Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ustanowienie systemu kohodowli organoidów i limfocytów naciekających nowotwór jelita grubego pochodzących od pacjentów

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68346

⸱

27 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Key Laboratory of biomarker high throughput screening and target translation of breast and gastrointestinal tumor, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, 2Department of General Surgery, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje metodę tworzenia modelu organoidowego raka jelita grubego (CRC) pochodzącego od pacjenta, współhodowanego z limfocytami naciekającymi nowotwór (TIL) w celu zbadania ich interakcji i potencjału terapeutycznego. Model ten stanowi platformę przedkliniczną do badania odpowiedzi immunologicznych w mikrośrodowisku guza oraz do przewidywania skuteczności terapii opartej na TIL w spersonalizowanym leczeniu raka jelita grubego.

Streszczenie

Rak jelita grubego (CRC) jest trzecim najczęściej występującym nowotworem na świecie. Limfocyty naciekające nowotwór (TIL) zostały zidentyfikowane jako ważny marker prognostyczny w CRC. Terapeutyczne zastosowanie TIL wykazało już obiecujące wyniki w przypadku czerniaka i raka szyjki macicy. Jednak ich zastosowanie w terapii CRC pozostaje w fazie eksploracyjnej. Odpowiedni model in vitro do oceny skuteczności TIL jest obecnie niedostępny, co utrudnia dalsze postępy w tej dziedzinie. Modele organoidów pochodzących od pacjenta (PDO), które ściśle zachowują cechy oryginalnej tkanki nowotworowej i odzwierciedlają heterogeniczność między pacjentami, stanowią doskonałą platformę do badania interakcji między CRC i TILs. W tym badaniu opisano metodę polegającą na ustaleniu pochodzącego od pacjenta modelu organoidowego CRC ze świeżo wyciętej tkanki nowotworowej, a następnie izolacji i ekspansji TIL. System ten umożliwia jednoczesną hodowlę organoidów CRC i TIL, umożliwiając ocenę cytotoksyczności i odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem TIL. Analizując skuteczność zabijania TIL na organoidach, można przewidzieć potencjalne wyniki immunoterapii opartej na TIL w spersonalizowanym leczeniu CRC. Co więcej, dalsza inżynieria TIL może zwiększyć ich skuteczność przeciwnowotworową, oferując obiecującą strategię opracowywania skuteczniejszych terapii komórkowych. Ten model kohodowli PDO-TIL zapewnia potężne narzędzie do przedklinicznej oceny terapii TIL i spersonalizowanych strategii leczenia raka jelita grubego.

Wprowadzenie

Rak jelita grubego (CRC) jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych i śmiertelnych nowotworów na świecie, stanowiącym poważne wyzwanie dla zdrowia publicznego1. Pomimo postępów w metodach leczenia, w tym chirurgii, chemioterapii i immunoterapii, rokowanie dla pacjentów z CRC - zwłaszcza tych z przerzutami - pozostaje złe. Mikrośrodowisko guza (TME) odgrywa istotną rolę w kształtowaniu progresji raka i odpowiedzi na leczenie, a limfocyty naciekające nowotwór (TIL) stają się kluczowym elementem wpływającym na odpowiedź immunologiczną przeciwko nowotworowi2. TIL, zróżnicowana populacja komórek odpornościowych znajdujących się w nowotworach, została zidentyfikowana jako znaczące markery prognostyczne w CRC, z wysokim poziomem infiltracji TIL często związanym z lepszymi wynikami klinicznymi3. Ostatnie badania podkreśliły również potencjał terapeutyczny TIL w innych nowotworach, takich jak czerniak4 i rak szyjki macicy5, w przypadku których immunoterapia oparta na TIL wykazała obiecującą skuteczność.

Jednak pomimo sukcesu TIL w niektórych typach raka, ich zastosowanie w CRC pozostaje obszarem trwających badań. Złożoność i niejednorodność CRC, w połączeniu z immunosupresyjnym mikrośrodowiskiem guza, stanowią wyzwanie dla skutecznej immunoterapii opartej na TIL6. Guzy CRC często wykazują wysoce immunosupresyjny TME7, charakteryzujący się obecnością regulatorowych komórek T (Treg), komórek supresorowych pochodzących z mieloidu (MDSC) i makrofagów związanych z nowotworem (TAM), z których wszystkie aktywnie hamują funkcję TIL. Co więcej, komórki CRC często wyrażają cząsteczki immunologicznych punktów kontrolnych, takie jak PD-L1, które mogą dodatkowo utrudniać zabijanie za pośrednictwem TIL8. Ponadto genetyczna heterogeniczność guzów CRC, w połączeniu z immunosupresyjnym zrębem, komplikuje zdolność TIL do skutecznego celowania i eliminowania komórek nowotworowych, co utrudnia osiągnięcie tego samego poziomu sukcesu, jaki obserwuje się w czerniaku i raku szyjki macicy9. Krytyczną luką w obecnych badaniach jest brak odpowiednich modeli in vitro , które mogłyby dokładnie symulować interakcje między CRC i TIL. Takie modele są niezbędne do oceny potencjału TIL w terapii CRC i optymalizacji ich zastosowania w spersonalizowanych strategiach leczenia.

Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) stały się potężnym narzędziem do modelowania nowotworów u ludzi10. Te hodowle 3D, pochodzące z tkanek nowotworowych pacjenta, ściśle naśladują histologiczne i genetyczne cechy oryginalnych guzów, zapewniając dokładniejsze odwzorowanie biologii guza w porównaniu z tradycyjnymi liniami komórkowymi 2D. Modele PDO zachowują również heterogeniczność między pacjentami, co czyni je idealnymi dla podejść medycyny spersonalizowanej11. W CRC PDO były wykorzystywane do badań przesiewowych leków i badania biologii nowotworów12, ale ich zastosowanie w ocenie odpowiedzi immunologicznej - szczególnie w kontekście TIL - pozostaje ograniczone. Projekt modelu kohodowli komórek PDO i immunologicznych musi zrównoważyć złożoność mikrośrodowiska z możliwością kontroli eksperymentalnej. Chociaż składniki takie jak makrofagi i komórki dendrytyczne mogą wzmacniać biomimikrę, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) stały się głównym wyborem ze względu na ich dostępność. Jednak PBMC mają niski odsetek limfocytów T specyficznych dla nowotworu, a subpopulacje monocytów mogą zakłócać stabilność mikrośrodowiskową13. W przeciwieństwie do tego, TIL naturalnie wzbogacają klony reagujące na nowotwór i przenoszą fenotyp wyczerpania in situ, co czyni je doskonałym modelem do precyzyjnej analizy mechanizmów unikania odpowiedzi immunologicznej w raku jelita grubego.

Celem tego badania jest opracowanie nowatorskiej platformy in vitro do oceny odpowiedzi przeciwnowotworowych w CRC za pośrednictwem TIL poprzez ustanowienie systemu kohodowli CRC PDO i TIL. Model ten umożliwia bezpośrednią ocenę cytotoksyczności TIL wobec CRC PDO oraz analizę odpowiedzi immunologicznej w kontekście specyficznym dla pacjenta. Wykorzystanie tego systemu może dostarczyć głębszego wglądu w potencjał immunoterapii opartych na TIL w leczeniu raka jelita grubego i wesprzeć badanie strategii mających na celu zwiększenie skuteczności TIL poprzez podejścia inżynieryjne. Poprzednie metody były ograniczone ze względu na niewielką liczbę TIL14. W większości przypadków PBMC były najpierw hodowane wspólnie z PDO przez dwa tygodnie, po czym specyficzne dla nowotworu TIL można było roznwać z PBMC, a następnie dalej hodować razem z PDO, aby zaobserwować efekty cytotoksyczne15. Jednak takie podejście ma również długi czas modelowania i niską ogólną wydajność. Natomiast opisana metoda pozwala na izolację i ustalenie PDO i TIL z mniejszych próbek tkanek nowotworowych, które następnie mogą być bezpośrednio współhodowane. Takie podejście może zapewnić większą wygodę zarówno pod względem metodologii, jak i wydajności. Ostatecznie system ten ma na celu zapewnienie potężnego narzędzia do przedklinicznej oceny terapii TIL, torując drogę do spersonalizowanych strategii leczenia, które mogą poprawić wyniki leczenia pacjentów z CRC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem materiałów pochodzenia ludzkiego zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i zostały wcześniej zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Zhongshan powiązanego z Uniwersytetem Dalian (numery zatwierdzenia: KY2023-206-1). Pisemną świadomą zgodę uzyskano od wszystkich pacjentów, którzy dostarczyli próbki kliniczne do tego badania. Odczynniki i sprzęt używany w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

Kryteria włączenia obejmowały patologicznie potwierdzoną tkankę pierwotnego raka jelita grubego, wystarczającą wielkość próby (≥1 cm3), brak historii terapii neoadjuwantowej (chemoradioterapii lub terapii celowanej) oraz podpisaną świadomą zgodę. Kryteria wykluczenia obejmowały niską jakość próbki z martwicą lub zwłóknieniem przekraczającą 50%, obecność współistniejącej ciężkiej infekcji lub choroby autoimmunologicznej, historię innych nowotworów złośliwych oraz odmowę udziału pacjenta.

1. Przygotowanie odczynnika do hodowli komórkowych

  1. Pożywka dla ChNP CRC: Przygotować kompletną pożywkę CRC ChNP zgodnie ze składem opisanym w tabeli 1.
  2. Kompletna pożywka (CM) dla TILs16: Uzupełnij pożywkę RPMI1640 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny, HEPES, 2-merkaptoetanolu i 3000 j.m./ml IL-2.
  3. Pożywka ekspandująca TILs (EM): Uzupełnij pożywkę RPMI1640 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny, HEPES i 600 IU / ml IL-2.
  4. AdDMEM++++: Suplement Advanced DMEM z 1% penicyliny-streptomycyny, 1% HEPES, 1% glutaminy i 5 mM Y-27632.
  5. Bufor do wytrawiania CRC: Dodać 50 μl kolagenazy typu IV i 10 μl roztworu penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B do AdDMEM++++.
  6. Roztwór do przemywania tkanek: Dodać 2% penicyliny-streptomycyny do PBS.

2. Przetwarzanie tkanek pochodzących od pacjenta

  1. Wyciąć pierwotną tkankę nowotworową raka jelita grubego (do wykonania przez doświadczonych chirurgów). Po pobraniu podziel tkankę na dwie części. Umieść jedną część w AdDMEM++++ w pojemniku na lód i przetransportuj ją do laboratorium w celu dysocjacji komórek nowotworowych i hodowli. Umieść drugą część w 4% paraformaldehydzie do analizy histopatologicznej17.
  2. Powoli rozmrażaj Matrigel w lodówce o temperaturze 4 °C. Bufor do lizy erytrocytów należy wstępnie podgrzać do temperatury pokojowej. Przygotuj nożyczki do tkanek, kleszcze, pożywkę AdDMEM++++ i bufor do trawienia CRC.
  3. Przenieść tkankę na szalkę Petriego i spłukać trzykrotnie 5 ml PBS. Wymień naczynie na nowe i spłucz trzykrotnie 5 ml buforu do płukania chusteczek, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
  4. Tkankę rozdrobnić nożyczkami, przenieść do buforu wytrawiającego i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut, aż do całkowitej dysocjacji.
  5. Przetnij tkankę nożyczkami do tkanek i przenieś ją do roztworu do trawienia tkanek. Trawić tkankę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i monitorować aż do zakończenia dysocjacji tkanek.
  6. Dodaj równą objętość AdDMEM++++, aby zneutralizować trawienie. Wirować przy 380 × g przez 5 minut w temperaturze 25 °C.
  7. Odrzucić supernatant za pomocą pipety. Obserwuj liczbę erytrocytów w osadzie. Dodać 1-3 ml lizatu erytrocytów i inkubować przez 10 minut w temperaturze 25 °C.
    1. Zakończ lizę równą objętością AdDMEM++++. Wirować przy 380 × g przez 5 minut w temperaturze około 25 °C.
  8. Odrzucić supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad komórek w odpowiedniej objętości AdDMEM++++.
  9. Określ ilościowo żywe komórki za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego w celu uzyskania jednokomórkowej zawiesiny tkanki nowotworowej.

3. Ustanowienie modelu ChNP i kultura TIL

  1. Podziel jednokomórkową zawiesinę tkanki nowotworowej na dwie części: użyj jednej do ustalenia modelu PDO, a drugiej do hodowli TIL.
  2. Po zliczeniu komórek wymieszaj 80 000 komórek na studzienkę zawiesiny komórkowej z Matrigelem w stosunku 1:1 w celu ustalenia modelu PDO.
  3. Zawiesić pozostałą zawiesinę komórek w CM na 24-dołkowej płytce o stężeniu 1 × 106 komórek/ml do hodowli TILs.
  4. Obserwuj codziennie. Rób zdjęcia, aby rejestrować status PDO i TIL. Zmieniaj podłoże co 2 dni.

4. Oczyszczanie i rozprężanie TIL

  1. Hoduj TIL przez 10-20 dni przed oczyszczeniem.
  2. Zebrać TIL do probówki wirówkowej. Przepłukać płytkę studzienkową świeżą pożywką i zebrać wszelkie pozostałe komórki z płytki studzienki.
  3. Wirować przy 125 × g przez 5 minut w temperaturze około 25 °C.
  4. Odrzucić supernatant za pomocą pipety. Przemyć 2 ml PBS i ponownie odwirować w temperaturze 125 × g przez 5 minut w temperaturze około 25 °C.
  5. Wykonaj zliczanie komórek.
  6. Użyj kulek magnetycznych CD3 + do sortowania, aby wyizolować limfocyty T CD3 + 18.
  7. Inkubować przeciwciało z zawiesiną komórkową w temperaturze 4 °C przez 10-15 minut.
  8. Inkubować kulki magnetyczne z zawiesiną przeciwciało-komórek w temperaturze 4 °C przez 10-15 minut.
  9. Umieść kolumnę sortującą w magnesie sortującym. Dodaj zawiesinę komórek do kolumny i pozwól, aby w kolumnie sortującej pozostały tylko dodatnie komórki oznaczone kulkami magnetycznymi.
  10. Usuń kolumnę sortującą z pola magnetycznego. Dodaj roztwór buforowy, aby wymyć dodatnie komórki zatrzymane w kolumnie. Zawiesić komórki w 2 ml PBS i odwirować przy 195 × g przez 5 minut w temperaturze około 25 °C.
  11. Odrzucić supernatant za pomocą pipety. Zawiesić komórki na 12-dołkowej płytce ze świeżą pożywką EM o stężeniu 1 × 106 komórek/ml. Dodać 5 μg/ml przeciwciała CD3. Komórki należy umieszczać w nowych kolbach hodowlanych co 3 dni.

5. Histologia i charakterystyka IHC ChNP

  1. Odessać pożywkę hodowlaną po tym, jak organoidy osiągną wielkość 50 μm.
  2. Utrwal kulki organoidowe bezpośrednio w 4% paraformaldehydzie. Odessać organoidy, odwirować przy 195 × g przez 5 minut w temperaturze około 25 °C, zanurzyć w 2% agarozie, pozostawić do utwardzenia i przenieść do 4% paraformaldehydu w celu utrwalenia przez noc.
  3. Następnego dnia wykonaj odwodnienie gradientowe. Przygotuj bloki woskowe, wytnij skrawki 4 μm, ponownie nawodnij za pomocą gradientu i wykonaj barwienie immunohistochemiczne przy użyciu przeciwciał CK7, CK20, Ki-67 i CDX-2.

6. Charakterystyka IF TIL

  1. Oczyść TIL, hoduj je aż do osiągnięcia odpowiedniej liczby i wyekstrahuj porcję do charakteryzacji.
  2. Scharakteryzować komórki zawiesiny za pomocą metody płatkowania. Ustawić prędkość obrotową płatkownicy na 343 × g przez 4 minuty w temperaturze około 25 °C.
  3. Policz i zasiej komórki w ilości 1 × 104 na szkiełko.
  4. Mocno przymocuj komórki do szkiełek przez odwirowanie.
  5. Utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 15 minut i umyj trzy razy PBS.
  6. Inkubować z roztworem blokującym (PBS zawierający 2% FBS) przez 1 godzinę.
  7. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi (CD45, CD3, EpCAM) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj trzy razy PBS.
  8. Przygotować i inkubować z przeciwciałem drugorzędowym zgodnie ze stężeniem zalecanym przez producenta przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj trzy razy PBS.
    UWAGA: Zwróć uwagę na homologię przeciwciał.
  9. Inkubować z DAPI przez 15 minut w temperaturze około 25 °C.
  10. Obserwuj wybarwione komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym.

7. System kohodowli ChNP i TIL

  1. Dodaj IFN-γ do pożywki organoidowej, aby poprawić prezentację antygenu. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny15.
  2. Rozcieńczyć przeciwciało anty-CD28 PBS. Pokryj 96-dołkową płytkę, dodając 50 μl roztworu przeciwciała do każdej studzienki. Uszczelnić płytkę folią uszczelniającą i inkubować w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
  3. Po 24 godzinach zdysocjuj organoidy na pojedyncze komórki za pomocą TrypLE. Policz komórki i przemyj dwukrotnie PBS.
  4. Zbierz sparowane TIL, policz komórki i umyj dwukrotnie PBS.
  5. Zaszczepić organoidy w ilości 1 ×10 4 komórek na studzienkę i zaszczepić TIL w ilości 1 × 105 komórek na studzienkę, aby osiągnąć stosunek efektora do celu (E:T) wynoszący 10:1 dla kohodowli.
  6. Przeprowadzić kohodowlę w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny, 3000 U/ml IL-2 i 20 μg/ml przeciwciała blokującego anty-PD-1. Inkubuj przez 3 dni i rób zdjęcia do obserwacji i dokumentacji.
    UWAGA: Ustaw organoidy bez TIL jako grupę kontrolną.

8. Funkcjonalny test TIL metodą cytometrii przepływowej

  1. Zbierz ChNP i TIL na koniec okresu wspólnej kultury.
  2. Przemyć komórki dwukrotnie PBS przez odwirowanie w stężeniu 300 × g przez 5 minut za każdym razem. Odrzucić supernatant za pomocą pipety.
  3. Przygotuj koktajl przeciwciał zawierający CD3-FITC, CD4-APC/cyjaninę7, CD8-APC, CD107a-PE-cyjaninę7, CD279-PE i 7-AAD.
  4. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl koktajlu przeciwciał i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, chroniąc przed światłem.
  5. Dodaj 1 ml PBS, aby umyć komórki. Odwirować przy 300 × g przez 5 minut i odrzucić supernatant za pomocą pipety.
  6. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS.
  7. Wykonaj analizę cytometrii przepływowej. Patrz rysunek uzupełniający 1 , aby zapoznać się ze szczegółową strategią analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Utworzenie i charakterystyka PDO z raka jelita grubego (CRC)
Próbki nowotworowe pobrano od pacjentów z CRC. Świeżo wyresekcyjną tkankę nowotworową CRC wykorzystano do utworzenia PDO oraz TIL, które następnie zastosowano w eksperymentach z kokulturą PDO-TIL (Rycina 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W badaniu tym wykorzystuje się tkankę CRC pochodzącą od pacjenta w celu uzyskania zarówno komórek nowotworowych, jak i TIL, z których ustanawia się PDO i rozszerza TIL. Interakcja między tymi dwoma składnikami jest następnie badana za pomocą systemu kokultur.

W poprzednich badaniach TIL ekstrahowano przy użyciu złożonego oprzyrządowania19 lub bezpośrednio z zawiesin tkanki nowotworowej20. Jednak metody te często nie są w stanie wygenerować wystar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin [82172822]; Program Wsparcia Innowacji Talentów Wysokiego Szczebla Biura Nauki i Technologii Dalian [2021RD02]; Wspólny plan programu nauki i technologii prowincji Liaoning [2024JH2/102600067]; Projekt Międzynarodowej Współpracy Naukowo-Technologicznej Prowincji Liaoning [2024JH2/101900006].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zaawansowany DMEM/F-12Gibco (firma Gibco)12634028
2-merkaptoetanolSigma63689
4% paraformaldehyduBBI (Biało-CzerwonE672002-0100
7-AADLegenda biologiczna420403
A83-01Tocris powiedział:2939
Suplement witaminy B27Gibco (firma Gibco)17504-44
CD107a-PE-cyjanina7Legenda biologiczna328618
CD279-PELegenda biologiczna329906
Przeciwciało monoklonalne CD3 (OKT3)Invitrogen14-0037-82
CD3-FITCLegenda biologiczna300406
CD45 (domena wewnątrzkomórkowa) (D9M8I) CSTNumer katalogowy: 13917S
CD4-APC/Cyjanina7Legenda biologiczna300518
CD8-APC (Przekaźnik Zabezpieczenia)Legenda biologiczna344722
CDX-2Płyta tysiąclecia (MXBZobacz materiał RMA-0631
Zobacz materiał CK20Płyta tysiąclecia (MXBZestaw-0025
CK7 powiedział:Płyta tysiąclecia (MXBZestaw-0021
Dylight 488, kozia IgG Anty-KrólikAbbkine powiedział:A23220
Dylight 549, Kozia IgG Anty-MyszAbbkine powiedział:Nr kat. A23310
EFG (EFG)PeprotechAF-100-15
EpCAM (Protokół EpCAM)CST36746T
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Komórka CellmaxZobacz materiał SA211.02
FGF 10Peprotech100-26
Gastrin (człowiek)Tocris powiedział:3006
GlutaMax 100xGibco (firma Gibco)35050-061
HepesSigmaZobacz materiał H4034
HEPESYSigmaZobacz materiał H4034
Ludzki zestaw do separacji komórek CD3+ (RUO)RWDZobacz materiał K1201-10
Ludzkie białko rekombinowane IFN-gammaPeproTech300-02-20UG
Czołg Ki-67CSTZobacz materiał 9449s
MatrigelCorning354234
N-acetylocysteinaSigmaA9165 (wersja angielska)
NikotynamidSigmaN0636 powiedział:
Niwolumab (anty-PD-1)SprzedawcaA2002 
Penicylina/StreptomycynaSigmaV900929
penicylina-streptomycynaNCM BiotechnologiaZobacz materiał C100C5
PrimocinSzczepionka InvivogenAnt-pm-1
Bufor do lizy RBCThermo-Invitrogen00-4300-54
Rekombinowana ludzka IL-2 (bez nośnika)Legenda biologiczna589104
Silnik RPMI 1640Gibco (firma Gibco)
SB202190SprzedawcaZobacz materiał S1077
Bejca błękitu trypanowego 0,4%Thermo-InvitrogenZobacz materiał T10282
Ultra-LEAF Oczyszczone przeciwciało anty-ludzkie CD28Legenda biologiczna302934
Oczyszczone przeciwciało anty-ludzkie CD3 Ultra-LEAFLegenda biologiczna317325
Y-27632SprzedawcaZobacz materiał S1049

Bibliografia

  1. Eng, C., et al. Colorectal cancer. Lancet. 404 (10449), 294-310 (2024).
  2. Sarnaik, A. A., Hwu, P., Mulé, J. J., Pilon-Thomas, S. Tumor-infiltrating lymphocytes: A new hope. Cancer Cell. 42 (8), 1315-1318 (2024).
  3. Paijens, S. T., Vledder, A., De Bruyn, M., Nijman, H. W. Tumor-infiltrating lymphocytes in the immunotherapy era. Cell Mol Immunol. 18 (4), 842-859 (2021).
  4. Betof Warner, A., Corrie, P. G., Hamid, O. Tumor-infiltrating lymphocyte therapy in melanoma: Facts to the future. Clin Cancer Res. 29 (10), 1835-1854 (2023).
  5. Huang, H., et al. Phase I study of adjuvant immunotherapy with autologous tumor-infiltrating lymphocytes in locally advanced cervical cancer. J Clin Invest. 132 (15), e157726(2022).
  6. Mengus, C., et al. In vitro modeling of tumor-immune system interaction. ACS Biomater Sci Eng. 4 (2), 314-323 (2018).
  7. Wang, H., Tian, T., Zhang, J. Tumor-associated macrophages (tams) in colorectal cancer (crc): From mechanism to therapy and prognosis. Int J Mol Sci. 22 (16), 8470(2021).
  8. Rasyid, N. R., et al. The potential of PD-1 and PD-L1 as prognostic and predictive biomarkers in colorectal adenocarcinoma based on TILs grading. Curr Oncol. 31 (12), 7476-7493 (2024).
  9. Chen, E., Zeng, Z., Zhou, W. The key role of matrix stiffness in colorectal cancer immunotherapy: Mechanisms and therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1879 (6), 189198(2024).
  10. Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. J Hematol Oncol. 15 (1), 58(2022).
  11. Lv, J., et al. Construction of tumor organoids and their application to cancer research and therapy. Theranostics. 14 (3), 1101-1125 (2024).
  12. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Sci Transl Med. 11 (513), eaay2574(2019).
  13. Magré, L., et al. Emerging organoid-immune co-culture models for cancer research: From oncoimmunology to personalized immunotherapies. J Immunother Cancer. 11 (5), e006290(2023).
  14. Matsueda, S., Chen, L., Li, H., Yao, H., Yu, F. Recent clinical researches and technological development in til therapy. Cancer Immunol Immunother. 73 (11), 232(2024).
  15. Cattaneo, C. M., et al. Tumor organoid-t-cell co-culture systems. Nat Protoc. 15 (1), 15-39 (2020).
  16. Itzhaki, O., et al. Establishment and large-scale expansion of minimally cultured "young" tumor infiltrating lymphocytes for adoptive transfer therapy. J Immunother. 34 (2), 212-220 (2011).
  17. Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26.e16 (2020).
  18. Moore, D. K., Motaung, B., Du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. Isolation of b-cells using miltenyi macs bead isolation kits. PLoS One. 14 (3), e0213832(2019).
  19. Albrecht, H. C., et al. Generation of colon cancer-derived tumor-infiltrating t cells (tils) for adoptive cell therapy. Cytotherapy. 25 (5), 537-547 (2023).
  20. Tan, Y. S., Lei, Y. L. Isolation of tumor-infiltrating lymphocytes by ficoll-paque density gradient centrifugation. Methods Mol Biol. 1960, 93-99 (2019).
  21. Ou, L., et al. Patient-derived melanoma organoid models facilitate the assessment of immunotherapies. EBioMedicine. 92, 104614(2023).
  22. Huang, H., et al. Patient-derived organoids as personalized avatars and a potential immunotherapy model in cervical cancer. iScience. 26 (11), 108198(2023).
  23. Parikh, A. Y., et al. Using patient-derived tumor organoids from common epithelial cancers to analyze personalized T-cell responses to neoantigens. Cancer Immunol Immunother. 72 (10), 3149-3162 (2023).
  24. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
  25. Xu, Y., et al. An engineered IL-15 cytokine mutein fused to an anti-PD1 improves intratumoral T-cell function and antitumor immunity. Cancer Immunol Res. 9 (10), 1141-1157 (2021).
  26. Chang, C. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
  27. Trefny, M. P., et al. Deletion of Snx9 alleviates CD8 T cell exhaustion for effective cellular cancer immunotherapy. Nat Commun. 14 (1), 86(2023).
  28. Sarnaik, A. A., et al. Lifileucel, a tumor-infiltrating lymphocyte therapy, in metastatic melanoma. J Clin Oncol. 39 (24), 2656-2666 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy raka jelita grubegokokultura organoidóworganoidy pochodzące od pacjentówekspansja TILkoraliki magnetyczne CD3cytometria przepływowaizolacja komórek odpornościowychocena cytotoksycznościbarwienie immunofluorescencyjne
Ustanowienie systemu kohodowli organoidów i limfocytów naciekających nowotwór jelita grubego pochodzących od pacjentów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.