Przedstawiony protokół opisuje uproszczone metody rozpoznawania dowolnego egzogennego DNA przy jednoczesnym generowaniu mutacji tylko na tych egzogennych DNA w Escherichia coli.
Artykuł metodologiczny
Indukowana niebieskim światłem półlosowa mutageneza na specyficznym egzogennym DNA w szczepie Escherichia coli BL21
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Technologie mutagenezy są szeroko stosowane w hodowli wariacyjnej, ukierunkowanej ewolucji i inżynierii białek. Jednak większość metod może indukować tylko losowe mutacje genomowego DNA, które są niekontrolowane, prowadząc do deformacji, a nawet śmiertelnych skutków. W tym przypadku, wykorzystując fuzję trzech systemów: edytora zasad cytozyny (CBE), indukowanych niebieskim światłem elementów p-Mag / n-Mag i rozszczepionej polimerazy RNA T7, ta opisana metoda obejmuje kontrolowany niebieskim światłem, specyficzny dla regionu DNA, półlosowy system mutagenezy.
System ten może mutować cytozynę do tyminy na DNA, zaczynając od promotora T7, a kończąc na terminatorze T7. Każdy egzogenny gen znajdujący się za promotorem T7 może być potencjalnie zmutowany. Narzędzia te zostały również zaprojektowane w dwóch częściach, aby system mógł być sterowany za pomocą niebieskiego światła. Pierwsza część została stworzona przez fuzję CBE z n-Mag i genem polimerazy RNA N-terminal-T7. Druga część polegała na fuzji p-Mag z polimerazą RNA C-terminal-T7. W niebieskim świetle te dwie części zostały połączone, aby działać jako generator mutacji w DNA między promotorem T7 a terminatorem T7. Bez niebieskiego światła p-Mag jest odłączany od n-Mag, uwalniając CBE od edycji DNA.
Celem tego protokołu jest wygenerowanie specyficznych dla regionu losowych mutacji w Escherichia coli z kontrolą światła niebieskiego i dalsza walidacja zmutowanych plazmidów. System można dostosować do systemu ewolucji in vivo , w którym można wybrać funkcję interesującego genu i zebrać pożądane mutacje do dalszych badań.
Wprowadzenie
Losowe mutacje i dobór naturalny są kluczowymi siłami napędzającymi ewolucję, która wygenerowała dużą zmienność genetyczną między gatunkami. Proces ewolucyjny został wykorzystany jako potężne narzędzie do inżynierii białek o zoptymalizowanych lub nowatorskich funkcjach1. Szacuje się, że naturalne tempo mutacji w wyniku replikacji DNA wynosi około jednej na 109 zasad na podział komórki u wielu prokariontów i eukariontów2. Niskie wskaźniki naturalnych mutacji sprawiają, że generowanie dużej różnorodności genetycznej w laboratoriach jest niepraktyczne. Badania koncentrowały się na opracowaniu metod, które zwiększ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Poniższy protokół określa, w jaki sposób przeprowadzić projekt egzogennej mutagenezy DNA przy użyciu systemu mutagenezy polimerazy CBE-Mag-T7 (krok 1). Po skonstruowaniu egzogennego plazmidu DNA opisano etapy transformacji dwóch plazmidów w celu ekspresji mutagenezy polimerazy CBE-Mag-T7 w szczepie E. coli BL21 poprzez dodanie izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG), a następnie naświetlanie światłem niebieskim w celu zainicjowania mutagenezy (kroki 2-9.2). Etapy kontroli jakości w celu oceny, ile mutacji zostało wygenerowanych na GFP lub egzogennym DNA, przeprowadzono przy użyciu sekwencjonowania Sangera (kroki 9.3-11.2).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Metody przedstawione w tym protokole służą do tworzenia mutacji na egzogennym DNA przy użyciu generatora mutacji polimerazy RNA CBE-Mag-T7. Geny do budowy systemu mutacji polimerazy RNA CBE-Mag-T7 i gen docelowy dla mutagenezy są włączone do szkieletu plazmidu pET-11a. Udana transformacja i naświetlanie światłem niebieskim zostały przeprowadzone bez żadnych uszkodzeń genomowego DNA bakterii, co wykazano za pomocą normalnej i porównywalnej liczby kolonii na LB-agarze (Figura 2).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Narzędzie do edycji zasad sterowane polimerazą zostało po raz pierwszy stworzone przez Cravensa i in. w 2021 r. przy użyciu strategii fuzji białek17. Mutacje na czterech nukleotydach DNA zostały pomyślnie włączone z szybkością większą niż 10-4 mutacje na pz. Ponieważ jednak mutacje były w sposób ciągły wprowadzane między promotorem T7 a terminatorem bez dodatkowej kontroli ze strony badaczy18, "dobre" mutacje nie mogły być zachowane przed ciągłą edycją. Aby zarad.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Stożkowe probówki wirówkowe 50 ml | Sokół | CLS352070 | |
| Ampicyliny | Chemikalia Thermo Scientific | Zobacz materiał J60977.14 | |
| Promiennik światła niebieskiego | Tholabs powiedział: | LIU470A | |
| Zestaw do klonowania montażu DNA | NEB | E5520S | |
| Synteza DNA/Prmers | BGI Genomika | ||
| Zestaw EndoFree Plasmid Midi | CWBIO powiedział: | CW2106S | Bufor P1: bufor do respensji, Bufor P2: bufor do lizy, Bufor E3: bufor równowagi, Bufor PS: bufor neutralizacyjny, Bufor PW: bufor do płukania, Endo-Free Buffer EB: bufor do oczyszczania DNA, RNaza A Endo-Remover FM: bufor do usuwania endotoksyn, Kolumny wirujące DM z probówkami zbiorczymi |
| Glicerol | Fisher Chemiczny | Zobacz materiał G33-4 | |
| Inkubowany wytrząsarka | Thermo Scientific | SK2001CPKG | |
| IPTG (izopropylotio-β-galaktozyd) | Invitrogen | 15529019 | |
| Czytnik mikropłytek | Thermo Scientific | Varioskan LUX | |
| Mikroskop | Księga Leica | DMI 4000B | |
| Multiskan FC | Chemikalia Thermo Scientific | ||
| One Shot BL21(DE3) Chemicznie kompetentny E. coli | Invitrogen | C600003 | |
| PureLink Szybki zestaw do oczyszczania plazmidu Midi o niskiej zawartości endotoksyn | Invitrogen | A36227 powiedział: | |
| Pyrex Wytrzymałe probówki wirówkowe z okrągłym dnem, z fenolową nakrętką i gumową wkładką | Corning 8422 | CLS8422100 |
Bibliografia
- Packer, M. S., Liu, D. R. Methods for the directed evolution of proteins. Nat Rev Genet. 16 (7), 379-394 (2015).
- Lynch, M. Evolution of the mutation rate. Trends Genet. 26 (8), 345-352 (2010).
- Myers, R. M., Lerman, L. S., Maniatis, T.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie