Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Fibroblasty związane z rakiem z guzów sutka myszy jako narzędzia do badań molekularnych i obliczeniowych

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68364

⸱

3 lipca 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Human Technopole, 3Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten przedstawia metody hodowli, manipulowania i analizowania mysich CAF, w tym testy funkcjonalne in vitro/in vivo , transkryptomikę i analizę obliczeniową. Ponadto opisano w nim platformę internetową opracowaną w celu analizy publicznie dostępnych transkryptomów mikrowypreparowanych składników zrębu i nabłonka z kolekcji ludzkich nowotworów raka piersi.

Streszczenie

Liczne badania potwierdziły kluczową rolę mikrośrodowiska guza (TME) we wzroście i agresywności raka piersi (BC). Fibroblasty związane z rakiem (CAF), dominujący składnik komórkowy TME, znacząco wpływają na jego zachowanie poprzez złożone przesłuchy z komórkami nowotworowymi i innymi komórkami zrębu w odpowiedzi na sygnały aktywujące pochodzące z nowotworu. Modele mysie są szeroko stosowane do badania mechanizmów leżących u podstaw roli CAF w progresji BC, ponieważ pozwalają na ocenę endogennego TME i ocenę zaangażowania układu odpornościowego za pomocą badań ksenoprzeszczepu syngenicznego. W tym miejscu przedstawiamy zestaw metod hodowli CAF pochodzących z BC, manipulowania ekspresją genów i oceny ich funkcji pronowotworowych przy użyciu podejść zarówno in vitro , jak i in vivo . Opisujemy również protokoły profilowania ekspresji genów CAF i analizy transkryptomicznej, wraz z procedurą obliczeniową do wnioskowania o sygnaturach transkrypcyjnych w guzach pierwotnych przy użyciu publicznie dostępnych masowych danych sekwencyjnych RNA. Dodatkowo wprowadzamy przyjazne dla użytkownika, internetowe narzędzie do analizy transkryptomów składników zrębu i nabłonka z mikrowypreparowanych laserowo guzów BC. Ostatecznie metody te mogą dostarczyć cennych informacji na temat mechanizmów molekularnych kierujących interakcjami między CAF a nowotworem i mają potencjał w zakresie identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Wprowadzenie

Rak piersi (BC) jest najczęstszym nowotworem złośliwym dotykającym kobiety i charakteryzuje się znaczną niejednorodnością molekularną, z odrębnymi profilami molekularnymi kierującymi diagnozą, decyzjami dotyczącymi leczenia i rokowaniem. Mikrośrodowisko guza (TME) jest również wysoce niejednorodne i odgrywa kluczową rolę w progresji guza, odporności i wynikach leczenia.

Fibroblasty związane z rakiem (CAF) są najliczniejszym typem komórek w TME i kluczowymi regulatorami rozwoju nowotworu. Przyczyniają się do odkładania i przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej, angiogenezy, unikania odpowiedzi immunologicznej i opornościna leki 1,2,3,4,5,6. CAF wpływają na komórki nowotworowe poprzez bezpośredni kontakt komórka-komórka, uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych7 i wydzielanie różnych rozpuszczalnych czynników 2,5 w celu promowania wzrostu guza, inwazji i oporności na terapię 8,9,10. Rzeczywiście, sygnatury genów związane ze zrębem mają wartość predykcyjną dla progresji BC i odpowiedzi na terapię oraz są związane z opornością na chemioterapię 11,12,13,14. Jednak pomimo istotnych dowodów sugerujących, że CAF są atrakcyjnym celem terapeutycznym, badania kliniczne ukierunkowane na te komórki w dużejmierze zakończyły się niepowodzeniem. Jednym z głównych wyzwań jest ograniczone zrozumienie mechanizmów molekularnych, za pomocą których CAF modulują zachowanie guza. Ostatnie postępy w jednokomórkowych i przestrzennych analizach transkryptomicznych dostarczyły głębszego wglądu w złożoność CAF w BC 16,17,18,19,20,21, umożliwiając identyfikację odrębnych podtypów CAF z określonymi programami funkcjonalnymi 16,22 i dodatkowo podkreślając ich złożoność i plastyczność23.

Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM), w których onkogeny lub geny supresorowe są nadmiernie eksprymowane lub inaktywowane, są dobrze ugruntowanymi modelami do badania raka u ludzi 24,25,26,27. W porównaniu z modelami syngenicznymi, które obejmują przeszczepianie komórek nowotworowych u myszy typu dzikiego 23,28, GEMM dokładniej naśladują wieloetapową progresję BC i interakcje między komórkami rakowymi a TME. Manipulowanie aktywnością CAF w GEMM było jednak wyzwaniem ze względu na ich niejednorodność, co utrudnia celowanie we wszystkie podtypy CAF bez wpływu poza cel na inne komponenty zrębu lub nabłonka5. Połączenie GEMM z uzupełniającymi podejściami, takimi jak manipulacja CAF in vitro, może pomóc w generowaniu modeli komórkowych do eksperymentów z utratą funkcji zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo. Jednak opracowanie stabilnych modeli komórkowych w celu zbadania funkcjonalnych ról określonych genów pozostaje wyzwaniem ze względu na szybki początek starzenia się.

W tym miejscu opisujemy solidną platformę do stabilnych eksperymentów z utratą funkcji w CAF, a następnie funkcjonalnej analizy in vitro i in vivo oraz profilowania transkrypcyjnego zmodyfikowanych komórek; podejście to oferuje kompleksową strategię analizy funkcjonalnego znaczenia genów wyrażających ekspresję CAF w raku piersi, z korzyściami w zakresie swoistości, odtwarzalności i zdolności adaptacyjnych w porównaniu z istniejącymi metodami. Podejście to zostało również uzupełnione przez nowatorskie narzędzie internetowe do badania transkryptomów mikrowypreparowanych laserowo przedziałów zrębu i nabłonka ludzkich guzów piersi, umożliwiając porównania międzygatunkowe i ułatwiając generowanie hipotez na podstawie danych pochodzących z badań ludzkich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie to jest zgodne ze wszystkimi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi obchodzenia się z myszami i pobierania próbek tkanek. Wszystkie zabiegi zostały przeprowadzone zgodnie z krajowymi i międzynarodowymi przepisami i politykami. Myszy trzymano w jednostce transgenicznej wolnej od specyficznych patogenów w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w temperaturze 22 °C przy wilgotności 50% i dostarczano im pożywienie i wodę ad libitum. Zabiegi chirurgiczne muszą być wykonywane zgodnie z instytucjonalnymi instrukcjami weterynaryjnymi w celu zapewnienia odpowiedniego znieczulenia i znieczulenia, zarówno podczas zabiegu, jak i w okresie pooperacyjnym. Tabela materiałów zawiera szczegółowe informacje na temat materiałów, odczynników i przyrządów używanych w tym protokole.

1. Hodowla komórkowa

  1. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przy wilgotności względnej 95%, w DMEM (HEK293T, CAF i unieśmiertelnione CAF (iCAF)) lub pożywce RPMI (4T1), uzupełnione 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny (1% Pen/Strepto).
    UWAGA: Kompletny skład pożywek (cDMEM, cRPMI): 10% inaktywowany termicznie FBS, skład pożywek głodowych (sDMEM, sRPMI): bez FBS. Średni czas podwajania dla komórek: HEK293T i iCAF wynoszą 24 godziny; Komórki 4T1 mają wartość 12h.
  2. Komórki pasażują po osiągnięciu 80% konfluencji, w stosunku nie większym niż 1:5, nigdy więcej niż 10 razy po rozmrożeniu, aby uniknąć dryfowania fenotypowego, jak opisano poniżej.
    1. Odessać pożywkę i delikatnie dodać 7 ml PBS na bok naczynia o średnicy 100 mm. Odessać PBS, dodać 1 ml trypsyny-EDTA. Inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: EDTA jest wymieniony jako związek niebezpieczny kategorii 2 w zakresie działania drażniącego na oczy. Trzymaj się w okapie biologicznym/dygestorium, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej.
    2. Dezaktywuj trypsynę-EDTA za pomocą 5 ml cDMEM, odłącz komórki, pipetując w górę iw dół, a następnie zbierz do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 290 x g przez 5 min.
    3. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml cDMEM. W celu rozszczepienia 1:5 należy zasiać 1 ml zawieszonych komórek w naczyniu o średnicy 100 mm zawierającym 9 ml cDMEM.
  3. Liczenie komórek: Umieścić 10 μl zawiesiny komórek z kroku 1.2.3 na boku komory liczącej Neubauera, policzyć komórki w dużych kwadratach i pomnożyć otrzymaną liczbę przez 1 x 104 w celu obliczenia liczby komórek zawartych w 1 ml zawiesiny komórek.
  4. Kriokonserwacja: Zamrozić 50% naczynia o średnicy 100 mm (około 3 x 106 komórek) w 0,5 ml lodowatego podłoża do zamrażania (10% DMSO w inaktywowanym termicznie FBS), jak opisano poniżej.
    1. Z szalki o średnicy 100 mm trypsynizować komórki zgodnie z opisem w krokach 1.2.1 i 1.2.2, z wyjątkiem tego, że komórki są ponownie zawieszane w 1 ml lodowatego podłoża do zamrażania.
    2. Dozować 0,5 ml do każdego kriowialu i umieścić w temperaturze -80 °C w pojemniku zapewniającym szybkość chłodzenia około 1 °C/min. Każdą porcję można rozmrozić w naczyniu o średnicy 100 mm.
  5. Test na zanieczyszczenie mykoplazmą: Zebrać 1 ml pożywki z komórek zlewających się hodowanych przez co najmniej 3 dni. Gotować w temperaturze 95 °C przez 20 min. Wirować w temperaturze 16200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Dodać 5 μl supernatantu do 45 μl mieszaniny reakcyjnej PCR (0,15 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl2, 1x bufor reakcyjny, 1 polimeraza U Taq, 0,5 μM startery A i B, patrz tabela 1). Wykonaj PCR, w tym kontrole pozytywne i negatywne, i oddziel produkty PCR na 1% żelu agarozowym wraz z drabinką DNA. Próbki skażone mykoplazmą będą miały pasmo 600 pz.

2. Izolacja CAF od guzów sutka

UWAGA: Ten krok jest zoptymalizowany dla zaawansowanych nowotworów o średnicy 5-10 mm (patrz odniesienie29 ).

  1. Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy. Wyizolować guzy sutka o wielkości co najmniej 125 mm3. Ostrożnie wytnij guz, usuwając otaczającą skórę, tkankę sutkową i widoczne martwicze obszary. Za pomocą pęsety zbierz do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml umieszczonej na lodzie.
  2. Zważ guz za pomocą wagi precyzyjnej, wytnij sześcienny kawałek 0,1-0,3 g za pomocą skalpela, przenieś do nowej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej lodowatym PBS i trzymaj na lodzie. Upewnij się, że tkanka jest zanurzona, aby uniknąć odwodnienia.
  3. Przelać do naczynia o średnicy 60 mm na lodzie. Drobno posiekaj 1 ml PBS za pomocą skalpela, aż uzyskasz kawałki o wielkości około 1-2 mm.
  4. Przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml na 0,1 g guza w cDMEM plus 10 μg/ml kolagenazy. Opłucz naczynie 1 ml tego samego podłoża za pomocą pipety P1000 z odciętą końcówką, aby uniknąć uszkodzenia komórek. Zabezpiecz nakrętkę folią uszczelniającą, aby uniknąć wycieku.
  5. Inkubować poziomo przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C na wytrząsarce orbitalnej. Umieścić sitko do komórek o pojemności 70 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml i przenieść homogenat za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Użyj tylnej części tłoka strzykawki o pojemności 5 ml, aby zmielić i przepchnąć próbkę przez filtr.
  6. Użyj cDMEM (nieprzekraczającej 30 ml końcowej objętości), aby odzyskać wszystko z sitka. Wirować komórki w temperaturze 129 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i odrzucić supernatant.
  7. Dodać 3 ml buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACK) w celu usunięcia czerwonych krwinek (RBC). Zamknij szczelnie probówki i wymieszaj przez odwrócenie. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.
  8. Zatrzymaj lizę RBC, dodając PBS do końcowej objętości 30 ml. Wirować komórki w temperaturze 129 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i odrzucić supernatant.
  9. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml cDMEM i policzyć żywe komórki, jak w kroku 1.3, używając 10 μl błękitu metylenowego: żywe komórki redukują barwnik do bezbarwnego produktu i stają się niebarwione, podczas gdy martwe komórki są barwione na niebiesko.
  10. Wysiewać 5 x 105 komórek/szalkę 60 mm w 5 ml cDMEM, inkubować 20 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 , zebrać nieprzylegające komórki i ponownie je pokryć przez noc.
  11. Po 48 godzinach lub 72 godzinach należy przeprowadzić trypsynizację różnicową. Ponieważ fibroblasty odrywają się szybciej niż komórki nabłonkowe i mioepitelialne30, postępuj zgodnie z opisem w kroku 1.2. ale ściśle monitoruj odrywanie komórek pod mikroskopem. Komórki w kształcie fibroblastów staną się okrągłe i odczepią się, podczas gdy komórki nabłonkowe pozostaną przyczepione.
  12. Dodaj cDMEM, aby dezaktywować trypsynę i zebrać oderwane CAF, przenosząc je do nowej 60 mm szalki w 5 ml cDMEM. Przejście pierwotne CAF 1:3 (patrz krok 1.2) dla trzech pasaży, a następnie przygotować zamrożone podwielokrotności wczesnego przejścia, jak opisano w kroku 1.4.

3. Unieśmiertelnienie przez transdukcję wirusa

UWAGA: Niektóre z poniższych kroków należy wykonać w środowisku odpowiednim do obchodzenia się z wektorami retrowirusowymi (np. BSL2+); Sprawdź swoje zasady instytucjonalne.

  1. Przygotowanie rekombinowanego wirusa
    1. Hodować HEK293T komórki i sprawdzić, czy nie ma zanieczyszczenia mykoplazmą (patrz krok 1).
    2. Pokryć naczynie o średnicy 100 mm, pipetując 6 ml roztworu poli-L-lizyny o stężeniu 0,1 mg/ml w ddH2O przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aspirować i pozostawić do wyschnięcia pod pokrywą (około 10 minut).
    3. Zasiew 3 x 106 komórek HEK293T (niskie pasażowanie, ujemny wynik mykoplazmy) w 10 ml cDMEM w naczyniu pokrytym poli-L-lizyną z kroku 3.1.2 (patrz krok 1.3).
    4. Następnego dnia przygotuj dwie probówki zawierające 0,75 ml pożywki zoptymalizowanej pod kątem transfekcji bez antybiotyków. Do jednego z nich dodaj 30 μl odczynnika do transfekcji za pośrednictwem kationów (T1). Do drugiego dodaj 2 μg pCL-Ampho (retrowirusowy wektor pakowania) i 2 μg retrowirusowego wektora cDNA pBABE-neo largeT (T2). Dodaj T2 do T1, delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 10 minut.
    5. Równomiernie rozprowadź pożywkę na komórkach po zastąpieniu jej pożywką zoptymalizowaną pod kątem transfekcji bez antybiotyków + 10% inaktywowanego termicznie FBS. Przenieść płytkę do zakładu hodowli tkankowej o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2+ (BSL-2+). Po 6-12 godzinach zastąp pożywkę cDMEM i inkubuj komórki przez 24-48 godzin.
    6. Przefiltrować pożywkę zawierającą cząstki pseudowirusa przez filtr strzykawkowy 0,45 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni lub -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.
  2. Transdukcja wirusa CAF
    1. Wysiać 7,5 x 105 CAF w każdej z dwóch 60-milimetrowych szalek w 4 ml cDMEM (patrz krok 1.3) i wyhodować je jak w kroku 1.1.
    2. Następnego dnia zastąp pożywkę z jednego naczynia 2 ml pożywki zawierającej pseudowirusa z kroku 3.1.6 (transdukowane CAF), dodaj 2 ml cDMEM i inkubuj przez 24 godziny. Pozostaw drugie danie nietknięte (nietransdukowane CAF).
    3. Następnego dnia powtórzyć krok 3.2.2 na transdukowanych CAF. Po 24 godzinach zastąp podłoże z obu szalek 4 ml cDMEM.
    4. Po kolejnych 24 godzinach rozpocznij selekcję, zastępując pożywkę obu naczyń cDMEM uzupełnionym o 400 μg/ml G418. Pożywkę zawierającą G418 należy wymieniać co 2-3 dni, aż w naczyniu kontrolnym niewydukowanych CAF nie pozostaną żadne żywe komórki.
      UWAGA: Komórki nietransdukowane są wrażliwe na G418 i umrą w ciągu 7-10 dni, co wskazuje, że tylko transdukowane komórki oporne na G418 przetrwają w stanie transdukowanych CAF. Optymalne stężenie antybiotyku należy określić dla każdego typu komórek, wykonując krzywe zabijania (badaj zakres od 50 do 1000 μg/ml stężenia G418 przez 7-10 dni i wybierz dawkę zabijającą wszystkie komórki w ciągu 10 dni).
    5. Przeprowadź wybrane transdukowane komórki 2x w stosunku 1:3 (patrz krok 1.2) przed wyjściem z obiektu BSL. Przygotować kriokonserwowane porcje wczesnych pasaży, jak w kroku 1.4.
    6. Sprawdź, czy komórki nadal się namnażają, nie wykazując fenotypu starczego przez kilka pasaży, a następnie przejdź do charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej (patrz kroki 4 i 6-9).

4. Charakterystyka fenotypowa

UWAGA: Markery CAF, takie jak alfa aktyna mięśni gładkich (α-SMA), kaweolina, białko aktywujące fibroblasty (FAP), N-kadheryna, płytkowy czynnik wzrostu beta (PDGFR-β), S100A4 i wimentyna29 można ocenić za pomocą RT-qPCR i Western Blot.

  1. RT-qPCR: Ekstrahować całkowite RNA jednofazowym roztworem fenolu i izotiocyjanianu guanidyny, jak opisano w pozycjibibliograficznej 15. Odwrotną transkrypcję 2 μg całkowitego RNA w objętości 20 μl, postępując zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi warunków reakcji. Rozcieńczyć cDNA w stosunku 1:20 i użyć 3 μl do przeprowadzenia reakcji RT-qPCR, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela 1 dla starterów).
    UWAGA: Zalecamy przygotowanie RNA z naczynia 12-dołkowego.
  2. Plama zachodnia
    1. Przemyć 2x PBS zgodnie z opisem w kroku 1.2.1, dodać 0,2 ml lodowatego buforu do lizy, odłączyć komórki skrobakiem i zebrać je w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml, jak opisano w29. Pozostaw na 20 minut na lodzie.
    2. Wirować próbki o masie 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant. Określ ilościowo białka za pomocą testu kolorymetrycznego zgodnie z instrukcjami producenta. Do Western blot należy użyć co najmniej 20 μg białka (zob . tabela 2 dla przeciwciał).
      UWAGA: Zalecamy przygotowanie białek z nie mniej niż 6 dołków w naczyniu.
  3. Analiza wydzielanych białek
    1. Zasiać 2 x 106 iCAF (patrz krok 1.3) w naczyniu o średnicy 100 mm w 10 ml cDMEM i wyhodować je zgodnie z opisem w kroku 1.1.
    2. Po 24 godzinach usunąć pożywkę, przemyć 2x 10 ml PBS i inkubować przez 48 godzin z 10 ml sDMEM (patrz krok 1.1) w celu wytworzenia kondycjonowanej pożywki (CM).
    3. Po kolejnych 48 godzinach przefiltrować CM przez filtr strzykawkowy 0,2 μm do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Trzymać mocno zarówno strzykawkę, jak i rurkę i być przygotowanym na pewien opór. CM może być przechowywany w temperaturze -80 °C do 6 miesięcy.
    4. Zagęścić CM około 10x za pomocą koncentratorów białka zgodnie z instrukcjami producenta, aby wytworzyć skoncentrowany CM (conCM). Określić ilościowo konCM, zagotować i wykonać Western Blot (patrz Tabela 2 dla przeciwciał).

5. Analiza knockdownu genu

UWAGA: Aby stabilnie zakłócać ekspresję genów, transdukujemy iCAF cząstkami lentiwirusowymi wykazującymi ekspresję specjalnie zaprojektowanych shRNA. Można je uzyskać, klonując sekwencje docelowe w odpowiednim wektorze lentiwirusowym, takim jak pLKO.1-Puro, zgodnie z protokołami dostępnymi na stronie https://www.addgene.org/protocols/plko/#C. Konkretne sekwencje docelowe można wybrać za pomocą publicznie dostępnych narzędzi do projektowania shRNA (np. GPP-Genetic Perturbation Portal firmy Broad Institute, https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/). Alternatywnie na rynku dostępne są zestawy gotowych wektorów kierowania (https://en.vectorbuilder.com/products-services/service/shrna-knockdown-solutions.html, https://www.sigmaaldrich.com/IT/it/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/mission-shrna-getting-started, https://www.origene.com/products/rnai/shrna-lentiviral-particles). Zalecamy zaprojektowanie 4-5 różnych shRNA dla każdego genu i wybranie najlepszych 2 do eksperymentów. Generuj również wektory niedocelowe jako kontrole negatywne. Niektóre z poniższych kroków należy podjąć w środowisku odpowiednim do obchodzenia się z wirusami pochodnymi wirusa HIV (np. BSL2+). Sprawdź swoje zasady instytucjonalne.

  1. Wytwarzanie cząstek lentiwirusowych
    1. Zasiew: 3 x 106 HEK293T komórek, jak w krokach 3.1.1-3.1.3. Następnego dnia należy przygotować kompleksy odczynnika do transfekcji DNA za pośrednictwem kationów lipidów, jak w kroku 3.1.4, używając odpowiednio 9 μg i 3 μg wektorów pakujących pCMV-R8.74 i pCMV-VSVG oraz 7 μg konstruktu pLKO.1 zawierającego shRNA w 0,75 ml pożywki zoptymalizowanej pod kątem transfekcji bez antybiotyków i postępować zgodnie z opisem w krokach 3.1.5 i 3.1.6.
  2. Transdukcja CAFs
    1. Zainfekuj komórki zgodnie z opisem w krokach 3.2.1, 3.2.2 i 3.2.4. Po 24 godzinach usunąć pożywkę infekcyjną i rozpocząć selekcję od 2 μg/ml puromycyny w cDMEM. Patrz uwaga w kroku 3.2.5 w celu określenia optymalnego stężenia.
    2. Wymień puromycynę/cDMEM po 48 godzinach. Selekcja jest zwykle zakończona w ciągu 3 dni. Rozwiń i zablokuj komórki, jak w kroku 3.2.6. Oceń skuteczność knockdown zarówno za pomocą RT-PCR, jak i Western blot, jak opisano w krokach 4.1. oraz 4.2.

6. Superaktywacja iCAF z CM z komórek nowotworowych

UWAGA: Poniższe kroki ilustrują metody charakterystyki in vitro aktywności pronowotworowej iCAF. Aktywność pronowotworową CAF można zwiększyć poprzez inkubację ich z CM z mysich komórek nowotworowych BC (superaktywacja, s.a.), jak opisano poniżej.

  1. Policz mysie komórki BC 4T1 zgodnie z opisem w kroku 1.3 i zasiej 2 x 106 komórek w naczyniu o średnicy 100 mm w 10 ml cRPMI (patrz krok 1.1).
  2. Po 24 godzinach usunąć pożywkę, przemyć 2x 10 ml PBS i inkubować przez 48 godzin z 10 ml sRPMI (patrz krok 1.1) w celu wytworzenia CM.
  3. Następnego dnia wysiewaj 2 x 106 iCAF na szalce o średnicy 100 mm w 10 ml cDMEM (patrz krok 1.3) i hoduj je zgodnie z opisem w kroku 1.1. Przefiltrować CM przez filtr strzykawkowy 0,2 μm do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, jak w kroku 4.3.3.
  4. Superaktywacja (s.a.): usunąć pożywkę z naczynia iCAF, przemyć 2x 10 ml PBS i dodać przefiltrowany 4T1 CM (8-10 ml). Inkubować przez 48 godzin w celu uzyskania s.a. iCAF.

7. Proliferacja komórek nowotworowych

  1. Wstępnie traktuj komórki 4T1 przez 48 godzin za pomocą iCAFs CM, przygotowanych jak w krokach 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3.
  2. Trypsynizuj je i policz, a następnie wysiewaj 4 x 103 komórek/dołek 96-dołkowej płytki w 100 μl cRPMI, jak opisano w kroku 1.3 i hodowli, jak w kroku 1.1. Trzyczęściowy egzemplarz techniczny.
    1. Przygotuj jedną 96-dołkową płytkę dziennie podczas kursu czasowego. Sugerowana tutaj liczba komórek jest zoptymalizowana pod kątem protokołu 4-dniowego; Skaluj go w dół, aby uzyskać dłuższy czas.
  3. Po 4 godzinach lub zaraz po przyłączeniu komórek usunąć pożywkę, przemyć PBS, delikatnie dodając 100 μl, uważając, aby nie oderwać komórek, opierając końcówkę o krawędź studzienki za pomocą pipety wielokanałowej i używając sterylnego zbiornika. Usuń PBS, a następnie podobnie dodaj 100 μl sDMEM (kontrola) lub iCAF CM, oba uzupełnione 2% inaktywowanym termicznie FBS (patrz kroki 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3).
  4. Po 4 godzinach należy zatrzymać tabliczkę dnia 0 zgodnie z opisem z punktu 7.5. W przypadku pozostałych punktów czasowych wymieniaj pożywkę co drugi dzień aż do końca eksperymentu.
  5. Aby ocenić gęstość komórek, wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora i przemyć studzienki 2x 100 μl PBS, jak opisano w kroku 7.3.
  6. Pod wyciągiem wyciągowym dodaj 100 μl 4% paraformaldehydu (PFA) do każdej studzienki i utrwal komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: PFA może powodować poważne uszkodzenie oczu i podrażnienie skóry; Jest szkodliwy w przypadku połknięcia i wdychania i podejrzewa się, że powoduje wady genetyczne i raka. Trzymaj się w dygestorium, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).
  7. Przemyć 3x 100 μl PBS jak w kroku 7.3 i pozostawić do wyschnięcia pod wyciągiem (około 10 min).
  8. Inkubować z 50 μl 0,1% fioletu krystalicznego w 20% metanolu przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Fiolet krystaliczny może powodować poważne uszkodzenie oczu i jest zgłaszany jako zagrożenie kategorii 4 dla ostrej toksyczności pokarmowej i zagrożenie kategorii 2 jako czynnik rakotwórczy. Trzymaj się go w dygestorium, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej.
  9. Przemyć 3x 100 μL ddH2O, opróżnić studzienki i postukać płytką o podkładkę chłonną lub ręcznik papierowy, aby całkowicie usunąć płyn.
  10. Fiolet krystaliczny rozpuścić w 100 μl 10% kwasu octowego przez 15 minut w temperaturze pokojowej i zmierzyć gęstość optyczną (OD) przy długości fali 600 nm w czytniku mikropłytek, używając 100 μl 10% kwasu octowego jako ślepej próby. Znormalizuj średnicę zewnętrzną dla tego dnia do 0 dla każdego warunku.

8. Migracja i inwazja

  1. Odpipetować 700 μl DMEM uzupełnionego 1% inaktywowanym termicznie FBS, 1% Pen/Strepto, do dołków 24-dołkowej płytki. Umieścić w każdym dołku wkładkę transwellową o porach 8 μm, pokrytą (inwazja) lub nie (migracja) biologicznie aktywną matrycą. Pozostawić płytkę w inkubatorze do zrównoważenia w temperaturze 37 °C podczas zbierania i liczenia komórek 4T1, jak w kroku 1.3.
  2. Odłącz komórki 4T1 wstępnie traktowane przez 48 godzin iCAFs CM od naczynia o średnicy 100 mm, jak w krokach 4.3.1, 4.3.2 i 4.3.3, używając 1 ml 5 mM EDTA zamiast trypsyny-EDTA.
  3. Dodać 5 ml cDMEM, zebrać komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i osadzać przez odwirowanie, jak w kroku 1.2. Ponownie zawiesić komórki w sDMEM, policzyć jak w kroku 1.3 i rozcieńczyć do 1 x 105 komórek/100 μl.
  4. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do górnej komory transwell. Jako kontrolę posiewu, wysiewaj 100 μl komórek na 24-dołkowej płytce, w 500 μl cDMEM. Inkubować przez 16 godzin (migracja) lub 24 godziny (inwazja) i przerwać eksperyment zgodnie z poniższym opisem.
    UWAGA: Czasy inkubacji muszą być określone empirycznie w przypadku użycia różnych komórek.
  5. Oznacz wkładki na ich górnej stronie cienkim markerem i zanurz je w stożkowej probówce o pojemności 50 ml wypełnionej PBS do mycia pęsetą. Ostrożnie wyczyść wewnętrzną część transwell bawełnianym wacikiem.
  6. Pod wyciągiem inkubować próbki w 700 μl 4% PFA przez 10 minut w temperaturze pokojowej (patrz krok 7.6).
  7. Umyć 3x 700 μL PBS i pozostawić do wyschnięcia pod kapturem (około 10 min). Inkubować inkubacje z 700 μl 0,1% fioletu krystalicznego w 20% metanolu przez 10 minut w temperaturze pokojowej (patrz krok 6.10).
  8. Umyj wkłady 3x zanurzając je w stożkowej tubie o pojemności 50 ml wypełnionej ddH2O za pomocą pęsety. Ostrożnie wyczyść wewnętrzną część transwell bawełnianym wacikiem. Przechowuj próbki w RT i rób zdjęcia do 3 dni później.
  9. Za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym zrób jedno zdjęcie obiektywem 10x, obrazując większość powierzchni studzienki, a następnie uzyskaj zdjęcia z 5 niezależnych obszarów za pomocą obiektywu 20x.
  10. Rozpuścić fiolet krystaliczny w 10% kwasie octowym w następujący sposób: w przypadku studzienek dodać 100 μl kwasu octowego i mieszać na wytrząsarce orbitalnej przez 10 minut w temperaturze pokojowej; W przypadku transwelli połóż je dolną powierzchnią do góry, na ławce, nanieś 50 μl kwasu octowego na powierzchnię i mieszaj pipetując, aż do całkowitego rozpuszczenia fioletu krystalicznego.
  11. Odczytać absorbancję przy 600 nm na płytce 96-dołkowej przy użyciu 50 μl rozpuszczonego materiału z powyższego kroku. Użyj 10% kwasu octowego jako ślepego półfabrykatu.
  12. Znormalizuj gęstość optyczną (OD) kontroli posiewu z kroku 8.5 i wyraź migrację lub inwazję w odniesieniu do warunków kontrolnych.

9. Pierwotny wzrost guza i tworzenie przerzutów do płuc

UWAGA: Poniższy krok ilustruje metody charakterystyki in vivo aktywności pronowotworowej CAF. Ten etap jest zoptymalizowany pod kątem oceny cech pronowotworowych CAF in vivo poprzez jednoczesną iniekcję w syngenicznych modelach myszy. Ponieważ zarówno CAF, jak i komórki 4T1 pochodzą z tła myszy BALB/c, używane są myszy BALB/c.

  1. Na 2 dni przed wstrzyknięciem 6-tygodniowe samice myszy BALB/c z metalowymi kolczykami identyfikacyjnymi golą 4. obszar gruczołusutkowego za pomocą golarki.
  2. Zebrać i zliczyć komórki 4T1 i s.a. iCAF, przygotowane zgodnie z opisem w kroku 6. W stożkowej probówce o pojemności 15 ml wymieszaj 1 x 105 komórek 4T1 i 3 x 105 s.a. iCAFs/mysz, biorąc pod uwagę nadmiar co najmniej 20%. Funkcji 4T1 należy używać tylko jako kontrolki.
  3. Wirować przy 290 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić w objętości PBS obliczonej w celu uzyskania powyższej liczby komórek/myszy w 50 μl, przenieść do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać na lodzie.
    UWAGA: Na przykład, aby wstrzyknąć 10 myszy, wymieszaj 1,2 x 106 komórek 4T1 z 3,6 x 106 s.a. iCAF, ogniwami peletowymi i ponownie zawieś w 600 μl PBS. Wstrzyknąć 50 μl zawiesiny komórkowej na mysz.
  4. Przygotuj obszar roboczy, czyszcząc i dezynfekując powierzchnię okapu z przepływem laminarnym. Przykryj piankową tablicę chirurgiczną arkuszem ochraniacza ławki.
  5. Myszy należy znieczulać pojedynczo, zgodnie z procedurami instytucjonalnymi (stosujemy dootrzewnowe wstrzyknięcie zasady tiletaminy/zasady zolazepamu + ksylazyna 70 mg/kg + 5 mg/kg). Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Za pomocą bawełnianej końcówki zdezynfekuj skórę roztworem jodu powidonu.
  6. Użyj testu szczypania palców u nóg, aby upewnić się, że myszy są pod odpowiednią narkozą. Za pomocą igły podskórnej wstrzyknąć 50 μl zawiesiny komórkowej do 4. poduszeczki tłuszczowejsutka . Użyć brodawki sutkowej jako punktu odniesienia i wstrzyknąć około 3 mm w kierunku nogi ipsilateralnej.
  7. Sprawdzaj myszy przez kilka godzin po wstrzyknięciu i w kolejnych dniach. Guzy stają się wyczuwalne palpacyjnie po 4 dniach.
  8. Mierz wielkość guza co 48 godzin za pomocą suwmiarki, określając maksymalną i minimalną średnicę. Oblicz objętość guza za pomocą wzoru: (długość x szerokość2)/2.
  9. Po 10 dniach od wstrzyknięcia należy chirurgicznie usunąć guzy pierwotne, jak opisano poniżej.
    1. Przygotować obszar operacyjny jak w kroku 9.5. Sterylizuj narzędzia w autoklawie i umieszczaj je na sterylnej powierzchni podczas pracy. Sterylizuj narzędzia między zwierzętami za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami.
    2. Znieczulić myszy jak w krokach 9.6 i 9.7. Za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcie o średnicy 5-8 mm w pobliżu guza i delikatnie odciągnij skórę, tworząc małą kieszeń, aby uzyskać dostęp do guza. Kauteryzuj wszelkie widoczne naczynia krwionośne za pomocą niskotemperaturowego długopisu kauteryzującego, aby uniknąć krwotoków podczas sekcji.
    3. Użyj skalpela, aby usunąć guz, starając się nie usuwać żadnej skóry. Umieść płaty skóry z powrotem w ich pierwotnym położeniu, zszyj je razem za pomocą nici chirurgicznej 5-0 z igłą 17 mm 1/2c i dodaj klej chirurgiczny, aby całkowicie uszczelnić ranę.
    4. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać leżący mostek. Zwierzęta, które przeszły operację, nie są zwracane do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieją.
  10. Ściśle monitoruj zwierzęta po operacji, a w kolejnych dniach, w razie potrzeby podaj leczenie przeciwbólowe, zgodnie z protokołami instytucjonalnymi. Stosujemy podskórne iniekcje karprofenu (3-5 mg/kg).
  11. Zważ guz za pomocą wagi precyzyjnej, jak w kroku 2.2. Przeciąć guz na pół za pomocą skalpela. Umieść jedną połówkę w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml, zamroź błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do analiz molekularnych. Drugą połowę umieścić w 5 ml 4% PFA w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na 24 godziny w temperaturze 4 °C w celu analizy histologicznej.
  12. W 21 dniu po wstrzyknięciu należy pośmiać myszy przez ekspozycję na CO2 i zebrać płuca po infuzji dotchawiczej z 4% PFA, jak opisano poniżej. Praca pod wyciągiem.
    1. Otwórz klatkę piersiową za pomocą nożyczek chirurgicznych. Usuń skórę z obszaru podżuchwowego i gruczołów ślinowych, aby wyraźnie odsłonić tchawicę.
    2. Przygotować strzykawkę igłową 22G zawierającą 4% roztwór PFA. Włóż igłę do tchawicy myszy, kierując ją w stronę płuc, jednocześnie zaciskając tchawicę w kierunku głowy. Roztwór należy wstrzykiwać aż do obrzęku płuc (około 2 ml).
    3. Wypreparuj płuca i umieść je w 15 ml probówce zawierającej 4% roztwór PFA. Delikatnie odwróć probówkę kilka razy i pozwól jej zastygnąć przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
  13. Wykonać półseryjne odcinki płuc i wybarwić hematoksyliną i eozyną (H&E), po jednym plasterku co 50/100 μm, aż do wyczerpania próbki, jak opisano w piśmiennictwie31.
  14. Punktacja przerzutów po sterowanej programowo analizie mikrofotografii skrawków barwionych H&E.

10. Sygnatury ekspresji genów

  1. Zdefiniuj sygnaturę genu zgodnie z poniższym opisem.
    1. W zależności od warunków eksperymentalnych i konkretnego badanego zagadnienia biologicznego, można uzyskać sygnaturę genu na kilka sposobów. Najczęściej ocenia się różnicę ekspresji między dwoma stanami (np. CAF w porównaniu z normalnymi odpowiednikami lub leczonymi na kilka sposobów (np. superaktywowanymi lub wyciszonymi) a nieleczonymi.
    2. Alternatywnie, zidentyfikuj geny o najbardziej zróżnicowanej ekspresji lub informatywności w analizowanych próbkach (np. geny o wysokiej wariancji lub z wysokim ładunkiem pierwszych składników analizy głównych składników). Tutaj jako przykład użyjemy podpisu regulowanego przez STAT3. Sygnatura ta została zdefiniowana jako geny obniżone po wyciszeniu STAT3 w BC CAFs29, jak opisano poniżej. Dokładny opis sekwencjonowania RNA znajduje się w piśmiennictwie 32,33.
  2. Z każdej próbki ekstrahować całkowite RNA w potrójnym technicznym trilikacie, jak w kroku 4.1.1, i ocenić jakość RNA w celu sprawdzenia integralności RNA (RIN ≥ 9).
  3. Przygotuj biblioteki z 2 μg wybranego poli(A) RNA i zsekwencjonuj je. Skorzystaliśmy z platformy NextSeq 500.
  4. Mapa jest odczytywana do zestawu referencyjnego Mus musculus mm9 przy użyciu TopHat v2.0. Rozdział 1034.
  5. Obliczanie liczby genów przy użyciu narzędzia htseq-count z pakietu HTSeq (http://www.huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html).
  6. Wykonaj analizę wyrażeń różnicowych przy użyciu języka R i pakietu DESeq2 (http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/DESeq2.html). Przefiltruj geny regulowane w dół za pomocą FDR < 0,05, aby zdefiniować sygnaturę STAT3.

11. Oszacowanie ekspresji sygnatury w guzach pierwotnych

UWAGA: Poniższe kroki opisują procedurę obliczeniowego szacowania ekspresji regulowanej przez STAT3 sygnatury29 w publicznie dostępnych danych transkryptomicznych guzów pierwotnych BC, testując jej związek z szacowaną proporcją zrębu w tym samym zestawie próbek.

  1. Zainstaluj języki R (https://cran.r-project.org/) i RStudio (https://posit.co/products/open-source/rstudio/). Uruchom go i zainstaluj wymagane biblioteki: GSVA35, TCGAbiolinks36.
  2. Pobierz pierwotne dane dotyczące ekspresji genów nowotworowych, takie jak dane TCGA z https://portal.gdc.cancer.gov/, dane METABRIC z http://synapse.org/ (syn1757063) lub inne dane transkryptomiczne z Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) jako wstępnie znormalizowane matryce ekspresji. Dane muszą być sformatowane jako macierz liczbowa z wierszami jako genami i kolumnami jako próbkami, a następnie znormalizowane w zależności od platformy i skalowane logarytmicznie przy użyciu przesunięcia 1.
    1. Pobierz listę ortologów genów mysz-człowiek z Biomart pod adresem https://www.ensembl.org/biomart/martview/, wybierz bazę danych: ensembl genes, wybierz zestaw danych genów ludzkich i kliknij na wybór atrybutów w lewej zakładce.
    2. Ze wstępnie wybranych funkcji otwórz zakładkę ZEWNĘTRZNE i oznacz symbol HGNC, wybierz Homologi w polu u góry strony i oflaguj Ortologi myszy / Nazwa genu myszy.
    3. Kliknij przycisk Wyniki w lewym górnym rogu, wybierz format CSV i kliknij przycisk GO , aby pobrać plik.
  3. Załaduj sygnaturę ekspresji genów (zestaw genów) w R. W tym przypadku używamy listy genów obniżonych po wyciszeniu STAT3 w mysich CAF.
  4. Załaduj listę ortologów genów mysz-człowiek w R i zmapuj sygnaturę STAT3 na odpowiednie ortologi ludzkie za pomocą tabeli Biomart.
  5. Załaduj dane dotyczące ekspresji genu pierwotnego guza w języku R i wywołaj funkcję GSVA z parametrami jako obiektem ssgseaParam, w tym danymi dotyczącymi guza pierwotnego i listą zawierającą sygnaturę STAT3.

12. Zbadaj związek między ekspresją sygnatury genu a cechami klinicznymi

  1. Zidentyfikuj interesujące Cię zmienne. Procent zrębu reprezentuje proporcję komórek w sekwencjonowanej próbce guza należących do zrębu guza. Należy wykorzystać następujące cechy kliniczne często kojarzone z danymi omicznymi: wielkość guza, stopień zaawansowania, wiek pacjenta w momencie rozpoznania, stan węzłów chłonnych, stan przerzutów itp. Wstępnie obliczone szacunki procentowe zrębu są dostępne dla TCGA.
    UWAGA: W szczególności dostępne szacunki zrębu to: EDec Immune/Stromal = Epigenomic Deconvolution procentu zrębu/immunologicznego37; Wynik immunologiczny = ssGSEA na podstawie profili ekspresji genów 141 genów immunologicznych38; LUMP = Unmetylacja leukocytów dla czystości, która uzyskuje średnio 44 niemetylowane miejsca CpG swoiste immunologicznie39; Wynik zrębu = ssGSEA na podstawie profili ekspresji genów 141 genów zrębu38; IHC = oszacowane na podstawie analizy obrazu preparatów barwionych hematoksyliną i eozyną, wytworzonych przez Nationwide Children's Hospital Biospecimen Core Resource40; BEZWZGLĘDNY = na podstawie somatycznych danych o liczbie kopii41.
  2. Pobierz dane EDEc z http://genboree.org/theCommons/documents/569, wyniki zrębu i odporności z https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/disease.html (RNASeqV2) oraz dane dotyczące czystości guza (LUMP, IHC, ABSOLUTE) z TCGAbiolinks. W przypadku innych zestawów danych oblicz procent zrębu korzystającego z pakietu GSVA, obliczając ssGSEA dla zrębu i sygnatur immunologicznych uzyskanych od Yoshihara i wsp.38.
  3. Oblicz korelację między wektorem liczbowym szacowanej proporcji zrębu a wektorem liczbowym wyrażenia sygnatury STAT3 w próbkach guza pierwotnego. Można to osiągnąć za pomocą funkcji cor.test w R.
  4. Pobierz dane kliniczne powiązane ze zbiorem danych transkryptomicznych guzów pierwotnych w postaci tabeli z próbkami w wierszach i cechami klinicznymi w kolumnach.
  5. Załaduj dane kliniczne do R i sprawdź, czy próbki w macierzy transkryptomicznej i w tabeli metadanych są w tej samej kolejności co funkcja dopasowania.
  6. W przypadku zmiennych numerycznych (np. wielkości guza) należy obliczyć korelację między wektorem liczbowym wyrażenia sygnatury STAT3 w próbkach guza pierwotnego a wektorem wartości cech klinicznych za pomocą funkcji cor.test.
  7. W przypadku zmiennych jakościowych (np. Status przerzutów) przetestuj różnicę w wyrażeniu sygnatury STAT3 między dwiema grupami próbek (np. guzy przerzutowe i nieprzerzutowe) za pomocą nieparametrycznego testu sumy rang Wilcoxona (przy założeniu, że dwie grupy próbek są niezależne). Można to osiągnąć za pomocą funkcji wilcox.test w R.

13. Badanie regulacji sygnatury w zrębie guza

UWAGA: Ekspresja sygnatury zrębu w guzach pierwotnych analizowanych za pomocą masowego sekwencjonowania RNA ma tę zaletę, że opiera się na dużych kohortach pacjentów ze szczegółowymi adnotacjami klinicznymi. Z drugiej strony, tylko oddzielenie zrębu i nabłonka pozwala na zdefiniowanie zmian ekspresji genów w jednym z dwóch przedziałów komórkowych w guzie w porównaniu z normalną tkanką42. MetaLCM to aplikacja ShinyApp, która ułatwia analizę zbiorów danych transkryptomicznych mikrowypreparowanych laserowo guzów piersi. Za pomocą tego narzędzia użytkownik może wyszukiwać solidne geny o zróżnicowanej ekspresji między dwoma stanami w transkryptomicznych zestawach danych mikrowypreparowanych guzów piersi z laserowym wychwytywaniem i testować regulację wcześniej zdefiniowanych sygnatur genów w zrębie guza. Poniższe kroki opisują, jak korzystać z MetaLCM.

  1. Uzyskaj dostęp do aplikacji pod linkiem https://aurorasavino.shinyapps.io/metalcm/. Aby rozpocząć analizę, należy wybrać cechy porównywanych warunków.
  2. Wybierz kierunek porównania. Wybierając geny regulowane w górę, pokazuje się geny o wyższej ekspresji w stanie 1.
  3. Wybierz próg wartości p dla wyrażenia różnicowego i naciśnij przycisk Uruchom , aby uruchomić analizę, a następnie za każdym razem, gdy ustawienia są zmieniane.
  4. Aby ograniczyć analizę do wstępnie zdefiniowanej listy genów, wpisz symbole genów oddzielone przecinkami lub zaimportuj plik CSV zawierający symbole genów w jednej kolumnie.
  5. Naciśnij przycisk Prześlij listę genów , aby zaimportować symbole genów. Naciśnij przycisk Reset , aby przywrócić analizę przy użyciu wszystkich genów. Zapisz listę genów o zróżnicowanej ekspresji: po dostarczeniu listy genów przeprowadzana jest wielokrotna korekta testowa tylko dla tych genów. Tabela zawiera średnią logFC, zwiniętą wartość p oraz indywidualne wartości logFC i p dla wyrażenia różnicowego w każdym dostępnym zestawie danych.
  6. Narysuj mapę cieplną ze zmianami fałdowania genów o zróżnicowanej ekspresji. Mapa cieplna pokazuje tylko geny o zróżnicowanej ekspresji z całkowicie spójnym znakiem zróżnicowanej ekspresji w zestawach danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

In vitro ocena aktywności CAF-ów
Wkład fibroblastów towarzyszących nowotworom (CAF) pochodzących z guzów piersi w agresywne cechy raka piersi (BC) badano z wykorzystaniem unieśmiertelnionych CAF (iCAF) wygenerowanych zgodnie z krokiem 3. iCAF poddano superaktywacji zgodnie z opisem w kroku 6, a następnie inkubowano w sDMEM w warunkach głodzenia w celu zebrania ich pożywki warunkowej (CM), której użyto do traktowania komórek 4T1 przez 48 h (patrz krok 7.1). Następnie po tym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu przedstawiamy zoptymalizowane protokoły unieśmiertelnienia mysich CAF i scharakteryzowania ich działania pronowotworowego zarówno in vitro , jak i in vivo. Zamiast selektywnie izolować określone podtypy CAF na podstawie ekspresji markerów, zdecydowaliśmy się zachować całą populację komórek, aby zachować heterogeniczność. Komórki zostały funkcjonalnie scharakteryzowane jako całość, a ich profile ekspresji genów zostały przeanalizowane w celu uchwycenia ich różnorodności. Unieśmiertelnienie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez Włoskie Stowarzyszenie Badań nad Rakiem (AIRC, IG16930 i IG24851 do V.P.); włoskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych (MIUR PRIN 2017 i 2022 do V.P.); Fundacja Truus i Gerrita van Riemsdijk, Liechtenstein, darowizna na rzecz V.P.; Region Piemontu (Deflect). A.S. był wspierany przez Włoską Fundację Badań nad Rakiem (FIRC) w ramach stypendium podoktorskiego, a Los Angeles było wspierane przez Fondazione Umberto Veronesi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1Kb plus drabinka DNAThermoFisher Naukowy10787018
Płytka 24-dołkowaSarstedt powiedział:833922
Płytka 96-dołkowaSarstedt powiedział:833924
Kwas octowySigma Aldirch695092
WiekI-HFLaboratoria biologiczne w Nowej AngliiCzynnik R3552Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Betadine (Betadyna)Meda Pharma23907076
Bü rker Komora zliczająca Firma VWR40443703
Kauteryzacja Low Temp FineTip DispKeelerAX10339KL
WirówkaEppendorf powiedział:Zobacz materiał 5810R
Rurka stożkowa 15 mlSarstedt powiedział:62554502
Probówka stożkowa 50 mlSarstedt powiedział:62547254
Mikroprobówki Cryopure 2 mlSarstedt powiedział:72380992
Kryształowy fioletSigma AldirchZobacz materiał C0775 powiedział:Przechowywać w RT, używać w dygestorium 
Płytka hodowlana o średnicy 100 mm Sarstedt powiedział:833902
Płytka hodowlana o średnicy 60 mm Sarstedt powiedział:833920
ddH20 powiedział:Domowej robotyPrzechowywać w RT, używać w okapie biologicznym
Suwmiarka cyfrowaPreciva02-301-2
Mikroskop cyfrowyKsięga LeicaDM6B (Biblioteka DM6B)
DimetylosulfotlenekSigma AldirchZobacz materiał D8418Zastosowanie w okapie biologicznym
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni (DMEM)Gibco (firma Gibco)11965092Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, użyj w okapie biologicznym
EcoRI-HFLaboratoria biologiczne w Nowej AngliiCzynnik R3101Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma AldirchE6758 powiedział:Przechowywać w RT, używać w okapie biologicznym
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco (firma Gibco)16000044Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, użyj w okapie biologicznym
Końcówki z filtrem 10 i mikro; LSarstedt powiedział:703010255
Końcówki z filtrem 100 µ LSarstedt powiedział:703030255
Końcówki z filtrem 1000 µ LSarstedt powiedział:703060255
Końcówki z filtrem 20 i mikro; LSarstedt powiedział:703030265
Końcówki z filtrem 200 µ LSarstedt powiedział:703031255
Filtropur S Plus 0,20 &mikro; m Sarstedt powiedział:831826102
Filtropur S Plus 0,45 &mikro; m Sarstedt powiedział:831826
Cienkie nożyczki2Biol1406009
Kleszcz2Biol1102412
Geneticin (Genetyka)Gibco (firma Gibco)10131035Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, użyj w okapie biologicznym
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000ThermoFisher Naukowy11668019Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, użyj w okapie biologicznym
Komory inwazyjne Matrigel z 8 μ m Membrana PET Corning354480
Czytnik mikropłytek (absorbancja 600 nm)Preparat PromegaZobacz materiał GM3500
Mikroprobówki 1,5 mL Sarstedt powiedział:7269001
OptymamGibco (firma Gibco)31985047Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, użyj w okapie biologicznym
Paraformaldehyd (PFA)Sigma Aldirch158127Przechowywać w RT, używać w dygestoriach
pBABE-neo largeTcDNA Addgene powiedział:1780Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, użyj w okapie biologicznym
pCL-AmpułkaNovus Biological 18746853Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, użyj w okapie biologicznym
pCMV-R8.74Addgene powiedział:22036Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, użyj w okapie biologicznym
pCMV-VSVG Addgene powiedział:8454Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, użyj w okapie biologicznym
Penicylina-Streptomycyna (Pen Strepto, 10 000 μ g/ml) Gibco (firma Gibco)15140122Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, użyj w okapie biologicznym
Mikroskop z kontrastem fazowym Olimpia Zobacz materiał BX42
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami  (PBS)Domowej robotyPrzechowywać w RT, używać w okapie biologicznym
pLKO.1-Puro Addgene powiedział:10878Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, użyj w okapie biologicznym
Roztwór poli-L-lizynySigma AldirchZobacz materiał P8920 powiedział:Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, użyj w okapie biologicznym
Dichlorowodorek puromycyny z  Streptomyces albonigerSigma AldirchZobacz materiał P8833 powiedział:
Bufor rCutSmart Laboratoria biologiczne w Nowej AngliiZobacz materiał B6004Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Golarka dla gryzoniAesculap powiedział:Zobacz materiał GT416
Instytut Pamięci Roswell Park (RPMI)Gibco (firma Gibco)61870010Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, użyj w okapie biologicznym
Okrągłe waciki do spragnieniaSigma AldirchZ744127
SkalpelGima27041
Secura Semi Micro BalanceSartorius Sartorius (Wyspa SarSECURA125-1S
Pipeta serologiczna 10 mL Sarstedt powiedział:861254001
Pipeta serologiczna 2 mL Sarstedt powiedział:861252001
Pipeta serologiczna 25 mL Sarstedt powiedział:861256001
Pipeta serologiczna 5 mL Sarstedt powiedział:861253001
Szwy 5-0Etyka1866G
Strzykawka 10 mlPentaferte00202250E14
Strzykawka 5 mlPentaferteNumer katalogowy: 00202250E12
Strzykawka Omnican Insulina 1 mlBraun9151125S
Anatomiczny3M Vetbond1469SB powiedział:
Wkładki Transwell 8 i mikro; m pore Sokół353097
Wkłady Transwell Matrigel 8 i mikro; m pore Corning354480
Trypsyna-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowejGibco (firma Gibco)15400054
Koncentrator odśrodkowy Vivaspin 20 MWCO 10 000 Da Sigma AldirchZ614602

Bibliografia

  1. Bhattacharya, S., et al. Group behavior and emergence of cancer drug resistance. Trends Cancer. 7 (4), 323-334 (2021).
  2. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  3. Marusyk, A., et al. Spatial proximity to fibroblasts impacts molecular features and therapeutic sensitivity of breast cancer cells influencing clinical outcomes. Cancer Res. 76 (22), 6495-6506 (2016).
  4. Su, S., et al. Cd10(+)gpr77(+) cancer-associated fibroblasts promote cancer formation and chemoresistance by sustaining cancer stemness. Cell. 172 (4), 841-856.e16 (2018).
  5. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  6. Watson, S. S., et al. Microenvironment-mediated mechanisms of resistance to HER2 inhibitors differ between HER2+ breast cancer subtypes. Cell Syst. 6 (3), 329-342.e6 (2018).
  7. Xie, J., et al. Cancer-associated fibroblast-derived extracellular vesicles: Regulators and therapeutic targets in the tumor microenvironment. Cancer Drug Resist. 8, 2(2025).
  8. Du, R., et al. PDPN-positive CAFs contribute to HER2-positive breast cancer resistance to trastuzumab by inhibiting antibody-dependent NK cell-mediated cytotoxicity. Drug Resist Updat. 68, 100947(2023).
  9. Zhang, H., et al. Define cancer-associated fibroblasts (CAFs) in the tumor microenvironment: New opportunities in cancer immunotherapy and advances in clinical trials. Mol Cancer. 22 (1), 159(2023).
  10. Zheng, S., et al. Dissecting the role of cancer-associated fibroblast-derived biglycan as a potential therapeutic target in immunotherapy resistance: A tumor bulk and single-cell transcriptomic study. Clin Transl Med. 13 (2), e1189(2023).
  11. Bainer, R., et al. Gene expression in local stroma reflects breast tumor states and predicts patient outcome. Sci Rep. 6, 39240(2016).
  12. Farmer, P., et al. A stroma-related gene signature predicts resistance to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer. Nat Med. 15 (1), 68-74 (2009).
  13. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Res. 17 (1), 23(2015).
  14. Xie, J., et al. Turning up a new pattern: Identification of cancer-associated fibroblast-related clusters in TNBC. Front Immunol. 13, 1022147(2022).
  15. Chen, Y., Mcandrews, K. M., Kalluri, R. Clinical and therapeutic relevance of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Clin Oncol. 18 (12), 792-804 (2021).
  16. Bartoschek, M., et al. Spatially and functionally distinct subclasses of breast cancer-associated fibroblasts revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Commun. 9 (1), 5150(2018).
  17. Liu, S. Q., et al. Single-cell and spatially resolved analysis uncovers cell heterogeneity of breast cancer. J Hematol Oncol. 15 (1), 19(2022).
  18. Massa, D., Tosi, A., Rosato, A., Guarneri, V., Dieci, M. V. Multiplexed in situ spatial protein profiling in the pursuit of precision immuno-oncology for patients with breast cancer. Cancers. 14 (19), 4885(2022).
  19. Tietscher, S., et al. A comprehensive single-cell map of T cell exhaustion-associated immune environments in human breast cancer. Nat Commun. 14 (1), 98(2023).
  20. Tzoras, E., et al. Dissecting tumor-immune microenvironment in breast cancer at a spatial and multiplex resolution. Cancers. 14 (8), 1999(2022).
  21. Wu, S. Z., et al. A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers. Nat Genet. 53 (9), 1334-1347 (2021).
  22. Ning, L., et al. Scrna-seq characterizing the heterogeneity of fibroblasts in breast cancer reveals a novel subtype sfrp4(+) caf that inhibits migration and predicts prognosis. Front Oncol. 14, 1348299(2024).
  23. Salemme, V., et al. The role of tumor microenvironment in drug resistance: Emerging technologies to unravel breast cancer heterogeneity. Front Oncol. 13, 1170264(2023).
  24. Attalla, S., Taifour, T., Bui, T., Muller, W. Insights from transgenic mouse models of pymt-induced breast cancer: Recapitulating human breast cancer progression in vivo. Oncogene. 40 (3), 475-491 (2021).
  25. Ferreira, T., Azevedo, T., Silva, J., Faustino-Rocha, A. I., Oliveira, P. A. Current views on in vivo models for breast cancer research and related drug development. Expert Opin Drug Discov. 19 (2), 189-207 (2024).
  26. Holen, I., Speirs, V., Morrissey, B., Blyth, K. In vivo models in breast cancer research: Progress, challenges and future directions. Dis Model Mech. 10 (4), 359-371 (2017).
  27. Pedroza, D. A., Gao, Y., Zhang, X. H., Rosen, J. M. Leveraging preclinical models of metastatic breast cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1879 (5), 189163(2024).
  28. Nuckhir, M., Withey, D., Cabral, S., Harrison, H., Clarke, R. B. State of the art modelling of the breast cancer metastatic microenvironment: Where are we. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 29 (1), 14(2024).
  29. Avalle, L., et al. Stat3 induces breast cancer growth via angptl4, mmp13 and stc1 secretion by cancer associated fibroblasts. Oncogene. 41 (10), 1456-1467 (2022).
  30. Halaban, R., Alfano, F. D. Selective elimination of fibroblasts from cultures of normal human melanocytes. In Vitro. 20 (5), 447-450 (1984).
  31. Avalle, L., et al. Micrornas-143 and -145 induce epithelial to mesenchymal transition and modulate the expression of junction proteins. Cell Death Differ. 24 (10), 1750-1760 (2017).
  32. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with rna-seq. J Biomed Biotechnol. 2010, 853916(2010).
  33. Ura, H., Togi, S., Niida, Y. A comparison of mrna sequencing (rna-seq) library preparation methods for transcriptome analysis. BMC Genomics. 23 (1), 303(2022).
  34. Kim, D., et al. Tophat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36(2013).
  35. Hanzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. Gsva: Gene set variation analysis for microarray and rna-seq data. BMC Bioinformatics. 14, 7(2013).
  36. Mounir, M., et al. New functionalities in the tcgabiolinks package for the study and integration of cancer data from gdc and gtex. PLoS Comput Biol. 15 (3), e1006701(2019).
  37. Onuchic, V., et al. Epigenomic deconvolution of breast tumors reveals metabolic coupling between constituent cell types. Cell Rep. 17 (8), 2075-2086 (2016).
  38. Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nat Commun. 4, 2612(2013).
  39. Aran, D., Sirota, M., Butte, A. J. Systematic pan-cancer analysis of tumour purity. Nat Commun. 6, 8971(2015).
  40. Liu, J., et al. An integrated tcga pan-cancer clinical data resource to drive high-quality survival outcome analytics. Cell. 173 (2), 400-416.e11 (2018).
  41. Carter, S. L., et al. Absolute quantification of somatic DNA alterations in human cancer. Nat Biotechnol. 30 (5), 413-421 (2012).
  42. Savino, A., De Marzo, N., Provero, P., Poli, V. Meta-analysis of microdissected breast tumors reveals genes regulated in the stroma but hidden in bulk analysis. Cancers. 13 (13), 3371(2021).
  43. Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral rnai system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
  44. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of crispr-cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  45. Pfefferle, A. D., et al. Transcriptomic classification of genetically engineered mouse models of breast cancer identifies human subtype counterparts. Genome Biol. 14 (11), R125(2013).
  46. Hahn, W. C., et al. Enumeration of the Simian virus 40 early region elements necessary for human cell transformation. Mol Cell Biol. 22 (7), 2111-2123 (2002).
  47. Counter, C. M., et al. Dissociation among in vitro telomerase activity, telomere maintenance, and cellular immortalization. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14723-14728 (1998).
  48. Ferrari, N., et al. Dickkopf-3 links hsf1 and Yap/Taz signalling to control aggressive behaviours in cancer-associated fibroblasts. Nat Commun. 10 (1), 130(2019).
  49. Herrera, M., et al. Cancer-associated fibroblast-derived gene signatures determine prognosis in colon cancer patients. Mol Cancer. 20 (1), 73(2021).
  50. Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
  51. Cobos, F. A., et al. Effective methods for bulk RNA-seq deconvolution using scRNA-seq transcriptomes. Genome Biol. 24 (1), 177(2023).
  52. Cheng, P. S. W., Zaccaria, M., Biffi, G. Functional heterogeneity of fibroblasts in primary tumors and metastases. Trends Cancer. 11 (2), 135-153 (2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

mikrośrodowisko guzarak piersiprofilowanie ekspresji genówanaliza transkryptomicznatest inwazjitest migracjigeny docelowe STAT3laserowa mikrodysekcja przechwytująca
Fibroblasty związane z rakiem z guzów sutka myszy jako narzędzia do badań molekularnych i obliczeniowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.