Artykuł metodologiczny

Powtarzalna produkcja SPOT jako wysokoprzepustowej platformy hodowlanej opartej na rusztowaniach

DOI:

10.3791/68405

⸱

29 lipca 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry, University of Toronto, 3Division of Engineering Science, University of Toronto

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten dokumentuje wytwarzanie i montaż SPOT, wysokoprzepustowej platformy hodowlanej opartej na rusztowaniach, w formatach 96- i 384-dołkowych. Szczegółowo opisuje również proces wysiewu dla SPOT, zarówno ręczny, jak i przy użyciu dostępnego na rynku urządzenia do obsługi cieczy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) są coraz częściej wykorzystywane w dziedzinie badań nad rakiem do modelowania nowotworów. Łączą one w sobie zalety modeli in vivo i tradycyjnych modeli in vitro , podsumowując złożoność i niejednorodność tkanek, a jednocześnie składając się z komórek ludzkich. Rozwój fizjologicznie reprezentatywnych modeli PDO spowodował zapotrzebowanie na urządzenia, które umożliwiają prostą analizę zachowania organoidów. Protokół ten wyjaśnia, jak złożyć i używać platformy SPOT (Scaffold-supported Platform for Organoid-based Tsites), wysokowydajnego, trójwymiarowego (3D) urządzenia do hodowli organoidów. Platforma ta eliminuje łąkotkę zwykle tworzoną przez hydrożele z nasionami, aby umożliwić dokładne, szybkie obrazowanie, podobne do procesu obrazowania w przypadku kultur dwuwymiarowych (2D). W rezultacie, organoidy i kokultury wysiane w SPOT można łatwo obrazować za pomocą mikroskopii wysokoprzepustowej. Zaprojektowany do użytku od ręki, SPOT jest dostępny dla badaczy z podstawowym doświadczeniem w hodowlach tkankowych i jest kompatybilny zarówno z ręcznymi, jak i automatycznymi przepływami pracy wysiewu. Protokół ten szczegółowo opisuje wytwarzanie SPOT w formatach 96- i 384-dołkowych, w tym instrukcje krok po kroku dotyczące montażu, wysiewu, kontroli jakości i rozwiązywania problemów. Podczas gdy produkcja wymaga 3-4 godzin, nie licząc czasu bezczynności, można jednocześnie produkować wiele płyt, co poprawia skalowalność. Usprawniając hodowlę i analizę PDO, SPOT zapewnia solidne narzędzie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i translacyjnych badań nad rakiem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo postępów w badaniach biomedycznych, opracowanie fizjologicznie istotnych testów in vitro pozostaje wyzwaniem. Idealny test powinien uwzględniać różnorodny zakres typów komórek, preparatów terapeutycznych, harmonogramów, oprzyrządowania komercyjnego i odczytów analitycznych, aby zaspokoić potrzeby badaczy z różnych dyscyplin. Jednak ze względu na brak odpowiednich narzędzi badacze często polegają na uproszczonych modelach, takich jak monowarstwy 2D unieśmiertelnionych linii komórkowych, które nie są w stanie oddać złożoności i znaczenia klinicznego, szczególnie w badaniach nad rakiem 1,2. Aby rozwiązać ten problem, biobankowanie nowotworów na dużą skalę i współpraca klinicystów przyczyniły się do opracowania wysoce wiernych modeli in vitro, takich jak organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów (PDO), które zachowują bardziej specyficzne dla pacjenta profile genetyczne i terapeutyczne w porównaniu z liniami komórkowymi 3,4,5. Tymczasem postępy w automatyzacji laboratoriów i odkrywaniu leków wymagają platform, które bezproblemowo integrują się z przepływami pracy o wysokiej przepustowości. Podczas gdy istniejące platformy zajmują się zarówno wiernością biologiczną, jak i skalowalnością, niewiele z nich było w stanie rozwiązać oba te wyzwania jednocześnie. Opracowywanie zautomatyzowanych, wysokoprzepustowych modeli, które replikują kluczowe cechy choroby, ma kluczowe znaczenie dla postępu badań biomedycznych i przyspieszenia generowania danych do zastosowań translacyjnych.

Wiele pojawiających się modeli ma na celu sprostanie wyzwaniom związanym z hodowlą wyspecjalizowanych typów komórek, takich jak PDO, o wysokiej przepustowości (ryc. 1). Standardowe platformy, na których organoidy są mieszane z hydrożelem na płytkach 96- lub 384-dołkowych, mają kilka ograniczeń: (i) duża objętość żelu komórkowego prowadzi do niespójnego dostępu do składników odżywczych, (ii) krzywizna łąkotki studni tworzy artefakty obrazowania i gradienty komórkowe, (iii) wysiew hydrożelu nie jest jednorodny we wszystkich partiach i personelu, (iv) niekompatybilność z automatyczną produkcją i zautomatyzowaną mikroskopią oraz (v) użycie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), która jest zwykle miękką i delikatną próbką ryzyka zniszczenie przy fizjologicznym zagęszczeniu tkanek lub włączenie typów komórek kurczliwych 1,9. Obecnie większość badań PDO na płytkach przeprowadza się albo przez ręczne wysiewanie żelu komórkowego na płytce10,11, albo metodą nakładania żelu, w której hydrożel rozcieńcza się mniej lepkim podłożem, a komórki odwirowuje się do dna studzienki w celu umieszczenia ich w odpowiedniej płaszczyźnie optycznej12,13. Oba podejścia nie zapewniają mechanicznego wsparcia dla długotrwałej kultury. Na podstawie naszych wcześniejszych obserwacji (dane niepublikowane), komercyjny hydrożel zmieszany z komórkami w standardowych płytkach studzienkowych kurczy się z powierzchni studni przez 9 z 12 dołków w ciągu 12 dni, podczas gdy metoda żelowo-nakładkowa nie ma fizjologicznych interakcji komórka-macierz. Ponadto powstałe kultury nie mogą być utrzymywane przez długi czas ze względu na ograniczenia przestrzenne w studni i są niekompatybilne z testami, które wymagają wysokiego stosunku odczynnika do pożywki komórkowej 14,15,16. Te praktyczne bariery utrudniają przyjęcie modeli 3D i ograniczają odtwarzalność doświadczeń w całej dziedzinie.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Ocena modeli kultur w oparciu o skalowalność i znaczenie biologiczne. Względne umiejscowienie różnych systemów hodowli in vitro i in vivo wzdłuż skalowalności (oś y), zdefiniowanej przez przepustowość płytki, i znaczenia biologicznego (oś x), podkreślające kompromisy między potencjałem przepustowości a wiernością fizjologiczną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zmotywowani tymi wyzwaniami, wysoka porowatość i mechaniczne wzmocnienie cienkiego rusztowania celulozowego zostały wykorzystane do opracowania platformy SPOT (Scaffold-supported Platform for Organoid-based Ttissue), dostępnej zarówno w formacie 96-, jak i 384-dołkowym. SPOT zawiera rusztowanie polimerowe o wstępnie wzorzystym wzorze przy użyciu wcześniej opracowanej metody infiltracji17, która pasuje do układu płytki, umożliwiając precyzyjne umieszczanie kropelek komórka-żel i zapewniając wsparcie strukturalne dla fazy hydrożelowej (ryc. 2A). Odprowadzanie kapilar do rusztowania prowadzi roztwór komórka-żel, tworząc mechanicznie wzmocnioną sieć biokompozytową (ryc. 2B). Ze względu na porowatą strukturę rusztowania, żel komórkowy infiltruje i tworzy cienką warstwę (o grubości około 70 μm), wymagającą dziesięciokrotnie mniejszej ilości żelu komórkowego do pokrycia dna studni14. Wykazano również zgodność SPOT z PDO gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) poprzez ocenę ich wzrostu za pomocą testów metabolicznych i pomiarów obrazowych. Od czasu swojego opracowania, SPOT wykazał się znaczną wszechstronnością i użytecznością dla badaczy zajmujących się hodowlą organoidów. Ponadto konstrukcja SPOT zapewnia przyjazną dla użytkownika skalowalność, ze zmniejszonymi objętościami odczynników i ulepszonymi możliwościami obrazowania dzięki płaskiej, pozbawionej menisku geometrii mikrożelu, zapewniając równomierną penetrację światła i dokładne obrazowanie o wysokiej zawartości14 (ryc. 2C,D). SPOT wspiera również kokulturę z innymi istotnymi typami komórek, takimi jak fibroblasty, w celu lepszego podsumowania mikrośrodowiska guza18.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Przegląd procesu pracy urządzenia 96-SPOT i analizy obrazu. (A) Schematyczne przedstawienie produkcji płyt SPOT: urządzenie jest montowane przez zestawienie komercyjnej płyty studziennej bez dna (na górze), rusztowania z wzorem PMMA (pokazanego na niebiesko) i folii poliwęglanowej (na dole) przy użyciu warstw dwustronnego kleju poliakrylowego (pokazanego na żółto). (B) Wysiewanie komórek do studni rusztowania: komórki są zawieszone w niespolimeryzowanym hydrożelu (pokazanym na różowo) i pipetowane do każdej studzienki, gdzie infiltruje rusztowanie. Hydrożel jest następnie pozostawiany do żelowania w celu zamknięcia komórek w hydrożelu podpartym rusztowaniu. (C) Mikroskopia: uzyskaną mikrotkankę można obrazować za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii szerokokątnej. (D) Analiza oparta na obrazie: Uzyskane obrazy komórek fluorescencyjnych (zielonych) zawieszonych w żelu można analizować przy użyciu standardowych potoków analizy obrazu. Reprezentatywny obraz mikroskopii epifluorescencyjnej komórek KP4 wykazujących ekspresję GFP w jednym dołku 96-SPOT. Podziałka wynosi 500 μm. Liczba ta została zmodyfikowana z14. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kolejną zaletą SPOT jest to, że system można zintegrować z urządzeniem do obsługi płynów typu open source, co ułatwia zautomatyzowane, powtarzalne wytwarzanie kultur PDO. To postęp zmniejsza zmienność użytkowników i wspiera złożone projekty eksperymentalne, w tym wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i podejścia medycyny spersonalizowanej18. Wcześniej wykazano również, że SPOT jest kompatybilny z multipleksowaną charakterystyką fenotypów komórkowych w heterogenicznych środowiskach nowotworowych opartą na pojedynczych komórkach i pobieraniem komórek na żądanie z SPOT przez trawienie18. Cechy te pozycjonują SPOT jako wszechstronne narzędzie do zastosowań przesiewowych, w których dane podłużne o wysokiej rozdzielczości są niezbędne do oceny skuteczności leku i zachowania komórek w fizjologicznie istotnych warunkach14,18. Łącząc te innowacje techniczne, projekt SPOT rozwiązuje krytyczne problemy z tradycyjnymi systemami hodowli 3D.

Protokół ten zawiera obszerny przewodnik dotyczący wytwarzania komponentów SPOT, montażu płytek i metod wysiewu w celu uzyskania solidnych i powtarzalnych kultur organoidów 3D. Zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące ręcznego wysiewu płytki za pomocą mikropipety oraz zautomatyzowanych procesów wysiewu z obsługą cieczy, która obsługuje zarówno formaty 96-, jak i 384-dołkowe. Ponadto protokół ten określa podstawowe środki kontroli jakości, takie jak weryfikacja jednolitej dystrybucji żelu i integralności rusztowania, w celu utrzymania wysokich standardów eksperymentalnych. Dostępne są również strategie rozwiązywania typowych problemów, takich jak niepełna infiltracja żelu, parowanie podczas siewu i odklejanie rusztowania, wyposażając badaczy w praktyczne rozwiązania optymalizujące ich przepływy pracy i osiągające wiarygodne wyniki.

SPOT został zaprojektowany w celu wypełnienia luk, z którymi borykają się tradycyjne testy organoidowe, w tym wyzwań związanych z wykonywaniem testów i zmianą pożywki przy jednoczesnym zachowaniu integralności żelu 10,11,12,13. Ogólnym celem tej metody jest wyprodukowanie platformy opartej na rusztowaniach, która wspiera hodowlę organoidów przez okres 12 dni. Ponadto metoda ta obejmuje również generowanie macierzy tkankowych w SPOT poprzez wysiew ręczny lub wspomagany przez ciecz, aby umożliwić użytkownikom wykonywanie dowolnych dalszych zakłóceń, w tym testów IC50 leków i badań przesiewowych małych cząsteczek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole jako przykład użyto organoidów gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC). Organoidy te zostały stworzone od pacjentów z PDAC, zakupionych w biobanku UHN w Princess Margaret Cancer Center (identyfikator PMLB PPTO.46 z University Health Network, Kanada) zgodnie z protokołem zgodnym z wytycznymi Rady ds. Etyki Badań Naukowych Uniwersytetu w Toronto (protokół #36107). Prosimy o zapoznanie się ze wszystkimi wymaganymi materiałami, odczynnikami i sprzętem w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie roztworu PMMA-aceton (czas: 20 min + ~ 8-16 h bezczynności)

UWAGA: Roztwór polimetakrylanu metylu (PMMA) i acetonu jest stosowany w SPOT do wyznaczania studni i zapobiegania wyciekom między odwiertami. Ogólna procedura polega na rozpuszczeniu stałego PMMA w acetonie. Wcześniej roztwór PMMA-acetonu użyto do ułożenia podobnego rusztowania papierowego w celu zablokowania mediów i wymiany gazowej w celu uzyskania hipoksji w innym modelu hodowli 3D17. W tym przypadku formuła PMMA-aceton jest przystosowana do generowania rusztowań infiltrowanych PMMA do produkcji SPOT.

  1. Do oznaczonej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml dodaj 1,75 g proszku PMMA. Następnie do dygestorium dodaj 7,84 ml acetonu i szczelnie zamknij rurkę, aby uniknąć odparowania rozpuszczalnika.
  2. Jeśli potrzebna jest wizualizacja wzoru polimerowego, dodaj 5-10 kropli lakieru do paznokci do roztworu. Zamknij szczelnie probówkę wirówkową. Ręcznie potrząśnij tubką, aby rozpocząć mieszanie lakieru z roztworem PMMA i acetonu.
    UWAGA: Aby zachować spójność w wielu partiach kreślenia, rozcieńczyć znaną ilość lakieru do paznokci w acetonie, a następnie odpipetować ten roztwór jako 7,84 ml acetonu.
  3. Umieść roztwór PMMA-aceton na noc w mieszalniku wirowym, aby upewnić się, że roztwór się rozpuści. Roztwór PMMA-acetonu należy przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 2 tygodnie, jeśli nie został otwarty.

2. Wykonywanie rusztowań z infiltracją PMMA

(Czas: dla wzoru 96-SPOT: 15 min konfiguracji + 6 min na rusztowanie; dla wzoru 384-SPOT: 15 min konfiguracji + 10 min na rusztowanie)

UWAGA: Produkcja rusztowań infiltrowanych PMMA dla 96-/384-SPOT odbywa się wyłącznie na stole warsztatowym (środowisko niesterylne). Aby wykonać rusztowania 96/384-SPOT, należy upewnić się, że zainstalowano odpowiednie oprogramowanie plotera do edycji grafiki lub bibliotekę sterowania ploterem wektorowym.Należy pamiętać, że niektóre podsekcje procedury mają zastosowanie zarówno do 96-SPOT, jak i 384-SPOT, podczas gdy inne są specyficzne dla jednego rozmiaru płytki. W tym drugim przypadku prezentowane będą opcje A (dla 96-SPOT) i B (dla 384-SPOT). W przypadku wzoru (A) 96-SPOT istnieją trzy warstwy; po pierwsze, linie zasysające zapewniają stały przepływ roztworu PMMA-acetonu; po drugie, tablica 96 okręgów; Na koniec wzorzec komiwojażera (TSP) kreśli przestrzenie między odwiertami. W przypadku wzoru (B) 384-SPOT pierwszy moduł zawiera linie gruntowania; po drugie, granica otaczająca płytę studzienki; Na koniec wykreślana jest siatka w taki sposób, aby pozostały 384 regiony. W przypadku obu wzorców rozmiary studni można kontrolować, zmieniając kod źródłowy, jak wykazano w Li i wsp.14.

  1. Przygotowanie do procesu infiltracji rusztowania
    1. Pozostawić roztwór PMMA-aceton (przechowywany w temperaturze 4 °C) na 10 minut w temperaturze pokojowej. Pozostaw uchwyt probówki do momentu rozpoczęcia kreślenia.
    2. Podłącz ploter do zasilania za pomocą zasilającego. Zielona lampka wskazuje, że urządzenie jest włączone. Podłącz USB plotera do wyznaczonego komputera w celu drukowania.
    3. Przykryj sztalugę klipsa kawałkiem pergaminu. Upewnij się, że cała powierzchnia sztalugi jest pokryta.
      1. Aby ułatwić drukowanie wzorów 96-/384-SPOT, przygotuj szablon 96-/384-SPOT na arkuszu papieru do drukarki. Wykonaj kroki 2.2-2.3 za pomocą długopisu zamiast strzykawki i papieru do drukarki zamiast papieru pergaminowego i filtra do herbaty. Gdy szablon będzie gotowy, umieść go na sztaludze z klipsem i przykryj pergaminem. Przejdź do kroku 2.2 i postępuj zgodnie z protokołem, aby wykonać rusztowania 96-/384-SPOT.
    4. Zacisnąć pergamin na sztaludze za pomocą spinaczy do segregatorów (Rysunek 3A). Weź arkusz rusztowania (tj. bibułę filtracyjną do herbaty) i przetnij wzdłuż boków, w których dwie warstwy są ze sobą połączone (rysunek 3B).
    5. Umieść przecięty filtr do herbaty - zwany dalej rusztowaniem papierowym - na sztaludze z klipsem, gładką stroną (zewnętrzna strona filtra do herbaty) do góry. Zaciśnij go z trzech stron. Upewnij się, że rusztowanie papierowe jest całkowicie spłaszczone na sztalugi z klipsem; W obszarze kreślenia nie może być żadnych zmarszczek.
  2. Wykreślanie wzoru 96/384-SPOT
    1. Aby skonfigurować oprogramowanie plotera i złożyć plik dla 96-SPOT, postępuj zgodnie z opcją 2.2.2; Aby zainstalować oprogramowanie i złożyć plik dla 384-SPOT, postępuj zgodnie z opcją 2.2.3.
    2. Konfiguracja oprogramowania plotera i pliku do drukowania 96-SPOT
      1. W aplikacji otwórz plik SVG dla 96-SPOT (Plik uzupełniający 1; Rysunek 4A). Na pasku menu przejdź do opcji Rozszerzenia > Sterowanie ploterem (Rysunek 4B).
      2. Gdy pojawi się nowe okno, dostosuj ustawienia, aby pasowały do rysunku uzupełniającego 1. Wróć do zakładki Wykres w oknie Rozszerzenie sterowania ploterem. Zostaw to otwarte na później.
    3. Konfiguracja interfejsu API biblioteki sterowania ploterem wektorowym i pliku do drukowania 384-SPOT
      1. Otwórz okno wiersza polecenia (Windows) lub Terminal (Mac). Wprowadź polecenie, aby uruchomić wyznaczony interaktywny notes obliczeniowy. Upewnij się, że notes zostanie otwarty w przeglądarce.
      2. Wybierz plik kodu 384-SPOT (Plik uzupełniający 2), aby go otworzyć. Używając końcówki 20G (lub końcówki 16G dla wzoru 384-SPOT), odessać 1 ml roztworu PMMA-acetonu za pomocą strzykawki kreślącej o pojemności 3 ml (Rysunek 3C).
        UWAGA: Zawór sterujący przepływem między strzykawką ładującą 10 ml a rurką EVA musi być otwarty (równolegle do cylindra). Ponieważ proces infiltracji jest napędzany grawitacyjnie, należy upewnić się, że strzykawka do kreślenia o pojemności 3 ml jest zawsze napełniona między oznaczeniem 0,5-1,5 ml, aby utrzymać stałą objętość dozowania podczas kreślenia.
    4. Podczas gdy końcówka strzykawki kreślącej o pojemności 3 ml nadal znajduje się w roztworze PMMA i acetonu, zamknij zawór sterujący przepływem między strzykawką ładującą 10 ml a rurką EVA (ustawić ją prostopadle do cylindra).
    5. Szybko zamknij rurkę z roztworem PMMA-acetonu. Załadować strzykawkę o pojemności 3 ml na uchwyt wstrzykiwacza. Wyregulować wysokość strzykawki w stosunku do uchwytu, aby uzyskać następujące wyrównanie (Rysunek 3D).
    6. Dostosuj położenie sztalugi klipsa tak, aby końcówka strzykawki o pojemności 3 ml spoczywała w punkcie początkowym naniesionego wzoru (tj. w ciemnej kropce w lewym górnym rogu wzoru szablonu). Podnieś uchwyt pióra plotera z dołączoną do niego strzykawką, aby wsunąć sztalugę z klipsem pod spód.
    7. Szybko odłączyć strzykawkę o pojemności 10 ml od rurki, aby ciśnienie atmosferyczne wywarło nacisk na roztwór PMMA-aceton przechowywany w strzykawce kreślącej o pojemności 3 ml. Otwórz zawór sterujący przepływem.
    8. Aby rozpocząć kreślenie wzoru 96-SPOT, wykonaj kroki 2.2.9; Aby rozpocząć kreślenie 384-SPOT, wykonaj krok 2.2.10.
    9. Rozpocznij kreślenie 96-SPOT w wyznaczonym ploterze, jak opisano poniżej.
      1. W oprogramowaniu kliknij przycisk Apply (Zastosuj ) w sekcji Rozszerzenia sterowania plotera. Ploter zacznie teraz działać, kreśląc wzór PMMA. Nie są wymagane żadne dalsze działania, dopóki drukowanie nie zostanie zakończone, a uchwyt pióra plotera nie powróci do pozycji wyjściowej.
      2. Aby zatrzymać ploter podczas drukowania, naciśnij mały srebrny przycisk po lewej stronie plotera. Następnie, za pomocą karty Rozszerzenia sterowania ploterem > Wznów , w oprogramowaniu graficznym wybierz wznowienie drukowania od miejsca, w którym zostało zatrzymane, lub powrót uchwytu pióra do pozycji wyjściowej (Rysunek uzupełniający 1C(iii)).
    10. Rozpocznij drukowanie 384-SPOT w wyznaczonym interfejsie obliczeniowym, jak opisano poniżej.
      1. W interfejsie kliknij Uruchom ponownie jądro i uruchom ponownie (podwójna strzałka na pasku narzędzi). Kod zacznie teraz działać, kreśląc wzorzec PMMA. Nie są wymagane żadne dalsze działania, dopóki wzór nie zostanie zakończony podczas drukowania, a uchwyt pióra nie powróci do pozycji wyjściowej.
      2. Aby zatrzymać ploter podczas drukowania, naciśnij mały srebrny przycisk po lewej stronie plotera. Ręcznie przesuń głowicę drukującą maksymalnie do tyłu i w lewo, aby osiągnęła pozycję początkową. Podłącz ponownie ploter do zasilania. W przeciwieństwie do wykreślania 96-SPOT, nie ma możliwości wznowienia kreślenia dla 384-SPOT od miejsca, w którym zostało wstrzymane; Zamień rusztowanie papierowe i rozpocznij kod od początku.
  3. Rozładowywanie strzykawki i sprzątanie
    1. Po zakończeniu kreślenia ponownie podłącz strzykawkę o pojemności 10 ml do rurki. Wyjąć strzykawkę o pojemności 3 ml z uchwytu pisaka plotera i przenieść pozostały roztwór PMMA-aceton z powrotem do fiolki podstawowej lub wyrzucić, jeśli podczas poprzednich etapów nastąpiło znaczne parowanie.
    2. Umyć cylinder strzykawki o pojemności 3 ml przez pipetowanie acetonu. Pozostawić rurkę strzykawki do wyschnięcia na powietrzu przed powrotem do miejsca przechowywania.
    3. Ostrożnie odkręć rusztowanie SPOT od sztalugi z klipsem.
    4. Sprawdź rusztowania SPOT wykreślone, aby upewnić się, że można je wykorzystać do eksperymentów (Rysunek 3E,F). Wskazówki można znaleźć w Tabeli 1 dotyczącej rozwiązywania problemów oraz w Tabeli 2 i Tabeli 3 dotyczącej zapewniania i kontroli jakości.
    5. Przechowuj wszystkie rusztowania z PMMA w torbie z zamkiem błyskawicznym w chłodnym, suchym miejscu.

3. Cięcie taśmy 96/384-dołkowej

(Czas: dla wzoru 96-punktowego: 15 minut na 5 sztuk taśmy; dla wzoru 384-punktowego: 30 minut na 5 sztuk taśmy)

UWAGA: Jest to jeden z najbardziej wydajnych sposobów precyzyjnego i wydajnego cięcia taśm, szczególnie w przypadku wzorów taśm 384-dołkowych. Metoda ta daje również możliwość grawerowania laserowego jednej warstwy taśmy (plastikowej górnej okładki) w celu poprawy użyteczności podczas procesu montażu. Alternatywnie, taśmy można również ciąć za pomocą nożyc do papieru w wolniejszym tempie bez procesu grawerowania.

  1. Otwórz plik do cięcia laserowego wzoru taśmy 96-/384-dołkowej (plik uzupełniający 3, plik uzupełniający 4) i załaduj wzór drukowania zakodowany trzema różnymi kolorami do oprogramowania do cięcia laserowego, klikając przycisk Drukuj z następującymi ustawieniami na rysunku uzupełniającym 2A.
  2. Załaduj kawałek taśmy na powierzchnię wycinarki laserowej i upewnij się, że taśma jest gładko spłaszczona na powierzchni. Użyj taśm papierowych lub ciężkich ciężarów, aby przytrzymać taśmy podczas cięcia.
    UWAGA: Upewnij się, że taśma jest płaska na powierzchni wycinarki laserowej. Wszelkie nierówności mogą mieć wpływ na jakość ciętych taśm, szczególnie taśm 384-dołkowych.
  3. Dostosuj położenie wzoru drukowania, aby wyrównać go z położeniem taśmy w oparciu o instrukcję obsługi wycinarki laserowej.
  4. Wytnij obie taśmy 96-/384-dołkowe przy użyciu tego samego ustawienia wycinarki laserowej, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 2B. Ważna jest kolejność linii o określonych kolorach. Najpierw przetnij czerwoną linię przed zieloną linią. Na końcu wytnij niebieski kolor.
    Czerwona linia: tryb Rast/Vest z 45% mocą lasera, 80% prędkością, 1000 PPI i osią Z 0,50 mm.
    Zielona linia: tryb Rast/Vest z 7% mocą lasera, 100% prędkością, 1000 PPI i osią Z 0,50 mm.
    Niebieska linia: tryb Rast/Vest z 50% mocą lasera, 80% prędkością, 1000 PPI i osią Z 0,50 mm.
  5. Przechowuj wzorzyste taśmy w odpowiedni sposób do momentu montażu SPOT.

4. Montaż 96/384-SPOT (czas: 1 h)

UWAGA: W tej sekcji szczegółowo opisano procedurę montażu urządzeń 96-/384-SPOT w sterylnym środowisku, takim jak komora bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Alternatywnie, urządzenia 96-/384-SPOT mogą być wstępnie zmontowane w niesterylnym środowisku, a następnie wysterylizowane w procesie sterylizacji gazem etylenu.

  1. Przygotowanie rusztowania SPOT do montażu
    1. Weźmy rusztowanie z wzorem PMMA dla 96- lub 384-SPOT. Wytnij nadmiar papieru wokół niebieskiego obszaru rusztowania. Pozostaw 5 mm białej przestrzeni na obwodzie niebieskiego obszaru. Wynikowy arkusz będzie miał wymiary około 760 mm x 1300 mm.
      UWAGA: Nie odcinać przewodu zalewowego. Jest to przydatne w określaniu, która strona rusztowania jest szorstka/gładka (rysunek 3E,F).
    2. Aby przygotować rusztowanie 96-punktowe do montażu, wykonaj krok 4.1.3. Aby przygotować rusztowanie 384-SPOT, wykonaj krok 4.1.4.
    3. Wykonać perforację przestrzeni międzydołkowych na rusztowaniu 96-SPOT.
      1. Połóż kawałek folii polietylenowej (1000 mm x 1500 mm) na sztywnym wsporniku akrylowym (2700 mm x 2700 mm). Umieść wspornik pokryty folią polietylenową na powierzchni roboczej i połóż rusztowanie na folii polietylenowej (Rysunek 5A).
      2. Wyrównaj krawędź linijki między pierwszymi dwoma rzędami w taki sposób, aby śledzenie wzdłuż tej krawędzi nie prowadziło do studni.
      3. Przyłóż koło śledzące do linijki u dołu rusztowania. Przetocz koło śledzące w górę na szczyt rusztowania, używając linijki, aby poprowadzić ścieżkę ostrza. Powtórz to dla wszystkich odstępów międzyrzędziowych na rusztowaniu (tj. 7x).
      4. Powtórz kroki 4.1.3.2 i 4.1.3.3 dla co drugiej przestrzeni międzykolumnowej, zaczynając od odstępu między dwiema pierwszymi kolumnami.
    4. Nie przeprowadzaj perforacji przestrzeni międzydołkowych na rusztowaniu 384-SPOT, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
      1. Nie należy perforować przestrzeni międzydołkowych rusztowania 384-SPOT. Przejdź bezpośrednio do kroku 4.2.
  2. Sterylizacja materiałów SPOT i sprzętu montażowego
    1. Umieść wydrukowane rusztowanie, dwie taśmy 96-dołkowe (lub taśmy 384-dołkowe), 96-dołkową płytkę bez dna (lub 384-dołkową płytkę bez dna), 96-dołkową pokrywę płytki (lub 384-dołkową pokrywę płytki), folię poliwęglanową, płytę polidimetylosiloksanu (PDMS), zamykaną plastikową torbę, pęsetę i precyzyjny nóż w BSC, UV na 20 minut z jednej strony (Rysunek 5B).
    2. Odwróć wszystkie materiały i sprzęt montażowy na drugą stronę i UV przez kolejne 20 minut.
  3. Mocowanie rusztowania do pierwszej taśmy 96/384-dołkowej
    1. Połóż rusztowanie szorstką stroną do góry (Rysunek 3F) na płycie PDMS, tak aby rzędy przebiegały poziomo. Użyj linii zalewania, aby określić, która strona jest szorstka (linia gruntowania wyrównana do prawej oznacza szorstką stroną do góry).
    2. Wygładź rusztowanie na płycie PDMS tak, aby na rusztowaniu (lub pod) nie było zmarszczek ani pęcherzyków. Usuń warstwę ochronną z niegrawerowanej strony taśmy dwustronnej. Lekko zapnij środek taśmy i wyrównaj dwie środkowe kolumny taśmy z rusztowaniem.
    3. Po wyrównaniu dociśnij środek taśmy w dół. Wygładź taśmę na rusztowaniu, zaczynając od środka i przesuwając się na zewnątrz.
      UWAGA: Nieprawidłowo ustawione rusztowanie będzie miało wyraźny wzór PMMA nakładający się na obszar dobrze wysiewu.
    4. Użyj pęsety, aby ostrożnie usunąć rusztowanie z płyty PDMS i przechowywać płytę do przyszłej produkcji.
  4. Mocowanie rusztowania do drugiej taśmy 96/384-dołkowej
    1. Umieść rusztowanie na stole warsztatowym. Odwróć rusztowanie tak, aby gładka strona (strona niezaklejona taśmą) była skierowana do góry.
    2. Usuń środkową warstwę ochronną z wygrawerowanej strony drugiej taśmy. Upewnij się, że dwie środkowe kolumny taśmy są odsłonięte. Jeśli używana jest taśma bez graweru, całkowicie usuń warstwę ochronną z jednej strony.
    3. Lekko zapnij środek taśmy i wyrównaj dwie środkowe kolumny taśmy z rusztowaniem.
    4. Po wyrównaniu taśmy z rusztowaniem dociśnij środek taśmy w dół. Jeśli używany jest grawerowany wzór taśmy, usuń pozostałe dwie warstwy ochronne przylegające do odsłoniętej środkowej części taśmy. Wygładź taśmę na rusztowaniu, zaczynając od środka i przesuwając się na zewnątrz.
  5. Mocowanie rusztowania do płyty bez dna
    1. Usuń warstwę ochronną taśmy z szorstkiej strony rusztowania. Jeśli używasz grawerowanej taśmy, usuń tylko środkową warstwę ochronną.
    2. Dopasuj rusztowanie do spodu płyty bez dna (z pokrywką). Po wyrównaniu dociśnij środek rusztowania do spodu płyty. Jeśli używasz grawerowanego wzoru, usuń warstwy ochronne przylegające do odsłoniętego środka. Wygładź rusztowanie na talerzu od środka na zewnątrz.
  6. Mocowanie rusztowania do folii poliwęglanowej
    1. Za pomocą pęsety ostrożnie poluzuj warstwę ochronną folii poliwęglanowej. Po poluzowaniu powoli oderwij warstwę ochronną od folii. Nie twórz wgłębień w folii, ponieważ wpłynie to na jej właściwości optyczne podczas obrazowania mikroskopowego.
    2. Powtórz krok 4.6.1 z drugą stroną folii poliwęglanowej. Po usunięciu obu warstw ochronnych odłóż folię na stół warsztatowy.
    3. Usuń warstwę ochronną z taśmy przymocowanej do dna płyty. Dociśnij folię poliwęglanową do rusztowania, zaczynając od środka na zewnątrz.
    4. Mocno dociśnij folię poliwęglanową do dna płyty, tak aby wszystkie studzienki uzyskały dobrze wyraźną granicę.
    5. Za pomocą precyzyjnego noża ostrożnie odetnij nadmiar materiału z dna płyty.
      UWAGA: Zwróć szczególną uwagę, aby nie przeciąć płyty ani żadnego z dołków. Jeśli nóż nie przecina się łatwo, sprawdź, czy nie wcina się w płytę.
  7. Przechowywanie 96/384-SPOT po montażu
    1. Po całkowitym zmontowaniu 96-SPOT umieść go w przezroczystej, zamykanej plastikowej torbie. Wynieś torbę na zewnątrz BSC.
    2. Umieść sztywny akrylowy wspornik na spodniej stronie płyty. Clamp akrylowy wspornik do płyty w przeciwległych rogach (Rysunek 5C). Trzymaj clamped przez co najmniej 30 minut na każdym rogu przed użyciem.
    3. Przechowuj płytkę w czystym, suchym miejscu do czasu użycia.

5. Siew 96/384-SPOT (czas: 2 h 45 min)

UWAGA: Ta sekcja szczegółowo opisuje procedurę wysiewu urządzeń 96-/384-SPOT w celu stworzenia jednolitych mikrotkanek 3D. Proces wysiewu polega na starannym dozowaniu określonej objętości żelu komórkowego (np. 5 μL dla 96-SPOT lub 2 μL dla 384-SPOT) na wstępnie zmontowane rusztowanie SPOT. Aby zapewnić równomierną infiltrację i rozprowadzenie żelu, kropla komórka-żel jest prowadzona wzdłuż porowatej struktury rusztowania przez odprowadzanie naczyń włosowatych. Ten krok może być wykonany ręcznie za pomocą mikropipety lub zautomatyzowany z obsługą cieczy. Po wysianiu płytki są inkubowane w temperaturze 37 °C, aby umożliwić polimeryzację żelu i enkapsulację komórek.

  1. Przygotowanie płytki 96/384-SPOT
    1. Odkręć 96-/384-SPOT i zdejmij akrylową podporę od dołu.
    2. W BSC wyjmij SPOT z plastikowej torby. Włącz UV, aby wysterylizować wnętrze płytki i przykryj na 20 minut, a następnie zamknij pokrywkę i odwróć na dno płytki na kolejne 20 minut obróbki UV.
    3. Odpipetować 70 μl PBS do każdej przestrzeni międzydołkowej płytki 96-punktowej. Nie pipetować PBS do płytki 384-SPOT. Schłodzić talerz w temperaturze 4 °C przez co najmniej 30 minut przed siewem.
  2. Przygotowanie komórek
    1. Oderwij komórki od kolb hodowlanych lub organoidy od kopułek żelowych zgodnie z zaleceniami i policz ilość komórek za pomocą hemocytometru zgodnie z instrukcjami producenta. Zanotować gęstość komórek w zawiesinie komórek (tj. liczbę komórek na ml) w celu obliczenia objętości zawiesiny komórek wymaganej dla kroków 5.4.1-5.4.2 w oparciu o pożądaną gęstość wysiewu.
  3. Przygotowanie żelu
    1. Postępując zgodnie z instrukcją przygotowania hydrożelu zoptymalizowaną wcześniej 17,19,20,21, utwórz hydrożel, dozując 1 ml 3 mg/ml kolagenu bydlęcego typu 1 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Składniki i powstałą mieszaninę należy przechowywać na lodzie przez cały czas przygotowania.
    2. Dozować 125 μl 10x stężonej minimalnej pożywki niezbędnej (MEM) do kolagenu bydlęcego. Powoli pipetuj w górę i w dół, aby mieszać, aż mieszanina zmieni kolor z różowego na żółty.
    3. Dozować 8 μl 0,8 M wodorowęglanu sodu do mieszaniny kolagenu bydlęcego. Powoli pipetuj w górę i w dół, aby mieszać, aż mieszanina stanie się bladoróżowa. Użyj zmieszanego roztworu w ciągu 30 minut od przygotowania, aby zapewnić spójne żelowanie w wielu eksperymentach.
      UWAGA: Jeśli mieszanina pozostaje żółta, miareczkować roztwór do pH 7, dodając 0,8 M w podwielokrotnościach 0,5 μl, aż do uzyskania jasnoróżowego koloru. OPCJONALNIE: Postępując zgodnie z tą samą procedurą, można przygotować żel do hodowli wymagających wyższego stężenia kolagenu. Do hodowli organoidów należy użyć mieszanki hydrożelowej scharakteryzowanej przez Landon-Brace i wsp.17.
  4. Zawiesina komórek w żelu
    1. Objętość zawiesiny komórkowej wymaganą do uzyskania docelowej gęstości żelu komórkowego należy odsysać do probówki do mikrowirówki i wirować przy 300 x g przez 5 minut.
    2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w żelu (objętość zmienia się w zależności od stężenia docelowego)
  5. Ręczny wysiew talerza 96-/384-SPOT
    1. Umieść płytkę 96-/384-SPOT na zamrożonym woreczku z lodem. Aby wysiać 96-SPOT, wykonaj kroki 5.5.2. Aby wysiać 384-SPOT, wykonaj kroki 5.5.3.
    2. Ręczny wysiew 96-SPOT
      1. Wstępnie pokryj końcówkę pipety o pojemności 10 μl mieszaniną komórek i żelu. Odessać 5 μl żelu za pomocą pipety o pojemności 20 μl i wyrzucić do pierwszego oporu, aż na końcówce utworzy się kropla. Przyłóż kroplę do środka studzienki.
        UWAGA: Wyrzucenie żelu poprzez dociśnięcie pipety do drugiego oporu może spowodować powstanie pęcherzyków powietrza. Wszystkie dołki muszą zostać wysiane w ciągu 5 minut, aby zapewnić równomierne żelowanie między dołkami.
      2. Po wysianiu wszystkich pożądanych dołków przykryć płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi polimeryzacji żelu. Dozować 200 μl pożywki do każdej studzienki z nasionami i inkubować przez co najmniej 1 nieprzerwaną godzinę przed wymaganym obrazowaniem lub zakłóceniami.
    3. Ręczny wysiew 384-SPOT
      1. Wstępnie pokryj końcówkę pipety o pojemności 10 μl mieszaniną komórek i żelu. Odessać 2 μl żelu za pomocą pipety o pojemności 10 μl i wyrzucić do pierwszego oporu, aż na końcówce utworzy się kropla.
        UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie pipety wielokanałowej o pojemności 10 μl.
      2. Przyłóż kroplę do środka studzienki. Po wysianiu wszystkich pożądanych dołków przykryć płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi polimeryzacji żelu.
      3. Dozować 60 μl pożywki do każdej studzienki z nasionami i inkubować przez co najmniej 1 godzinę bez przerwy przed wymaganym obrazowaniem lub zakłóceniami.
    4. Siew 96/384-SPOT za pomocą płynnego uchwytu
      1. Podczas przygotowywania mieszaniny komórkowo-żelowej włącz obsługę cieczy i jej moduł filtra HEPA na wysoki poziom. Ostrożnie rozpyl 70% etanolu wewnątrz pojemnika na płyny i wytrzyj go ręcznikami papierowymi nasączonymi etanolem.
      2. Przed przystąpieniem do kalibracji głowicy pipety należy załadować protokół wysiewu 96-SPOT lub 384-SPOT (plik uzupełniający 5 lub plik uzupełniający 6). Zainstaluj moduły temperatury w gniazdach 1 i 4 (Rysunek 6A).
      3. Do kalibracji należy używać wyznaczonych pudełek z końcówkami filtrów P20 i P200. Załaduj je odpowiednio do gniazd 5 i 6 (Rysunek 6B). Skalibruj głowicę pipety na podstawie monitów wyświetlanych w oprogramowaniu. Po kalibracji przełącz się na sterylną skrzynkę końcówek filtra P20 i P200 w celu wysiewu na szczelinach 5 i 6. Ponownie spryskaj powierzchnię 70% etanolem i zamknij drzwiczki do momentu wysiewu.
        UWAGA: Konieczne jest dokładne skalibrowanie końcówek do górnej części płytki 96-/384-SPOT. Zaleca się użycie taśmy uszczelniającej do płyt, aby ułatwić wizualizację osi z końcówek względem górnej części płyty. Idealna pozycja to taka, w której wszystkie końcówki głowicy wielokanałowej stykają się z taśmą uszczelniającą płytkę i tworzą niewielkie wgniecenie.
    5. Włącz oba moduły temperatury i ustaw je na 4 °C, podczas gdy ogniwa znajdują się na ostatnim etapie wirowania podczas przygotowywania mieszaniny komórkowo-żelowej. Po zakończeniu kroku 5.4 załaduj żądaną ilość mieszaniny komórkowo-żelowej do każdej probówki z 8 paskami 0,2 ml PCR wewnątrz BSC.
      UWAGA: Minimalna objętość mieszaniny komórkowo-żelowej, którą należy załadować do każdej probówki, wynosi: 96-SPOT: 5 μL pomnożone przez liczbę kolumn, które należało wysiać, plus objętość martwą; 384-SPOT: 2 razy 2 μL pomnożone przez liczbę kolumn, które musiały zostać wysiane razy, a następnie plus objętość martwa. Zaleca się, aby martwa objętość wynosiła około 10 - 20 μl na probówkę, aby uniknąć pęcherzyków i niekompletnych kolumn pod koniec.
    6. Zamknij 8-paskowe probówki PCR o pojemności 0,2 ml za pomocą 8-paskowych płaskich nakrętek przed przeniesieniem mieszaniny komórek i żelu z BSC na lodzie.
    7. Załaduj wstępnie schłodzoną płytkę SPOT na moduł temperatury w gnieździe 4 z blokiem formatującym płytę z płaskim dnem (Rysunek 6B).
    8. Załaduj 8-paskowe probówki PCR o pojemności 0,2 ml z mieszaniną komórkowo-żelową na moduł temperatury w gnieździe 3 z blokiem formatu 96-dołkowego.
    9. Otwórz płaskie nakrętki i pokrywę płytki SPOT i przechowuj je w pojemniku do obsługi cieczy, ale z dala od używanych szczelin. Otwórz pokrywę pudełka końcówek filtra P20 i P200.
    10. Uruchom protokół. Po wysianiu wszystkich pożądanych dołków przykryć płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi polimeryzacji żelu.
    11. Dozować 200 μl lub 60 μL (96-/384-SPOT) pożywki do każdego dołka z nasionami i inkubować przez co najmniej 1 godzinę bez przerwy przed wymaganym obrazowaniem lub zakłóceniami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzór z PMMA na rusztowaniu papierowym służy jako fizyczna bariera zapobiegająca wymianie treści między studniami. Taka konstrukcja ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że sąsiednie studzienki pozostają izolowane chemicznie i biologicznie, zapobiegając niezamierzonej dyfuzji pożywki, leków, wydzielanych czynników, a nawet komórek14. Włączenie PMMA pozwala na precyzyjną podział na przedziały, dzięki czemu SPOT jest niezawodną platformą do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i badań współkultur...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym protokole znajduje się szczegółowy przewodnik dotyczący wytwarzania i stosowania 96- i 384-dołkowego SPOT, obejmujący montaż, ręczny i wspomagany płynem wysiew żelu komórkowego. W przeciwieństwie do tradycyjnych systemów zatyczek hydrożelowych, SPOT eliminuje artefakty związane z łąkotką, ułatwiając nieniszczące obrazowanie organoidów in situ, jak opisano wcześniej 14,16,22. Dodatkowo rusztowanie zapewnia w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za pomoc Jennifer Lam w pozyskiwaniu obrazu. Rysunek 1, Rysunek 2 i Rysunek 7A zostały utworzone za pomocą BioRender.com. Praca ta była wspierana przez grant Discovery Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) (grant #RGPIN-2021-03488) dla APM; program Canada First Research Excellence (CFREF) Medicine by Design Grand Questions dla A.P.M.; Stypendia dla absolwentów NSERC Canada - program doktorancki dla RC; Nagroda Fundacji Charytatywnej Peterborough K.M. Hunter dla R.C.; stypendium CRAFT Narodowej Rady ds. Badań Naukowych (NRC) przyznane N.T.L.; NSERC CREATE TOeP do N.T.L.; Nagroda Naukowa dla Studentów Studiów Licencjackich NSERC dla Z. K.; oraz Nagroda Doskonałości Uniwersytetu w Toronto dla CMT

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki PCR 0,2 ml (paski po 8 sztuk) Sarstedt powiedział:72.985.002
Probówka wirówkowa 1,5 mlFroggaBio powiedział:Zobacz materiał LMCT1.7B
1000-μ Końcówki do pipet LZaćmienie4-1019-260-000
Pipety serologiczne 10 mlFroggaBio powiedział:394010
Strzykawka 10 mlBD, Kanada302995
10x Minimalna pożywka (MEM 10x)Gibco (firma Gibco)11430030
Talerz 150 mmCorning430599
Końcówki dozujące o rozmiarze 16 ze złączem Luer lockMcMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone6699A2
20 i mikro; L stojaki na końcówki filtrówOtwarte trony999-00099
200 i mikro; L stojaki na końcówki filtrówOtwarte trony999-00081
200-μ Końcówki do pipet LZaćmienie4-1030-260-000
Końcówki dozujące o rozmiarze 20 z przyłączem Luer lockMcMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone6699A4
384-dołkowa płytka bez dna ()Greiner82051-544
Strzykawka 3 ml BD, Kanada309657
Stożkowa probówka wirówkowa o pojemności 50 mlFirma VWRCA21008-940
Stożkowa probówka wirówkowa o pojemności 50 mlFirma VWRCA21008-940
96-dołkowa płytka bez dna ()Greiner82050-714
AcetonFisher NaukowyA18-1
Waga analitycznaN/AN/A
Rozszerzenie AxiDraw dla Inkscape (https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation)N/AN/A
Interfejs API AxiDraw w Pythonie (https://axidraw.com/doc/py_api/#installation) N/AN/A
AxiDraw V3 Wysokowydajna osobista maszyna do pisania i rysowaniaŹli szaleni naukowcy, Stany ZjednoczoneN/A
Kolagen bydlęcy (PureCol 3 mg/ml)Zaawansowana BioMatrix5005
Linia komórkowa do wyboruN/AN/A
Sztaluga z klipsem (zawarta w pakiecie AxiDraw V3)Źli szaleni naukowcy, Stany ZjednoczoneN/A
Wybrane podłoża hodowlaneN/AN/A
Taśma ochronna zatrzymująca brud3 mln6851 PN36851
Dwustronna taśma klejąca poliakrylowa (800 mm x 1200 mm)Badania nad klejami, ARcare90106NB
Surowica płodowa bydlęca (FBS)Gibco (firma Gibco)12483-020
Filtry do herbaty Finum XL Riensch & Held GmbH & Co. KG, Hamburg, Niemcy420.69.00
Płaskie nakrętki do probówek PCR 0,2 ml (paski po 8 sztuk)Sarstedt powiedział:65.989.002
Wytrzymałe zaciski sprężynowe z tworzywa sztucznegoPUNKT ODNIESIENIA1024-554
Moduł HEPA – Model 110-130 V 60 HzOtwarte trony999-00109
Worek z lodu (mrożony, 1400 mm x 1800 mm)N/AN/A
Oprogramowanie InkscapeN/AN/A
Wycinarka laserowaUniwersalny system laserowyVLS3.75
Miniaturowe rurki z octanu etylu i winylu (EVA) o średnicy zewnętrznej 0,07 calaMcMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone1883T3
Wielokanałowa pipeta elektroniczna P20 (Gen2)Otwarte trony999-00005
Wielokanałowa pipeta elektroniczna P300 (Gen2)Otwarte trony999-00006
Lakier do paznokciSally HansenSBS-006861 powiedział:Opcjonalnie, do pigmentacji tuszu PMMA
Opentrony OT-2Otwarte trony999-00111
Pipeta P1000GilsonFA10006M
Pipeta 8-kanałowa P200GilsonF144072
Pipeta P200GilsonFA10005M
Ręczniki papieroweN/AN/A
ParafilmFirma Bemis, Inc.52859-079
Papier pergaminowy   N/AN/A
Pipety PasteuraFirma VWR14672-380
Penicylina-streptomycyna (P/S)Sigma-AldrichZobacz materiał P4333 powiedział:
Poli(metakrylan metylu) (PMMA)Sigma-Aldrich182230
Folia poliwęglanowa (760 mm x 1300 mm)McMaster-Carr powiedział:Numer katalogowy: 85585K102
Monomer i środek sieciujący z polidimetylosiloksanu (PDMS, 1500 mm x 2700 mm)Kleje Ellsworth4019862
Nóż precyzyjnyN/AN/A
Sztywny wspornik akrylowy (rozmiar dopasowany do dna płyty studzienki)McMaster-Carr powiedział:Numer katalogowy: 8560K239
Wspornik ze sztywnej tekturyN/AN/A
LinijkaN/AN/A
Nożyczki N/AN/A
Wodorowęglan sodu (0,8 M w wodzie destylowanej)Sigma-AldrichZobacz materiał S6014
Pokład temperaturowy z blokami aluminiowymi (Gen2)Otwarte trony999-00097
Koło kreślarskie HEEPDD (Amazonka)B07YQWB284
Taśma przezroczysta N/AN/A
Trypan niebieskiGibco (firma Gibco)15250-061
TrypsynaGibco (firma Gibco)25200-056
PęsetaN/AN/A
Mieszalnik wirowy N/AN/A

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-Dimensional Cell Culture: A Breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16 (3), 5517-5527 (2015).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  3. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-21 (2022).
  4. Done, A. J., Birkeland, A. C. Organoids as a tool in drug discovery and patient-specific therapy for head and neck cancer. CR Med. 4 (6), 101087(2023).
  5. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  6. Schuster, B., et al. Automated microfluidic platform for dynamic and combinatorial drug screening of tumor organoids. Nat Commun. 11 (1), 5271(2020).
  7. Bozal, S. B., et al. Development of an automated 3D high content cell screening platform for organoid phenotyping. SLAS Disc. 29 (7), 100182(2024).
  8. Seiler, S. T., et al. Modular automated microfluidic cell culture platform reduces glycolytic stress in cerebral cortex organoids. Sci Rep. 12 (1), 20173(2022).
  9. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnol Adv. 34 (8), 1427-1441 (2016).
  10. Pinho, D., Santos, D., Vila, A., Carvalho, S. Establishment of Colorectal Cancer Organoids in Microfluidic-Based System. Micromachines. 12 (5), 497(2021).
  11. Töpfer, E., et al. Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms. Toxicol in Vitro. 61, 104606(2019).
  12. Tong, Z., et al. Towards a defined ECM and small molecule based monolayer culture system for the expansion of mouse and human intestinal stem cells. Biomaterials. 154, 60-73 (2018).
  13. Krebs, J., et al. Carrageenan-Based Crowding and Confinement Combination Approach to Increase Collagen Deposition for In Vitro Tissue Development. Gels. 9 (9), 705(2023).
  14. Li, N. T., et al. An off-the-shelf multi-well scaffold-supported platform for tumour organoid-based tissues. Biomaterials. 291, 121883(2022).
  15. Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Commun Biol. 2 (1), 78(2019).
  16. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  17. Landon-Brace, N., et al. An Engineered Patient-Derived Tumor Organoid Model That Can Be Disassembled to Study Cellular Responses in a Graded 3D Microenvironment. Adv Func Mater. 31 (41), 2105349(2021).
  18. Cao, R., et al. An Automation Workflow for High-Throughput Manufacturing and Analysis of Scaffold-Supported 3D Tissue Arrays. Adv Healthcare Mater. 12 (19), 2202422(2023).
  19. Rodenhizer, D., Dean, T., Xu, B., Cojocari, D., McGuigan, A. P. A three-dimensional engineered heterogeneous tumor model for assessing cellular environment and response. Nat Protoc. 13 (9), 1917-1957 (2018).
  20. Young, M., et al. A TRACER 3D Co-Culture tumour model for head and neck cancer. Biomaterials. 164, 54-69 (2018).
  21. Dean, T., Li, N. T., Cadavid, J. L., Ailles, L., McGuigan, A. P. A TRACER culture invasion assay to probe the impact of cancer associated fibroblasts on head and neck squamous cell carcinoma cell invasiveness. Biomater Sci. 8 (11), 3078-3094 (2020).
  22. Du, Y., et al. Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening. J Mol Cell Biol. 12 (8), 630-643 (2020).
  23. Shing, C. B. Automating the Generation of a High-Throughput Three- Dimensional Human Adipocyte Model. , University of Toronto. (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organoidy pochodz ce od pacjent wplatforma do hodowli organoid wprzesiewanie wysokoprzepustoweplatforma hydro elowazautomatyzowana obs uga cieczyin ynieria tkankowamodelowanie chor b nowotworowychobrazowanie organoid wtr jwymiarowa hodowla kom rkowa

Powiązane artykuły