Testy z wyborem i bez wyboru w celu zbadania odporności A. thaliana na owady gryzące

Podsumowanie

Odporność roślin na gryzące owady roślinożerne można testować na kilka sposobów. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak zaplanować eksperyment z wyborem oraz bez wyboru, wykorzystując roślinę modelową Arabidopsis thaliana, aby zidentyfikować odporność na szkodnika z gatunku Pieris rapae.

Streszczenie

Larwy kapuśnika są szkodnikiem w warunkach rolniczych. Ten gatunek gąsienic żywi się roślinami z rodziny kapustowatych, do których należy wiele roślin uprawnych, takich jak kapusta, brokuły, brukselka itp. Hodowla owadów odbywa się na roślinach kapusty w szklarni. Do hodowli *Pieris rapae* potrzebne są co najmniej dwie klatki: jedna dla larw, a druga dla osobników dorosłych, czyli motyli. W celu zbadania roli hormonów roślinnych i toksycznych związków roślinnych w odporności na tego szkodnika przedstawiamy dwa eksperymenty. Pierwszym jest określenie roli kwasu jasmonowego (JA – hormonu roślinnego często wskazywanego jako czynnik odporności na owady) w odporności na żerującego owada *Pieris rapae*. Wzrost gąsienic można porównać na roślinach typu dzikiego oraz roślinach mutantach z zaburzoną produkcją JA. Eksperyment ten jest uznawany za test „bez wyboru” (no choice), ponieważ larwy są zmuszone do odżywiania się jedną rośliną, która syntetyzuje JA lub wykazuje jego niedobór. Po drugie, przedstawiamy eksperyment badający rolę glukozynolanów, które służą jako sygnały do ovipozycji (składania jaj). W tym przypadku wykorzystujemy *Arabidopsis* typu dzikiego oraz mutanty z zaburzoną produkcją glukozynolanów w eksperymencie „z wyborem” (choice), w którym samice motyli mogą wybrać, na roślinach którego genotypu złożą jaja. Niniejsze wideo prezentuje układ eksperymentalny dla obu analiz, a także reprezentatywne wyniki.

Protokół

Eksperyment bez wyboru:

1. Ostrożnie zamknij badaną roślinę Arabidopsis w plastikowym kubeczku. W tym przypadku: Col-0 (WT) oraz mutant z upośledzoną produkcją JA. Należy zadbać o to, aby ograniczyć uszkodzenia liści. W tym celu używam trzonka tego pędzla.
   
2. Za pomocą cienkiego pędzla pobierz świeżo wyklutą larwę z kolonii hodowanej na kapuście.
   
3. Ostrożnie umieść larwę na roślinach Arabidopsis.
   
4. Zważ larwę w 4., 7. i 10. dniu. WSKAZÓWKA: Hoduj rośliny w warunkach krótkiego dnia (8 h światła), aby zwiększyć przyrost wegetatywny (jedna larwa może przejść pełny cykl życiowy na jednej roślinie).

Eksperyment wyboru:

1. Wybiera się dwie rośliny, po jednej z każdego genotypu. Najlepiej uprawiać rośliny w jednej doniczce, aby ograniczyć wpływ innych czynników, takich jak efekt tacy itp.
   
2. Rośliny umieszcza się w klatce dla motyli.
   
3. Wybiera się płodną samicę. Zazwyczaj odławiam samicę, która aktywnie składa jaja w kolonii hodowlanej.
   
4. Samicę wpuszcza się do klatki z dwiema roślinami do wyboru na 24 hrs.
   

WSKAZÓWKA 1: Aby wyeliminować efekt uczenia się, nie należy ponownie wykorzystywać samic w kolejnych testach wyboru.

WSKAZÓWKA 2: Porównywać można jedynie rośliny o podobnym fenotypie wzrostu. Alternatywnie można umieścić liść każdego genotypu na wierzchu kolby Erlenmeyera i porównać ich atrakcyjność dla samicy.

Więcej informacji na temat tego protokołu oraz odporności roślin na żerowanie owadów można znaleźć w Annual Reviews of Plant Biology.