To jest pierwsza część kompleksowego protokołu próbkowania Xenopus. Pobrane tkanki to komora serca, pień tętniczy, lewy płat wątroby, pęcherzyk żółciowy, płuco, trzustka, śledziona, krtań, przełyk, żołądek, jelita, jądra, ciała tłuszczowe, jajowód, sparowane nerki, splot kulszowy, skóra, grasica i całe oko.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Skuteczne techniki kompleksowego pobierania próbek dostępnych tkanek u dorosłych Xenopus
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Xenopus od dawna jest kluczowym organizmem modelowym do badania rozwoju i chorób kręgowców, oferując głęboki wgląd w procesy komórkowe i funkcje genów. Pomimo bogactwa informacji na temat embrionalnego Xenopusa, nadal istnieje znaczna luka w standaryzowanych metodach pobierania próbek z tkanek dorosłych, zwłaszcza w przypadku nowoczesnych podejść, takich jak proteomika ilościowa. Badanie to wprowadza kompleksowy protokół do szybkiego, precyzyjnego i wydajnego pobierania próbek z wielu tkanek u dorosłych Xenopus. Protokół odpowiada na wyzwania związane z subtelnymi różnicami anatomicznymi w porównaniu z innymi bezogonowcami, zapewniając powtarzalność nawet dla osób z ograniczonym doświadczeniem w sekcjach żab. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem wysokiej jakości analiz biochemicznych poprzez priorytetowe traktowanie świeżości próbki. Umożliwiamy szybkie pobranie do 18 tkanek w ciągu godziny. Ponadto metody te mają zastosowanie do warunków perfuzji i nieperfuzji, zapewniając elastyczność dla szeregu potrzeb eksperymentalnych. Prace te nie tylko wypełniają krytyczną lukę metodologiczną dotyczącą Xenopus laevis i tropicalis, ale także służą jako cenne źródło informacji dla badaczy dostosowujących techniki do podobnych modeli, zwiększając w ten sposób zakres i wiarygodność porównawczych badań biologicznych i ewolucyjnych.
Wprowadzenie
Xenopus oferuje unikalną przewagę nad myszami, danio pręgowanymi i innymi organizmami modelowymi do badania chorób ludzkich, szczególnie w kontekście rozwojowym i ewolucyjnym. Jego zewnętrzny rozwój embrionalny i duże, łatwe do manipulowania zarodki umożliwiają obserwację w czasie rzeczywistym i interwencje eksperymentalne (np. przeszczep tkanki, edycję genów), które są trudne u myszy, które rozwijają się wewnętrznie i wymagają inwazyjnych procedur. Dodatkowo, trójkomorowe serce i czworonogi Xenopusa stanowią bardziej bezpośredni ewolucyjny pomost do badania wad wrodzonych1, regeneration kończyn2, oraz cardiac development3. W przeciwieństwie do myszy, kijanki Xenopus mogą regenerować kończyny i narządy, modelując procesy regeneracyjne nieobecne u ssaków, a ich wodne stadium życia pozwala na nieinwazyjne badanie wpływu środowiska lub toksyn. W połączeniu z szybszą hodowlą, niższymi kosztami i mniejszymi ograniczeniami etycznymi, Xenopus doskonale nadaje się do wysokoprzepustowych, mechanistycznych badań organogenezy i reakcji na stres, które są trudne do odtworzenia w systemach ssaków.
Ten artykuł ma na celu zaoferowanie jasnych wskazówek dotyczących precyzyjnego i powtarzalnego pobierania próbek narządów z tkanek dorosłych Xenopus, tak jak jest to dostępne dla kijanek Xenopus4. Chociaż dostępna jest "cyfrowa sekcja"5 i "obrazowanie mikro-CT"6 dorosłego Xenopus, osiągnięcie spójnego pobierania próbek narządów i tkanek u dorosłych Xenopus pozostaje trudne bez szczegółowych instrukcji dostarczonych dla innych dorosłych modeli, takich jak mice7,8,9.
Chociaż dostępny jest przewodnik po próbkach dla sześciu kluczowych tkanek10, obecnie nie jest dostępny żaden szczegółowy i obszerny przewodnik po sekcjach i próbkach dla Xenopus. Istnieje obszerny przewodnik po sekcjach dla Rana sp.11, a różne podręczniki do sekcji w klasie są dostępne dla innych anurans12, Jednak dla osób, które nie mają doświadczenia w technikach pobierania próbek lub anatomii, subtelne różnice między Xenopus a innymi anuranami sprawiają, że istniejące zasoby są niewystarczające do spójnego i powtarzalnego pobierania próbek tkanek.
Ten przewodnik został opracowany, aby nadać priorytet świeżości tkanek dla proteomiki i immunochemii. Dla doświadczonego użytkownika wszystkie tkanki mogą zostać pobrane od jednej osoby w mniej niż godzinę. Zaleca się, aby jeśli użytkownik nie ma doświadczenia, wypróbował ten protokół na osobnikach, które zostały poddane eutanazji z innych powodów, zanim złoży w ofierze jakiekolwiek zwierzę, które jest trudniejsze do zastąpienia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z zasadami i przepisami Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee IS 00001365_3). Jeśli przed próbkowaniem przestrzegany jest protokół perfuzji13, przejdź do kroku 2.3.
1. Przygotowanie (bez perfuzji)
- Upewnij się, że instytucja badawcza zatwierdziła technikę eutanazji opisaną w niniejszym protokole.
- Przygotować roztwór 5 g/l MS-222 (metanosulfonian trikainy) i 5 g/l wodorowęglanu sodu (patrz tabela materiałów). Sprawdź pH, aby upewnić się, że wynosi ≥7,
UWAGA: Objętość musi być większa niż objętość wymagana do całkowitego pokrycia zwierząt poddawanych eutanazji. - Wykonaj pierwotną eutanazję, umieszczając Xenopus w roztworze MS-222 (od kroku 1.2), trzymając zwierzę zanurzone przez łącznie 1 h14.
- Umieść powierzchnię preparacyjną (tacę lub arkusz pianki) pod nachyleniem w pojemniku wtórnym lub w inny sposób ułóż ją tak, aby ułatwić drenaż krwi.
- Gdy żaba znajduje się w roztworze przez 1 godzinę, pierwotna eutanazja została zakończona. Usuń żabę i sprawdź utratę reakcji na ból, wykonując uszczypnięcie stopy.
- Należy odnotować wiek (jeśli jest znany), płeć i stan zdrowia zwierzęcia, od którego pobiera się próbkę, a także informację, czy została ona poddana perfuzji. Zważyć Xenopus i wykonać wszelkie dodatkowe wymagane pomiary przed pobraniem próbki.
- Ułóż żabę na grzbiecie i przypnij kończyny przednie bliżej ciała (Rysunek 1A).
- Za pomocą nożyczek preparacyjnych przeciąć skórę, w górę linii środkowej, a następnie na boki, tworząc dwie klapy.
- Zidentyfikuj linea alba (Rysunek 1B). Użyj kleszczy, aby chwycić kresę białą i odciągnąć ją od jamy celomicznej. Ostrożnie użyj nożyczek, aby ciąć w kierunku głowy, przez mięśnie. Wykonaj dwie klapy ze ściany wnęki i odetnij lub przypnij wszystkie klapy.
- Zidentyfikuj serce, które powinno nadal bić. Jeśli serce nie jest łatwo dostępne, użyj nożyczek preparujących, aby zmniejszyć kości krucze (Rysunek 1B).
UWAGA: Jeśli serce przestało bić przed pobraniem próbki, świeżość próbki została zagrożona. - W razie potrzeby wypełnij protokół szybkiej perfuzji9.
2. Pobieranie próbek
UWAGA: Jeśli zwierzę zostało poddane perfuzji, przejdź do kroku 2.3. Wszystkie marginesy powinny wynosić około 25 mm. Kleszcze i nożyczki należy wycierać do czysta lub wymieniać między próbkami. Próbki ze wszystkich tkanek należy pobrać w ciągu 1 godziny od eutanazji, aby zapewnić maksymalną świeżość.
- Za pomocą pipety transferowej przepłukać jamę celomiczną schłodzonym PBS lub 0,7x PBS15, aby usunąć krew i zachować widoczność.
- Zidentyfikuj cienki osierdzie (Ryc. 2A) i pociągnij go za pomocą kleszczy tkankowych. Za pomocą końcówki nożyczek do irydektomii delikatnie ją perforuj, uważając, aby nie przeciąć leżących pod spodem tkanek. Oderwij osierdzie od trzech komór serca (Ryc. 2B).
- Przytnij małżowiny uszne, przecinając je w miejscu, w którym stykają się z komorą i pniem tętniczym.
- Użyj kleszczy, aby chwycić komorę za wierzchołek i przeciąć ją poniżej miejsca, w którym styka się z pniem tętnicy, pozostawiając margines (Rysunek 2C).
- Sprawdź wzrokowo komorę w powiększeniu, aby upewnić się, że nie są przyczepione żadne niechciane tkanki.
UWAGA: Środek komory może zawierać jasną tkankę zastawki spiralnej; To może być zachowane. U zwierząt, u których nie doszło do perfuzji, usunięcie komory może kwalifikować się jako wtórna eutanazja (zwana również znieczuleniem końcowym). - Natychmiast po pobraniu próbek należy przepłukać próbki tkanek w schłodzonym PBS lub 0,7x PBS, w zależności od potrzeb eksperymentalnych15,
UWAGA: U zwierząt poddanych perfuzji oczekuje się, że wszystkie tkanki z wyjątkiem wątroby zostaną czysto wypłukane. Jeśli tak nie jest, należy sporządzić notatkę. W tkankach nieperfundowanych wszystkie media płuczące zostaną nasycone krwią. Kroki 2.5–2.6 należy wykonać po pobraniu próbki z każdej tkanki. - Zauważ, że pień tętniczy rozdziela się na dwa pnie aorty (zwane również aortami bocznymi) i że każdy z nich dzieli się na trzy łuki tętnicze (Rysunek 2D). Pociągnij pień tętniczy i przetnij pnie aorty natychmiast po miejscu, w którym te łuki się rozszczepiają.
- Obserwuj trzy płaty wątroby (Ryc. 3A). Chwyć wargę lewego płata (po prawej stronie widza) i delikatnie unieś ją tak, aby widoczne były przewody wątrobowe i torbielowate. Próbka z dolnych 2/3 płata, poniżej tych nasadek (Rysunek 3B).
- Zidentyfikuj woreczek żółciowy, który może drastycznie różnić się kolorem. Chwyć woreczek żółciowy, odciągnij go od prawego płata wątroby i odetnij jego przyczep (Rysunek 3C). Jeśli nie pęknie, zerwij go nożyczkami do irydektomii.
- Chwyć wierzchołek płuca i pociągnij go mocno. Zwróć uwagę na teksturę pęcherzyków płucnych i określ, gdzie kończy się ta tekstura, a zaczyna oskrzela. Wytnij na tym marginesie (Rysunek 3D). Jeśli płuco jest zrośnięte z otrzewną, ostrożnie je odłącz.
- Zidentyfikuj jajnik, który jest otoczony warstwą otrzewnej trzewnej zwaną nabłonkiem zarodkowym. Delikatnie przesuń płatki, aż znajdą się po odpowiednich stronach, aby obszar przyczepu był widoczny (Rysunek 4A); Te przyczepy są bezpośrednio brzuszne do sparowanej nerki. Za pomocą nożyczek usuń jajniki jak najbliżej nerek, nie uszkadzając ich (Rysunek 4B). Podczas tego procesu, jeśli oocyty wyciekną, pobierz z nich próbkę, a następnie spłucz.
UWAGA: Usunięcie jajnika jest pomocne w uzyskaniu lepszego dostępu do tkanek samicy żaby. - Sprawdź przedni płat (zwany również płatem środkowym) wątroby i zwróć uwagę, jak łączy się on z żołądkiem i dwunastnicą przez krezkę (Rycina 3A i Figura 4C). Przeciąć krezkę i więzadło wątrobowo-nerkowe za pomocą nożyczek do irydektomii. Pozostałą mięsistą masą jest trzustka i wspólny przewód żółciowy.
- Zerwij połączenie trzustki i wspólnego przewodu żółciowego z przednim płatem wątroby, pozostawiając margines. Chwyć żołądek kleszczami zębatymi i jeden koniec trzustki kleszczami tkankowymi. W powiększeniu delikatnie oderwij trzustkę od żołądka (Ryc. 4D).
- Jeśli trzustka nie odejdzie czysto, usuń pozostałą tkankę trzustki. Alternatywnie, odłącz trzustkę metodycznie za pomocą nożyczek do irydektomii i kleszczy do tkanek.
UWAGA: Oczekuje się, że oprócz wspólnego przewodu żółciowego w tej próbce znajdzie się część krezki i przewodu trzustkowego.
- Jeśli trzustka nie odejdzie czysto, usuń pozostałą tkankę trzustki. Alternatywnie, odłącz trzustkę metodycznie za pomocą nożyczek do irydektomii i kleszczy do tkanek.
- Zidentyfikuj śledzionę i pobierz z niej próbkę, przecinając jej przyczep do otrzewnej (Ryc. 4E).
- Usunąć i usunąć pozostałe tkanki wątroby.
- Usuń drugie płuco i pozostałe oskrzela w miejscu, w którym przyczepiają się do krtani. Chwytając krtań za jej dolny koniec, zacznij wyjmować ją z jamy, zrywając wyraźne przyczepy, gdy staną się widoczne.
- Gdy krtań zostanie podniesiona, jej przyczepienie do przełyku stanie się zauważalne. Ostrożnie obierz i odetnij tkankę przełyku od krtani za pomocą zakrzywionych nożyczek do irydektomii (Rysunek 5A). Następnie pociągnij krtań w dół i odetnij ją od jamy ustnej. Wytnij wszystkie wyraźne załączniki, które stają się widoczne.
- Zwróć uwagę na krzywiznę żołądka, która odróżnia go od przełyku, a także na ograniczenie odźwiernika, które odróżnia żołądek od jelit (Ryc. 5B). Przeciąć przewód pokarmowy bezpośrednio przed krzywizną żołądka, oddzielając go od przełyku.
- Otwórz usta i zidentyfikuj wspólny otwór trąbek Eustachiusza na jego dachu16. Przy otwartych ustach pociągnij za przełyk, aby zauważyć jego przyczepienie (Rysunek 5C). Podnieś przełyk z jamy, odcinając po drodze wyraźne przyczepy. Odetnij przełyk od jamy policzkowej bezpośrednio pod otworem Eustachiusza.
- Chwyć żołądek i przetnij go w miejscu, w którym styka się z dwunastnicą, w miejscu ograniczenia odźwiernika (Ryc. 5A,B).
- Napnij okrężnicę i przytnij ją jak najbliżej kloaki (Rysunek 5D). Wyciągnij jelita, odcinając wszelkie wyraźne przyczepy otrzewnej.
- Jeśli żaba jest samcem, zidentyfikuj jądra i usuń je za pomocą nożyczek do irydektomii, uważając, aby nie uszkodzić leżącej poniżej nerki (Ryc. 6A).
- Rozsuń ciała tłuszczowe tak, aby znajdowały się po swojej stronie; widoczny będzie obszar nad nerką, gdzie ciało tłuszczowe łączy się z otrzewną. Chwyć podstawę jednego z tłustych ciał i użyj nożyczek, aby odciąć je od otrzewnej, pozostawiając margines (Ryc. 6B).
- Zidentyfikuj i usuń pęcherz moczowy, przecinając go jak najbliżej kloaki (Ryc. 6C).
- Jeśli żaba jest samicą lub ma wyraźny szczątkowy jajowód, chwyć dolny koniec jajowodu, odciągnij go od kloaki i przytnij jak najbliżej kloaki (Ryc. 6D). Wyciągnij jajowód z jamy celomicznej, odcinając wszelkie przyczepy otrzewnej, gdy staną się widoczne (Ryc. 6E).
- Usuń i usuń pozostałe ciała tłuszczowe i jądra lub jajowód.
- Użyj kleszczy, aby chwycić nerki u ich dolnej podstawy i zwróć uwagę, że są one pokryte przezroczystą otrzewnową (zaotrzewnową)17. Odetnij otrzewną u podstawy nerki (Ryc. 7A), a następnie wyjmij nerki z jamy celomicznej (Ryc. 7B), używając nożyczek, aby w razie potrzeby przeciąć otrzewną.
- W powiększeniu odetnij nadmiar otrzewnej i wszelkie pozostałe tkanki tłuszczowe, jajnika lub jąder.
- Obserwuj wiązkę nerwów obwodowych łączących koniec kręgosłupa z każdą nogą; to jest splot kulszowy. Chwyć wiązkę nerwów kleszczami i odetnij je w miejscu, w którym wychodzą z jamy celomicznej (Ryc. 7C). Wyjmij wiązkę z jamy i przetnij ją w miejscu, w którym nerwy opuszczają kręgosłup (Rysunek 7D).
- Usuń szpilki ze zwierzęcia, odwróć je na jego brzuch i ponownie przypnij kończyny zwierzęcia. Wybierz jedną z kończyn tylnych, z których chcesz pobrać próbkę, i przypnij stopę tej kończyny.
- Usuń płat skóry w kształcie migdała znad mięśnia brzuchatego łydki/kości piszczelowej (Ryc. 8A,B).
- Chwyć skórę grzbietu i przetnij na boki, tak aby wokół środkowej części zwierzęcia znajdowało się ciągłe cięcie (Ryc. 8C).
- Usuń szpilki, zabezpiecz nogi jedną ręką i chwyć przednią skórę grzbietową za pomocą ząbkowanych kleszczy. Oskóruj zwierzę, ciągnąc skórę grzbietową nad głową i ramionami, używając siły (Rysunek 8D).
- Zidentyfikuj masę tłuszczową pokrywającą staw szczękowy, odetnij tylny brzeg masy od miejsca, w którym jest zrośnięta z różowymi tkankami mięśniowymi, a następnie użyj nożyczek do irydektomii, aby odciąć ją od leżącej poniżej kości (Rysunek 9A). W zależności od wieku i dojrzałości zwierzęcia pojawi się skupisko melanoforów (Ryc. 9B). Przyciąć masę tak, aby nie były przyczepione mięśnie ani chrząstki.
- Przypnij zwierzę i wybierz oko. Włóż zakrzywione nożyczki do irydektomii do oczodołu wokół krzywizny oka (Rysunek 9C). Delikatnie naciąć wokół oka, odcinając przyczepy mięśniowe.
- Wsuń nożyczki głębiej w orbitę i odłącz nerw wzrokowy za okiem. Użyj tych nożyczek, aby usunąć oko z orbity, a następnie jeszcze bardziej zmniejszyć przyczepy mięśniowe.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Postępując zgodnie ze wszystkimi krokami tego protokołu, komora serca, pień tętniczy, lewy płat wątroby, pęcherzyk żółciowy, płuco, trzustka, śledziona, krtań, przełyk, żołądek, jelita, jądra, ciała tłuszczowe, jajowód, sparowane nerki, splot kulszowy, skóra, grasica i całe oko zostały czysto wycięte w ciągu godziny od eutanazji (zobacz Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół ma na celu zapewnienie elastyczności użytkownikom na różnych poziomach doświadczenia, przy jednoczesnym zapewnieniu pobierania niezbędnych tkanek w sposób terminowy i skuteczny. Zaleca się, aby nowi użytkownicy postępowali zgodnie z każdym krokiem w protokole, aby zapewnić systematyczne pobieranie tkanek. Bardziej doświadczeni użytkownicy mogą jednak zdecydować się na pominięcie niektórych kroków i pobranie próbek tylko tych tkanek, których potrzebują. Na przykład dostęp do śledziony, która z...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.
Podziękowania
Prace te były wspierane przez grant NIH OD R24 ODO31956. Chcielibyśmy również podziękować Samancie Jalbert i Jill Ralston za ich pomoc i wsparcie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 5-krotne szkło powiększające ze światłem LED i podstawką | amazon.com B08QJ6J8P1 | światło nie może wytwarzać ciepła | |
| Jednorazowe pipety transferowe | VWR | 414004-036 | |
| Kleszcze preparacyjne drobno spiczaste | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Nożyczki preparacyjne ostre, proste 6,5" | VWR | 76457-374 | |
| Taca preparcyjna | Fisher Scientific | 14-370-284 | arkusze styropianu są akceptowalną alternatywą |
| Pojemnik do eutanazji | US Plastic | Pozycja 2860 | alternatywnych nieprzezroczystych pojemników dopuszczalne |
| pokrywy pojemnika do eutanazji | US Plastic | Pozycja 3047 | |
| Nożyczki do irydektomii 6-calowe | nożyczki do irysa | VWR | 470018-938 |
| MS-222: Syncaina (dawniej trykaina) | Pentair AES | TRS1 | |
| 5,5 cala, stal nierdzewna | Fisher Scientific | S08100 | |
| Wodorowęglan sodu, proszek, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Kleszcze do próbek, ząbkowane | VWR | 82027-442 | |
| Kołki teowe do preparowania | Fisher Scinetific | S99385 |
Bibliografia
- Duncan, A. R., Khokha, M. K. Xenopus as a model organism for birth defects—Congenital heart disease and heterotaxy. Semin Cell Biol. 51, 73(2016).
- Kawasumi-Kita, A., et al. hoxc12/c13 as key regulators for rebooting the developmental program in Xenopus limb regeneration. Nat Commun. 15, 3340(2024).
- Hoppler, S., Conlon, F. L. Xenopus: experimental access to cardiovascular development, regeneration discovery, and cardiovascular heart-defect modeling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (6), a037200(2020).
- Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. Xenopus tadpole tissue harvest. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), (2017).
- Porro, L. B., Richards, C. T. Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography. J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).
- Laznovsky, J., et al. Unveiling vertebrate development dynamics in frog Xenopus laevis using micro-CT imaging. Gigascience. 13, giae037(2024).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice—Part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice—Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55 (6), 413-431 (2004).
- Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice—Part 3. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55 (6), 433-449 (2004).
- Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Techniques for rapidly sampling six crucial organs in adult Xenopus. J Vis Exp. (204), (2024).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Dissection of a frog (Rana sp.). Atlas of animal anatomy and histology. , Springer. Cham. 213-263 (2016).
- O'Rourke, D. P. Amphibians used in research and teaching. ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).
- Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Effective rapid blood perfusion in Xenopus. J Vis Exp. (195), e65287(2023).
- AVMA guidelines for the euthanasia of animals. 37, 2020 edition, AVMA Veterinary Medical Association. https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
- Balls, M., Worley, R. S. Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cell line isolated from Xenopus. Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).
- Mason, M., Wang, M., Narins, P. Structure and function of the middle ear apparatus of the aquatic frog, Xenopus laevis. Proc Inst Acoust. 31, 13-21 (2009).
- Holz, P. H., Raidal, S. R. Comparative renal anatomy of exotic species. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).
- Adamson, R. H. Permeability of frog mesenteric capillaries after partial pronase digestion of the endothelial glycocalyx. J Physiol. 428, 1-13 (1990).
- O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio Protoc. 6 (4), e1733(2016).
- Vitt, L. J., Caldwell, J. P. Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetology: An Introductory Biology of Amphibians and Reptiles. , Academic Press. 35-81 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
