Test preferencji węchowych do pomiaru węchowych uprzedzeń hedonicznych w mysich modelach depresji

Podsumowanie

W tym miejscu przedstawiamy protokół testu preferencji węchowych, który pozwala na ocenę negatywnych uprzedzeń węchowych zarówno wobec apetytywnych, jak i awersyjnych bodźców zapachowych w mysich modelach depresji.

Streszczenie

Depresja jest największym pojedynczym czynnikiem przyczyniającym się do niepełnosprawności na całym świecie, dotykając 280 milionów ludzi rocznie. Poza zmniejszoną aktywnością i motywacją, wykazano, że depresja wiąże się z negatywnym nastawieniem wartościowym: pacjenci uważają, że neutralne i pozytywne bodźce sensoryczne są mniej przyjemne, a negatywne bardziej nieprzyjemne w porównaniu z osobami zdrowymi. W szczególności węchowe odchylenie hedoniczne może stanowić marker stanu choroby u pacjentów i można je łatwo zmierzyć w modelach mysich. Jednak istnieje bardzo niewiele testów na zwierzętach, które mierzą stronniczość emocjonalną w sposób translacyjny. W tym miejscu proponujemy protokół wiarygodnej oceny atrybucji walencji zapachu myszy kontrolnych i depresyjnych poprzez badanie substancji zapachowych związanych z różnymi wartościami hedonicznymi. Korzystając z tego testu preferencji węchowych i kilku odczytów behawioralnych, potwierdzamy negatywne odchylenie węchowe zarówno w stosunku do bodźców apetytywnych, jak i awersyjnych w dwóch różnych mysich modelach depresji. Co ważne, metoda ta ma zastosowanie zarówno u mężczyzn, jak i kobiet. Wreszcie, protokół ten pozwala na wiele adaptacji w celu poprawy oceny reakcji emocjonalnej i może być łatwo łączony z klasycznymi narzędziami do monitorowania aktywności neuronalnej na żywo.

Wprowadzenie

Depresja jest poważnym zaburzeniem nastroju i główną przyczyną niepełnosprawności na całym świecie. Według Światowej Organizacji Zdrowia depresję cierpi około 280 milionów ludzi, czyli 4% populacji. Występuje o 50% częściej wśród kobiet niż wśród mężczyzn, a wybuch COVID-19 zwiększył o 25% częstość występowania zaburzeń depresyjnych w pierwszym roku pandemii (Światowa Organizacja Zdrowia, 2022). Ponadto około jedna trzecia pacjentów nie reaguje na klasyczne terapie przeciwdepresyjne, zaobserwowanie efektów przeciwdepresyjnych trwa tygodnie, a fizjopatologia zaburzeń nastroju pozostaje w dużej mierze nieznana.

Na podstawie DSM-5¹ diagnoza depresji opiera się na kilku objawach, w tym obniżonym nastroju, utracie zainteresowania lub przyjemności, znacznej zmienności masy ciała, fizycznym i psychicznym spowolnieniu, zmęczeniu, poczuciu bezwartościowości, trudnościach z koncentracją i nawracających myślach o śmierci. Badania kliniczne wykazały również, że zaburzenia nastroju towarzyszą zmianom sensorycznym: pacjenci z depresją uważają bodźce sensoryczne za mniej przyjemne niż osoby z grupy kontrolnej ^2,3,4.

Hedoniczna "walencja" odnosi się do stopnia, w jakim coś jest przyjemne (pozytywna walencja) lub awersyjne (negatywna wartościowość). Przypisanie walencyjne do bodźca może wywołać dostosowane zachowanie, w tym podejście lub unikanie⁵. Co ciekawe, proces ten jest wysoce konserwatywny między gatunkami, od owadów po ludzi⁶. Depresja wiąże się zatem z negatywnym nastawieniem wartościowym. Jednak diagnoza kliniczna w niewielkim stopniu opiera się na ocenach błędów sensorycznych.

Wśród modalności sensorycznych szczególnie interesujący jest węch, ponieważ bodźce węchowe w dużej mierze omijają przekaźniki wzgórzowe i rzutują na układ limbiczny u ssaków, w tym u ludzi. Z ewolucyjnego punktu widzenia wykazano, że system ten ma kluczowe znaczenie w kodowaniu zestawu pierwotnych reakcji na bodźce środowiskowe 7,8,9,10,11,12. Oprócz tych wspólnych obwodów neuronalnych, badania kliniczne ujawniają obustronny związek między węchem a depresją, przy czym pacjenci z depresją doświadczają zmian węchowych, a także zaburzeń węchowych powodujących objawy depresyjne¹³. Ponadto funkcja węchu jest odzyskiwana u pacjentów z depresją po leczeniu farmakologicznym lub terapii 14,15,16,17. Wyniki te sugerują, że deficyty węchowe mogą być biomarkerem stanu (stanu objawów klinicznych u pacjentów), a nie cechy (właściwości, które odgrywają wcześniejszą, być może przyczynową, rolę w patofizjologii zaburzenia psychicznego i dlatego mogą być wykorzystane do wczesnej, przedobjawowej diagnozy) choroby¹⁸. W związku z tym lepsze i głębsze zrozumienie, w jaki sposób modalność węchowa jest zmieniona w depresji, może utorować drogę do nowych narzędzi terapeutycznych do diagnozowania i wykrywania odpowiedzi na leczenie.

W związku z tym ocena węchowego błędu hedonicznego w modelach depresji byłaby szczególnie interesująca, zarówno w celu oceny indukowanego fenotypu depresyjnego, jak i jako narzędzie do badania mechanizmów neuronalnych stojących za tymi zmianami w przypisywaniu walencji. W poprzednich badaniach stosowano już podejścia behawioralne do oceny przypisywania walencji zapachu u myszy. Testy te mają jednak kilka zastrzeżeń: wymagają wyrafinowanych urządzeń¹⁹, które w większości obejmują pudełka zamknięte pokrywą 19,20,21, zakładają stały kontakt fizyczny z roztworem zapachowym 20,21,22 i/lub skutkują bardzo krótkim czasem eksploracji zapachu 21,22,23. To sprawia, że testy te są niekompatybilne z klasycznymi narzędziami do monitorowania aktywności neuronalnej na żywo, które wymagają dłuższego czasu pobierania próbek u myszy na uwięzi.

Co więcej, Malkesman i in. opracowali już test wąchania moczu samic (FUST) do monitorowania aktywności poszukiwania nagrody u gryzoni poprzez pomiar badania węchowego samców myszy narażonych na mocz samic myszy²⁴. Jednak ten test ocenia reakcję behawioralną tylko na jeden konkretny pozytywny bodziec o charakterze społecznym i z krótkim czasem interakcji. Ponadto test ten został zaprojektowany wyłącznie dla samców gryzoni, chociaż depresja jest dwa razy częstsza wśród kobiet niż wśród mężczyzn.

Aby przezwyciężyć wszystkie te ograniczenia, opracowaliśmy tutaj Test Preferencji Węchowych (OPT) zaadaptowany z Bigot i ^wsp.14, w którym zarówno samce, jak i samice myszy mogą być narażone na wiele różnych neutralnych, pozytywnych i negatywnych zapachów w celu precyzyjnej oceny odpowiedzi hedonicznej w kontekście depresji. Dobór zapachów może opierać się na wcześniejszych publikacjach^14,25, ale ten test pozwala również na eksplorację nowych bodźców społecznych, żywieniowych, związanych z infekcją, przy użyciu zarówno naturalnych składników, jak i monomolekularnych lub specjalnie zaprojektowanych mieszanin chemicznych.

Protokół

Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i procedury eksperymentalne były zgodne z krajowymi i europejskimi (2010/63/UE) wytycznymi i zostały zatwierdzone przez francuskie Ministerstwo Badań Naukowych (APAFiS: #16380-2018080217358599_v1; APAFIS #51636-2024101718013761_v4). C57BL/6JRj samce i samice myszy (model UCMS) oraz C57BL/6NTac (model CORET) samce myszy (8 tygodni). Wybór podszczepu C57BL/6 opierał się na odpowiedniej literaturze²⁷. Co ważne, każdy model został porównany z własną kontrolą z tego samego podszczepu. Wszystkie myszy były trzymane w pomieszczeniach socjalnych (4-5 myszy w klatce) i utrzymywane w standardowych warunkach (23 ± 1 °C; wilgotność 40%) w cyklu 14/10 godzin światło/ciemność (światła włączane o 7 rano) z jedzeniem i wodą ad libitum.

1. Konfiguracja eksperymentalna

1. Montaż areny
   1. Przygotuj zestaw doświadczalny, który składa się z dwukomorowej areny (45 cm × 50 cm × 25 cm) wykonanej z szarych ścian z pleksiglasu i białej podłogi. Podziel dwie komory (25 cm × 45 cm) szarą ścianą z pleksiglasu (37 cm × 25 cm).
   2. Umieść perforowaną szalkę Petriego (60 mm × 15 mm z 7 otworami o średnicy 5 mm) na spodzie ściany z każdej komory.
   3. Pionowo przymocuj szalki Petriego do ściany za pomocą dwustronnego kleju lub kleju samoprzylepnego (np. Blu-tack).
   4. Umieść kamerę na szczycie areny, aby rejestrować zachowanie zwierząt (2 m nad areną) i automatycznie śledzić ich ruchy podczas eksperymentu.
2. Wybór zapachów
   1. Przed eksperymentem wybierz listę zapachów o neutralnej, pozytywnej i ujemnej wartościowości, które będą badane (przykłady znajdują się w tabeli 1 ).
   2. Sprawdź, czy wszystkie wybrane zapachy mają podobną prężność pary. Dodatkowo oceń dyfuzję na całej arenie pod kątem niektórych zapachów za pomocą detektora fotojonizacji (PID)²⁶.
   3. Przetestuj każdy zapach w osobnym dniu.
      UWAGA: Zaleca się zaplanowanie użycia najpierw zapachów neutralnych, następnie zapachów pożądawczych, a na końcu zapachów awersyjnych, aby zminimalizować efekty eksploracji z dnia na dzień. Ta kolejność minimalizuje efekty przeniesienia z jednego dnia testu na drugi. Alternatywnie można zastosować losową prezentację, ale wszystkie grupy eksperymentalne muszą być badane z tą samą sekwencją zapachów.
3. Projektowanie grup eksperymentalnych
   1. Podziel myszy na co najmniej dwie grupy eksperymentalne: myszy kontrolne i myszy, które przejdą model depresji. Zwierzęta z tej samej grupy powinny być trzymane w tych samych klatkach.
      UWAGA: Każda grupa eksperymentalna powinna składać się z co najmniej około 7-8 osób, aby uzyskać istotność statystyczną. Klatki powinny być zlokalizowane w pobliżu w pomieszczeniu dla zwierząt, aby zminimalizować efekt klatki.
   2. Wywołaj fenotyp podobny do depresji w odpowiednich grupach myszy przy użyciu modelu depresji z wyboru.
      UWAGA: Opisywanie protokołów wywołujących zachowania podobne do depresji u myszy wykracza poza zakres tego artykułu. Jednak w niniejszym badaniu przedstawiono eksperymenty z wykorzystaniem dwóch różnych modeli (Nieprzewidywalny Przewlekły Łagodny Stres [UCMS] i Kortykosteron [CORT])^27,28 jako reprezentatywne wyniki dla tego testu preferencji węchowych. Krótko mówiąc, model UCMS opiera się na ekspozycji na wiele różnych stresorów środowiskowych przez kilka tygodni, podczas gdy model CORT polega na chronicznym podawaniu kortykosteronu rozpuszczonego w wodzie pitnej myszy (około 5 mg/kg/dzień w zależności od tego, ile piją myszy).

2. Faza przyzwyczajenia

1. Ogólne przyzwyczajenie i obsługa
   1. Po przyjeździe pozostaw myszy w spokoju przez 1 tydzień bez zmiany pościeli. Dodaj dodatkowy materiał bawełniany i igloo w klatce, aby zmniejszyć stres.
   2. Po 1 tygodniu delikatnie dotykaj wszystkich myszy codziennie przez 3-4 dni i przyzwyczajaj je do obchodzenia się z kubkiem, najlepiej w pomieszczeniu eksperymentalnym.
2. Warunki doświadczalne badania
   1. Przenieś mysz do pokoju testów behawioralnych 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu.
      UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby pomieszczenie behawioralne składało się z dwóch oddzielnych części, dzięki czemu zwierzęta mogą przebywać w jednej części, podczas gdy badana mysz występuje w drugiej.
   2. Należy pamiętać, że zachowane są standardowe warunki mieszkaniowe (23 ± 1 °C; wilgotność 40%), a w pomieszczeniu nie ma uciążliwych dźwięków, oświetlenia ani zapachów.
   3. Za pomocą luksomierza ustaw oświetlenie na około 40 luksów na arenie. Upewnij się, że oświetlenie na arenie jest jednorodne.
3. Przyzwyczajenie do areny
   1. Dodać czystą bibułę filtracyjną (42,5 mm) do obu szalek Petriego (60 mm × 15 mm).
   2. Użyj przezroczystej taśmy, aby przymocować pokrywkę szalki Petriego do jej dna (ponieważ zostanie ona umieszczona pionowo).
   3. Pierwszego dnia delikatnie umieść wszystkie myszy z tej samej klatki na arenie na 10 minut, aby zmniejszyć neofobię.
      UWAGA: Zawsze umieszczaj myszy na arenie przy przenoszeniu kubków, aby uniknąć stresu związanego z podnoszeniem za ogon.
   4. Następnego dnia wprowadź każdą mysz indywidualnie na arenę, dokładnie pomiędzy dwoma przedziałami i nagrywaj zachowanie przez 10 minut.
      UWAGA: Upewnij się, że dokładnie wyczyściłeś arenę i dolną część ścian roztworem dezynfekującym (np. etanolem 70%), aby uniknąć utrzymujących się zapachów między osobnikami, a zwłaszcza między samcami i samicami myszy.
   5. Powtarzaj przez 2-3 dni z rzędu.
4. Kryterium eksploracji
   1. Określ dwa obszary (25 cm i 15 cm), w których umieszczono szalki Petriego i zmierz czas, jaki każde zwierzę spędza w każdej strefie.
   2. Uśrednij te miary ze wszystkich indywidualnych etapów habituacji.
   3. Jeżeli średni czas przebywania w każdej ze stref jest wyższy niż 50 s, kryterium jest spełnione. Jeśli nie, powtarzaj sesje habituacyjne aż do osiągnięcia kryterium lub wyklucz zwierzę z analizy.
      UWAGA: Dziennie można wykonać maksymalnie dwie sesje habituacyjne (rano i po południu).

3. Faza testowania

1. Przygotowanie zapachu
   1. W dniu badania przygotuj zapach z odpowiednim rozcieńczeniem pod kapturem chemicznym. Rozcieńczyć zapach w oleju mineralnym lub wodzie destylowanej, w zależności od struktury chemicznej. Aby uniknąć zanieczyszczenia, olej mineralny należy przechowywać w oddzielnym, wentylowanym pomieszczeniu, z dala od substancji zapachowych.
      UWAGA: Użycie nowej butelki oleju mineralnego jest zalecane podczas rozpoczynania nowego eksperymentu.
   2. Roztwór środka zapachowego należy przechowywać w szklanej fiolce. Unikaj plastikowych pojemników na tuby, które mogą powodować zanieczyszczenie zapachem.
   3. Tuż przed badaniem każdej myszy należy zebrać 200 μl roztworu zapachowego za pomocą mikropipety za pomocą końcówek filtrujących i umieścić go na bibule filtracyjnej na jednej z dwóch szalek Petriego.
   4. Niech druga bibuła filtracyjna na drugiej szalce Petriego pozostanie nietknięta.
   5. Przenieś szalki Petriego w pomieszczeniu testowym i przymocuj je pionowo do ściany areny.
      UWAGA: Nie przygotowuj i nie wyrzucaj roztworów zapachowych w pomieszczeniu eksperymentalnym, aby uniknąć zanieczyszczenia zapachem. Podczas eksperymentu regularnie zmieniaj rękawiczki. Jeśli podejrzewa się, że rękawice mogą zostać zanieczyszczone podczas manipulacji zapachem, zmień je przed złapaniem myszy do testów.
2. Test behawioralny
   1. Umieść każdą mysz osobno na arenie, tuż między dwoma przegródkami.
   2. Nagrywaj przez 10 min.
   3. Usuń mysz z areny.
   4. Usuń zapach szalki Petriego.
   5. Oczyść arenę roztworem dezynfekującym (np. etanol 70%) i wysusz ją. Pamiętaj również, aby wycierać o dolną część ścian komory.
   6. Wyrzuć bibułę filtracyjną i powtórz przygotowanie zapachu dla następnej myszy.
   7. Najlepiej testować tylko jeden zapach dziennie. Preferencyjnie używaj najpierw zapachów neutralnych, następnie zapachów pozytywnych, a na końcu zapachów negatywnych (patrz rysunek 1).
      UWAGA: Przeprowadzaj zarówno etapy habituacji, jak i testowania mniej więcej o tej samej porze dnia przez wszystkie dni eksperymentu (najlepiej między 9 a 15). Jeżeli liczba zwierząt wymaga dłuższego okresu czasu, należy zwrócić uwagę na naprzemienne badanie różnych grup doświadczalnych, aby uniknąć błędu systematycznego w ciągu dnia. Jeśli samce i samice mają być testowane w tym samym eksperymencie, preferuj testowanie jednej płci po drugiej.
      UWAGA: Używaj czystych szalek Petriego każdego dnia testu, aby uniknąć zanieczyszczenia zapachem. Warto zauważyć, że perforowane szalki Petriego mogą być ponownie wykorzystane do wielu eksperymentów po odpowiednim oczyszczeniu i odkażeniu zapachów. W razie potrzeby kontrolną bibułę filtracyjną można również wymieniać z dnia na dzień.

4. Analiza danych

1. Śledzenie zachowań
   1. Użyj programu do automatycznego śledzenia, aby zarejestrować pozycję myszy podczas testów.
   2. Zdefiniuj oddzielne strefy w arenie do analizy (patrz Rysunek 1):
      1. Zdefiniować "strefę zapachu" (25 cm × 15 cm), obszar, w którym umieszcza się szalkę Petriego z bibułą filtracyjną nasączoną zapachem (tj. obszar najbliższy zapachowi stanowiący około jednej trzeciej komory powierzchni).
      2. Zdefiniuj "strefę kontrolną" (25 cm × 15 cm), symetryczną do "strefy zapachu", ale bez dodawania zapachu na szalce Petriego.
      3. Zdefiniuj "strefę za zapachem" (25 cm × 30 cm), tj. pozostała część komory to miejsce, w którym umieszczona jest szalka Petriego.
      4. Zdefiniować "tylną strefę kontrolną" (25 cm × 30 cm), symetryczną do "tylnej strefy kontroli", składającą się z pozostałej części przedziału bezzapachowego.
         UWAGA: Śledzenie środkowego punktu ciała myszy jest wystarczające do analizy preferencji węchowych zwierzęcia. Jednak śledzenie nosa każdej myszy może dokładniej zilustrować badanie węchu przez zwierzę.
2. Odczyty odpowiedzi hedonistycznej
   1. Korzystając z automatycznego śledzenia, zbierz następujące informacje dla każdej myszy i każdego dnia testu, w tym kroki przyzwyczajenia:
      1. Zapisz całkowity dystans przebyty na arenie (m).
      2. Zapisz czas spędzony w każdej strefie areny (aren).
      3. Zapisz liczbę wejść w każdej strefie areny.
   2. Wykorzystaj całkowitą przebytą odległość, aby ocenić główne efekty lokomotoryczne.
   3. Aby ocenić różnice w preferencjach węchowych wobec różnych zapachów, skorzystaj z głównych odczytów:
      1. Wykorzystaj czas spędzony w strefie zapachowej.
      2. Użyj liczby wejść w strefie zapachowej.
      3. Użyj wskaźnika preferencji, obliczonego jako czas spędzony w strefie zapachowej znormalizowany do czasu spędzonego w tej strefie podczas habituacji (normalizacja jest wykonywana na myszach ze wszystkich grup). Średnia odnosi się do średniej arytmetycznej czasu spędzonego w strefie zapachu, a sd odnosi się do jej odchylenia standardowego.
         
      4. Użyj wskaźnika eksploracji zapachu, obliczonego jako średnia znormalizowanych wartości przebytej odległości, czasu spędzonego w strefie zapachowej i liczby wejść w strefę zapachową w następujący sposób:
         
         
         UWAGA: Ten wskaźnik preferencji można w razie potrzeby dostosować, na przykład porównując czas spędzony w strefie zapachu i strefy kontroli. Jeśli grupy wykazują znaczące różnice w eksploracji "strefy zapachowej" podczas habituacji, normalizację można przeprowadzić tylko w odniesieniu do grupy kontrolnej, a nie do wszystkich grup łącznie.
   4. Wizualnie przedstaw te odczyty dla myszy kontrolnych i depresyjnych jako średnią ± standardowym błędem średniej (SEM).
   5. Użyj dwukierunkowej analizy wariancji powtarzanych pomiarów (ANOVA), a następnie testów post hoc (tutaj nieskorygowanego testu najmniejszej znaczącej różnicy Fishera), aby uwzględnić zarówno grupy eksperymentalne, zapachy (współczynnik powtarzanego pomiaru), jak i czynniki wpływu interakcji. Współczynnik interakcji wskazuje, czy różnice między grupami są spójne we wszystkich prezentowanych zapachach.
   6. Sprawdź normalność i homoskedastyczność za pomocą dostosowanych testów (test Shapiro-Wilka, test Bartletta). Istotność statystyczną ustalono na poziomie *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Wyniki

Aby sprawdzić, czy myszy podobne do depresji wykazują negatywne odchylenie węchowe^14,29 i czy można je wiarygodnie zmierzyć za pomocą protokołu testu preferencji węchowych, który tutaj opisujemy, oceniliśmy odpowiedź hedoniczną na różne zapachy w dwóch różnych mysich modelach depresji.

Po pierwsze, użyliśmy mysiego modelu nieprzewidywalnego przewlekłego łagodnego stresu (UCMS) trwającego 4 tygodnie, dostosowanego do²⁸ (patrz plik uzupełniający 1, aby uzyskać szczegółowy protokół), aby wywołać fenotyp podobny do depresji u młodych samic myszy C57BL / 6JRj (Figura 2A, B). Te samice myszy zostały przetestowane w teście preferencji węchowych z moczem samców myszy (MU, czysty) jako zapachem apetytywnym i 2,4,5-trimetylotiazolem (TMT, 5% w oleju mineralnym) jako zapachem awersyjnym. Średnio każda mysz spędzała co najmniej 50 s zarówno w strefie "kontrolnej", jak i "zapachowej" podczas habituacji, spełniając kryterium (ryc. 2C). Jednak poprzez przyzwyczajenie myszy UCMS spędzały znacznie więcej czasu w "strefie kontrolnej" w porównaniu z kontrolą, ale ponieważ nie ma znaczącej różnicy w odniesieniu do strefy, w której zapach zostanie dodany, różnicę tę można odrzucić. Jeśli chodzi o odległość, myszy kontrolne poruszały się znacznie więcej niż UCMS, gdy były wystawione na działanie MU, ale nie podczas habituacji lub w obecności TMT (ryc. 2D). Wreszcie, wszystkie odczyty odpowiedzi hedonicznej (czas spędzony w strefie zapachowej, liczba wejść w strefie zapachowej i wskaźnik preferencji) wykazują znaczące różnice lub tendencję statystyczną między samicami z grupy kontrolnej i UCMS (ryc. 2E-G). Efekt ten jest również widoczny poprzez globalny wskaźnik eksploracji zapachu, który jest połączoną miarą odpowiedzi hedonicznej i lokomotorycznej (ryc. 2H). Konsekwentnie, każdy odczyt wykazuje zatem negatywne nastawienie hedonistyczne w odpowiedzi zarówno na apetytywne, jak i awersyjne bodźce węchowe. Co ciekawe, wynik emocjonalności, który jest obliczany jako znormalizowana wartość fenotypu lękowego i depresyjnego na podstawie dużej baterii testów behawioralnych¹⁴, jest dodatnio skorelowany ze wskaźnikiem eksploracji zapachów zarówno dla MU, jak i TMT (Figura 2I), wykazując związek między reakcją behawioralną na pozytywne i negatywne zapachy a fenotypem lękowym i depresyjnym.

Po drugie, tym razem użyliśmy tego samego protokołu UCMS, aby wywołać fenotyp podobny do depresji u samców myszy. Podczas testu preferencji węchowych myszy te zostały wystawione na działanie moczu samic myszy (FU, czysty), który jest pożądający, oraz TMT, jak poprzednio, jako negatywny zapach (ryc. 3A, B). Nie ma różnicy w czasie spędzonym w czterech strefach podczas habituacji, ani w odległości przebytej w teście (ryc. 3C,D). Czas spędzony w strefie zapachowej wskazuje na znaczne zmniejszenie eksploracji FU i TMT w UCMS w porównaniu z kontrolami (rysunek 3E). Ponadto myszy UCMS wchodzą znacznie rzadziej w strefę zapachową lub mają tendencję do tego i wykazują znacznie obniżony wskaźnik preferencji zarówno dla FU, jak i TMT (ryc. 3F, G), potwierdzając negatywne odchylenie węchowe w stanie podobnym do depresji. Podobnie, indeks eksploracji zapachu wykazuje ujemnie zmienioną reakcję behawioralną na FU i TMT myszy UCMS w porównaniu z grupą kontrolną (ryc. 3H), która wydaje się być dodatnio skorelowana z wynikiem emocjonalności zwierząt (ryc. 3I).

W trzecim eksperymencie uciekliśmy się do innego modelu depresji, który opiera się na przewlekłym podawaniu kortykosteronu (CORT) w wodzie pitnej samców myszy C57BL / 6NTac, podczas gdy myszy kontrolne otrzymują tylko roztwór nośnika (Veh) (10% 2-hydroksypropylo-beta-cyklodekstryny) ²⁷. Po czterech tygodniach leczenia CORT lub Veh myszy przyzwyczajono do życia przez cztery dni, a następnie wystawiono na działanie neutralnego zapachu (OCT: 2-trans octenal, 1% w wodzie), pozytywnego zapachu (PO: olej arachidowy) i negatywnego zapachu (TMT: 2,4,5-trimetylotiazol, 5% w oleju mineralnym) (Rysunek 4A, B). Poprzez habituację nie było różnic między Veh a CORT (ryc. 4C). Jednak obie grupy spędzały znacznie więcej czasu w "strefie zapachowej" w porównaniu ze "strefą kontrolną". Nie ma różnic w przebytej odległości, z wyjątkiem pozytywnego zapachu (PO), dla którego myszy Veh poruszały się bardziej niż CORT (ryc. 4D). Co ważne, podobnie jak w przypadku myszy UCMS, czas spędzony w strefie zapachowej został znacznie skrócony w przypadku myszy CORT, gdy były wystawione na działanie neutralnego i pożądającego zapachu (Figura 4E). Zmniejszona eksploracja zapachu jest również widoczna poprzez znaczne ograniczenie lub tendencję do mniejszej liczby wejść w strefę zapachową (rysunek 4F). W tym przypadku różnice między grupami ujawniają się w zależności od analizowanego odczytu, prawdopodobnie ze względu na ograniczenia związane z liczbą wykorzystanych zwierząt, a także potencjalny efekt podłogi spowodowany krótkim czasem eksploracji obserwowanym po ekspozycji TMT. Ogólnie rzecz biorąc, wskaźnik preferencji jest znacznie niższy u myszy CORT dla wszystkich bodźców zapachowych w porównaniu z Veh (Figura 4H). Wreszcie, wskaźnik eksploracji zapachów dla wszystkich zapachów jest istotnie skorelowany z wynikiem emocjonalności zwierząt (Rysunek 4I), pokazując po raz kolejny, że ten test preferencji węchowych jest odpowiednim narzędziem do oceny negatywnych uprzedzeń emocjonalnych w kilku mysich modelach depresji.

Wreszcie, możemy wykluczyć możliwość, że zaobserwowane różnice mogą być spowodowane zmniejszeniem aktywności lokomotorycznej, a nie uprzedzeniami emocjonalnymi. Rzeczywiście, lokomocja nie różni się między grupami podczas habituacji, gdy ocenia się całkowity przebyty dystans (Rysunek 2D, Rysunek 3D, Rysunek 4D). Ponadto, w oparciu o analizę statystyczną, ogólne zmniejszenie zaangażowania w zadania lub efekt nowości również nie mogą wyjaśnić tych uprzedzeń. W rzeczywistości znaleźliśmy znaczący wpływ czynnika zapachu w analizie wskaźnika preferencji, bez znaczącej interakcji między grupami eksperymentalnymi a zapachami. Wyniki te pokazują, że myszy podobne do depresji rzeczywiście wykonują to zadanie, a ich zmniejszona eksploracja jest specyficzna dla każdej wskazówki węchowej.

Rysunek 1: Ogólny schemat osi czasu i konfiguracja testu preferencji węchowych. Myszy są najpierw przyzwyczajane do areny. W pierwszym dniu habituacji myszy z tej samej klatki trzyma się razem, aby zmniejszyć neofobię. Następnego dnia są one umieszczane pojedynczo na arenie. Po przyzwyczajeniu do jednej z komór dodaje się zapach. Najpierw testowane są zapachy neutralne, następnie zapachy pozytywne, a na końcu zapachy negatywne. Na potrzeby analizy arenę można podzielić na cztery różne strefy. Stworzone za pomocą Biorender. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Negatywne odchylenie węchowe w mysim modelu depresji u samic UCMS. Panie przewodniczący, panie i panowie! Kalendarium i grupy eksperymentalne badania: Samice myszy kontrolnych i UCMS (Unpredictable Chronic Mild Stress) są testowane w teście preferencji węchowych z dodatnim (MU: mocz samca myszy, czysty) i ujemnym zapachem (TMT: 2,4,5-trimetylotiazol, 5% w oleju mineralnym). Stworzone za pomocą Biorender. (C) Myszy UCMS spędzały średnio znacznie więcej czasu w "strefie kontrolnej" i mniej czasu w "strefie za zapachem" w porównaniu z kontrolami podczas habituacji (Grupa: F(1, 12) = 74,03, p < 0,0001; Strefa: F(2,434, 29,21) = 7,688, p = 0,0012; Interakcja: F(3, 36) = 5,148, p = 0,0046). (D) Całkowita odległość przebyta znacznie zmniejszyła się w UCMS po wystawieniu na działanie MU, ale nie dla habituacji (Hab) i TMT (grupa: F(1, 12) = 4,664, p = 0,0518; Zapach: F(1,871, 22,45) = 4,846, p = 0,0195; Interakcja: F(2, 24) = 4,797, p = 0,0177). (E) Myszy UCMS spędzały znacznie mniej czasu na badaniu MU i TMT (Grupa: F(1, 12) = 24,39, p = 0,0003; Zapach: F(1, 12) = 59,69, p < 0,0001; Interakcja: F(1, 12) = 2,267, p = 0,1580). (F) Myszy UCMS weszły poniżej strefy zapachowej lub miały tendencję do (Grupa: F(1, 12) = 9,279, p = 0,0102; Zapach: F(1, 12) = 5,100, p = 0,0433; Interakcja: F(1, 12) = 1,649, p = 0,2233). (G) Wskaźnik preferencji dla MU i TMT jest znacznie obniżony u myszy UCMS (Grupa: F(1, 12) = 24,39, p = 0,0003; Zapach: F(1, 12) = 59,69, p < 0,0001; Interakcja: F(1, 12) = 2,267, p = 0,1580). (H) Wskaźnik eksploracji zapachu dla MU i TMT jest znacznie obniżony u myszy UCMS (F(1, 12) = 14,71, p = 0,0024; Zapach: F(1, 12) = 0, p > 0,9999; Interakcja: F(1, 12) = 0,02630, p = 0,8739). (I) Wskaźnik eksploracji zapachu dla MU i TMT jest dodatnio skorelowany z wynikiem emocjonalności zwierząt (MU: Pearson R² = 0,4837, F(1,12) = 11,24, **p = 0,0058; TMT: Pearson R² = 0,5340, F(1,12) = 13,75, **p = 0,0030). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Negatywne odchylenie węchowe w męskim mysim modelu depresji UCMS. Panie przewodniczący, panie i panowie! Oś czasu i grupy eksperymentalne badania: Samce myszy kontrolnych i UCMS są testowane w teście preferencji węchowych z pozytywnym (FU: mocz samicy myszy, czysty) i ujemnym zapachem (TMT: 2,4,5-trimetylotiazol, 5% w oleju mineralnym). Stworzone za pomocą Biorender. (C) Nie ma różnic w średnim czasie spędzanym w różnych strefach areny poprzez habituację (Grupa: F(1, 13) = 3,921, p = 0,0693; Zoner = F(1,688, 21,94) = 34,57, p < 0,0001; Interakcja: F(3, 39) = 0,7385, p = 0,5355). (D) Nie ma różnic w całkowitej odległości przebytej między kontrolami a UCMS (Grupa: F(1, 13) = 2,313, p = 0,1522; Zapach: F(1,722, 22,38) = 1,746, p = 0,1998; Interakcja: F(2, 26) = 0,8806, p = 0,4266). (E) Czas spędzony na eksploracji strefy zapachowej za pomocą FU i TMT jest znacznie skrócony u myszy UCMS (Grupa: F(1, 13) = 6,808, p = 0,0216; Zapach: F(1, 13) = 16,21, p = 0,0014; Interakcja: F(1, 13) = 0,3304, p = 0,5753). (F) Myszy UCMS wchodziły znacznie rzadziej w strefę zapachu dla TMT i miały tendencję do FU (Grupa: F(1, 13) = 6,572, p = 0,0236; Zapach: F(1, 13) = 3,784, p = 0,0737; Interakcja: F(1, 13) = 0,2145, p = 0,6509). (G) Indeks preferencji myszy UCMS jest znacznie obniżony dla FU i TMT (Grupa: F(1,13 ) = 6,808, p = 0,0216; Zapach: F(1, 13) = 16,21, p = 0,0014; Interakcja: F(1, 13) = 0,3304, p = 0,5753); (H) Wskaźnik eksploracji zapachów UCMS jest znacznie obniżony dla obu zapachów (Grupa: F(1, 13) = 12,42, p = 0,0037; Zapach: F(1, 13) = 0,002580, p = 0,9603; Interakcja: F(1, 13) = 0,5804, p = 0,4598). (I) Wskaźnik eksploracji zapachu dla FU i TMT jest zwykle dodatnio skorelowany z wynikiem emocjonalności zwierząt (FU: Pearson R² = 0,2573, F(1, 13) = 4,504, p = 0,0536; TMT: Pearson R² = 0,2266, F(1, 13) = 3,809, p = 0,0729). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Negatywne odchylenie węchowe w mysim modelu depresji CORT. (A,B) Oś czasu i grupy eksperymentalne badania: Samce myszy Veh i CORT są testowane w teście preferencji węchowych z neutralnym (OCT: trans-2-oktenal, 1% w wodzie), dodatnim (PO: olej arachidowy, czysty) i ujemnym (TMT: 2,4,5-trimetylotiazol, 5% w oleju mineralnym). Myszom Veh i CORT podaje się odpowiednio roztwór nośnika i nośnika + kortykosteronu przez cały czas trwania eksperymentu. Stworzone za pomocą Biorender. (C) Średni czas spędzony w różnych strefach areny podczas habituacji (Grupa: F(1, 10) = 0,07588, p = 0,7886; Strefa: F(2,224, 22,24) = 6,939, p = 0,0036; Interakcja: F(3, 30) = 0,7033, p = 0,5575). (D) Całkowita odległość przebyta podczas testu habituacji (Hab) i różnych zapachów (Grupa: F(1, 10) = 4,193, p = 0,0678; Zapach: F(3, 30) = 11,80, p < 0,0001; Interakcja: F(3, 30) = 1,489, p = 0,2375). (E) Myszy CORT spędzają mniej czasu w strefie zapachowej niż Veh dla OCT i PO (Grupa: F(1, 10) = 5,094, p = 0,0476; Zapach: F(2, 20) = 28,87, p < 0,0001; Interakcja: F(2, 20) = 3,841, p = 0,0388). (F) Myszy CORT wchodzą rzadziej do strefy zapachowej lub mają tendencję do niej w porównaniu z Veh (Grupa: F(1, 10) = 6,832, p = 0,0259; Zapach: F(2, 20) = 2,738, p = 0,0889; Interakcja: F(2, 20) = 0,2902, p = 0,7512). (G) qmice CORT wykazują niższy wskaźnik preferencji dla OCT i PO (Grupa: F(1, 10) = 5,895, p = 0,0356; Zapach: F(2, 20) = 20,83, p < 0,0001; Interakcja: F(2, 20) = 1,437, p = 0,2611). (H) Wskaźnik eksploracji zapachu jest znacznie obniżony u myszy UCMS dla wszystkich zapachów (Grupa: F(1, 10) = 12,35, p = 0,0056; Zapach: F(2, 20) = 0,04381, p = 0,9572; Interakcja: F(2, 20) = 0,3622, p = 0,7006). (I) Wskaźnik eksploracji zapachu dla każdego zapachu jest dodatnio skorelowany z wynikiem emocjonalności zwierząt (OCT: Pearson R² = 0,5601, F(1, 10) = 12,73, **p = 0,0051; PO: Pearson R² = 0,4495, F(1, 10) = 8,165, *p = 0,0170; TMT: Pearson R² = 0,5061, F(1, 10) = 10,25, **p = 0,0095). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Nazwa	Skrót	Rozcieńczeniu	Valence
2,4,5-trimetylotiazol	Technologie transportowe i transportowe (	5% w oleju mineralnym	Minus
2-przezoktenalny	PAŹ	1% w wodzie	Neutralny
Mocz samicy myszy	FU	Czysty	Plus
Mocz samca myszy	MU	Czysty	Plus
Olej arachidowy	Zamówienie zakupu	Czysty	Plus

Tabela 1: Przykłady zapachów o neutralnej, pozytywnej i ujemnej wartościowości.

Plik uzupełniający 1: Protokół dla 4-tygodniowego nieprzewidywalnego przewlekłego łagodnego stresu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Negatywne uprzedzenia emocjonalne są główną cechą zaburzeń depresyjnych i są szczególnie interesujące dla lepszego zrozumienia fizjopatologii choroby. W związku z tym kluczowe jest zarówno uwzględnienie oceny uprzedzeń sensorycznych w modelach przedklinicznych, aby poprawić charakterystykę fenotypu podobnego do depresji, jak i zbadać, jakie mechanizmy biologiczne leżą u podstaw przetwarzania emocjonalnego i jego zmian w stanach patologicznych. Co więcej, węch to zmysł wyboru do badania uprzedzeń emocjonalnych. Z perspektywy translacyjnej etologicznie istotna jest ocena przetwarzania emocjonalnego zarówno u myszy, jak i u ludzi. Ponadto systemy węchowe i emocjonalne są ze sobą ściśle powiązane i mają wspólne struktury neuronalne w trakcie ewolucji. Istnieje silny, wzajemny związek między upośledzonym węchem a depresją¹⁰, co sprawia, że węch jest obiecującym i potężnym narzędziem do wykorzystania w diagnozie i reakcji na leczenie, a także w badaniach podstawowych.

W tym miejscu opracowaliśmy protokół testu preferencji węchowych w celu oceny węchowych uprzedzeń emocjonalnych w dwóch mysich modelach depresji. Co ważne, metoda ta pozwala na ocenę reakcji na dużą różnorodność bodźców o zmiennej wartościowości, zarówno pozytywnych, jak i negatywnych, a także bodźce neutralne, których wartość mogła ulec zmianie w warunkach patologicznych. Te późniejsze bodźce nie są obowiązkowe dla ważności testu, ale mogą wnieść do eksperymentu interesujące dodatkowe informacje. Test ten pozwala również na ocenę skalowalności odpowiedzi przy użyciu różnych stężeń zapachu. Kluczowa jest ocena reakcji na bodźce o różnych wartościach hedonicznych oraz oddzielenie pozytywnego od negatywnego przetwarzania emocjonalnego w kontekście depresji. Rzeczywiście, wyniki przedkliniczne wskazują, że leczenie przeciwdepresyjne może nie przywracać jednakowo pozytywnego i negatywnego przetwarzania węchowego¹⁴. Spontaniczna eksploracja wrodzonych istotnych bodźców zapachowych lub awersyjnych zapobiega również czynnikom zakłócającym wynikającym z deficytów poznawczych lub motywacyjnych związanych ze stanami podobnymi do depresji^30,31. Dlatego protokół ten nie wymaga długich faz uczenia się, co ma zalety techniczne. Ważne jest, aby pamiętać, że oba modele użyte w tym badaniu opierają się na interwencjach przeprowadzonych w wieku dorosłym, więc przyszłe eksperymenty będą konieczne, aby ocenić, czy ten protokół jest również wrażliwy na ocenę innych czynników ryzyka depresji, w tym przeciwności losu we wczesnym okresie życia.

Co ważne, protokół ten ma zastosowanie zarówno u mężczyzn, jak i kobiet, co ma kluczowe znaczenie, ponieważ kobiety są dwa razy bardziej narażone na depresję niż mężczyźni. Jednak mężczyźni mogą być niedostatecznie zdiagnozowani z powodu depresji z powodu oczekiwań społecznych, wstydu lub stygmatyzacji, jak opisano w Shi i ^wsp.32. Niemniej jednak depresja wydaje się różnić między mężczyznami i kobietami pod względem symptomatologii (objawów klinicznych), etiologii (przyczyny biologiczne) i przewidywalności leczenia 33,34,35, jednak wiele modeli i testów depresji jest nadal zaprojektowanych głównie dla mężczyzn. Na przykład standardowy test wąchania moczu^{kobiet 24} wykorzystuje podobny protokół, ale opiera się na unikalnej społecznej wskazówce zapachowej. Chociaż bardzo pouczający, wynik tego testu jest krótki w czasie eksploracji (30 s w grupie kontrolnej) i jest przeznaczony głównie dla samców myszy, ponieważ mocz samic nie ma takiego samego znaczenia etologicznego i hedonicznego dla obu płci. Wreszcie, wydaje się, że węchowa odpowiedź hedoniczna jest wrażliwa na leczenie przeciwdepresyjne¹⁴, co czyni nasz test narzędziem z wyboru do wiarygodnego charakteryzowania stanów podobnych do depresji, zastępując inne kontrowersyjne testy, takie jak test pływania siłowego 36,37,38.

Co ważne, wynikiem testu jest wydłużenie czasu eksploracji bodźca (100-200 s) w porównaniu z poprzednio opisanymi testami 21,22,23. Wydłużony czas trwania eksploracji jest szczególnie ważny, gdy test ten jest połączony na przykład z technikami monitorowania aktywności neuronalnej na żywo. Ponadto test ten nie wymaga pozbawienia pokarmu/wody, co pozwala uniknąć metabolicznych czynników zakłócających. Wreszcie, test ten można przeprowadzić w okresie świetlnym, zmniejszając ograniczenia eksperymentalne (cykl odwrotny, nagrania w podczerwieni).

Jednak, aby pomyślnie przeprowadzić ten protokół, niektóre kroki techniczne są krytyczne. Po pierwsze, ważne jest, aby eksperymenty były przeprowadzane w bardzo kontrolowanym i niestresującym środowisku: oświetlenie powinno być jednorodne i nie powinno być zbyt jasne, a w pomieszczeniu nie powinno być żadnych niepokojących dźwięków ani zapachów. Myszy mogą być testowane na arenie raz dziennie, a test musi być przeprowadzany mniej więcej o tej samej porze każdego dnia. Ponadto podczas wykonywania tych eksperymentów zaleca się wyjątkowego eksperymentatora w celu zmniejszenia stresu zwierząt.

Po drugie, należy zapewnić wystarczającą eksplorację areny przez dni przyzwyczajenia. Jeśli mysz spędza średnio mniej niż 50 s w którejkolwiek ze stref, w których umieszcza się szalki Petriego podczas habituacji, można dodać jeden lub dwa dodatkowe dni habituacji przed przetestowaniem zapachów. Jeśli mysz nadal nie eksploruje areny wystarczająco długo, powinna zostać wyłączona z analizy. W przypadku początkowej niesymetrycznej eksploracji "strefy zapachu" podczas habituacji między grupami eksperymentalnymi, obliczenie indeksu preferencji może być dostosowane do skorygowania zróżnicowanych spontanicznych uprzedzeń preferencji, na przykład poprzez normalizację przez czas spędzony podczas habituacji w odniesieniu do każdej grupy, a nawet w odniesieniu do ich własnej eksploracji podczas habituacji. Rzeczywiście, kolejną trudnością może być duża zmienność między grupami eksperymentalnymi. Jeśli pojawi się problem, aby ograniczyć zmienność wewnątrzosobniczą, myszy można testować przez dwa kolejne dni z tym samym zapachem. Wyniki można następnie uśrednić między dwoma dniami. Co ważne, kolejne testowanie odpowiedzi węchowej nie powinno znacząco wpływać na zachowania eksploracyjne¹⁴.

Jeśli chodzi o przygotowanie zapachu, roztwory muszą być przygotowywane w innym pomieszczeniu niż testowane, a eksperymentatorzy powinni mieć świadomość, że roztwór nie dyfunduje nadmiernie w pomieszczeniu behawioralnym. Na koniec, roztwory powinny być przygotowane na krótko przed badaniem i przechowywane w szklanej fiolce bez zapachu, tak aby zapach nie zanikł ani nie został zanieczyszczony. W przypadku niektórych zapachów, takich jak mocz samców i samic myszy, które są rzekomo bardzo pożądane, jeśli myszy kontrolne nie prezentują odczytów eksploracyjnych związanych z wysoce pozytywną wartościowością, należy sprawdzić rozwiązanie. W szczególności mocz myszy musi być świeżo pobrany od młodych myszy (w wieku maksymalnie 5 miesięcy) na krótko przed badaniem (maksymalnie 2-3 dni wcześniej) i przechowywany w temperaturze 4 °C w celu zachowania właściwości węchowych. Warto zauważyć, że zbieranie przez kilka kolejnych dni powinno zapobiec skutkom spowodowanym etapami cyklu rujowego u samic myszy. W razie potrzeby mocz można przechowywać w temperaturze -20 °C w celu dłuższego przechowywania, chociaż ta procedura nie jest zalecana, ponieważ znacznie zmniejsza intensywność zapachu. Podobnie, postrzegana przyjemność oleju arachidowego może być również zmienna, na przykład w zależności od partii lub marki. Co ważne, w komorach można dodać dwa odrębne zapachy lub zapachy o różnych stężeniach, zamiast "strefy kontrolnej" bez substancji zapachowych, w celu zmierzenia preferencji między dwoma roztworami zapachowymi.

Wreszcie, test preferencji węchowych można dostosować na różne sposoby, aby ulepszyć jego konstrukcję i poszerzyć jego potencjalne zastosowania. Rzeczywiście, oprócz odczytu motorycznego, ocena reakcji emocjonalnej za pomocą tego testu może być poprawiona poprzez połączenie różnych technik pomiaru różnych składników emocji⁶. Na przykład mikrofon ultradźwiękowy może być umieszczony obok areny, aby rejestrować wokalizacje ultradźwiękowe, które mogą być emitowane w odpowiedzi na pewne pozytywne i negatywne bodźce^24,39. Temperatura ciała może być również monitorowana za pomocą kamery na podczerwień lub wszczepialnego nadajnika telemetrycznego w czasie rzeczywistym 40,41,42. Niektóre z tych przekaźników są nawet w stanie uzyskać dostęp do częstości akcji serca i oddechu 43,44,45. Połączenie tych narzędzi pomogłoby w stworzeniu bardziej wyrafinowanej oceny behawioralnej reakcji emocjonalnej. Test preferencji węchowych można również łatwo połączyć z innymi technikami w celu dalszego wyjaśnienia mechanizmów neuronalnych stojących za dysregulacją emocjonalną, takimi jak optogenetyka, fotometria światłowodowa lub mini-scope obrazowanie na żywo lub zapisy elektrofizjologii in vivo. Wreszcie, protokół ten można łatwo przełożyć na praktykę kliniczną, integrując ocenę uprzedzeń sensorycznych i hedonicznej odpowiedzi węchowej w badaniach na ludziach, a nawet jako narzędzie diagnostyczne lub terapeutyczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2,4,5-trimetylotiazol	Sigma-Aldrich	W332518-100G-K
2-trans oktenalny	Sigma-Aldrich	Nr kat. 52464-1ML
Blu-tack	UHU powiedział:	N/A
Bibuła filtracyjna	Fisher Naukowy	11710125	42,5 milimetra
Szklana fiolka	HOLENDERSKA DOMINIKA	958983
Olej mineralny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M5904-500ML
Noldus Ethovision	Noldus Ethovision	Wersja 17.5	Alternatywnie można użyć Single Mouse Tracker w oprogramowaniu ICY o otwartym kodzie źródłowym lub Deeplabcut
szalka Petriego	Sokół	351007	Szalka Petriego 60 mm x 15 mm z 7 wykonanymi na zamówienie otworami o średnicy 5 mm
Arena z pleksiglasu	Wykonane na zamówienie	N/A	Arena z pleksiglasu o wymiarach 45 cm x 50 cm x 25 cm podzielona na dwie komory ścianą o wymiarach 37 cm x 25 cm pośrodku.