontrolę światła. System można łatwo dostosować do systemu ewolucji in vivo , w którym GFP może zostać zastąpiony przez inne geny będące przedmiotem zainteresowania, a funkcja może być wybrana na podstawie dopasowania komórki lub przeżycia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższy protokół określa, w jaki sposób przeprowadzić projekt egzogennej mutagenezy DNA przy użyciu systemu mutagenezy polimerazy CBE-Mag-T7 (krok 1). Po skonstruowaniu egzogennego plazmidu DNA opisano etapy transformacji dwóch plazmidów w celu ekspresji mutagenezy polimerazy CBE-Mag-T7 w szczepie E. coli BL21 poprzez dodanie izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG), a następnie naświetlanie światłem niebieskim w celu zainicjowania mutagenezy (kroki 2-9.2). Etapy kontroli jakości w celu oceny, ile mutacji zostało wygenerowanych na GFP lub egzogennym DNA, przeprowadzono przy użyciu sekwencjonowania Sangera (kroki 9.3-11.2).

1. Zaprojektuj egzogenne DNA i skonstruuj system mutagenezy polimerazy CBE-Mag-T7

  1. Znajdź sekwencjonowanie egzogennego DNA lub cDNA za pomocą narzędzi online (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene lub https://www.uniprot.org/).
    UWAGA: Tutaj użyliśmy sekwencji GFP jako egzogennego DNA do mutagenezy cytozyny.
  2. Zastąp DNA gfp DNA będącym przedmiotem zainteresowania za pomocą odpowiedniego zestawu do klonowania.
    UWAGA: Używamy NheI do usunięcia DNA gfp z oryginalnego plazmidu w zestawie do montażu kolonii DNA. Alternatywą jest współpraca z firmami w zakresie syntezy DNA. Patrz Plik Uzupełniający 1 dla sekwencji plazmidu.
  3. Zsyntetyzuj wszystkie geny razem z systemem mutagenezy polimerazy CBE-Mag-T7 i włącz je do szkieletu pET-11a z opornością na ampicylinę.
    UWAGA: Współpracowaliśmy z firmą zajmującą się syntezą DNA, aby zbudować ten plazmid i uzyskaliśmy bakterie glicerolowe zawierające nasz docelowy plazmid.

2. Aktywacja szczepu bakteryjnego

  1. Odpipetować 10 μl podstawowych bakterii glicerolu na krawędź płytki agarowej LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny. Rozprowadź bakterie z tego miejsca po płytce za pomocą sterylnej pętli.
  2. Inkubować płytkę do góry nogami w temperaturze 37 °C przez noc w inkubatorze bakteryjnym.

3. Amplifikacja plazmidu

  1. Wybierz pojedynczą kolonię z płytki i zaszczep ją w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 15 ml pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny.
  2. Umieścić kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C, 180 obr./min przez 14-16 godzin.

4. Ekstrakcja plazmidu

  1. Weź 5-15 ml nocnej kultury bakteryjnej i przenieś ją do probówki wirówkowej. Wirować przy 18 894 × g przez 1 min.
  2. Zebrać osad bakteryjny i ostrożnie usunąć cały supernatant. Zawiesić osad bakteryjny w 500 μl buforu do sporządzania zawiesiny przez wirowanie lub pipetowanie.
  3. Dodaj 500 μl buforu do lizy do probówki, delikatnie wymieszaj, odwracając probówkę 8-10x i pozostaw w temperaturze pokojowej na 5 minut, aby zlizować komórki.
    UWAGA: Potwierdź całkowitą lizę, upewniając się, że nie pozostały żadne widoczne białe kłaczkowate materiały.
  4. Dodać 200 μl buforu równoważącego do kolumny wirowej umieszczonej w probówce zbiorczej. Odwirować przy 18 894 × g przez 2 minuty i odrzucić przepływ. Umieść kolumnę z powrotem w probówce zbiorczej.
  5. Dodać 500 μl buforu neutralizacyjnego do lizatu bakteryjnego, delikatnie wymieszać odwracając probówkę 8-10x, aż pojawi się biały osad i pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 minut.
  6. Odwirować przy 18 894 × g przez 5 minut i przenieść supernatant do kolumny filtracyjnej. Odwirować przy 18 894 × g przez 1 minutę w celu przefiltrowania roztworu.
  7. Do przefiltrowanego roztworu dodać 0,3x objętość izopropanolu, wymieszać przez odwrócenie. Przenieść mieszaninę do zrównoważonej kolumny wirowej.
  8. Odwirować przy 18 894 × g przez 1 minutę, odrzucić przepływ i umieścić kolumnę z powrotem w probówce zbiorczej.
  9. Przemyć kolumnę 750 μl buforu do przemywania wodą, odwirować przy stężeniu 18,894 × g przez 1 minutę i odrzucić przepływ.
  10. Ponownie odwirować kolumnę przy 18,894 × g przez 1 minutę w celu usunięcia resztek buforu do przemywania wodą.
  11. Umieść kolumnę wirową w nowej probówce wirówkowej. Dodać 100-200 μl buforu elucyjnego do środka membrany kolumny. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 2-5 minut i odwiruj przy 18 894 × g przez 2 minuty. Przechowywać plazmidowe DNA w temperaturze -20 °C.

5. Transformacja plazmidowa (komórki kompetentne chemicznie E. coli BL21)

  1. Weź 50 μl rozmrożonych chemicznie kompetentnych komórek BL21 na lodzie. Dodać 2 μl plazmidowego DNA z kroku 4.11 i delikatnie wymieszać. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
  2. Szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 45 s, a następnie natychmiast przenieść rurkę z powrotem do lodu na 2 minuty.
  3. Do każdej probówki dodać 500 μl sterylnej pożywki LB. Inkubować w temperaturze 37 °C, 180 obr./min przez 1 godzinę, aby umożliwić odzysk.
  4. Odwirować przy 1 000 × g przez 5 minut, odrzucić nadmiar supernatantu, pozostawiając około 100 μl. Ponownie zawiesić komórki i płytkę na agarze LB zawierającym 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować do góry nogami w temperaturze 37 °C przez noc.

6. Ekspresja generatora mutacji polimerazy CBE-Mag-T7 (forma nieaktywna)

  1. Wykonaj kroki 5.1-5.4. Przed rozprowadzeniem komórek równomiernie nałożyć 1 mM IPTG na powierzchnię agaru LB z ampicyliną. Użyj wody dejonizowanej jako kontroli w celu porównania z grupami leczonymi IPTG.
  2. Po wyhodowaniu wszystkich kolonii wybierz 10-20 kolonii do hodowli w 5 ml pożywki LB zawierającej 1 mM IPTG w 100 ml okrągłodennych szklanych probówkach z fenolową nakrętką i gumową wkładką w temperaturze 16 °C, 180 obr./min przez 8 godzin.
    UWAGA: Wszystkie kolonie można przechowywać w temperaturze 4 °C w celu krótkotrwałego przechowywania przed przejściem do kroku 7.

7. Aktywuj generator mutacji polimerazy CBE-Mag-T7

  1. Zebrać bakterie do 100 ml okrągłodennych szklanych probówek z fenolową nakrętką i gumową wkładką i odwirować w ilości 18 894 × g przez 2 minuty.
  2. Zmień medium na medium LB bez żadnego IPTG.
    UWAGA: Ten krok jest ważny, aby upewnić się, że generator mutacji polimerazy CBE-Mag-T7 nie może się edytować. Zaprojektowaliśmy system lacI/O w celu ochrony klastrów genów polimerazy CBE-Mag-T7.
  3. Napromienić płytkę jednym promiennikiem światła niebieskiego (470 nm, 4 mW/cm2) podczas hodowli w temperaturze 37 °C przez określony czas. Wykonaj sekwencjonowanie Sangera, aby zweryfikować mutacje i sprawdzić, czy dłuższa ekspozycja zwiększa częstotliwość mutacji.
    UWAGA: Tutaj ustawiamy ekspozycję na niebieskie światło na 0, 8, 16 i 24 godziny.

8. Selekcja mutacji w celu zwiększenia funkcji białek i kontynuacji mutagenezy

UWAGA: Tutaj używamy genu gfp jako egzogennego DNA do mutagenezy i szukamy mutacji, które mogą zwiększyć intensywność fluorescencji białka GFP.

  1. Wybierz kolonie, oznacz pozycję na talerzu i zaszczep zebrane kolonie w 100 μL ddH2O.
  2. Przenieść 100 μl zawiesiny bakteryjnej na płytkę 96-dołkową i odczytać intensywność GFP przy Ex/Em = 488/510 nm.
  3. Powtarzaj kroki od 6.3 do 9.2, aż będzie można zidentyfikować pewne oczywiste kolonie.

9. Zatrzymaj mutagenezę i zweryfikuj mutacje

  1. Po wykonaniu kilkugodzinnego naświetlania światłem niebieskim przenieś wszystkie bakterie z powrotem do ciemnego miejsca w temperaturze 4 °C na kolejne 15 minut.
  2. Postępuj zgodnie z tymi samymi krokami ekstrakcji plazmidu, jak opisano w kroku 4.
  3. Zaprojektuj startery do przodu i do tyłu dla sekwencjonowania Sangera.
    UWAGA: Tutaj używamy ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT jako startera do przodu i TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG jako startera odwrotnego do sekwencjonowania Sangera.

10. Analiza danych i obliczanie częstości mutacji

  1. Wyświetl mutację, otwierając plik .ab1 i ręcznie sprawdź szczyty.
  2. Analizuj częstotliwość mutacji za pomocą narzędzi online (np. narzędzia Mutation Surveyor).
  3. Prześlij plik danych Sangera do narzędzia online i rozpocznij analizę szybkości mutacji.

11. Przygotowanie bulionu bakteryjnego glicerolu

  1. Zaszczepić pojedynczą kolonię w probówce zawierającej 5 ml pożywki LB ze 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować w temperaturze 37 °C, 180 obr./min przez 12-16 godzin.
  2. Wymieszaj kulturę bakteryjną z 50% glicerolem w stosunku 1:1. Porcjować do 1,5 ml probówek wirówkowych. Przechowywać w temperaturze -80 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody przedstawione w tym protokole służą do tworzenia mutacji na egzogennym DNA przy użyciu generatora mutacji polimerazy RNA CBE-Mag-T7. Geny do budowy systemu mutacji polimerazy RNA CBE-Mag-T7 i gen docelowy dla mutagenezy są włączone do szkieletu plazmidu pET-11a. Udana transformacja i naświetlanie światłem niebieskim zostały przeprowadzone bez żadnych uszkodzeń genomowego DNA bakterii, co wykazano za pomocą normalnej i porównywalnej liczby kolonii na LB-agarze (Figura 2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narzędzie do edycji zasad sterowane polimerazą zostało po raz pierwszy stworzone przez Cravensa i in. w 2021 r. przy użyciu strategii fuzji białek17. Mutacje na czterech nukleotydach DNA zostały pomyślnie włączone z szybkością większą niż 10-4 mutacje na pz. Ponieważ jednak mutacje były w sposób ciągły wprowadzane między promotorem T7 a terminatorem bez dodatkowej kontroli ze strony badaczy18, "dobre" mutacje nie mogły być zachowane przed ciągłą edycją. Aby zarad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stożkowe probówki wirówkowe 50 mlSokółCLS352070
AmpicylinyChemikalia Thermo ScientificZobacz materiał J60977.14
Promiennik światła niebieskiegoTholabs powiedział:LIU470A
Zestaw do klonowania montażu DNA NEBE5520S
Synteza DNA/PrmersBGI Genomika
Zestaw EndoFree Plasmid Midi CWBIO powiedział:CW2106SBufor P1: bufor do respensji, Bufor P2: bufor do lizy, Bufor E3: bufor równowagi, Bufor PS: bufor neutralizacyjny, Bufor PW: bufor do płukania, Endo-Free Buffer EB: bufor do oczyszczania DNA, RNaza A Endo-Remover FM: bufor do usuwania endotoksyn, Kolumny wirujące DM z probówkami zbiorczymi
GlicerolFisher ChemicznyZobacz materiał G33-4
Inkubowany wytrząsarkaThermo ScientificSK2001CPKG
IPTG (izopropylotio-β-galaktozyd)Invitrogen15529019
Czytnik mikropłytekThermo ScientificVarioskan LUX
Mikroskop Księga LeicaDMI 4000B
Multiskan FCChemikalia Thermo Scientific
One Shot BL21(DE3) Chemicznie kompetentny E. coliInvitrogenC600003
PureLink Szybki zestaw do oczyszczania plazmidu Midi o niskiej zawartości endotoksynInvitrogenA36227 powiedział:
Pyrex  Wytrzymałe probówki wirówkowe z okrągłym dnem, z fenolową nakrętką i gumową wkładkąCorning  8422CLS8422100

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Packer, M. S., Liu, D. R. Methods for the directed evolution of proteins. Nat Rev Genet. 16 (7), 379-394 (2015).
  2. Lynch, M. Evolution of the mutation rate. Trends Genet. 26 (8), 345-352 (2010).
  3. Myers, R. M., Lerman, L. S., Maniatis, T. A general method for saturation mutagenesis of cloned DNA fragments. Science. 229 (4710), 242-247 (1985).
  4. Lai, Y. P., Huang, J., Wang, L. F., Li, J., Wu, Z. R. A new approach to random mutagenesis in vitro. Biotechnol Bioeng. 86 (6), 622-627 (2004).
  5. Greener, A., Callahan, M., Jerpseth, B. An efficient random mutagenesis technique using an e. Coli mutator strain. Methods Mol Biol. 57, 375-385 (1996).
  6. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  7. Ravikumar, A., Arrieta, A., Liu, C. C. An orthogonal DNA replication system in yeast. Nat Chem Biol. 10 (3), 175-177 (2014).
  8. Ravikumar, A., Arzumanyan, G. A., Obadi, M. K. A., Javanpour, A. A., Liu, C. C. Scalable, continuous evolution of genes at mutation rates above genomic error thresholds. Cell. 175 (7), 1946-1957.e13 (2018).
  9. Moore, C. L., Papa, L. J. 3rd, Shoulders, M. D. A processive protein chimera introduces mutations across defined DNA regions in vivo. J Am Chem Soc. 140 (37), 11560-11564 (2018).
  10. Halperin, S. O., et al. Crispr-guided DNA polymerases enable diversification of all nucleotides in a tunable window. Nature. 560 (7717), 248-252 (2018).
  11. Molina, R. S., et al. In vivo hypermutation and continuous evolution. Nat Rev Methods Primers. 2, 37(2022).
  12. Badran, A. H., Liu, D. R. Development of potent in vivo mutagenesis plasmids with broad mutational spectra. Nat Commun. 6, 8425(2015).
  13. Segall-Shapiro, T. H., Meyer, A. J., Ellington, A. D., Sontag, E. D., Voigt, C. A. A 'resource allocator' for transcription based on a highly fragmented T7 RNA polymerase. Mol Syst Biol. 10 (7), 742(2014).
  14. Shis, D. L., Bennett, M. R. Library of synthetic transcriptional and gates built with split T7 RNA polymerase mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5028-5033 (2013).
  15. Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform. Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).
  16. Baumschlager, A., Aoki, S. K., Khammash, M. Dynamic blue light-inducible T7 RNA polymerases (Opto-T7RNAPS) for precise spatiotemporal gene expression control. ACS Synth Biol. 6 (11), 2157-2167 (2017).
  17. Cravens, A., Jamil, O. K., Kong, D., Sockolosky, J. T., Smolke, C. D. Polymerase-guided base editing enables in vivo mutagenesis and rapid protein engineering. Nat Commun. 12 (1), 1579(2021).
  18. Nayak, D., Siller, S., Guo, Q., Sousa, R. Mechanism of T7 RNAP pausing and termination at the T7 concatemer junction: A local change in transcription bubble structure drives a large change in transcription complex architecture. J Mol Biol. 376 (2), 541-553 (2008).
  19. Furuya, A., Kawano, F., Nakajima, T., Ueda, Y., Sato, M. Assembly domain-based optogenetic system for the efficient control of cellular signaling. ACS Synth Biol. 6 (6), 1086-1095 (2017).
  20. Dionisi, S., Piera, K., Baumschlager, A., Khammash, M. Implementation of a novel optogenetic tool in mammalian cells based on a split T7 RNA polymerase. ACS Synth Biol. 11 (8), 2650-2661 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mutageneza wiat em niebieskimedytor zasad cytozynysystem promotora T7mutacja egzogennego DNAin ynieria bia ekewolucja sterowanamutageneza specyficzna dla regionuewolucja in vivo
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły