Szybka diagnostyka zakażenia prątkami gruźlicy i lekooporności na podstawie fluorescencji PCR w czasie rzeczywistym

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono protokół wykrywania Mycobacterium tuberculosis i jego lekooporności przy użyciu technologii ilościowego PCR (qPCR) w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Gruźlica (TB) jest poważnym problemem zdrowotnym, który nieproporcjonalnie dotyka wrażliwe populacje. Pojawienie się i rozprzestrzenianie się lekoopornej gruźlicy stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego na świecie. Tradycyjne metody diagnostyczne Mycobacterium tuberculosis (MTB), takie jak mikroskopia cytologiczna i posiew, mają znaczne ograniczenia i często skutkują opóźnionym leczeniem klinicznym. Aby sprostać temu wyzwaniu, opracowano skuteczny schemat diagnostyczny oparty na fluorescencyjnym PCR w czasie rzeczywistym. Wysokiej jakości kwasy nukleinowe MTB można wyekstrahować z próbek testowych, a stan oporności można określić w kluczowych miejscach oporności. W porównaniu z tradycyjnymi metodami, podejście to znacznie skraca czas wykrywania do zaledwie kilku godzin, umożliwiając określenie stanu infekcji i odporności wkrótce po pierwszej wizycie pacjenta. Czułość detekcji przekracza 85%, a swoistość sięga 95%. Ta nieinwazyjna technologia nie tylko minimalizuje dyskomfort pacjenta, ale także wspiera dokładną diagnozę w oddolnych placówkach medycznych dzięki niskim kosztom i wysokiej wydajności. Ogólnie rzecz biorąc, podejście to stanowi znaczną poprawę w diagnostyce gruźlicy.

Wprowadzenie

Gruźlica (TB), przewlekła choroba zakaźna wywoływana przez Mycobacterium tuberculosis (MTB), jest jedną z dziesięciu głównych przyczyn zgonów na świecie¹. Gruźlica lekooporna (DR-TB) stanowi poważne wyzwanie dla wysiłków na rzecz zwalczania gruźlicy. Plan działania na rzecz budowania społeczności wolnych od gruźlicy (2022-2027), wydany przez Chińskie Centrum Kontroli i Prewencji Chorób (China CDC), podkreśla potrzebę wczesnych badań przesiewowych w kierunku lekooporności u wszystkich pacjentów z bakteriologicznie potwierdzoną gruźlicą płuc². Opowiada się za przyjęciem nowatorskich technologii diagnostyki molekularnej w celu zwiększenia możliwości wykrywania DR-TB, skrócenia czasu diagnostyki, maksymalizacji identyfikacji przypadków DR-TB, zapewnienia standaryzacji leczenia i zarządzania oraz wdrożenia niezbędnych środków kontroli zakażeń³. Ponadto obwieszczenie w sprawie wzmocnienia zapobiegania i kontroli DR-TB (nr 4, 2023) nakazuje ogólnokrajową promocję zaawansowanych technik diagnostycznych. Apeluje o terminowe badania przesiewowe w kierunku oporności dla wszystkich pacjentów z potwierdzoną bakteriologicznie gruźlicą, aby osiągnąć powszechne badania przesiewowe, poprawić standaryzację diagnostyczną i zwiększyć dostępność opieki zdrowotnej⁴.

DR-TB odnosi się do przypadków gruźlicy, które są oporne na co najmniej jeden lek przeciwgruźliczy. Obecne klasyfikacje obejmują gruźlicę oporną na ryfampicynę (RR), monooporną, polioporną, wielolekooporną (MDR), preekstensywnie lekooporną (pre-XDR) i ekstensywnie lekooporną (XDR). Globalna metaanaliza epidemiologii DR-TB ujawnia alarmujące wskaźniki oporności: MDR-TB na poziomie 11,6%, oporność na izoniazyd na poziomie 15,7%, oporność na ryfampicynę na poziomie 9,4% i monooporność na poziomie 11,8%. Dane te podkreślają powagę i złożoność DR-TB⁵.

Ryfampicyna i izoniazyd są podstawowymi lekami w leczeniu gruźlicy. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zauważa jednak, że chociaż dostępne są technologie szybkiej diagnostyki oporności na ryfampicynę, brakuje analogicznych narzędzi do leczenia oporności na izoniazydy. Luka ta utrudnia szybkie rozpoznanie gruźlicy wielolekoopornej (MDR-TB). Tymczasowa definicja "gruźlicy opornej na ryfampicynę" odzwierciedla to ograniczenie diagnostyczne, podkreślając niewystarczającą zdolność do szybkiego wykrywania oporności na inne leki^6,7. WHO szacuje, że przypadki gruźlicy opornej na izoniazyd są dwa razy częstsze niż przypadki oporne na ryfampicynę. Poleganie wyłącznie na badaniach przesiewowych oporności na ryfampicynę grozi przeoczeniem gruźlicy monoopornej na izoniazyd (Hr-TB)⁸. Niewykryci pacjenci z gruźlicą Hr-TB leczeni standardowymi schematami są narażeni na podwyższone ryzyko niepowodzenia leczenia, nawrotu i progresji do MDR-TB⁹. Niepokojąca jest również oporność na etambutol. Jako lek o kluczowym znaczeniu w leczeniu gruźlicy i MDR-TB, chińskie badanie bazowe DR-TB z 2017 r. wykazało wskaźniki oporności na etambutol na poziomie 4,9% w nowych przypadkach i 17,2% w przypadkach ponownego leczenia¹⁰.

Obecnie, do wykrywania oporności pozostałości gruźlicy na leki, sztuczna hodowla jest nadal preferowaną metodą w niektórych laboratoriach, ale technologia fluorescencyjnego PCR w czasie rzeczywistym jest lepsza od konwencjonalnych metod wykrywania oporności na leki gruźlicy: wykrywanie i kwantyfikacja: fluorescencyjny PCR w czasie rzeczywistym zapewnia dokładną analizę ilościową poprzez monitorowanie sygnałów fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym, podczas gdy konwencjonalne metody nie mają tej dokładności. Tradycyjne metody eksperymentalne są czasochłonne i pracochłonne, wymagają przeszkolonego personelu i są wysoce subiektywne. Wręcz przeciwnie, PCR w czasie rzeczywistym przechwytuje sondy fluorescencyjne i sygnały przez komputer, minimalizując błędy ludzkie. Konwencjonalne metody analizy danych są bardziej subiektywne, podczas gdy PCR w czasie rzeczywistym zapewnia dokładną i obiektywną analizę za pomocą krzywych amplifikacji, krzywych standardowych i innych metod analizy. Postępy te sprawiają, że fluorescencyjny PCR w czasie rzeczywistym jest preferowaną metodą wykrywania lekooporności gruźlicy¹¹.

Podsumowując, gruźlica lekooporna (DR-TB) pojawiła się jako globalny kryzys. Oporność na kluczowe leki – izoniazyd, ryfampicynę i etambutol – dodatkowo komplikuje wysiłki na rzecz zwalczania gruźlicy. Terminowe i dokładne wykrywanie oporności na leki ma kluczowe znaczenie dla kierowania dostosowanymi schematami leczenia, poprawy skuteczności terapii i zmniejszenia zagrożenia DR-TB.

Aby sprostać wyzwaniu diagnostycznemu, w tym badaniu wykorzystano zestaw, który może zidentyfikować Mycobacterium tuberculosis i wykryć mutacje oporne na leki w ciągu 3,5 godziny przy użyciu próbek plwociny. Udało się to osiągnąć dzięki wsparciu fluorescencji qPCR w czasie rzeczywistym. Metoda jest prosta, opłacalna i dokładna, co czyni ją cennym narzędziem w walce z DR-TB.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Szpitala Piątego Oddziału Korpusu Produkcyjno-Budowlanego Xinjiang; numer etyczny jest LLWYH2025001 i nie ma konfliktu etycznego. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Pobieranie próbek

1. Do pobierania próbek plwociny należy używać międzynarodowo znormalizowanych zakrętek z plwociną zalecanych przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) lub szczelnych plastikowych pudełek i pudełek z woskowanego papieru.
2. Oznacz pojemniki na plwocinę imieniem i nazwiskiem pacjenta, numerem (ambulatoryjny numer sekwencyjny dla nowych pacjentów lub numer rejestracyjny dla pacjentów kontrolnych), elementami badania i numerami sekwencyjnymi pojemników 1, 2, 3 (1 = natychmiastowa plwocina tego samego dnia, 2 = plwocina nocna, 3 = poranna plwocina następnego dnia). W przypadku pacjentów bez plwociny należy pobrać próbki poprzez pobranie plwociny pod wpływem aerozolu.
   UWAGA: Personel powinien ocenić jakość pobranych próbek plwociny. Objętość próbki powinna być na ogół utrzymywana na poziomie 3-5 ml. Kwalifikowane próbki obejmują suchą plwocinę, brązową plwocinę zabarwioną krwią, plwocinę zawierającą niewielką ilość świeżej krwi lub śluzówkę. Niekwalifikowane próbki, takie jak ślina, powinny być ponownie przedłożone do badania po uzyskaniu dalszych wytycznych.

2. Wstępne przetwarzanie plwociny

1. Dodaj 1-2 razy objętość 4% roztworu NaOH do pojemnika na plwocinę w zależności od objętości zebranej plwociny. Wstrząśnij i mieszaj zawartość przez 2 minuty.
2. Umieść pojemnik w komorze bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej na 15 minut, potrząsając nim kilka razy w tym okresie, aby zapewnić całkowite upłynnienie plwociny.
   UWAGA: Z NaOH należy obchodzić się ostrożnie ze względu na jego charakter. Jeśli plwocina nie jest w pełni upłynniona, wydłuż czas wstrząsania. Ten krok jest szczególnie ważny w całym eksperymencie.

3. Przygotowanie odczynnika (obszar przed PCR)

1. Przygotowanie odczynników: Przygotuj odczynniki w wyznaczonym obszarze przed PCR. Rozmrozić zamrożone odczynniki do temperatury pokojowej. Wir przez 5-10 s. Wirować przy 3000 × g przez 5-10 s w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Ten odczynnik jest dwusystemowy (A/B) i musi być przygotowany osobno.
2. Przygotowanie głównej mieszanki PCR
   1. Mieszanka A: W probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml połącz (n + 3) × 19,6 μl RIF PCR Mix A i (n + 3) × 0,4 μl enzymu TB. Wir przez 5-10 s. Wirować przy 3000 × g przez 5-10 s w temperaturze pokojowej (PCR Mix A: 60 μL).
   2. Mieszanka B: W kolejnej probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml połącz (n + 3) × 19,6 μl RIF PCR Mix B i (n + 3) × 0,4 μl enzymu TB. Wirować i odwirować jak wyżej (PCR Mix B: 60 μL).
3. Przechowywanie i stosowanie: Przygotowane mieszanki wzorcowe należy przechowywać w temperaturze ≤−18 °C. Jeśli nie zostanie natychmiast zużyty, zużyć w ciągu 4 godzin
   UWAGA: Ten sam protokół dotyczy odczynników EMB i INH.
4. Podawanie głównej mieszanki PCR: Dozować 20 μl PCR Mix A i Mix B do oddzielnych cienkościennych probówek reakcyjnych PCR. Przenieść porcjowane probówki w szczelnie zamkniętych workach do obszaru ekstrakcji.

4. Ekstrakcja kwasu nukleinowego i ładowanie próbki (obszar ekstrakcji)

1. Odwirować 1,2 ml całkowicie upłynnionej plwociny o stężeniu 15 058 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić sklarowany osad i zachować osad. Opcjonalnie: Odwirować całą przefermentowaną próbkę, jeśli pozwala na to sprzęt.
2. Zawiesić osad w 1,2 ml soli fizjologicznej, wirować i odwirować w stężeniu 15 058 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok prania trzy razy.
3. Dodać 250 μl TB buforu ekstrakcyjnego do osadu. Wirować i przeprowadzać lizę termiczną w temperaturze 99 °C przez 10 minut. Schłodzić do temperatury pokojowej. Wirować przy 15 058 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i zebrać supernatant (wyekstrahowaną próbkę).
   UWAGA: W przypadku próbek lepkich należy zwiększyć objętość buforu skraplanego lub wydłużyć czas wirowania. Jeśli próbki są przeznaczone wyłącznie do ekstrakcji DNA, należy wydłużyć czas upłynniania, aby zapewnić całkowite roztrawienie.
4. Za pomocą mikropipety dodać 5 μl wyekstrahowanej próbki lub kontroli ujemnej/dodatniej do każdej cienkościennej probówki reakcyjnej PCR. Natychmiast uszczelnij probówki i odpowiednio oznacz.
5. Wiruj probówki PCR przez 5-10 s i krótko odwiruj (5-10 s). Przenieś probówki do obszaru amplifikacji PCR.

5. Amplifikacja PCR (obszar amplifikacji)

UWAGA: Programy do wykrywania oporności na ryfampicynę, etambutol i izoniazyd zostały ustawione na termocyklerze Hongshi (Tabela 1, Tabela 2 i Tabela 3). Warunki jazdy na rowerze są wliczone w cenę.

1. Umieść załadowane cienkościenne probówki reakcyjne PCR w termocyklerze w celu amplifikacji.
2. Uzyskaj dostęp do interfejsu cyklera. Kliknij na Experiment Wizard (Kreator eksperymentów) i wybierz typ eksperymentu jako Standardową Krzywą Topnienia (jak pokazano w Rysunek 1).
3. Kliknij Edytor płytek, wybierz poziomo dwie sąsiednie puste studzienki i przypisz odpowiedni szablon leku z prawego panelu, aby zdefiniować jedną próbkę (jak pokazano na Rysunek 2).
4. Konfiguracja kontroli ujemnych/dodatnich i informacji o próbce. Kliknij Start, aby uruchomić program. Czas pracy wynosi 2 h i 22 min.
5. Po zakończeniu przenieś cienkościenne probówki reakcyjne PCR (szczelnie) do szczelnie zamkniętej torby. Zabezpiecz zamknięcie i traktuj jak odpad niebezpieczny biologicznie.
6. Kliknij Analizuj w termocyklerze, aby przetworzyć dane.
   UWAGA: Granice wykrywalności tej metody są następujące: Grupa złożona: 10 bakterii/ml; Ryfampicyna: 20 000 bakterii/ml; Izoniazyd: 10 000 bakterii/ml; Etambutol: 10 000 bakterii/ml. (Dane dotyczące granicy wykrywalności (LoD) pochodzą z analizy statystycznej 765 przypadków klinicznych podanych w instrukcji obsługi odczynnika.)

6. Interpretacja wyników

1. Określ mutacje, porównując różnice temperatur topnienia (Tm) między próbkami testowymi a kontrolami pozytywnymi.
   UWAGA: Typ dziki (wrażliwy na lek): Wartości Tm próbki są zgodne z kontrolą pozytywną we wszystkich czterech kanałach (odchylenie ≤1 °C). Zmutowany (oporny na leki): wartość Tm w dowolnym kanale jest o ≥2 °C niższa niż w kontroli dodatniej (ΔTm ≥2 °C).

Wyniki

W niniejszym badaniu wykorzystano fluorescencyjną PCR w czasie rzeczywistym oraz analizę krzywych topnienia do badania próbek plwociny pobranych od 17 pacjentów z gruźlicą. Dodatkowo, u 30 pacjentów przeprowadzono testy na oporność na ryfampicynę, a u 20 badano oporność na izoniazyd oraz etambutol. Metoda fluorescencyjnej PCR w czasie rzeczywistym wykazała 88,2% dodatnią wykrywalność kompleksu Mycobacterium tuberculosis.

Dyskusja

Pojawienie się na skalę światową lekoopornych szczepów Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) znacznie skomplikowało leczenie pacjentów z gruźlicą (TB). W szczególności gruźlica wielolekooporna (MDR) i ekstensywnie lekooporna (XDR) stanowi ogromne wyzwanie w zwalczaniu gruźlicy¹². Szybkie wykrycie oporności na leki ma kluczowe znaczenie dla opracowania odpowiednich schematów leczenia, zapobiegania niepowodzeniom terapeutycznym i ograniczenia dalszego rozprzestrzeniania się opornych szc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
lizy
	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Mycobacterium tuberculosis Zestaw do wykrywania mutacji oporności na ethambutol	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Mycobacterium tuberculosis Zestaw do wykrywania mutacji oporności na izoniazydy	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Mycobacterium tuberculosis Wykrywanie mutacji oporności na ryfampicynę Ki	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
SLAN-96P System PCR w czasie rzeczywistym	Shanghai Hongshi Medical Technology Co., Ltd.	SLAN-96P
Roztwór do przetwarzania plwociny	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
TopPette Pipettor

Bufor do wirówki o dużej prędkości2411070124030801240111012403100124110701