Artykuł metodologiczny

Podawanie Δ 9-tetrahydrokannabinolu (THC) u młodych i dorosłych myszy

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68358

⸱

1 sierpnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, University of California, Irvine, 2Department of Biological Chemistry, University of California, Irvine, 3Department of Pharmaceutical Sciences, University of California, Irvine

W tym artykule

Podsumowanie

Δ 9-tetrahydrokannabinol (THC) jest odurzającym składnikiem konopi indyjskich i substancją kontrolowaną w Stanach Zjednoczonych. W artykule przedstawiono standardowe procedury pozyskiwania, przechowywania i podawania THC myszom zgodne z obowiązującymi przepisami prawnymi oraz pokrótce przedstawiono metodę oceny podstawowych efektów farmakodynamicznych THC u gryzoni.

Streszczenie

Δ 9-tetrahydrokannabinol (THC) jest odpowiedzialny za odurzające (psychotropowe) działanie konopi indyjskich i produktów pochodnych konopi dostępnych obecnie na legalnych i nielegalnych rynkach. Efekty psychotropowe THC są wytwarzane poprzez aktywację receptorów kannabinoidowych CB1 w mózgu, które normalnie są angażowane przez endogenne substancje kannabinoidowe (endokannabinoidowe). Poza mózgiem, THC przyczynia się do regulacji szerokiego zakresu procesów fizjologicznych poprzez aktywację receptorów CB1 i CB2. Funkcje fizjologiczne pełnione przez substancje endokannabinoidowe i receptory kannabinoidowe - znane jako układ endokannabinoidowy - zmieniają się znacznie w ciągu życia, przy czym okres dojrzewania jest okresem zwiększonej wrażliwości na wkład tego kompleksu sygnałowego. W artykule opisano protokół przygotowania THC do podawania pozajelitowego i oceny jego ostrych skutków farmakodynamicznych u myszy obojga płci na dwóch etapach rozwoju: w okresie dojrzewania i wczesnej dorosłości. Koncentrując się na trzech dawkach, które są szeroko stosowane w literaturze (1, 5 i 10 mg/kg) oraz na drodze dootrzewnowej, zilustrowano dobrze znane efekty THC - indukcji katalepsji, hamowania aktywności lokomotorycznej i supresji nocycepcji. Ponadto, biorąc pod uwagę status THC jako substancji kontrolowanej w Stanach Zjednoczonych, pokrótce przedstawiono procedury jego pozyskiwania i przechowywania zgodnie z obowiązującymi przepisami.

Wprowadzenie

Rozpowszechnienie używania konopi indyjskich w dorosłej populacji Stanów Zjednoczonych stale rosło w ciągu ostatnich dziesięcioleci i utrzymało się na wysokim poziomie w 2023 roku. Wśród dorosłych w wieku od 19 do 30 lat około 42% zgłosiło używanie konopi indyjskich w ciągu ostatniego roku, 29% w ciągu ostatniego miesiąca, a 10% zgłosiło codzienne lub quasi-codzienne używanie (20 lub więcej razy w ciągu ostatnich 30 dni)1. W przypadku osób dorosłych w wieku od 35 do 50 lat liczby te wynoszą odpowiednio 29%, 19% i 8%. Choć szacunki te nie różnią się statystycznie od tych uzyskanych w 2022 r., wskazują one na wzrosty na przestrzeni ostatnich 5 i 10 lat dla obu grup demograficznych1. Co ważne, obecne dowody sugerują, że około 9% osób używających konopi indyjskich rozwija tolerancję i uzależnienie od narkotyku – stan znany jako zaburzenie związane z używaniem konopi indyjskich (SUD)2 i potencjalny problem zdrowotny3.

Podobnie jak w przypadku innych środków psychoaktywnych, używanie konopi indyjskich zazwyczaj rozpoczyna się we wczesnych latach nastoletnich i stopniowo wzrasta w okresie dojrzewania. W 2023 r. 8%8-klasistów w Stanach Zjednoczonych, 18% 10-klasistów i 29% 12-klasistów zgłosiło, że zażyło narkotyk co najmniej raz4. Liczby te, choć w ciągu ostatnich kilku lat utrzymywały się na stosunkowo stabilnym poziomie, nawet w obliczu zmniejszonego postrzegania ryzyka 5,6 są nadal zbyt wysokie. Oprócz powszechnego zastosowania pozamedycznego, konopie indyjskie wykazały potencjał terapeutyczny w odniesieniu do wielu schorzeń 7,8. Syntetyczna forma jego odurzającego (psychotropowego) składnika, Δ 9-tetrahydrokannabinol (THC) (ryc. 1), jest stosowana od ponad 40 lat jako lek na receptę w leczeniu nudności i utraty apetytu u pacjentów z HIV i rakiem poddawanych chemioterapii 9,10. Zarówno THC, jak i jego analog kannabidiol (CBD) (ryc. 1), który nie jest psychotropowy, są zaangażowane w leczenie bólu, stanów zapalnych i różnych zaburzeń neurologicznych11,12. W związku z tym szybkie rozprzestrzenianie się produktów leczniczych pochodzących z konopi indyjskich – np. w epilepsji dziecięcej i autyzmie – również wprowadza nowe grupy młodych ludzi do tego narkotyku. Zmiany te są szczególnie niepokojące w kontekście społecznym, w którym zmiany legislacyjne i coraz szersza akceptacja napędzają interesy finansowe, które mogą być nadrzędne wobec obaw o zdrowie i bezpieczeństwo publiczne13.

Konopie indyjskie zawierające THC ("marihuana") są spożywane w różnych formach, w tym palenia, waporyzacji, artykułów spożywczych, nalewek i olejów. Po spożyciu, THC rozprowadza się po całym ciele i dostaje się do mózgu, gdzie wywołuje euforię, relaks, zmienioną percepcję zmysłową i zwiększony apetyt, chociaż może również powodować niepokój i paranoję u niektórych osób 14,15. THC oddziałuje z układem endokannabinoidowym (ECB) poprzez aktywację dwóch typów receptorów kannabinoidowych (CB) zlokalizowanych zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz mózgu15,16. W mózgu, gdzie receptory CB1 są najliczniejsze, ich aktywacja wpływa między innymi na nastrój, percepcję bólu, apetyt i funkcje poznawcze. THC aktywuje również receptory CB1 i CB2 w narządach obwodowych, wpływając na ogólnoustrojowy metabolizm energetyczny - w tym pobieranie, wchłanianie i magazynowanie składników odżywczych - a także inicjację bólu, stan zapalny i odporność17,18.

THC wywiera zarówno ostre, jak i trwałe skutki, a dodatkowe badania przedkliniczne i kliniczne nad długoterminowymi konsekwencjami używania konopi indyjskich są nadal potrzebne. Szczególny nacisk należy położyć na potencjalne działania niepożądane związane z wysokimi dawkami THC, biorąc pod uwagę, że średnie stężenie THC w konopiach indyjskich sprzedawanych w Stanach Zjednoczonych wzrosło w ciągu ostatnich dziesięcioleci z 8,9% w 2008 r. do 17,1% w 2017 r.19 , a w ostatnich latach było jeszcze wyższe. "Produkty z konopi indyjskich o dużej mocy" (produkty zawierające wysokie stężenie THC) są powszechne na wielu legalnych rynkach w całych Stanach Zjednoczonych, gdzie średnia zawartość THC w kwiatach konopi wynosi 20-35%, a niektóre produkty ekstrakcyjne osiągają nawet 90% THC. Przy tak wysokich dawkach, THC może mieć jakościowo inne efekty niż te wytwarzane przez tradycyjną "marihuanę o niskiej mocy" używaną w latach 1970. i 1980., która zawierała 6% THC lub mniej20. W związku z tym zrozumienie farmakologii produktów z konopi indyjskich o dużej mocy ma kluczowe znaczenie dla informowania o strategiach prewencyjnych i kierowania polityką regulacyjną i fiskalną. Dodatkowo, zrozumienie, w jaki sposób czynniki takie jak wiek, genetyka i istniejące wcześniej schorzenia wpływają na indywidualne reakcje na THC, może pomóc w dostosowaniu profilaktyki i leczenia do określonych populacji. W szczególności należy dokładniej zbadać konsekwencje zażywania konopi indyjskich przez nastolatków oraz kobiety w ciąży lub karmiące piersią, ponieważ narażenie na kannabinoidy w okresie prenatalnym/okołoporodowym i młodzieńczym, w których system EBC odgrywa kluczową rolę neurorozwojową, może prowadzić do trwałych negatywnych konsekwencji21. Potrzebne są również dalsze badania, aby zrozumieć, w jaki sposób THC wchodzi w interakcje z innymi lekami lub substancjami. Kompleksowe dane na temat bezpieczeństwa i skuteczności THC mogą stanowić podstawę do podejmowania decyzji regulacyjnych i polityki zdrowia publicznego, zapewniając bezpieczne stosowanie zarówno w kontekście medycznym, jak i niemedycznym.

W tym miejscu przedstawiamy standardowe procedury uzyskiwania, przechowywania i podawania THC w warunkach laboratoryjnych zgodnie z obowiązującym ustawodawstwem Stanów Zjednoczonych (Ustawa o substancjach kontrolowanych z 1971 roku). Koncentrując się na trzech dawkach THC szeroko stosowanych w literaturze naukowej (1, 5 i 10 mg/kg)22 oraz dootrzewnowej (i.p.) drodze podawania, zilustrowano trzy klasyczne efekty THC: indukcję katalepsji, hamowanie aktywności lokomotorycznej i antynocycepcję. Protokół ten może być również stosowany po wielokrotnych wstrzyknięciach THC w celu zbadania konsekwencji przewlekłego stosowania THC, co prowadzi do tolerancji i szeregu konsekwencji dla zdrowia psychicznego, które zwykle nie są obserwowane przy ostrym podawaniu u ludzi.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine i zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi National Institutes of Health (NIH) dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt doświadczalnych.

1. Procedury pozyskiwania i przechowywania THC

UWAGA: W Stanach Zjednoczonych stosowanie THC w badaniach akademickich wymaga wykonania kilku kroków wymaganych przez status prawny konopi. Zarówno konopie indyjskie, jak i THC pochodzące z konopi indyjskich są klasyfikowane jako substancje kontrolowane z Wykazu I. Z tego powodu, zanim będzie można kupić marihuanę lub THC, badacze muszą uzyskać licencję od Drug Enforcement Administration (DEA). Przegląd tego procesu, który może trwać do 6 miesięcy lub dłużej, znajduje się poniżej.

  1. Określenie zakresu badań: Określ cel i cele procesu badawczego oraz określ, dlaczego THC jest konieczne. Opracuj protokół badawczy szczegółowo opisujący potrzebne ilości THC, jego komercyjne źródło oraz sposób obchodzenia się z nim i przechowywania. Podaj jak najwięcej istotnych szczegółów.
  2. Otrzymanie instytucjonalnego zatwierdzenia regulacyjnego: Przedłożenie propozycji badawczej do Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt (IACUC) (w przypadku prac przedklinicznych) lub Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) (w przypadku prac klinicznych). Ten etap przeglądu chroni prawa uczestników badań i zapewnia, że badanie jest zgodne ze standardami etycznymi.
  3. Zgodność z przepisami stanowymi: Należy pamiętać o wszelkich przepisach stanowych dotyczących badań nad konopiami indyjskimi, ponieważ mogą się one znacznie różnić. Na przykład w Kalifornii uzyskaj zgodę Kalifornijskiego Panelu Doradczego ds. Badań (RAPC)23.
  4. Pozyskiwanie THC: Kupuj konopie indyjskie i THC od hodowców lub producentów, którzy są do tego celu licencjonowani.
    UWAGA: Lista zatwierdzonych hodowców jest dostępna na stronie internetowej DEA. National Institute on Drug Abuse (NIDA) dostarcza THC za pośrednictwem NIDA Drug Supply Program24. Aby ubiegać się o udział w tym programie, należy podać informacje o instytucji, szczegółowy protokół badawczy oraz dokumentację przepisów instytucjonalnych, takich jak listy zatwierdzające IACUC lub IRB. Wypełnienie formularza DEA 222, który jest jednostronicowym formularzem specjalnie przeznaczonym dla każdego numeru rejestracyjnego DEA, jest wymagane do zakupu lub przekazania substancji kontrolowanych z Wykazu 1.
  5. Odbieranie i przechowywanie THC
    1. Przechowuj THC w bezpiecznie zamkniętym sejfie lub skarbcu, który jest zgodny z projektem zatwierdzonym przez DEA. Dostęp do obszaru badawczego powinien być kontrolowany (na przykład drzwi do budynku i/lub laboratorium powinny być zamknięte na klucz). Tylko upoważniony personel powinien mieć dostęp do THC.
    2. Przygotuj i ustal listę osób, które mają do niej dostęp, i aktualizuj tę listę. Wyraźnie oznacz pojemniki THC z nazwą, stężeniem, datą otrzymania i ostrzeżeniami o zagrożeniu.
    3. Postępuj zgodnie z ustalonymi procedurami utylizacji, które wymagają określonej dokumentacji i przestrzegania przepisów federalnych i stanowych. Utrzymuj THC na poziomie -20 °C lub niższym.
  6. Zarządzanie zapasami:
    1. Wdróż solidny system inwentaryzacji, aby śledzić ilość, użycie i lokalizację THC. Przygotuj segregator substancji kontrolowanych, który zawiera licencję z Wykazu 1, informacje o upoważnionym personelu, zapisy wszystkich wpływów, utylizacji i użycia substancji (rysunek 2).
    2. Przeprowadzaj regularne audyty praktyk w zakresie inwentaryzacji i przechowywania, wypełniając dziennik inwentaryzacji dwa razy w roku, aby zapewnić zgodność z wymogami prawnymi. Okresowo sprawdzaj dzienniki dostępu i rekordy zapasów.
  7. Szkolenia i protokoły: Szkolenie powinno być zapewnione dla całego personelu, który ma do czynienia z THC. Należy ustanowić jasne protokoły przechowywania, obchodzenia się i usuwania leku.
    UWAGA: Wdrażając te praktyki, laboratoria akademickie mogą zapewnić zgodność z wymogami prawnymi i utrzymać bezpieczne środowisko badawcze.

2. Procedury podawania THC myszom przez wstrzyknięcie i.p.

UWAGA: Podczas obchodzenia się z THC ważne jest, aby kontrolować temperaturę i chronić związek przed światłem, aby zachować jego stabilność. THC jest wrażliwe na ciepło i powinno być przechowywane w temperaturze -20 °C lub niższej w celu długotrwałego przechowywania. W przypadku krótkotrwałego przechowywania, THC może być przechowywane w temperaturze pokojowej lub w lodówce w temperaturze 4 °C przez kilka godzin. THC jest również wrażliwe na promieniowanie ultrafioletowe (UV) i światło widzialne, które może powodować degradację poprzez utlenianie. Aby temu zapobiec, THC powinno być przechowywane w hermetycznych pojemnikach ze szkła bursztynowego lub przezroczystych pojemnikach owiniętych folią aluminiową i przechowywanych w ciemności. Zaleca się oznaczanie wszystkich próbek datami i warunkami przechowywania, aby zapewnić prawidłowe śledzenie i stabilność.

  1. Materiałów
    1. Przygotuj wszystkie roztwory przy użyciu wody ultraczystej i odczynników klasy analitycznej. Uzyskaj THC od Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) lub RTI International (Research Triangle Park, NC) lub za pośrednictwem NIDA Drug Supply Program24.
  2. Sprzęt i zaopatrzenie
    1. Upewnij się, że elementy wymienione w Tabeli Materiałów są gotowe przed rozpoczęciem procedury.
      UWAGA: Podczas pracy z THC konieczne jest używanie szklanych fiolek (8 ml lub podobnych) i pojemników. Tworzywa sztuczne mogą reagować lub absorbować cząsteczki hydrofobowe, takie jak THC, co może prowadzić do utraty próbki lub niespójnych stężeń. Szkło jest stabilne chemicznie i niereaktywne, co pomaga zapobiegać niepożądanym interakcjom z cząsteczkami hydrofobowymi.
  3. Procedury podawania THC myszom
    1. Wyjmij pojemnik THC ze skrytki bezpieczeństwa w zamrażarce.
    2. Trzymając pojemnik na lodzie, odbierz odpowiednią objętość THC za pomocą pipety i ostrożnie dodaj ją na dno szklanej fiolki o pojemności 8 ml. Obliczyć objętość na podstawie dawki (mg/kg) i masy ciała myszy (g).
    3. Przenieść fiolkę do dygestorium chemicznego i delikatnie odparować rozpuszczalnik do sucha za pomocą delikatnego strumienia azotu gazowego. Należy uważać, aby nie rozprysnąć roztworu zawierającego THC na boki fiolki, ponieważ spowoduje to poważne straty. Proces ten trwa około 5-10 minut.
    4. Zapisz w Dzienniku Użycia Substancji Kontrolowanej I: Zaloguj się w Spoiwie Substancji Kontrolowanej, ile THC zostało pobrane z aktualnie używanej fiolki.
    5. Gdy rozpuszczalnik całkowicie wyschnie, dodaj odpowiednią objętość Tween-80. Jest to objętość Tween-80 wymagana do uzyskania końcowego 5% stężenia Tween-80 w soli fizjologicznej, jak pokazano w kroku 2.3.8.
    6. Ogrzać fiolkę w zlewce zawierającej gorącą wodę o temperaturze lub niższej niż 60 °C. Obracać fiolkę, aby całkowicie rozpuścić THC i powtórzyć w razie potrzeby.
    7. Stopniowo dodawaj sterylną sól fizjologiczną małymi porcjami: na przykład 200 μl, 300 μl, 500 μl i 1 ml. Wiruj i podgrzej.
    8. Powtarzać kroki 2.3.6 i 2.3.7, aż do momentu, gdy całkowita objętość soli fizjologicznej zostanie dodana do uzyskania końcowego roztworu THC w 5% Tween-80 i 95% soli fizjologicznej, a roztwór zostanie całkowicie rozpuszczony.
    9. (OPCJONALNIE) Poddać sonifikację fiolki w ultradźwiękowej łaźni wodnej ustawionej na około 100% mocy przy 40 kHz i temperaturze 37 °C przez 5 minut. Sprawdzić, czy roztwór jest klarowny i wolny od jakiejkolwiek nierozpuszczonej substancji. Kolor płynu może się różnić w zależności od używanego pojazdu.
    10. Zważyć mysz i określić odpowiednią ilość do wstrzyknięcia. Objętość wstrzyknięcia powinna wynosić 10 ml/kg mc. na mysz.
    11. Kontynuuj wstrzyknięcia dootrzewnowe (i.p.). Upewnij się, że roztwory THC są świeżo przygotowane w dniu użycia.

3. Procedury oceny skutków farmakologicznych THC

  1. Zwierzęta
    1. Do tego badania wykorzystano myszy obu płci.
      UWAGA: W tym badaniu wykorzystano młodzież (dzień po urodzeniu, PND, 30-35) i dorosłych (PND 70-75) myszy C57BL / 6J obu płci z Jackson Laboratories (Farmington, CT).
      Procedura ma zastosowanie do innych szczepów myszy.
    2. Trzymaj myszy w wentylowanych klatkach (4-5 na klatkę) z jedzeniem i wodą dostępną ad libitum. Zwierzęta losowo należy przypisać pod względem wieku i masy ciała do grup poddanych działaniu substancji i pozwolić im zaaklimatyzować się przez co najmniej 1 tydzień przed eksperymentami.
    3. Utrzymuj pomieszczenia mieszkalne w 12-godzinnym cyklu światła/12-godzinnym ciemnym (światła włączają się o 6:30) ze stałą temperaturą (20 ± 2 °C) i wilgotnością względną (55%-60%).
  2. Grupy eksperymentalne
    1. Podziel każdą grupę wiekową i płciową na cztery grupy poddane zabiegowi: jedną grupę kontrolną nośnika i trzy grupy leczenia THC dla dawek 1, 5 i 10 mg/kg.
  3. Podawanie leków
    1. Świeżo przygotuj THC, jak opisano powyżej, w nośniku 95% soli fizjologicznej z 5% Tween-80 i podawaj przez wstrzyknięcie i.p.
  4. Testy behawioralne
    UWAGA: W tym przykładzie każde zwierzę przeszło testy opisane poniżej, aby śledzić działanie THC22. Trzy testy behawioralne przeprowadzono kolejno na tej samej kohorcie zwierząt. Kolejność procedur była następująca: lokomocja (30 minut po THC), katalepsja (45 minut po THC) i zanurzenie w ogonie (60, 180 i 300 minut po THC) (ryc. 3). W eksperymentach z udziałem nastolatek ponownie wykorzystaliśmy tę samą grupę leczoną nośnikiem, a następnie podaliśmy 1 mg/kg lub 10 mg/kg THC tej samej kohorcie w celu przeprowadzenia testów katalepsji i zanurzenia w ogonie. Takie podejście pozwoliło nam osiągnąć wystarczającą moc statystyczną przy jednoczesnej minimalizacji liczby wykorzystywanych zwierząt, zgodnie z wytycznymi etycznymi. Zachowanie zostało zarejestrowane za pomocą kamery, a pliki filmowe zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania do śledzenia zachowań.
    1. Test katalepsji
      UWAGA: Katalepsja u myszy jest stanem (pato)fizjologicznym charakteryzującym się brakiem dobrowolnych ruchów, sztywnością postawy i odpornością na wywołane zewnętrznie zmiany pozycji ciała. Jest uważany za jeden z czterech standardowych efektów THC, wraz z hamowaniem ruchu drogowego, antynocycepcją i obniżoną temperaturą ciała. W tym przykładzie zachowanie kataleptyczne zostało ocenione na podstawie ustalonych procedur22, jak opisano poniżej:
      1. Konfiguracja: Przygotuj poziomy drążek (o długości 7 cm) umieszczony 4 cm nad powierzchnią czystej ławki laboratoryjnej przy normalnym oświetleniu otoczenia (160 luksów). Umieść w pobliżu elektroniczny timer, który jest gotowy do użycia.
      2. Przenieś mysz z pomieszczeń do laboratorium testowego i zaaklimatyzuj ją w klatce przez 60 minut przed badaniem. Noś czysty fartuch laboratoryjny i nie używaj perfum.
      3. Używając czystych rękawiczek lateksowych, delikatnie wyjmij mysz z klatki, bezpiecznie podaj odpowiednią ilość THC lub nośnika i umieść ją z powrotem w klatce.
      4. W odpowiednim czasie po wstrzyknięciu THC (w tym przypadku 45 minut) wyjmij mysz z klatki i delikatnie połóż jej przednie łapy na poziomym drążku.
      5. Rejestruj czas bezruchu za pomocą elektronicznego timera.
        UWAGA: Czas bezruchu jest definiowany jako czas, jaki upłynął od momentu umieszczenia myszy na pasku do momentu usunięcia jednej lub obu łap.
      6. Zatrzymaj stoper, gdy mysz zdejmie jedną lub obie łapy z paska lub gdy zostanie osiągnięty czas graniczny 10 s.
      7. Powtórz test dwukrotnie dla każdej myszy, z 2-minutową przerwą między próbami.
      8. Użyj średniej z dwóch czasów bezruchu do końcowej analizy danych.
      9. Miara wyniku: Użyj czasu bezruchu (w sekundach) jako wskaźnika katalepsji.
    2. Test w terenie otwartym (aktywność lokomotoryczna w nowym środowisku)
      UWAGA: Hipolokomocja wywołana THC jest oceniana za pomocą testu na otwartym polu i zgodnie z ustalonym protokołem25.
      1. Konfiguracja: Do tego testu użyj areny na otwartym polu wyposażonej w sprzęt do śledzenia wideo. Upewnij się, że arena na otwartym polu jest czysta i wolna od zapachów z poprzednich eksperymentów.
        UWAGA: Skuteczne czyszczenie można wykonać przy użyciu dostępnych na rynku produktów opisanych w Tabeli materiałów.
      2. Przenieś mysz z pomieszczeń do laboratorium testowego i zaaklimatyzuj ją w klatce przez 60 minut przed badaniem. Upewnij się, że pomieszczenie testowe jest oświetlone o niskim natężeniu (10 luksów)25. Noś czysty fartuch laboratoryjny i nie używaj perfum.
      3. Używając czystych rękawiczek, delikatnie wyjmij mysz z klatki, bezpiecznie podaj odpowiednią ilość THC lub nośnika i umieść mysz z powrotem w klatce.
      4. W odpowiednim czasie po wstrzyknięciu THC (w tym przypadku 30 minut) delikatnie umieść mysz na środku areny, uważając, aby zminimalizować stres związany z obsługą.
      5. Nagrywaj 10-minutowe sesje za pomocą kamery i oprogramowania do śledzenia zachowań.
      6. Po teście umieść mysz z powrotem w klatce domowej i dokładnie wyczyść arenę opisanym powyżej roztworem czyszczącym.
      7. Miara wyniku: Oblicz całkowitą przebytą odległość, mierzoną w metrach, jako podstawowy parametr do ilościowego określenia aktywności lokomotorycznej.
    3. Test zanurzenia w ogonie (progi nocyceptywne, zwane również testem wycofania ogona gorącej wody)
      UWAGA: Nocycepcję ocenia się za pomocą testu zanurzenia w ogonie, jak opisano wcześniej26. Test ten służy do oceny skuteczności potencjalnych leków przeciwbólowych i oceny tolerancji na ich działanie. Podczas testu ciepło jest przykładane do ogona myszy jako bolesny bodziec i mierzony jest czas wycofania ogona ze źródła ciepła.
      1. Konfiguracja: Przygotuj łaźnię wodną utrzymywaną w temperaturze 54 °C przy normalnym oświetleniu otoczenia (160 luksów). Umieść w pobliżu elektroniczny timer, który jest gotowy do użycia.
      2. Delikatnie przytrzymuj mysz za pomocą kieszeni na miękką tkankę wykonanej przy użyciu podkładek treningowych dla zwierząt (Glad), upewniając się, że ogon pozostaje dostępny.
      3. Zanurz dystalną jedną trzecią ogona w łaźni wodnej i jednocześnie uruchom stoper.
      4. Rejestruj opóźnienie do wycofania ogona (w sekundach), zdefiniowane jako odruchowe machanie ogonem.
      5. Ustaw maksymalny czas odcięcia 10 s, aby zapobiec uszkodzeniom tkanek i dyskomfortowi.
      6. Powtórz pomiar dwa razy dla każdej myszy w każdym punkcie czasowym (w tym przypadku 60, 180 i 300 minut po wstrzyknięciu THC), z 5-minutową przerwą między próbami.
      7. Uśrednij dwa pomiary opóźnienia na potrzeby analizy danych.
      8. Miara wyniku: Oblicz opóźnienie do wycofania ogona, mierzone w sekundach, jako główną zmienną wynikową do oceny efektów antynocyceptywnych.
  5. Analizy statystyczne
    1. Wyraź wyniki jako średnie ± SEM. Określ istotność za pomocą dwukierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnych porównań Šídáka lub trójczynnikowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya. Rozważ różnice znaczące, jeśli P < 0,05.
      UWAGA: Do przeprowadzenia analizy użyto GraphPad Prism w wersji 10.4.

Wyniki

Aby zilustrować opisany powyżej protokół, przedstawiamy wyniki dotyczące ostrych efektów farmakologicznych THC. Cztery grupy myszy (po 8 osobników w grupie) – młode samce, dorosłe samce, młode samice oraz dorosłe samice – otrzymały trzy dawki THC (1, 5 i 10 mg/kg) oraz nośnik jako kontrolę. Następnie oceniono katalepsję, aktywność lokomotoryczną i nocycepcję, skupiając się na zależności efektów od dawki oraz różnicach ze względu na płeć i wiek.

Po pierwsze, w odniesieniu do ostrych efektów kataleptycznych, THC wywołało zależną od dawki katalepsję u adolescentów i dorosłych samców myszy (Rycina 4A i Tabela 1). Czas trwania reakcji był zależny od dawki (P<0.0001, dwuczynnikowa ANOVA), przy czym dawki 5 i 10 mg/kg wywołały statystycznie istotne efekty w obu grupach wiekowych w porównaniu z grupami kontrolnymi otrzymującymi nośnik w każdej z grup (P < 0.0001 w teście wielokrotnych porównań Šídáka). Przy dawce 10 mg/kg THC wywołało katalepsję zarówno u adolescentek, jak i u dorosłych samic myszy (Rycina 4B i Tabela 2), przy czym dorosłe samice wykazały mniej wyraźną odpowiedź w porównaniu z adolescentkami (P < 0.0001 w teście wielokrotnych porównań Šídáka). Zbiory danych poddano dalszej analizie w celu ustalenia, czy płeć wpływa na indukowaną przez THC katalepsję. U adolescentek zaobserwowano niewielką, ale istotną odpowiedź dymorficzną płciowo w porównaniu z samcami (P = 0.0204) (Rycina 4C i Tabela 3). Znacznie silniejszy wpływ płci stwierdzono u dorosłych samic, które były istotnie mniej wrażliwe na efekty kataleptyczne THC w porównaniu z dorosłymi samcami myszy (P < 0.0001) (Rycina 4D i Tabela 4).

Po drugie, w odniesieniu do ostrych efektów lokomotorycznych, THC zredukowało aktywność lokomotoryczną u samców myszy (Rysunek 5A oraz Tabela 5). Efekt ten był zależny zarówno od dawki THC, jak i od wieku zwierząt (P < 0,0001 oraz P = 0,0042 odpowiednio), przy czym myszy w okresie dojrzewania wykazywały większą wrażliwość na działanie THC w porównaniu z myszami dorosłymi. Testy porównań wielokrotnych post-hoc wykazały, że przy dawce THC 5 mg/kg myszy w okresie dojrzewania poruszały się znacząco mniej niż myszy dorosłe (P < 0,0001). THC zredukowało aktywność lokomotoryczną również u samic myszy (Rysunek 5B oraz Tabela 6). Dwuczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) wykazała istotne efekty zarówno dawki, jak i wieku również u samic myszy (odpowiednio P < 0,0001 oraz P = 0,0103) (Rysunek 5B oraz Tabela 6). Jednakże testy porównań wielokrotnych post-hoc nie wykazały statystycznie istotnych różnic między samicami w okresie dojrzewania a samicami dorosłymi przy dawkach THC 0 lub 10 mg/kg (Rysunek 5B). Zbiory danych te poddano dalszej analizie, aby ustalić, czy płeć wpływa na indukowaną przez THC hipolokomocję. Nie zaobserwowano dymorfizmu płciowego u myszy w okresie dojrzewania (Rysunek 5C oraz Tabela 7); natomiast u myszy dorosłych stwierdzono statystycznie istotny dymorfizm płciowy (P = 0,0046), przy czym dorosłe samice wykazywały znacząco wyższą aktywność ruchową w porównaniu z dorosłymi samcami. Niemniej jednak, testy porównań wielokrotnych post-hoc nie wykazały statystycznie istotnych różnic między płciami przy dawkach THC 0 lub 10 mg/kg (Rysunek 5D oraz Tabela 8).

Po trzecie, w odniesieniu do ostrych efektów antynocyceptywnych, THC zmniejszyło nocycepcję w teście zanurzenia ogona u samców myszy (adolescenci, Rysunek 6A i Tabela 9; osobniki dorosłe, Rysunek 6C i Tabela 11). U samców w okresie adolescencji THC wywołało istotne efekty antynocyceptywne przy dawkach 5 i 10 mg/kg, badane w 60, 180 i 360 minutach po podaniu (P < 0,0001 testem wielokrotnych porównań Šídáka, w stosunku do czasu reakcji odruchowej ogona u myszy z grupy kontrolnej otrzymującej nośnik) (Rysunek 6A i Tabela 9). Dwuczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) potwierdziła silny wpływ dawki THC na czas reakcji odruchowej ogona (P < 0,0001) i wykazała zależny od czasu spadek efektów antynocyceptywnych, szczególnie przy najwyższej dawce (P = 0,0133) (Rysunek 6A i Tabela 9). Podobny efekt zależny od dawki THC, ale bez wpływu czasu, zaobserwowano u samic myszy w okresie adolescencji (P < 0,0001 i P = 0,9923, odpowiednio) (Rysunek 6B i Tabela 10). U dorosłych samców THC wywołało istotne efekty antynocyceptywne tylko przy najwyższej dawce (10 mg/kg) i w najwcześniejszym punkcie czasowym (60 min po podaniu) (P < 0,0001 testem wielokrotnych porównań Šídáka, w porównaniu z kontrolami z nośnikiem) (Rysunek 6C i Tabela 11). Dwuczynnikowa ANOVA wykazała istotny wpływ zarówno dawki, jak i czasu (dawka, P < 0,0001; czas, P = 0,0007) (Tabela 11). U dorosłych samic istotny efekt antynocyceptywny zaobserwowano tylko przy najwyższej dawce (10 mg/kg) i w najwcześniejszym punkcie czasowym (60 min po podaniu) (P < 0,0012 testem wielokrotnych porównań Šídáka, w stosunku do kontroli z nośnikiem) (Rysunek 6D i Tabela 12). W kwestii wpływu płci i wieku na indukowaną przez THC antynocycepcję, dwuczynnikowa ANOVA ujawniła, że efekty THC na czas reakcji odruchowej ogona były zależne zarówno od wieku, jak i płci (Rysunek 6E,F, Tabela 13, i Tabela 14). Najsilniejszy efekt zaobserwowano u samców w okresie adolescencji 60 min po podaniu THC, choć we wszystkich czterech grupach myszy stwierdzono istotną indukowaną przez THC antynocycepcję w porównaniu z odpowiednimi kontrolami z nośnikiem w tym punkcie czasowym (Rysunek 6E). Co ciekawe, istotny wpływ płci zaobserwowano u myszy w okresie adolescencji, ale nie u dorosłych, w 60 min po podaniu THC (adolescenci, P = 0,0083; dorośli, P = 0,9919 testem wielokrotnych porównań Šídáka) (Rysunek 6E i Tabela 13). W 300 min po podaniu THC istotne efekty antynocyceptywne stwierdzono tylko u myszy w okresie adolescencji, zarówno u samców, jak i samic, ale nie u myszy dorosłych (Rysunek 6F i Tabela 14). Trójczynnikowa ANOVA przeanalizowała jednocześnie trzy zmienne: dawkę, wiek i płeć, wykazując istotny wpływ zarówno czasu, jak i dawki (P = 0,0007 i P < 0,0001, odpowiednio), a także istotną interakcję między czasem a dawką (P = 0,0022) (Tabela 15).

Schemat struktury chemicznej THC i CBD pokazujący różnice molekularne w kannabinoidach.
Rysunek 1: Struktury chemiczne fitokannabinoidów, THC i CBD, oraz endokannabinoidów, anandamidu i 2-AG. Delta-9-tetrahydrokanabinol (THC) jest wytwarzany w kwiatostanach żeńskich roślin konopi i odpowiada za ich działanie psychotropowe; THC działa poprzez wiązanie się z receptorami CB1 i CB2 sprzężonymi z białkiem G w mózgu i innych tkankach organizmu. Kannabidiol (CBD) jest niepsychotropowym kannabinoidem o właściwościach przeciwdrgawkowych i prawdopodobnie przeciwpsychotycznych oraz przeciwzapalnych. Dwa główne endogenne aktywatory receptorów CB, anandamid i 2-arachidonoilo-sn-glicerol (2-AG), są pochodnymi lipidów przekaźnikami w mózgu i tkankach obwodowych, produkowanymi na żądanie, które uczestniczą w różnych procesach sygnalizacji krótkodystansowej, takich jak precyzyjne dostrajanie plastyczności synaptycznej w OUN. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela dziennika zużycia substancji kontrolowanych do badań; zawiera datę, ilość, personel, podpis.
Rycina 2: Przykład dziennika zużycia substancji kontrolowanych grupy I. Każde użycie THC powinno być odnotowane w dedykowanym dzienniku zużycia substancji kontrolowanych grupy I, który jest przechowywany w segregatorze substancji kontrolowanych w zamykanej szafce lub zabezpieczonym pomieszczeniu biurowym. Formularz ten powinien zawierać imię i nazwisko oraz afiliację głównego badacza (Principal Investigator), który musi posiadać rejestrację na licencję dla substancji z grupy 1, informacje o leku kontrolowanym i dokładnej partii, numer protokołu, osobę upoważnioną do użycia leku wraz z ilością oraz stanem pozostałym po każdym użyciu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat harmonogramu eksperymentu dla efektów THC; etapy: otwarta przestrzeń, katalepsja, test cofania ogona.
Rysunek 3: Schemat przedstawiający kolejność eksperymentów z testami behawioralnymi. Kolejność procedur była następująca: lokomocja (30 min po THC), katalepsja (45 min po THC) oraz zanurzenie ogona (60, 180 i 300 min po THC). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy zależności odpowiedzi od dawki w przypadku katalepsji u samców i samic myszy, osobników młodocianych i dorosłych, badanie behawioralne.
Rycina 4: Ostra katalepsja indukowana THC u myszy. THC wywołuje katalepsję u młodocianych i dorosłych (A) samców oraz (B) samic myszy. Odpowiedź oceniano za pomocą testu poprzeczki po wstrzyknięciu THC d.o. w wskazanej dawce. Ten sam zestaw danych przeanalizowano pod kątem wpływu płci na indukowaną przez THC katalepsję u (C) młodocianych i (D) dorosłych samców i samic myszy. Wyniki przedstawiono jako średnie ± SEM. Istotność statystyczną określono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnych porównań Šídáka. Różnice uznano za istotne, jeśli P < 0,05. ****P < 0,0001 w porównaniu z grupą kontrolną (vehicle), ##P < 0,01 oraz ####P < 0,0001 w porównaniu z grupą młodocianą 10 mg/kg na panelu B lub grupą samców 10 mg/kg na panelach C i D. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Reakcja behawioralna u myszy; wykres słupkowy; całkowity dystans vs. dawka; porównanie osobników młodzieńczych/dorosłych.
Rysunek 5: THC-indukowana ostra hipolokomocja u myszy. THC redukuje spontaniczną aktywność lokomotoryczną u młodzieńczych i dorosłych (A) samców oraz (B) samic myszy. Reakcję oceniano za pomocą testu otwartego pola po wstrzyknięciu THC d.o. w wskazanej dawce. Ten sam zestaw danych przeanalizowano pod kątem wpływu płci na THC-indukowaną hipolokomocję u (C) młodzieńczych oraz (D) dorosłych samców i samic myszy. Wyniki przedstawiono jako średnie ± SEM. Istotność określono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu porównań wielokrotnych Šídáka. Różnice uznano za istotne, jeśli P < 0.05. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 oraz ****P < 0.0001 w porównaniu z kontrolą nośnika, a ####P < 0.0001 w porównaniu z grupą młodzieńczych 5 mg/kg na panelu A. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy latencji odruchu cofania ogona, efekt dawki THC u myszy młodzieńczych/dorosłych, porównanie samców/samic w czasie.
Rycina 6: THC-indukowana analgesia ostra u myszy. Ostre efekty antynocyceptywne THC mierzono za pomocą testu zanurzenia ogona u (A) młodzieńczych samców, (B) młodzieńczych samic, (C) dorosłych samców i (D) dorosłych samic myszy po 60, 180 lub 300 minutach od wstrzyknięcia THC d.p. w indicated dose. Ten sam zestaw danych przeanalizowano pod kątem wpływu wieku i płci na THC-indukowaną antynocycepcję po (E) 60 min lub (F) 300 min od podania THC. Wyniki przedstawiono jako średnie ± SEM. Istotność określono za pomocą dwuczynnikowej analizy ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Šídáka. Różnice uznano za istotne, jeśli P < 0.05. *P < 0.05, ***P < 0.001 i ****P < 0.0001 w porównaniu z kontrolą nośnikiem, oraz ##P < 0.01 pomiędzy grupą młodzieńczych samców i młodzieńczych samic przy dawce 10 mg/kg, a @P < 0.05 i @@P < 0.01 w porównaniu odpowiednio z grupą dorosłych samców i dorosłych samic przy dawce 10 mg/kg. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Tabela 1: Analiza ANOVA dwuczynnikowa dotycząca ostrych efektów THC w wywoływaniu katalepsji u młodniczych i dorosłych samców myszy (powiązana z Rysunkiem 4A) (n = 7-8 na grupę). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Analiza dwuczynnikowa ANOVA dotycząca ostrych efektów THC w wywoływaniu katalepsji u młodych i dorosłych samic myszy (powiązana z Rysunkiem 4B) (n = 5-8 na grupę). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Analiza ANOVA dwuczynnikowa dotycząca ostrych efektów THC w wywoływaniu katalepsji u młodych samców i samic myszy (powiązana z Rysunkiem 4C) (n = 5-8 na grupę). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Analiza dwuczynnikowa ANOVA efektów ostrych THC w wywoływaniu katalepsji u dorosłych myszy samców i samic (powiązana z Rysunkiem 4D) (n = 7-10 na grupę). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: Analiza ANOVA dwuczynnikowa dotycząca ostrych efektów THC na lokomocję u adolescentów i dorosłych samców myszy (powiązana z Rysunkiem 5A) (n = 7-9 na grupę). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 6: Analiza ANOVA dwuczynnikowa dotycząca ostrych efektów THC na lokomocję u młodych i dorosłych myszy żeńskich (powiązana z Rysunkiem 5B) (n = 5-8 na grupę). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 7: Analiza dwuczynnikowa ANOVA dotycząca ostrych efektów THC na lokomocję u adolescentów myszy samców i samic (powiązana z Rysunkiem 5C) (n = 5-8 na grupę). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 8: Analiza ANOVA dwuczynnikowa dotycząca ostrych efektów THC na lokomocję u dorosłych samców i samic myszy (powiązana z Rysunkiem 5D) (n = 7-9 na grupę). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 9: Analiza dwuczynnikowa ANOVA dotycząca ostrych efektów przeciwbólowych THC u adolescentów myszy samców (powiązana z Rysunkiem 6A) (n = 7-8 na grupę). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 10: Analiza ANOVA dwuczynnikowa dotycząca ostrych efektów przeciwbólowczych THC u nastoletnich myszy żeńskich (powiązana z Rysunkiem 6B) (n = 5-8 na grupę). Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 11: Analiza dwuczynnikowa ANOVA dotycząca ostrych efektów przeciwbólowych THC u dorosłych samców myszy (powiązana z Rysunkiem 6C) (n = 6-8 na grupę). Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 12: Analiza dwukierunkowa ANOVA dotycząca ostrych efektów przeciwbólowych THC u dorosłych samic myszy (powiązana z Rysunkiem 6D) (n = 7-8 na grupę). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 13: Analiza dwuczynnikowa ANOVA dotycząca ostrych efektów przeciwbólowych THC u myszy adolescentów i dorosłych, samców i samic, badanych 60 min po wstrzyknięciu 10 mg/kg THC (powiązana z Rysunkiem 6E) (n = 5-8 na grupę). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 14: Analiza dwuczynnikowa ANOVA dotycząca ostrych efektów przeciwbólowych THC u adolescentów i dorosłych myszy, samców i samic, badanych 300 min po wstrzyknięciu 10 mg/kg THC (powiązana z Rysunkiem 6F) (n = 5-8 na grupę). Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 15: Trójczynnikowa analiza ANOVA efektów przeciwbólowych THC w ostrym stanie u myszy nastoletnich i dorosłych, samców i samic, badanych po 60, 180 i 300 min od wstrzyknięcia 10 mg/kg THC (powiązana z Rysunkiem 6E i 6F) (n = 7-8 na grupę). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Ten artykuł zawiera przegląd procedur uzyskiwania i przechowywania THC zgodnie z obowiązującymi przepisami amerykańskimi oraz przedstawia protokół przygotowania THC do wstrzyknięcia dootrzewnowego i podawania go młodym (PND 30-35) i młodym dorosłym myszom (PND 70-75). Bardzo ważne jest, aby pozyskiwać THC z legalnego źródła i przestrzegać wszystkich obowiązujących przepisów. W Stanach Zjednoczonych naukowcy muszą spełniać zarówno federalne, jak i stanowe wymogi regulacyjne, nawet w stanach, w których marihuana jest legalna zarówno do użytku medycznego, jak i niemedycznego. Korzystanie z certyfikowanego źródła zapewnia dostęp do THC klasy badawczej, które jest produkowane pod ścisłą kontrolą, gwarantując stałą moc i czystość. W przeciwieństwie do tego, korzystanie z nieuregulowanego lub nieautoryzowanego źródła zagraża integralności naukowej, wprowadza ryzyko przekierowania i naraża badaczy na konsekwencje prawne.

Zbadaliśmy trzy standardowe reakcje farmakologiczne na THC - katalepsję, zmniejszenie lokomocji i analgezję. Odtworzyliśmy obszerne dane literaturowe (patrz na przykład piśmiennictwo 27,28,29) pokazujące, że THC wpływa na te reakcje w sposób zależny od dawki. Testy te są wykorzystywane w badaniach przedklinicznych do oceny właściwości farmakologicznych agonistów receptorów kannabinoidowych, chociaż ich znaczenie dla doświadczeń u ludzi może się różnić. Katalepsja odnosi się do stanu, w którym podmiot doświadcza zmniejszonej zdolności do poruszania się lub angażowania się w normalne funkcje motoryczne. Objawia się to fizycznym unieruchomieniem lub sztywnością, a podmiot przyjmuje nietypowe pozycje. Zmniejszona lokomocja (lub hipolokomocja) odnosi się do spadku ogólnego poziomu poziomej aktywności motorycznej, co objawia się spowolnieniem lub rzadszym ruchem. Może to być spowodowane uspokojeniem, upośledzeniem motorycznym lub po prostu brakiem motywacji do ruchu. W badaniach na zwierzętach często obserwuje się to jako zmniejszenie zachowań eksploracyjnych lub ogólnego poziomu aktywności w nowym środowisku. Trzeci test, antynocycepcja, odnosi się do zdolności THC do zwiększania opóźnienia wycofania ogona w teście zanurzenia w ogonie. W modelach zwierzęcych, gdzie ocena subiektywnego składnika analgezji wymaga specjalistycznych testów, antynocycepcja zanurzeniowa zapewnia użyteczny, choć ograniczony, pogląd na to, jak leki wpływają na funkcję nocyceptywną.

Przedstawione wyniki pokazują, że THC w zależności od dawki wywołuje katalepsję niezależnie od płci i wieku, w szczególności przy dawkach 5 mg/kg i 10 mg/kg. Efekt specyficzny dla wieku i płci zaobserwowano u dorosłych samic myszy, które wykazywały znacznie stępioną produkcję katalepsji w porównaniu z samcami lub dorastającymi samicami. Hipolokocja wywołana THC w nowym środowisku była silniejsza u dorastających myszy w porównaniu z dorosłymi myszami, niezależnie od płci. Ta związana z wiekiem różnica była możliwa do odróżnienia od selektywnych efektów hipokomotorycznych THC u dorosłych w ich domowej klatce, znajomym środowisku30. Jeśli chodzi o ostre działanie antynocyceptywne THC, statystycznie istotne efekty stwierdzono zarówno przy dawkach 5 mg/kg, jak i 10 mg/kg u dorastających samców myszy, ale u dorosłych samców myszy tylko dawka 10 mg/kg była skuteczna. Spośród trzech badanych tutaj punktów czasowych, antynocyceptywne działanie THC było najwyższe po 60 minutach od THC i zanikało później. Dorastający mężczyźni byli najbardziej wrażliwi na antynocyceptywne działanie THC spośród czterech grup wiekowo-płciowych, a istotną różnicę między płciami zaobserwowano w grupach dorastających myszy po 60 minutach od wstrzyknięcia 10 mg/kg THC. Po 300 minutach podawania THC stwierdzono wyraźny efekt wieku, w którym zaobserwowano znaczące działanie antynocyceptywne u młodzieży, ale nie u dorosłych myszy, niezależnie od płci. Ogólnie rzecz biorąc, dorastające myszy wykazywały zwiększoną wrażliwość na THC w porównaniu z dorosłymi, szczególnie w pomiarach lokomocji i nocycepcji. Podsumowując, wyniki te wskazują, że okres dojrzewania jest wrażliwym okresem dla ostrych skutków farmakologicznych THC, chociaż może tobyć zależne od testu. Wyniki wskazują również na wpływ zarówno wieku, jak i płci na działanie THC, co sugeruje, że dorosłe kobiety są najmniej wrażliwe na THC.

Narażenie na THC w okresie dojrzewania – zwłaszcza gdy jest częste i w dużych dawkach – może zakłócić funkcjonowanie układu endokannabinoidowego w całym ciele, wtym w mózgu. Zakłócenie to może prowadzić do długotrwałych skutków zarówno dla zdrowia psychicznego, jak i fizycznego 32,33,34. Badania epidemiologiczne w ciągu ostatnich trzech dekad konsekwentnie wykazywały powiązania między używaniem konopi indyjskich przez młodzież a długotrwałymi upośledzeniami funkcji poznawczych, nastroju i funkcjonowania psychospołecznego, przy czym skutki te mogą potencjalnie rozciągać się na dorosłość, nawet po zaprzestaniu używania 32,33,34,35,36. Ponadto zgłaszano długoterminowe zmiany w masie ciała, metabolizmie i funkcji immunologicznej. Chociaż powiązania te są dobrze udokumentowane, bardzo ważne jest ustalenie związku przyczynowo-skutkowego między używaniem konopi indyjskich a jego potencjalnym wpływem na zdrowie. Różne metody, w tym niezgodna analiza bliźniąt, randomizacja mendlowska i interwencje quasi-eksperymentalne, mogą być stosowane do oceny związku przyczynowo-skutkowego w populacjach ludzkich. Jednak eksperymenty na zwierzętach laboratoryjnych również odgrywają istotną rolę w wyjaśnianiu związku przyczynowo-skutkowego37. Wyniki naszego laboratorium, finansowanego przez National Institute on Drug Abuse, wykorzystujące model gryzoni o umiarkowanej, ale częstej ekspozycji na THC w okresie dojrzewania, potwierdzają hipotezę, że okres dojrzewania jest okresem podatnym na ekspozycję na THC 17,18,25,38,39,40. Nawet umiarkowane dawki leku w tym krytycznym oknie rozwojowym mogą mieć trwały wpływ na różne składniki dorosłego układu endokannabinoidowego. Efekty te są związane ze zmianami neurobehawioralnymi, a także upośledzeniem odpowiedzi immunologicznej i zdolności do radzenia sobie ze stresem psychospołecznym. Nasze wcześniejsze badania ujawniły również nieoczekiwane zmiany w funkcjonowaniu tkanki tłuszczowej, dostarczając potencjalnego molekularnego wyjaśnienia długoterminowych zmian metabolicznych obserwowanych u regularnych użytkowników konopiindyjskich18. Poprzez niewłaściwą aktywację receptorów CB1 w mózgu podczas ważnych okresów neurorozwojowych, takich jak okres dojrzewania, THC może zakłócić równowagę wymaganą do dojrzewania mózgu, prowadząc do zmian strukturalnych i funkcjonalnych, które mogą utrzymywać się w wieku dorosłym.

U ludzi palenie i waporyzacja są najczęstszymi metodami konsumpcji konopi indyjskich we wszystkich grupach wiekowych. Nasz obecny protokół określa podawanie THC drogą dootrzewnową (i.p.), która jest praktyczna, powtarzalna i wywołuje reakcje farmakokinetyczne i farmakodynamiczne u gryzoni, które pod kilkoma względami przypominają te obserwowane u ludzi zażywających konopie indyjskie. Na przykład wykazano, że dawka IP wynosząca 5 mg/kg THC u dorastających i dorosłych samców myszy wytwarza szczytowe stężenia we krwi porównywalne z tymi, które zgłaszano u dorosłych ludzi. Dostarczanie THC w aerozolu (potocznie nazywanego "parą") jest badane jako uzupełnienie iniekcji IP. Podejście to opiera się na założeniu, że bierne wdychanie THC w aerozolu, podobnie jak palenie lub waporyzacja, prowadzi do wchłaniania płucnego, co skutkuje szybszym początkiem efektów, zmniejszonym metabolizmem wątroby pierwszego przejścia i potencjalnie wyraźnymi wynikami psychoaktywnymi w porównaniu z podawaniem pozajelitowym. Warto zauważyć, że poprzednie badania wykazały, że szczury samodzielnie podają ekstrakty z konopi indyjskich w aerozolu lub mieszaniny THC / kannabidiolu w instrumentalnych paradygmatach behawioralnych, podkreślając potencjał tej metody do badania wzmacniających właściwości THC.

Podsumowując, protokół ten opiera się na ustalonych metodach oceny zachowań tetrad wywołanych kannabinoidami41,42, które są zależne od aktywacji neuronalnych receptorów CB 143, oferując kilka kluczowych aktualizacji i udoskonaleń. Po pierwsze, opisujemy procedury, które są zgodne z obecnymi przepisami DEA i instytucjonalnymi dotyczącymi uzyskiwania, obsługi i podawania krytycznych kwestii związanych z THC dla każdego, kto nie ma praktycznego doświadczenia. Po drugie, stosujemy paradygmat tetrady do myszy dorastających (PND 30-35) i młodych dorosłych (PND 70-75), dwóch etapów rozwojowych, które są bardzo istotne dla wczesnego okresu życia i wschodzącej ekspozycji na konopie indyjskie u dorosłych, ale pozostają niedostatecznie reprezentowane w badaniach przedklinicznych. Wyniki tego badania podsumowują znane, zależne od dawki działanie THC na katalepsję, lokomocję i analgezję, ujawniając jednocześnie zwiększoną wrażliwość na THC u dorastających myszy, szczególnie w domenach nocyceptywnych i lokomotorycznych. Ten specyficzny dla wieku wgląd i dostosowanie regulacyjne sprawiają, że protokół ten jest szczególnie cenny dla nowicjuszy w badaniach nad kannabinoidami oraz dla badaczy badających wpływ kannabinoidów na rozwój.

Oświadczenia

Autorzy nie informują o żadnych biomedycznych interesach finansowych ani potencjalnych konfliktach interesów.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez National Institutes on Drug Abuse (grant nr 2P50DA044118 [do DP]).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 ml strzykawki TBBD309659200/skrzynka; Sterylne, jednorazowego użytku.
8 ml szklane fiolkiFisher Naukowy W224584144/Case, służy do przygotowania roztworu do wstrzykiwań THC.
Oprogramowanie ANY-mazeANY-labirynt6000Służy do nagrywania filmów z testów behawioralnych i ilościowego określania elementów testów do analizy danych.
Myszy C57BL/6JLaboratoria Jacksona#000664Myszy typu dzikiego używane do wszystkich eksperymentów; Może określić dokładny wiek i pożądaną płeć.
Skala kompasu CXOhaus powiedział:Zobacz materiał CR221Służy do ważenia myszy w celu określenia ilości THC do wstrzyknięcia; Maksymalnie 220 g, d = 0,1 g.
Płyta grzejna Corning PyroceramFisher Naukowy11500151Służy do podgrzewania łaźni wodnej do testu Tail Flick.
Delta-9-tetrahydrokannabinolChemikalia na Kajmanach 12068Przechowywany w bezpiecznie zamkniętym sejfie na leki z Wykazu 1 w -30 º C zamrażarka.
Rękawice nitrylowe FisherbrandFisher Naukowy19-181-610100 w opakowaniu; Jednorazowe rękawice bezlateksowe używane do stosowania odpowiednich środków ochrony osobistej.
GraphPad Pryzmat v10.4Podkładka graficznaN/aOprogramowanie do analizy statystycznej służące do analizy danych eksperymentalnych i przeprowadzania testów statystycznych.
Zlewka o dużej wytrzymałościFisher NaukowyZobacz materiał S81280Służy do przechowywania gorącej wody do testu Tail Flick.
Azot gazowy o wysokiej czystościGaz powietrznyUN1066 powiedział:  Służy do odparowywania etanolu z roztworu podstawowego THC.
Kamera internetowa Logitech C920Logitech960-001055Służy do rejestrowania testów behawioralnych zwierząt; Carl Zeiss 1080p/30 kl./s HD USB.
Otwórz poleStoelting Co60101Pudełko z nieprzezroczystymi bokami do przeprowadzania badań w terenie; Boki łatwo zdejmowane do czyszczenia.
Klocki treningowe dla zwierzątZadowolonyB088G1N2H885 w opakowaniu; 22 w. i ostry; 22 w.; służy do owijania i trzymania myszy do testu Tail Flick.
Igły PrecisionGlideBD305109100 w opakowaniu zbiorczym; 0,4 mm i ostry; 13 mm; Sterylne, jednorazowego użytku.
SłonyFisher Scientific (Cytiva)Z1377Butelki 1 l, USP Sterile Grade.
SCOE 1xBioFOG (Szczepionka BioFOG)R-SKRoztwór czyszczący stosowany do czyszczenia materiałów do badań behawioralnych.
Tween-80 powiedział:Sigma AldrichP8074-500MLBioXtra, lepka ciecz; CAS # 9005-65-6.
Ultradźwiękowa kąpiel wodnaFisher Scientific (Branson)CPX2800Kontrola temperatury; Cyfrowa myjka ultradźwiękowa.
Mieszalnik wirowyFisher Naukowy2215365Służy do mieszania zawartości roztworu THC do wstrzykiwań podczas jego przygotowywania.

Bibliografia

  1. Patrick, M. E., Miech, R. A., Johnston, L. D., O'Malley, P. M. Monitoring the future panel study annual report: National data on substance use among adults ages 19 to 65, 1976-2023. , At. https://monitoringthefuture.org/wp-content/uploads/2024/07/mtfpanel2024.pdf (2024).
  2. Lopez-Quintero, C., et al. Probability and predictors of transition from first use to dependence on nicotine, alcohol, cannabis, and cocaine: Results of the National Epidemiologic Survey on Alcohol and Related Conditions (NESARC). Drug Alcohol Depend. 115 (1-2), 120-130 (2011).
  3. Cerda, M., et al. Association between recreational marijuana legalization in the United States and changes in marijuana use and cannabis use disorder from 2008 to 2016. JAMA Psychiatry. 77 (2), 165-171 (2020).
  4. Miech, R. A., et al. Monitoring the future national survey results on drug use, 1975-2023: Secondary school students. , https://archive.org/details/mtf2023 (2023).
  5. Pacek, L. R., Mauro, P. M., Martins, S. S. Perceived risk of regular cannabis use in the United States from 2002 to 2012: Differences by sex, age, and race/ethnicity. Drug Alcohol Depend. 149, 232-244 (2015).
  6. Hammond, C. J., Chaney, A., Hendrickson, B., Sharma, P. Cannabis use among U.S. adolescents in the era of marijuana legalization: A review of changing use patterns, comorbidity, and health correlates. Int Rev Psychiatry. 32 (3), 221-234 (2020).
  7. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. The health effects of cannabis and cannabinoids: The current state of evidence and recommendations for research. , Natl Acad Press. (2017).
  8. Health effects of cannabis and cannabinoids and barriers to research: Report to Congress pursuant to requirements of the Medical Marijuana and Cannabidiol Research Expansion Act. Dept Health Hum Serv. , National Institutes of Health. (2023).
  9. Maccarrone, M., et al. Goods and bads of the endocannabinoid system as a therapeutic target: Lessons learned after 30 years. Pharmacol Rev. 75 (5), 885-958 (2023).
  10. Whiting, P. F., et al. Cannabinoids for medical use: A systematic review and meta-analysis. JAMA. 313 (24), 2456-2473 (2015).
  11. Montagner, P., et al. Charting the therapeutic landscape: A comprehensive evidence map on medical cannabis for health outcomes. Front Pharmacol. 15, 1494492(2024).
  12. Manzoni, O. J., Manduca, A., Trezza, V. Therapeutic potential of cannabidiol polypharmacology in neuropsychiatric disorders. Trends Pharmacol Sci. 46 (2), 145-162 (2025).
  13. Kalant, H. Cannabis control policy: No rational basis yet for legalization. Clin Pharmacol Ther. 97 (6), 538-540 (2015).
  14. Huestis, M. A. Pharmacokinetics and metabolism of the plant cannabinoids, delta9-tetrahydrocannabinol, cannabidiol and cannabinol. Handb Exp Pharmacol. 168, 657-690 (2005).
  15. Grotenhermen, F. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of cannabinoids. Clin Pharmacokinet. 42 (4), 327-360 (2003).
  16. Jung, K. M., Piomelli, D. Cannabinoids and Endocannabinoids. Neuroscience in the 21st Century. , Springer. New York. (2016).
  17. Jung, K. M., Lin, L., Piomelli, D. Overactivation of the endocannabinoid system in adolescence disrupts adult adipose organ function in mice. Cells. 13 (5), 461(2024).
  18. Lin, L., et al. Adolescent exposure to low-dose THC disrupts energy balance and adipose organ homeostasis in adulthood. Cell Metab. 35 (7), 1227-1241.e7 (2023).
  19. Chandra, S., et al. New trends in cannabis potency in USA and Europe during the last decade (2008-2017). Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 269 (1), 5-15 (2019).
  20. Petrilli, K., et al. Association of cannabis potency with mental ill health and addiction: A systematic review. Lancet Psychiatry. 9 (9), 736-750 (2022).
  21. Bara, A., et al. Cannabis and synaptic reprogramming of the developing brain. Nat Rev Neurosci. 22 (7), 423-438 (2021).
  22. Mabou Tagne, A., et al. Delta(9)-tetrahydrocannabinol alleviates hyperalgesia in a humanized mouse model of sickle cell disease. J Pharmacol Exp Ther. 391 (9), 174-181 (2024).
  23. Research advisory panel. , Office of the Attorney General, State of California. At https://oag.ca.gov/research (2024).
  24. NIDA drug supply program. , National Institute on Drug Abuse. At https://nida.nih.gov/research/research-data-measures-resources/nida-drug-supply-program (2024).
  25. Lee, H. L., et al. Frequent low-impact exposure to THC during adolescence causes persistent sexually dimorphic alterations in the response to viral infection in mice. Pharmacol Res. 199, 107049(2024).
  26. Mabou Tagne, A., et al. Persistent exposure to delta(9)-tetrahydrocannabinol during adolescence does not affect nociceptive responding in adult mice. J Pharmacol Exp Ther. 378 (3), 215-221 (2021).
  27. Martin, B. R., et al. molecular modeling evaluations of cannabinoid analogs. Pharmacol Biochem Behav. 40 (3), 471-478 (1991).
  28. Fride, E., Mechoulam, R. Pharmacological activity of the cannabinoid receptor agonist, anandamide, a brain constituent. Eur J Pharmacol. 231 (2), 313-314 (1993).
  29. Pertwee, R. G. The central neuropharmacology of psychotropic cannabinoids. Pharmacol Ther. 36 (2-3), 189-261 (1988).
  30. Torrens, A., et al. Comparative pharmacokinetics of delta(9)-tetrahydrocannabinol in adolescent and adult male mice. J Pharmacol Exp Ther. 374 (1), 151-160 (2020).
  31. Rubino, T., Parolaro, D. Long lasting consequences of cannabis exposure in adolescence. Mol Cell Endocrinol. 286 (1-2 Suppl 1), S108-S113 (2008).
  32. Schneider, M. Puberty as a highly vulnerable developmental period for the consequences of cannabis exposure. Addict Biol. 13 (2), 253-263 (2008).
  33. Chadwick, B., Miller, M. L., Hurd, Y. L. Cannabis use during adolescent development: Susceptibility to psychiatric illness. Front Psychiatry. 4, 129(2013).
  34. Renard, J., et al. Long-term consequences of adolescent cannabinoid exposure in adult psychopathology. Front Neurosci. 8, 361(2014).
  35. Albaugh, M. D., et al. Association of cannabis use during adolescence with neurodevelopment. JAMA Psychiatry. 78 (9), 1-11 (2021).
  36. Schweinsburg, A. D., Brown, S. A., Tapert, S. F. The influence of marijuana use on neurocognitive functioning in adolescents. Curr Drug Abuse Rev. 1 (1), 99-111 (2008).
  37. Rubino, T., Parolaro, D. The impact of exposure to cannabinoids in adolescence: Insights from animal models. Biol Psychiatry. 79 (7), 578-585 (2016).
  38. Lee, H. L., et al. Frequent low-dose delta(9)-tetrahydrocannabinol in adolescence disrupts microglia homeostasis and disables responses to microbial infection and social stress in young adulthood. Biol Psychiatry. 92 (11), 845-860 (2022).
  39. Lim, J., et al. Adolescent exposure to low-dose delta9-tetrahydrocannabinol depletes the ovarian reserve in female mice. Toxicol Sci. 193 (1), 31-47 (2023).
  40. Torrens, A., et al. Comparative pharmacokinetics of delta9-tetrahydrocannabinol in adolescent and adult female mice. Cannabis Cannabinoid Res. 9 (6), 1537-1542 (2024).
  41. Fride, E., et al. Behavioral methods in cannabinoid research. Methods Mol Med. 123, 269-290 (2006).
  42. Metna-Laurent, M., et al. Cannabinoid-induced tetrad in mice. Curr Protoc Neurosci. 80, 9.59.1-9.59.10 (2017).
  43. Monory, K., et al. Genetic dissection of behavioural and autonomic effects of delta(9)-tetrahydrocannabinol in mice. PLoS Biol. 5 (9), e269(2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Podawanie THCmyszy m odocianesystem endokannabinoidowyiniekcja dosytronicznatest katalepsjiaktywno lokomotorycznatest zanurzenia ogonaodpowied na dawkr nice mi dzy p ciami
Podawanie Δ 9-tetrahydrokannabinolu (THC) u młodych i dorosłych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.