Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rurociąg miksturowy do generowania molekularnych operacyjnych jednostek taksonomicznych (MOTU) wśród chrząszczy nadbrzeżnych i wodnych

914 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68323

⸱

11 lipca 2025

 ,  , 
1Ateneo Biodiversity Research Laboratory, Department of Biology, School of Science and Engineering, Higher Education Cluster, Ateneo de Manila University, 2Ateneo Institute of Sustainability, Ateneo de Manila University, 3Ateneo School of Medicine and Public Health, Higher Education Cluster, Ateneo de Manila University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiony tutaj protokół ma na celu poprowadzenie użytkowników przez komputerowe przetwarzanie sekwencji genów podjednostki I podjednostki cytochromu c (COI) generowanych przez chrząszcze, tak aby hipoteza grupowania gatunków zwana molekularnymi operacyjnymi jednostkami taksonomicznymi (MOTU) mogła zostać wygenerowana z DNA.

Streszczenie

Spadek różnorodności biologicznej postępuje w tempie niewyobrażalnym, jednak monitorowanie różnorodności biologicznej jest utrudnione przez wiele czynników, w tym niekompletny spis różnorodności wyjściowej i kurczącą się populację wykwalifikowanych taksonomów. Pokonanie tej przeszkody w inwentaryzacji gatunków "ciemnych taksonów", czyli hiperróżnorodnych grup, często niedostatecznie zbadanych w taksonomii, jest szczególnie istotne w tropikach, które stoją w obliczu nieprzezwyciężonej presji środowiskowej. Podczas gdy alfa-taksonomia oparta na morfologii pozostaje złotym standardem w identyfikacji gatunków, metody oparte na DNA wykazują ogromny potencjał w przyspieszaniu wyznaczania i odkrywania gatunków. W tym miejscu opisujemy potok mikstur do generowania molekularnych operacyjnych jednostek taksonomicznych (MOTU) obejmujący sześć podejść do delimitacji gatunków molekularnych wdrożonych na dwóch bardzo niepozornych rodzajach chrząszczy, a mianowicie Byrrhinus Motschulsky, 1858 z rodziny Limnichidae i Anacaena Thomson, 1859 z rodziny Hydrophilidae, z Filipin. Ponieważ protokół ten koncentruje się na przetwarzaniu kodów kreskowych DNA i biorąc pod uwagę, że te dane genetyczne można uzyskać albo przez sekwencjonowanie, albo przez pobieranie z internetowych baz danych, punktem wyjścia dla opisanego tutaj protokołu są sekwencje DNA. Biorąc pod uwagę kody kreskowe COI, potok wykorzystuje kombinację trzech podejść do delimitacji gatunków molekularnych opartych na progach, a mianowicie TaxonDNA, K2P i ASAP, które wykorzystują wyrównanie sekwencji jako dane wejściowe. Ponadto potok przebiega w oparciu o trzy podejścia oparte na koalescencji, a mianowicie PTP-ML, PTP-BI i mPTP, które wymagają pliku drzewa jako danych wejściowych. Niektóre podejścia wiążą się z użyciem serwerów internetowych, podczas gdy inne wykorzystują oprogramowanie lokalne. Dzięki przedstawionemu doborowi metod algorytmicznych można zidentyfikować MOTU zarówno w drodze konsensusu, jak i większości. Co ciekawe, rurociąg ten wyznaczył niemal rzucające się w oczy gatunki chrząszczy z Filipin, nawet te udokumentowane z tych samych lub sąsiednich miejsc.

Wprowadzenie

W obliczu bezprecedensowego tempa wymierania gatunków na świecie w różnych taksonach1,2,3,4, dążenie do stworzenia kompleksowego inwentarza różnorodności biologicznej, obejmującego gatunki dotychczas nieodkryte i nieopisane, staje się wyścigiem z czasem2,5. Po pierwsze, ochrona różnorodności biologicznej ma sens jedynie w świetle właściwej wiedzy taksonomicznej6,7. Zatem identyfikacja różnorodności biologicznej na poziomie gatunku jest niezbędna, biorąc pod uwagę, że blisko spokrewnione, lecz odmienne gatunki mogą zajmować unikalne nisze fundamentalne8.

W systematyce chrząszczy taksonomia alfa, czyli taksonomia tradycyjna, stanowi złoty standard w identyfikacji gatunków, podobnie jak w większości, jeśli nie we wszystkich grupach zwierząt9. Podejście to opiera się na cechach morfologicznych w celu klasyfikacji organizmów na wyższych poziomach taksonomicznych oraz zapewnienia identyfikacji na poziomie gatunku10,11. W wielu przypadkach identyfikacja na poziomie rodziny12 lub nawet rodzaju13 może być przeprowadzona wyłącznie na podstawie zewnętrznych cech morfologicznych, takich jak kształt ciała i specjalistyczne adaptacje. Tymczasem identyfikacja gatunkowa chrząszczy jest zazwyczaj przeprowadzana poprzez porównanie szczegółów strukturalnych aedeagusa lub narządów kopulacyjnych samca14,15,16.

Pomimo szerokiej akceptacji tej opartej na morfologii alfa-taksonomii, podejście to do odkrywania gatunków jest utrudnione przez liczne „bariery taksonomiczne”6,17,18, zwłaszcza wśród bezkręgowców19. W systematyce chrząszczy identyfikacja i/lub odkrywanie gatunków za pomocą alfa-taksonomii napotyka trudności związane z ograniczoną liczbą wykwalifikowanych taksonomików20,21, zwięzły i mało informacyjne wcześniejsze opisy22 oraz problemy logistyczne związane z dostępem do literatury i okazów typowych23.

Sytuacja ta jest jeszcze bardziej utrudniona, gdy rozważany takson jest kryptyczny lub mało charakterystyczny. Gatunki kryptyczne to zbiór gatunków z tego samego rodzaju, a nawet z różnych rodzajów, których nie można łatwo rozróżnić na podstawie morfologii porównawczej ze względu na subtelne międzygatunkowe różnice fenetyczne24. Niektóre taksony kryptyczne, określane jako „dark taxa”25,26,27, dodatkowo charakteryzują się wysoką różnorodnością przy jednoczesnym dużym niedoborze badań. Niestety, zjawisko to nie jest rzadkie w przypadku chrząszczy nadrzecznych i wodnych8,28. Brak precyzyjnego wyznaczenia granic gatunkowych wśród kryptycznych „dark taxa” zagraża różnorodności biologicznej, ponieważ jednolite środki ochrony stosuje się wobec organizmów o potencjalnie różnych niszach i wymaganiach ekologicznych8,29.

W obliczu tych wyzwań, „taksonomia integracyjna”23, czyli podejście łączące taksonomię alfa z innym rodzajem dowodów, zyskało popularność w ciągu ostatnich dwóch dekad jako metoda opisywania nowych gatunków30,31,32. Jednym z takich rodzajów dowodów wykorzystywanych w badaniach taksonomii integracyjnej chrząszczy33,34,35,36,37,38,39 oraz innych rzędów owadów40,41,42,43,44,45 jest sekwencjonowanie DNA. W szczególności gen mitochondrialnej podjednostki I cytochromu c oksydazy (COI) jest wykorzystywany do kodowania kreskowego (barcodingu) różnorodnych grup zwierząt ze względu na jego umiarkowany konserwatyzm46,47,48. Podczas gdy jego 658bp-długi koniec 5′ (COI-5′), znany również jako „fragment kodowania kreskowego” lub „fragment Folmera”, został zaproponowany jako sekwencja „diagnostyczna”49, stosowany jest również 723 bp-długi fragment COI-3′ ze względu na dostępność solidnego zestawu starterów dla końca 3′50,51,52.

Podczas gdy kod kreskowy DNA z wykorzystaniem COI został opracowany do identyfikacji na poziomie gatunków, jest on ograniczony przez repozytorium sekwencji a priori 53, takie jak GenBank54 i BOLD55; podejścia do molekularnego wyznaczania granic gatunków określają granice gatunkowe, wykorzystując jedynie dostarczone sekwencje DNA, bez konieczności posiadania wcześniejszego repozytorium56. Istnieją dwie klasy podejść do molekularnego wyznaczania granic gatunków, w zależności od pliku wejściowego. Po pierwsze, stosując dopasowanie sekwencji jako dane wejściowe, podejścia oparte na progach wykorzystują wartości odcięcia do określenia zróżnicowania między gatunkami i wewnątrz gatunków48,57,58. Jako metody oparte na dystansie, podejścia te opierają się na zaobserwowanym maksymalnym dystansie wewnątrzgatunkowym wynoszącym 3% dla owadów, co określa się mianem „luki kodowania” (barcoding gap)51,59. Do podejść opartych na progach należą m.in. SpeciesIdentifier zaimplementowany w TaxonDNA60, dystans genetyczny via model dwuparametrowy Kimury (K2P)61 oraz Assemble Species by Automatic Partitioning (ASAP)62.

Po drugie, wykorzystując drzewo jako plik wejściowy, podejścia oparte na teorii koalescencji identyfikują granice gatunków i sortują niezależne linie poprzez określanie zmian w tempie rozgałęziania linii63,64,66. Często opierając się na filogenetycznej koncepcji gatunku67, podejścia oparte na koalescencji obejmują procesy rozkładu Poissona dla drzew (PTP)68 oraz ich wariant, multi-rate PTP69. W każdym przypadku klastry utworzone przez metody molekularnego delimitowania gatunków określa się zbiorczo jako molekularne operacyjne jednostki taksonomiczne (MOTUs).

W niniejszej pracy przedstawiamy metody potoku analizy służącego do generowania MOTU, obejmujące trzy podejścia oparte na progach oraz trzy podejścia oparte na koalescencji (Rysunek 1). Potok został przetestowany na dwóch zbiorach danych, mianowicie (1) sekwencjach COI-3′ chrząszczy z rodzaju Byrrhinus Motschulsky, 1858 żyjących w strefach nadrzecznych, składającym się z dwóch opublikowanych gatunków35 wyodrębnionych wcześniej za pomocą taksonomii integratywnej oraz dodatkowych sekwencji z nieopisanych gatunków, oraz (2) sekwencjach COI-5′ chrząszczy z rodzaju Anacaena Thomson, 1859, składającym się z sekwencji dwóch opublikowanych gatunków70 wyodrębnionych wcześniej za pomocą alfa-taksonomii oraz dodatkowych sekwencji z nieopisanych gatunków.

Schemat analizy sekwencji DNA; dopasowanie, próg, metody koalescencyjne, szacowanie drzewa, etapy MOTU.
Rysunek 1: Schemat blokowy procesu generowania MOTU. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Materiałami wyjściowymi dla tego rurociągu analiz są sekwencje DNA, które mogą zostać pobrane z repozytoriów online (np. BOLD, GenBank) lub wygenerowane w drodze sekwencjonowania metodą Sangera71. Tabela 1 oraz Tabela 2 zawierają numery akcesyjne zestawów danych, których reprezentatywne wyniki przedstawiono w niniejszej pracy.

1. Krok przygotowawczy dla podejść opartych na progach: Dopasowanie sekwencji

  1. Wczytaj sekwencje w programie MEGA X72.
    UWAGA: Program MEGA X można pobrać ze strony https://www.megasoftware.net/
    1. Kliknij Align , aby otworzyć menu rozwijane. Kliknij Edit/Build Alignment i wybierz Create a new alignment. Kliknij OK , aby potwierdzić wybór. Jako typ danych do wyrównania wybierz DNA .
    2. Najeżdżając kursorem na kartę Edit , wybierz z menu File opcję Insert Sequence. Przejdź do katalogu z sekwencjami i wybierz sekwencje do wczytania do programu MEGA.
  2. Wykonaj wyrównanie sekwencji, klikając Alignment, a następnie Align by ClustalW73. Pozostaw ustawienia domyślne i kliknij OK.
  3. Ręcznie edytuj sekwencje, przycinając oba końce oraz usuwając wszelkie insercje lub delecje.
    1. Aby usunąć insercje, kliknij wstawione zasady i/lub pozycje, a następnie naciśnij klawisz Delete na klawiaturze.
    2. Aby skorygować delecje, kliknij pozycję, która powinna zostać usunięta, oznaczoną znakiem „-”. Usuń znak „-” i wpisz właściwą zasadę.
    3. Znajdź pierwszą pozycję, w której wszystkie sekwencje posiadają znak. Kliknij w puste pole w nagłówku wiersza pozycji po lewej stronie od wyznaczonej pozycji i przeciągnij zaznaczenie, aż zostaną wybrane wszystkie nadmiarowe pozycje wszystkich sekwencji do początku. Naciśnij Delete , aby przyciąć.
    4. Powtórz krok 1.3.3, szukając ostatniej pozycji, w której wszystkie sekwencje posiadają znak. Kliknij w puste pole w nagłówku wiersza pozycji po prawej stronie od wyznaczonej pozycji i przeciągnij zaznaczenie, aż zostaną wybrane wszystkie nadmiarowe pozycje wszystkich sekwencji do końca. Naciśnij Delete.
      UWAGA: Rysunek 2A przedstawia prawidłowe wyrównanie sekwencji DNA. Końcowy zestaw danych stanowi macierz sekwencji o równej długości; w związku z tym długość sekwencji nie jest czynnikiem wpływającym na wyniki badania. Sekwencje referencyjne służą jako podstawa dla końcowej długości macierzy wyrównania.
  4. Przetłumacz sekwencję, aby sprawdzić obecność kodonów stop, ponieważ COI jest sekwencją kodującą białko.
    1. Zaznacz wszystkie sekwencje, a następnie kliknij kartę Translated Protein Sequences.
    2. Po wyświetleniu monitu zweryfikuj kod genetyczny jako Invertebrate Mitochondrial. Jeśli kod genetyczny jest inny, kliknij No – pojawi się menu umożliwiające zaznaczenie pola dla kodu genetycznego Invertebrate Mitochondrial .
    3. Jeśli kodony stop, oznaczone gwiazdkami w obrębie wyrównania, występują w całej kolumnie, kliknij DNA Sequences i usuń pierwszą pozycję we wszystkich sekwencjach.
    4. Powtórz poprzedni krok, jeśli w jakiejkolwiek sekwencji nadal występują kodony stop.
    5. Jeśli kodony stop nadal są obecne, przywróć wcześniej usunięte pozycje. Zaznacz wszystkie sekwencje, najedź kursorem na kartę Data i kliknij Reverse.
    6. Powtórz krok 1.4.1. Jeśli kodony stop nadal są obecne, powtórz kroki 1.4.3 i 1.4.4.
      UWAGA: Rysunek 2B przedstawia prawidłowe wyrównanie kodonów.
  5. Kliknij DNA Sequences i zapisz wyrównanie sekwencji w formacie .mas/x. Eksportuj sekwencję do innych odpowiednich typów plików, takich jak plik .meg oraz plik .fasta.
    UWAGA: Niektóre podejścia do delimitacji molekularnej gatunków działają lepiej bez grupy zewnętrznej (outgroup). W związku z tym warto rozważyć wygenerowanie kopii pliku wyrównania bez grupy zewnętrznej.

Dopasowanie sekwencji genetycznych, oprogramowanie MAFFT, analiza DNA na białko, genomika porównawcza.
Rysunek 2: Dopasowanie sekwencji w programie MEGA X. (A) Ręcznie oczyszczone końcowe dopasowanie sekwencji DNA oraz (B) przetłumaczone dopasowanie sekwencji białkowych dla zbioru danych Byrrhinus, nie wykazujące insercji, delecji i luk. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

2. Wyznaczanie granic za pomocą modułu Taxon DNA w programie Species Identifier 1.8

UWAGA: Identyfikator gatunków można pobrać ze strony https://taxondna.sourceforge.net/

  1. Otwórz program TaxonDNA. Kliknij Import, a następnie FASTA. Prześlij dopasowanie w formacie .fasta.
  2. Kliknij Modules, a następnie Cluster. Ustaw próg na 3%. Następnie zaznacz opcję Generate information about individual cluster (Rysunek 3).
  3. Kliknij Make clusters now!. Zapisz wyniki, wykonując zrzut ekranu.

Interfejs klastrowania sekwencji DNA dla analizy taksonomicznej; przedstawia wyniki klastrowania sekwencji i statystyki.
Rycina 3: Okno programu TaxonDNA w Species Identifier 1.8 pokazujące zdefiniowany przez użytkownika próg 3% dla delimitacji. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

3. Wyznaczenie granic metodą Kimura 2-parameter (K2P) w programie MEGA X

  1. W programie MEGA otwórz plik .meg, klikając File, a następnie Open A File/Session. Kliknij Distance, a następnie Compute Pairwise Distances. Potwierdź wybór pliku .meg do delimitacji.
  2. Najedź kursorem na żółte pole obok Model/Method, a następnie kliknij strzałkę, która pojawi się po prawej stronie pola.
  3. Z menu rozwijanego wybierz Kimura 2-parameter model. Kliknij Ok, aby uruchomić program. Otwórz okno wyników danych (Rysunek 4).
  4. Kliknij File, a następnie Export/Print Distances.
  5. Otwórz menu rozwijane obok Output Format i wybierz XL: Microsoft Excel workbook. W polu Decimal Places wybierz 4.
  6. Zapisz otrzymaną arkusz w programie Microsoft Excel. Użyj formatowania warunkowego, aby wyróżnić te wartości, których dystans jest mniejszy niż 0.03 (czyli 3%).
    UWAGA: W przeciwieństwie do innych podejść omówionych w tym artykule, metoda K2P nie zapewnia natychmiastowego klastrowania, ponieważ zależy ono od zdefiniowanego przez użytkownika progu. Ten schemat działania opiera się na założeniu, że próg wynosi 3%, co oznacza, że każda para sekwencji, której dystans genetyczny jest mniejszy niż 3%, należy do tego samego klastra molekularnego.

Macierz dystansu filogenetycznego, porównanie DNA, tabela, różnice genetyczne gatunków.
Rysunek 4: Wyświetlone w programie MEGA X okno z wynikami analizy metodą modelu Kimura-2-parameter. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

4. Delimitacja przy użyciu metody Assemble Species by Automatic Partitioning (ASAP)

  1. Przejdź do serwera WWW ASAP: https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/asap/asapweb.html
  2. Prześlij dopasowanie, klikając w pomarańczowe pole z napisem Choose a file… i wybierając plik .fasta. Alternatywnie przeciągnij plik .fasta do pomarańczowego pola. Przewiń w dół i kliknij Go.
  3. Aby pobrać wyniki grupowania, kliknij list w wierszu z najniższą wartością ASAP-score i najwyższą rangą p-val (Rysunek 5).
    UWAGA: Wynik wyjściowy to plik .txt, który przedstawia podzbiory klastrów molekularnych.

Wyniki analizy statystycznej; tabela zbioru danych, histogram, wykres uporządkowanych odległości; analiza rozkładu danych.
Rycina 5: Okno wynikowe w ASAP pokazujące możliwe wyznaczenia granic. Pierwszy wynik (niebieska ramka) został zaakceptowany ze względu na najniższy ASAP-score (czerwona ramka) i najwyższy ranking P-val (żółta ramka). Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

5. Krok przygotowawczy dla podejść opartych na koalescencji: Estymacja drzewa

  1. Otwórz plik .meg, klikając Data, a następnie Open A File/Session. Przeprowadź test najlepszego modelu substytucji.
    1. Kliknij Models, a następnie znajdź Best DNA/Protein Models (ML). Potwierdź wybór pliku .meg do analizy.
    2. Kliknij Ok w menu Analysis Preferences (Rysunek 6A). Odnotuj najlepszy model, który charakteryzuje się najniższą wartością BIC i AICc (Rysunek 6B).
      UWAGA: Zazwyczaj jest to pierwszy model na liście w wyświetlonym oknie. Pełne nazwy skróconych modeli znajdują się w dolnej części tego okna.
  2. Wygeneruj drzewo.
    1. Kliknij Phylogeny , a następnie Construct/Test Maximum Likelihood Tree.
    2. Zastosuj najlepiej dopasowany model substytucji nukleotydów. Zrób to, klikając w żółte pole obok Model/Method. Wybierz odpowiedni model z menu rozwijanego.
    3. Jeśli najlepiej dopasowany model substytucji nukleotydów zawiera „+G”, „+I” lub oba te oznaczenia, kliknij pole obok Rates among Sites i wybierz odpowiednie parametry (G, I, G + I) z menu rozwijanego (Rysunek 6C).
    4. W sekcji Phylogeny Test kliknij pole obok Test of Phylogeny i wybierz Bootstrap method z menu rozwijanego. Kliknij pole obok „No. of Bootstrap Replications” i wpisz 1000 (Rysunek 6C). Kliknij Ok, aby uruchomić analizę.
  3. Po otwarciu okna z wynikowym drzewem (Rysunek 6D), zapisz sesję drzewa w formacie .mts/x. Zapisz wynik jako plik .nwk. Zapisz również drzewo jako plik obrazu .png.

Ustawienia metody analizy filogenetycznej, tabela wiarygodności i schemat drzewa; maksymalna wiarygodność, bootstrap.
Rysunek 6: Estymacja drzewa w programie MEGA X jako krok przygotowawczy dla podejść opartych na koalescencji. (A) Ustawienia służące do wyznaczenia najlepiej dopasowanego modelu substytucji nukleotydów. (B) Dla zbioru danych Byrrhinus najlepiej dopasowanym modelem jest GTR + I ze względu na najniższe wartości BIC i AICc (czerwona ramka). (C) Podczas generowania drzewa maksymalnej wiarygodności jako parametry ustawiono GTR (żółta ramka) + I (niebieska ramka). (D) Wynikowe surowe drzewo ML, które zostanie wykorzystane w kolejnych analizach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

6. Wyznaczenie granic za pomocą procesów drzew Poissona (PTP)

UWAGA: Poniższe kroki pozwolą uzyskać wyniki dla PTP-ML i PTP-BI.

  1. Przejdź do serwera WWW PTP: https://species.h-its.org/ptp/
  2. Prześlij plik w formacie newick, klikając Choose file. W sekcji My tree is wybierz Rooted (Rycyna 7A).
  3. Wprowadź parametry analizy. W polu No. MCMC generations wprowadź 100000. W polu Thinning wprowadź 100. W polu Burn-in wprowadź 0.1. W polu Seed wprowadź 123.
  4. Określ grupę zewnętrzną, wpisując nazwy końcówek drzewa w polu pod Outgroup taxa names (jeśli dotyczy). Instrukcje dotyczące formatowania danych wejściowych znajdują się po prawej stronie pola wprowadzania.
  5. Wprowadź adres e-mail w odpowiednim polu i kliknij Submit. W oknie wyników delimitacji gatunków PTP kliknij here , aby otworzyć okno z wynikami.
  6. W sekcji Maximum likelihood solution pobierz wyniki PTP-ML, klikając Download delimitation results (Rycyna 7B).
  7. W sekcji Bayesian-supported solution pobierz wyniki PTP-BI, klikając Download delimitation results.
    ​UWAGA: Wyniki będą wskazywać grupy sekwencji w partycjach. Zostaną one oznaczone jako ponumerowane gatunki, po których następuje wartość wsparcia, gdzie wartość 1.000 jest idealna.

wyniki wyznaczania granic gatunków bPTP, diagram drzewa filogenetycznego, ustawienia MCMC, analiza maksymalnej wiarygodności
Rycina 7: Molekularne wyznaczanie granic gatunków za pomocą procesów drzewa Poissona (PTP). (A) Okna prezentujące parametry wejściowe. (B) Wynikowe okno w serwerze WWW PTP z linkiem zawierającym wyniki wyznaczania granic gatunków (czerwona ramka). Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

7. Delimitacja za pomocą wielostawnych procesów drzew Poissona (mPTP)

  1. Przejdź do serwera WWW mPTP: https://mptp.h-its.org/#/tree
  2. Prześlij plik w formacie newick, przeciągając go na szary prostokąt lub klikając w ten prostokąt. Po załadowaniu danych na tej samej stronie kliknij Proceed to outgroup selection (Rysunek 8A).
  3. Na stronie Outgroup specification wybierz grupę zewnętrzną (outgroup), klikając w pole obok etykiet taksonów okazów grupy zewnętrznej. Kliknij opcję Crop Outgroup na dole sekwencji. Kliknij Model selection.
  4. Kliknij MPTP, następnie kliknij Visualization Options. Na stronie Visualization options zaakceptuj ustawienia domyślne.
    UWAGA: Alternatywnie, całkowity rozmiar obrazu można dostosować, wprowadzając wartość (w px) w polu SVG width. Czcionkę i odstępy tekstu można dostosować, wprowadzając żądane rozmiary (w px) w polach SVG font size, Space between tips, Left Margin, Right Margin, Top Margin oraz Bottom margin.
  5. Kliknij Contact details. Wprowadź adres e-mail w celu późniejszego odwołania się do wyników (opcjonalnie).
  6. Kliknij Overview. Upewnij się, że zweryfikowano liczbę wprowadzonych taksonów oraz wybrane grupy zewnętrzne.
  7. Kliknij Submit. Kliknij prawym przyciskiem myszy pliki w sekcji Downloadable Files (Rysunek 8B) i wybierz Zapisz jako…, aby zapisać wyniki.
    UWAGA: Tekstowy plik wynikowy będzie zawierał całkowitą liczbę wyodrębnionych gatunków na początku wyników. Następnie zostanie przedstawione, które sekwencje należą do poszczególnych klastrów. Klastry te i odpowiadające im sekwencje są rozmieszczone analogicznie do wygenerowanego drzewa w pliku .svg. Plik SVG mPTP wyświetli grupowanie sekwencji. Klastry są przedstawione jako grupy sekwencji połączone czerwonymi gałęziami wzdłuż drzewa. Każdy odizolowany zestaw czerwonych gałęzi wskazuje pojedyncze MOTU.

Interfejs analizy filogenetycznej do przesyłania drzewa, wyboru grupy zewnętrznej i parsowania plików w konfiguracji badawczej.
Rycina 8: Molekularne wyznaczanie granic gatunków za pomocą wielostopniowych procesów drzew Poissonowskich (mPTP). (A) Okna wyświetlające informacje mPTP-read dotyczące przesłanego drzewa. (B) Okno wynikowe w serwerze WWW mPTP z linkiem zawierającym wyniki wyznaczania granic (czerwona ramka). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

8. Generowanie MOTU

  1. Otwórz drzewo za pomocą programu do edycji zdjęć lub programu PowerPoint.
  2. Utwórz pasek reprezentujący wyniki każdego podejścia do delimitacji gatunków molekularnych (przykłady znajdują się na Rysunku 9 oraz Rysunku 10). Upewnij się, że każdy pojedynczy pasek jest wyrównany z sekwencjami, które zawiera w swoim klastrze molekularnym.
  3. Wyznacz MOTU za pomocą jednej z dwóch poniższych metod74
    1. Jeśli wszystkie podejścia dają identyczne wyniki dla danego klastra molekularnego, uznaj klaster molekularny za MOTU na podstawie konsensusu.
    2. Jeśli większość podejść daje identyczne wyniki dla danego klastra molekularnego, uznaj klaster molekularny za MOTU na podstawie większości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym artykule zaimplementowano potok analizy delimitacji gatunków molekularnych, obejmujący TaxonDNA, K2P, ASAP, dwa warianty PTP oraz mPTP, w odniesieniu do chrząszczy wodnych i nadrzecznych. Wynik każdego z sześciu podejść określany jest jako „klastry molekularne”, natomiast podsumowanie jako „molekularne operacyjne jednostki taksonomiczne” lub MOTUs75.

Potok przetwarzania concoction został przetestowany na dwóch zbiorach danych. Pierwszy zbiór danych (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas gdy sekwencje DNA, zwłaszcza COI49, mogą być porównywane z sekwencjami referencyjnymi 22,53,78 w publicznych repozytoriach online 54,55,79,80 dla systemu identyfikacji biologicznej 46, takie podejście jest ograniczone przez dostępne zdeponowane s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Urzędowi ds. Rybołówstwa i Zasobów Wodnych (BFAR) oraz zainteresowanym jednostkom samorządu terytorialnego za udzielenie nam uprzedniej świadomej zgody na przeprowadzenie pobierania próbek bioróżnorodności. Dziękujemy dr Hendrikowi Freitagowi za wskazówki dotyczące prac taksonomicznych. Dziękujemy również recenzentom i redakcji za pomocne, konstruktywne uwagi. Na koniec wyrażamy naszą najwyższą wdzięczność dla University Research Council Big Project Grant (URC 2022-09) oraz Open Access Publication Grant Uniwersytetu Ateneo de Manila, SC Johnson Student Research and Development Fund for Environmental Leadership Instytutu Badawczego Nauki i Inżynierii Ateneo oraz LinnéSys: Systematics Research Fund of the Linnean Society of London i Systematics Association za sfinansowanie tego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
JAK NAJSZYBCIEJ Eksplorator Sparthttps://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/asap/asapweb.html
KomputerDowolna jednostka przetwórcza
MEGA X Oprogramowanie MEGAhttps://www.megasoftware.net/
Serwer WWW mPTPhttps://mptp.h-its.org/#/tree
Serwer WWW PTPInstytut Studiów Teoretycznych w Heidelbergu (HITS)https://species.h-its.org/ptp/
Identyfikator gatunku   https://taxondna.sourceforge.net/

Bibliografia

  1. Ceballos, G., Ehrlich, P. R. Mammal population losses and the extinction crisis. Science. 296 (5569), 904-907 (2002).
  2. Dirzo, R., et al. Defaunation in the Anthropocene. Science. 345 (6195), 401-406 (2014).
  3. Cardoso, P., et al. Scientists' warning to humanity on insect extinctions. Biol Conserv. 242, 108426(2020).
  4. Wagner, D. L., Grames, E. M., Forister, M. L., Berenbaum, M. R., Stopak, D. Insect decline in the Anthropocene: Death by a thousand cuts. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (2), 1-10 (2021).
  5. Steffen, W., Crutzen, P. J., McNeill, J. R. Welcome to the Anthropocene. Ambio. 36 (8), 614-621 (2007).
  6. de Carvalho, M. R., et al. Taxonomic impediment or impediment to taxonomy? A commentary on systematics and the cybertaxonomic-automation paradigm. Evol Biol. 34 (3-4), 140-143 (2007).
  7. Satler, J. D., Carstens, B. C., Hedin, M. Multilocus species delimitation in a complex of morphologically conserved trapdoor spiders (Mygalomorphae, Antrodiaetidae, Aliatypus). Syst Biol. 62 (6), 805-823 (2013).
  8. Arribas, P., Andújar, C., Sánchez-Fernández, D., Abellán, P., Millán, A. Integrative taxonomy and conservation of cryptic beetles in the Mediterranean region (Hydrophilidae). Zool Scr. 42 (2), 182-200 (2013).
  9. Baker, K., et al. Carpooling with ecologists, geographers and taxonomists: Perceptions from conducting environmental research in tropical regions. Biodivers Conserv. 28 (4), 975-981 (2019).
  10. Tan, D. S. H., Ang, Y., Lim, G. S., Bin Ismail, M. R., Meier, R. From "cryptic species" to integrative taxonomy: An iterative process involving DNA sequences, morphology, and behaviour leads to the resurrection of Sepsis pyrrhosoma (Sepsidae: Diptera). Zool Scr. 39 (1), 51-61 (2010).
  11. Tan, M. K., Storozhenko, S. Y., Hwang, W. S., Meier, R. Integrative taxonomy reveals two sympatric species of the genus Eucriotettix Hebard, 1930 (Orthoptera: Tetrigidae). Zootaxa. 4268 (3), 377-394 (2017).
  12. Yule, C. M. Freshwater invertebrates. Freshwater Invertebrates of the Malaysian Region. , 23-31 (2004).
  13. Komarek, A., Jäch, M. A., Ji, L. Hydrophilidae: I. Check list and key to Palearctic and Oriental genera of aquatic Hydrophilidae (Coleoptera). Water Beetles of China. 3, 383-395 (2003).
  14. Rudoy, A., Ribera, I. The macroevolution of size and complexity in insect male genitalia. PeerJ. 4, e1882(2016).
  15. Rudoy, A., Beutel, R. G., Ribera, I. Evolution of the male genitalia in the genus Limnebius Leach, 1815 (Coleoptera, Hydraenidae). Zool J Linn Soc. 178, 97-127 (2016).
  16. Shapiro, A. The lock-and-key hypothesis: Evolutionary and biosystematic interpretation of insect genitalia. Annu Rev Entomol. 34 (1), 231-245 (1989).
  17. Scotland, R., Hughes, C., Bailey, D., Wortley, A. The big machine and the much-maligned taxonomist. Syst Biodivers. 1 (2), 139-143 (2003).
  18. Vinarski, M. V. Roots of the taxonomic impediment: Is the "integrativeness" a remedy. Integr Zool. 15 (1), 2-15 (2020).
  19. Cardoso, P., Erwin, T. L., Borges, P. A. V., New, T. R. The seven impediments in invertebrate conservation and how to overcome them. Biol Conserv. 144 (11), 2647-2655 (2011).
  20. Engel, M. S., et al. The taxonomic impediment: A shortage of taxonomists, not the lack of technical approaches. Zool J Linn Soc. XX, 1-7 (2021).
  21. Tancoigne, E., Dubois, A. Cladistics taxonomy: No decline, but inertia. Cladistics. , 1-4 (2013).
  22. Riedel, A., Sagata, K., Suhardjono, Y. R., Tänzler, R., Balke, M. Integrative taxonomy on the fast track: Towards more sustainability in biodiversity research. Front Zool. 10 (15), 1-9 (2013).
  23. Dayrat, B. Towards integrative taxonomy. Biol J Linn Soc. 85 (3), 407-415 (2005).
  24. Bickford, D., et al. Cryptic species as a window on diversity and conservation. Trends Ecol Evol. 22 (3), 148-155 (2007).
  25. Page, R. D. M. DNA barcoding and taxonomy: Dark taxa and dark texts. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1702), 20150334(2016).
  26. Morinière, J., et al. A DNA barcode library for 5,200 German flies and midges (Insecta: Diptera) and its implications for metabarcoding-based biomonitoring. Mol Ecol Resour. 19 (4), 900-928 (2019).
  27. Hartop, E., Srivathsan, A., Ronquist, F., Meier, R. Towards large-scale integrative taxonomy (LIT): Resolving the data conundrum for dark taxa. Syst Biol. 71 (6), 1404-1422 (2022).
  28. Fossen, E. I., Ekrem, T., Nilsson, A. N., Bergsten, J. Species delimitation in northern European water scavenger beetles of the genus Hydrobius (Coleoptera, Hydrophilidae). ZooKeys. 564, 71-120 (2016).
  29. Bálint, M., et al. Cryptic biodiversity loss linked to global climate change. Nat Clim Change. 1 (6), 313-318 (2011).
  30. Padial, J. M., De La Riva, I. A response to recent proposals for integrative taxonomy. Biol J Linn Soc. 101 (3), 747-756 (2010).
  31. Andújar, C., Arribas, P., Ruiz, C., Serrano, J., Gómez-Zurita, J. Integration of conflict into integrative taxonomy: Fitting hybridization in species delimitation of Mesocarabus (Coleoptera: Carabidae). Mol Ecol. 23 (17), 4344-4361 (2014).
  32. Schlick-Steiner, B. C., et al. Integrative taxonomy: A multisource approach to exploring biodiversity. Annu Rev Entomol. 55 (1), 421-438 (2010).
  33. Stüben, P. E., Astrin, J. J. Integrative taxonomy, phylogeny, and new species of the weevil genus Onyxacalles Stüben (Coleoptera: Curculionidae: Cryptorhynchinae). Psyche (Lond). 2012, 1-22 (2012).
  34. Hawlitschek, O., et al. Pleistocene climate change promoted rapid diversification of aquatic invertebrates in Southeast Australia. BMC Evol Biol. 12 (142), 1-15 (2012).
  35. Delocado, E. D., Freitag, H. Two new species of Byrrhinus Motschulsky, 1858 (Coleoptera, Limnichidae, Limnichinae) from Negros, Philippines. ZooKeys. 1070, 51-72 (2021).
  36. De Vera, G. C. M., Sia, J. I. L., Freitag, H., Delocado, E. D. The first new species of Leptelmis Sharp, 1888 (Coleoptera, Elmidae) from the Philippines in the last 50 years. Tijdschr Entomol. 166 (2-3), 175-186 (2023).
  37. Seno, C. B. N., Delocado, E. D., Freitag, H. Three new species of Ancyronyx Erichson, 1847 (Coleoptera, Elmidae) from Mindanao, Philippines. Tijdschr Entomol. 72, 61-80 (2022).
  38. López-López, A., Hudson, P., Galián, J. Islands in the desert: Species delimitation and evolutionary history of Pseudotetracha tiger beetles (Coleoptera: Cicindelidae: Megacephalini) from Australian salt lakes. Mol Phylogenet Evol. 101, 279-285 (2016).
  39. Ibarra, J. W. B., Bantiding, F. J. A., Delocado, E. D. First Georissidae (Coleoptera) from the Philippines with description of two new species of Georissus Latreille, 1809. Tijdschr Entomol. , 45-58 (2025).
  40. Boonsoong, B., Sartori, M. Review and integrative taxonomy of the genus Prosopistoma Latreille, 1833 (Ephemeroptera, Prosopistomatidae) in Thailand, with description of a new species. ZooKeys. 825, 123-144 (2019).
  41. Wang, Y., Nansen, C., Zhang, Y. Integrative insect taxonomy based on morphology, mitochondrial DNA, and hyperspectral reflectance profiling. Zool J Linn Soc. 177 (2), 378-394 (2016).
  42. Schutze, M. K., et al. One and the same: Integrative taxonomic evidence that Bactrocera invadens (Diptera: Tephritidae) is the same species as the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Syst Entomol. 40 (2), 472-486 (2015).
  43. Schär, S., et al. Integrative biodiversity inventory of ants from a Sicilian archipelago reveals high diversity on young volcanic islands (Hymenoptera: Formicidae). Org Divers Evol. 20, 405-416 (2020).
  44. Ševčík, J., et al. Integrative taxonomy of Central European Planetella (Diptera: Cecidomyiidae) indicates high species diversity, intraspecific variation and low host specificity. Acta Entomol Musei Natl Pragae. 63 (2), 413-450 (2023).
  45. Mengual, X., Ståhls, G., Vujić, A., Marcos-García, M. Á Integrative taxonomy of Iberian Merodon species (Diptera, Syrphidae). Zootaxa. 1377, 1-26 (2006).
  46. Hebert, P. D. N., et al. Biological identifications through DNA barcodes. Proc R Soc B Biol Sci. 270 (1512), 313-321 (2003).
  47. Hebert, P. D. N., et al. Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14812-14817 (2004).
  48. Hebert, P. D. N., Gregory, T. R. The promise of DNA barcoding for taxonomy. Syst Biol. 54 (5), 852-859 (2005).
  49. Hebert, P. D. N., Ratnasingham, S., DeWaard, J. R. Barcoding animal life: Cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc R Soc Lond B. 270 (Suppl), S96-S99 (2003).
  50. Simon, C., et al. Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Ann Entomol Soc Am. 87 (6), 651-701 (1994).
  51. Hendrich, L., et al. Mitochondrial Cox1 sequence data reliably uncover patterns of insect diversity but suffer from high lineage-idiosyncratic error rates. PLoS ONE. 5 (12), e14448(2010).
  52. Balke, M., et al. Suggestions for a molecular biodiversity assessment of Southeast Asian freshwater invertebrates: Lessons from the megadiverse beetles (Coleoptera). J Limnol. 72 (Suppl 2), 61-68 (2013).
  53. Virgilio, M., et al. Comparative performances of DNA barcoding across insect orders. BMC Bioinformatics. 11, 206(2010).
  54. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Res. 41 (D1), 36-42 (2013).
  55. Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. BOLD: The barcode of life data system. Mol Ecol Notes. 7, 355-364 (2007).
  56. Pons, J., et al. Sequence-based species delimitation for the DNA taxonomy of undescribed insects. Syst Biol. 55 (4), 595-609 (2006).
  57. Puillandre, N., et al. automatic barcode gap discovery for primary species delimitation. Mol Ecol. 21 (8), 1864-1877 (2012).
  58. Fontaneto, D., Flot, J. F., Tang, C. Q. Guidelines for DNA taxonomy, with a focus on the meiofauna. Mar Biodivers. 45 (3), 433-451 (2015).
  59. Balke, M., et al. New Guinea highland origin of a widespread arthropod supertramp. Proc R Soc B Biol Sci. 276 (1666), 2359-2367 (2009).
  60. Meier, R., et al. DNA barcoding and taxonomy in Diptera: A tale of high intraspecific variability and low identification success. Syst Biol. 55 (5), 715-728 (2006).
  61. Kimura, M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol. 16 (2), 111-120 (1980).
  62. Puillandre, N., Brouillet, S., Achaz, G. ASAP: Assemble species by automatic partitioning. Mol Ecol Resour. 21 (2), 609-620 (2021).
  63. Wiens, J. J., Penkrot, T. A. Delimiting species using DNA and morphological variation and discordant species limits in spiny lizards (Sceloporus). Syst Biol. 51 (1), 69-91 (2002).
  64. Fujisawa, T., Barraclough, T. G. Delimiting species using single-locus data and the generalized mixed Yule coalescent approach: A revised method and evaluation on simulated data sets. Syst Biol. 62 (5), 707-724 (2013).
  65. Yang, Z., Rannala, B. Unguided species delimitation using DNA sequence data from multiple loci. Mol Biol Evol. 31 (12), 3125-3135 (2014).
  66. Leaché, A. D., Fujita, M. K. Bayesian species delimitation in West African forest geckos (Hemidactylus fasciatus). Proc R Soc B Biol Sci. 277 (1697), 3071-3077 (2010).
  67. Luo, A., et al. Comparison of methods for molecular species delimitation across a range of speciation scenarios. Syst Biol. 67 (5), 830-846 (2018).
  68. Zhang, J., et al. A general species delimitation method with applications to phylogenetic placements. Bioinformatics. 29 (22), 2869-2876 (2013).
  69. Kapli, P., et al. Multi-rate Poisson tree processes for single-locus species delimitation under maximum likelihood and Markov chain Monte Carlo. Bioinformatics. 33 (11), 1630-1638 (2017).
  70. Sanchez, E. G. S., Delocado, E. D., Freitag, H. Two new species of Anacaena Thomson, 1859 (Coleoptera, Hydrophilidae) from the Philippines. ZooKeys. 1112, 11-25 (2022).
  71. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  72. Kumar, S., et al. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Mol Biol Evol. 35 (6), 1547-1549 (2018).
  73. Thompson, J. D., Higgins, D. G., Gibson, T. J. CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680 (1994).
  74. Pentinsaari, M., Vos, R., Mutanen, M. Algorithmic single-locus species delimitation: Effects of sampling effort, variation and nonmonophyly in four methods and 1870 species of beetles. Mol Ecol Resour. 17 (3), 393-404 (2017).
  75. Galimberti, A., et al. Integrated operational taxonomic units (IOTUs) in echolocating bats: A bridge between molecular and traditional taxonomy. PLoS ONE. 7 (6), e40122(2012).
  76. Kundrata, R., Jäch, M. A., Bocak, L. Molecular phylogeny of the Byrrhoidea-Buprestoidea complex (Coleoptera, Elateriformia). Zool Scr. 46 (2), 150-164 (2017).
  77. Komarek, A., Freitag, H. Taxonomic revision of Agraphydrus Règimbart, 1903 V. Philippine species and their first DNA barcodes. Koleopt Rundsch. 90, 201-242 (2020).
  78. Tautz, D., et al. A plea for DNA taxonomy. Trends Ecol Evol. 18 (2), 70-74 (2003).
  79. Altschul, S. F., et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  80. Porter, T., Hajibabaei, M. Over 2.5 million COI sequences in GenBank and growing. bioRxiv. , 353904(2018).
  81. Gómez, R. A., Reddell, J., Will, K., Moore, W. Up high and down low: Molecular systematics and insight into the diversification of the ground beetle genus Rhadine LeConte. Mol Phylogenet Evol. 98, 161-175 (2016).
  82. Kodada, J., et al. Ancyronyx clisteri, a new spider riffle beetle species from Borneo, redescription of A. sarawacensis Jäch including a description of the larva and new distribution data for A. procerus Jäch using DNA barcodes (Coleoptera, Elmidae). ZooKeys. 912, 25-64 (2020).
  83. Hajibabaei, M., Janzen, D. H., Burns, J. M., Hallwachs, W., Hebert, P. D. N. DNA barcodes distinguish species of tropical Lepidoptera. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (4), 968-971 (2006).
  84. Yeo, D., Srivathsan, A., Meier, R. Longer is not always better: Optimizing barcode length for large-scale species discovery and identification. Syst Biol. 69 (5), 999-1015 (2020).
  85. Sabordo, M. R., Delocado, E., Freitag, H. Two new species of the genus Ancyronyx Erichson, 1847 from the island of Negros, Philippines (Insecta, Coleoptera, Elmidae). Tijdschr Entomol. 163 (1), 13-30 (2020).
  86. Astrin, J. J., et al. Exploring diversity in cryptorhynchine weevils (Coleoptera) using distance-, character- and tree-based species delineation. Mol Phylogenet Evol. 63 (1), 1-14 (2012).
  87. Pritchard, J. K., Stephens, M., Donnelly, P. Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics. 155, 945-959 (2000).
  88. Huelsenbeck, J. P., Andolfatto, P., Huelsenbeck, E. T. Structurama: Bayesian inference of population structure. Evol Bioinform. 7, 55-59 (2011).
  89. Hausdorf, B., Hennig, C. Species delimitation using dominant and codominant multilocus markers. Syst Biol. 59 (5), 491-503 (2010).
  90. Fujita, M. K., et al. Coalescent-based species delimitation in an integrative taxonomy. Trends Ecol Evol. 27 (9), 480-488 (2012).
  91. Monaghan, M. T., et al. Accelerated species inventory on Madagascar using coalescent-based models of species delineation. Syst Biol. 58 (3), 298-311 (2009).
  92. Yang, Z., Rannala, B. Bayesian species delimitation using multilocus sequence data. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (20), 9264-9269 (2010).
  93. Ence, D. D., Carstens, B. C. SpedeSTEM: A rapid and accurate method for species delimitation. Mol Ecol Resour. 11 (3), 473-480 (2011).
  94. de Queiroz, K. Species concepts and species delimitation. Syst Biol. 56 (6), 879-886 (2007).
  95. Blair, C., Bryson, R. W. Cryptic diversity and discordance in single-locus species delimitation methods within horned lizards (Phrynosomatidae: Phrynosoma). Mol Ecol Resour. 17 (6), 1168-1182 (2017).
  96. Dellicour, S., Flot, J. F. Delimiting species-poor data sets using single molecular markers: A study of barcode gaps, haplowebs and GMYC. Syst Biol. 64 (6), 900-908 (2015).
  97. Dellicour, S., Flot, J. F. The hitchhiker's guide to single-locus species delimitation. Mol Ecol Resour. 18 (6), 1234-1246 (2018).
  98. Liu, L., et al. Estimating phylogenetic trees from genome-scale data. Ann N Y Acad Sci. 1360 (1), 36-53 (2015).
  99. Lim, G. S., Balke, M., Meier, R. Determining species boundaries in a world full of rarity: Singletons, species delimitation methods. Syst Biol. 61 (1), 165-169 (2012).
  100. Zhou, Z., et al. molecular species delimitation based on COI-5P barcode sequences revealed high cryptic/undescribed diversity for Chinese katydids (Orthoptera: Tettigoniidae). BMC Evol Biol. 19 (1), (2019).
  101. Toussaint, E. F. A., et al. Comparative molecular species delimitation in the charismatic Nawab butterflies (Nymphalidae, Charaxinae, Polyura). Mol Phylogenet Evol. 91, 194-209 (2015).
  102. Carstens, B. C., Dewey, T. A. Species delimitation using a combined coalescent and information-theoretic approach: An example from North American Myotis bats. Syst Biol. 59 (4), 400-414 (2010).
  103. Esselstyn, J. A., et al. Single-locus species delimitation: A test of the mixed Yule-coalescent model, with an empirical application to Philippine round-leaf bats. Proc R Soc Lond B. 279 (1743), 3678-3686 (2012).
  104. Stech, M., et al. Molecular species delimitation in the Racomitrium canescens complex (Grimmiaceae) and implications for DNA barcoding of species complexes in mosses. PLoS One. 8 (1), e53134(2013).
  105. Kekkonen, M., Hebert, P. D. N. DNA barcode-based delineation of putative species: Efficient start for taxonomic workflows. Mol Ecol Resour. 14 (4), 706-715 (2014).
  106. Meier, R., et al. "Dark taxonomy": A new protocol for overcoming the taxonomic impediments for dark taxa and broadening the taxon base for biodiversity assessment. Cladistics. 41, 223-238 (2025).
  107. Ebach, M. C., Holdrege, C. DNA barcoding is no substitute for taxonomy. Nature. 434, 697(2005).
  108. Ebach, M. C., Holdrege, C. More taxonomy, not DNA barcoding. BioScience. 55 (10), 822-823 (2005).
  109. Mora, C., et al. How many species are there on Earth and in the ocean. PLoS Biol. 9 (8), e1001127(2011).
  110. Stork, N. E. How many species of insects and other terrestrial arthropods are there on Earth. Annu Rev Entomol. 63, 31-45 (2018).
  111. Scheffers, B. R., et al. What we know and don't know about Earth's missing biodiversity. Trends Ecol Evol. 27 (9), 501-510 (2012).
  112. Carbayo, F., Marques, A. C. The cost of describing the entire animal kingdom. Trends Ecol Evol. 26 (4), 153-154 (2011).
  113. Walsh, J. C., et al. Trends and biases in the listing and recovery planning for threatened species: An Australian case study. Oryx. 47 (1), 134-143 (2013).
  114. Carrizo, S. F., et al. Freshwater megafauna: Flagships for freshwater biodiversity under threat. BioScience. 67 (10), 919-927 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Potok MOTUkodowanie kreskowe DNAdelimitacja gatunk wchrz szcze nadrzecznesekwencje COIdopasowanie sekwencjidrzewo najwi kszej wiarygodno cimodel Kimura 2 Parameter
Rurociąg miksturowy do generowania molekularnych operacyjnych jednostek taksonomicznych (MOTU) wśród chrząszczy nadbrzeżnych i wodnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.