Efektywne pobieranie próbek z genetycznie zakodowanej przestrzeni projektowej biosensorów możliwe dzięki projektowaniu eksperymentów i automatyzacji przepływu pracy

Summary

Protokół ten zapewnia metodę systematycznej globalnej optymalizacji genetycznie kodowanych bioczujników poprzez wspomagane automatyzacją generowanie i ocenę bibliotek genetycznych. Jest to połączone z metodologiami projektowania eksperymentów w celu usprawnienia eksperymentów i umożliwienia selekcji komponentów genetycznych w celu dostrojenia bioczujników do określonych wyników projektu.

Abstract

Genetycznie kodowane bioczujniki są potężnymi narzędziami do wysokowydajnego przetwarzania informacji, umożliwiającymi transdukcję środowiskowych lub chemicznych sygnałów wejściowych na różne wyjścia. Umożliwia to dynamiczne wykrywanie, bezpośrednią kontrolę i precyzyjną regulację ekspresji genów w szerokim zakresie zastosowań biotechnologicznych, w tym optymalizacji enzymów, rozwoju szczepów i kontroli procesów mikrobiologicznych. Aby dostosować je do tego celu, wydajność bioczujników można udoskonalić, modyfikując stechiometrię elementów obwodu biosensora (np. transporterów, modułów wejściowych i wyjściowych) i/lub dostrajając powiązane interakcje międzycząsteczkowe gospodarz-biosensor (np. DNA-białko, białko-białko). Jednak w tym przypadku ogromna liczba możliwych permutacji biosensorów tworzy złożoną kombinatoryczną przestrzeń projektową, wymagającą starannej optymalizacji strategii badań przesiewowych w celu zidentyfikowania konfiguracji, które zapewniają pożądaną wydajność fenotypową. Złożoność tę dodatkowo potęgują cechy działania bioczujników, takie jak możliwość przestrajania, które wymagają analizy miareczkowania efektorowego w warunkach badań przesiewowych monoklonalnych. W związku z tym potrzeba eksploracji różnorodnych sekwencji i przestrzeni eksperymentalnej sprawia, że metody próbkowania frakcyjnego szczególnie dobrze nadają się do tego celu. Podstawą tego przepływu pracy są algorytmy projektowania eksperymentów (DoE), które są dobrze umiejscowione, aby umożliwić wydajne, oparte na statystyce mapowanie strukturalne i ułamkowe próbkowanie tej kombinatorycznej eksperymentalnej przestrzeni projektowej.

Opisano w nim połączenie wysokowydajnej automatyzacji i podejścia obliczeniowego w celu efektywnego próbkowania przestrzeni projektowej bioczujników opartych na allosterycznych czynnikach transkrypcyjnych w celu uzyskania odrębnych konfiguracji z cyfrowymi i analogowymi krzywymi dawka-odpowiedź. Protokół rozpoczyna się od stworzenia i zautomatyzowanego wyboru bibliotek promotorów i miejsc wiązania rybosomów. Biblioteki te i odpowiadające im dane wyrażeń są przekształcane w ustrukturyzowane, bezwymiarowe dane wejściowe, co umożliwia obliczeniowe mapowanie całej eksperymentalnej przestrzeni projektowej. Próbkowanie frakcyjne jest następnie wykonywane przy użyciu algorytmu DoE i sprzężone z analizą miareczkowania efektorowego przy użyciu wysokowydajnej platformy automatyzacji. Ten przepływ pracy zapewnia niezależne ramy dla rozwoju i optymalizacji przyszłych systemów biosensorów i obwodów genetycznych, zapewniając zestaw narzędzi regulacyjnych dla społeczności biologii syntetycznej.

Introduction

Zdolność do regulowania ekspresji genów jest podstawową funkcją we wszystkich formach życia, ułatwiającą dynamiczne reakcje w czasie rzeczywistym na wpływy zarówno wewnętrzne, jak i zewnętrzne, od efektorów chemicznych po bodźce biofizyczne1^. Niezliczona liczba transkrypcyjnych systemów regulacyjnych występujących w całej przyrodzie ma ogromny potencjał w zakresie rozszerzania i przyspieszania inżynierii metabolicznej i badań biotechnologicznych, które są możliwe dzięki biologii syntetycznej. U prokariontów znaczna część regulacji zachodzącej w komórce jest kontrolowana przez jednoskładnikowe mechanizmy regulacyjne napędzane interakcjami allosterycznych czynników transkrypcyjnych (aTF) z wieloma efektorami małocząsteczkowymi². Zazwyczaj składające się z domeny wiążącej efektor (EBD) i domeny wiążącej DNA (DBD), aTF działają jak przełączniki molekularne po związaniu się z określonymi efektorami małych cząsteczek, modulując powinowactwo ich DBD do określonych sekwencji operatora DNA zlokalizowanych w regionach promotorowych genomu, co powoduje aktywację lub represję transkrypcji³. Ten zwodniczo prosty mechanizm doprowadził do powstania wielu różnorodnych strategii regulacyjnych, począwszy od systemów represji/derepresji, a skończywszy na aktywatorach zdolnych do wykrywania i reagowania na oszałamiającą liczbę małocząsteczkowych efektorów lub bodźców^{środowiskowych4.} W związku z tym biologia syntetyczna wykorzystała tę różnorodność do skonstruowania genetycznie kodowanych bioczujników zdolnych do łączenia mnóstwa sygnałów wejściowych w niestandardowe wyjścia, tj. produkcję fluorescencyjnych białek reporterowych i regulację szlaków syntezy. Stosowane w biotechnologicznych przepływach pracy, takie systemy umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym wewnątrzkomórkowych stężeń metabolitów, dynamiczną regulację szlaków i łatwe odczyty, pomagając w rozwoju bardziej wydajnych szlaków, szczepów i procesów biologicznych 5,6,7,8.

Zasadniczo bioczujniki są charakteryzowane według szeregu parametrów, w tym specyficzności, zakresu operacyjnego, zakresu dynamicznego, czułości i nachylenia, przy czym krzywa odpowiedzi na dawkę bioczujnika opisuje te parametry za pomocą sygnału wyjściowego w funkcji stężenia liganda (rysunek 1)9,10,11,12 . Równanie Hilla można wykorzystać do dopasowania charakterystyki wydajności bioczujnika, dostarczając półempirycznych dowodów dla każdego z opisanych powyżej parametrów, zapewniając w ten sposób sposób sposób charakterystykę systemu bioczujników, umożliwiając jednocześnie ocenę wysiłków wymaganych do dostrojenia systemu do wyników sterowanych aplikacją. Swoistość można zdefiniować jako względne różnice w wyjściowym sygnale indukowanym przez jeden efektor w porównaniu z szeregiem innych potencjalnych cząsteczek efektorowych i jest zwykle modulowana na poziomie EBD aTF. Zakres operacyjny definiuje się jako zakres stężeń ligandów, które bioczujnik jest w stanie wykryć, dyktując zakres stężeń, na które bioczujnik będzie w stanie zareagować. Z kolei zakres dynamiki opisuje stosunek najwyższego mierzalnego stanu aktywacji (ON) do stanu nieaktywnego (OFF) i jest ważnym parametrem zapewniającym, że bioczujnik niezawodnie zgłasza stężenia efektorowe powyżej autofluorescencji tła¹⁰. Czułość cząsteczki efektora jest opisana jako stężenie wymagane do wywołania określonego sygnału wyjściowego, mierzone przez połowę maksymalnego stężenia (EC₅₀) efektora¹³. Wreszcie, nachylenie krzywej jest oznaczone przez kooperatywność (n_H) aTF dla jego miejsca operatora w promotorze i skutkuje bardziej cyfrowym lub analogowym profilem wyjściowym odpowiedzi. Kooperatywność wynika z interakcji białko-białko między aTF związanymi z ligandami, tworząc kompleksy multimeryczne, które wzmacniają powinowactwo do miejsca operatora, co skutkuje gwałtownym wzrostem responsywności obwodu przy nasycających stężeniach ligandów i bardziej cyfrowym profilu odpowiedzi¹⁴.

Charakterystyka reakcji bioczujnika na dawkę może znacząco wpłynąć na przydatność jego zastosowań i często stanowi decydujący punkt dla każdego zastosowania koncepcyjnego. Wydajność biosensora może się znacznie różnić w zależności od systemu, przy czym zakres operacyjny zwykle waha się od 0,1 nM-10 mM¹³, podczas gdy zakresy dynamiczne mogą wynosić od 1,4 do 2000 razy¹⁵. Ponadto, chociaż liczba związków efektorowych zgłoszonych w odniesieniu do aTF jest szeroka (produkty przemiany materii, aminokwasy, metale, antybiotyki, quorum sensing itp.),¹¹, nie jest ona wyczerpująca, co stanowi wyzwanie dla badaczy, gdy odpowiedni bioczujnik dla ich efektora nie istnieje jeszcze w literaturze. Biologia syntetyczna umożliwiła inżynierię bioczujników, które odpowiadają na takie wyzwania, umożliwiając dostrojenie zakresu efektora i charakterystyki dawka-odpowiedź w celu ściślejszego dopasowania do wyników badań aplikacji, i została wykorzystana do rozwiązania obu wyżej wymienionych problemów, odpowiednio16,17. Dwa kluczowe obszary inżynierii są ukierunkowane za pomocą biologii syntetycznej, regionu promotorowego bioczujnika i samego aTF, pośrednicząc w ich działaniu na poziomie transkrypcji i białka. Podejścia, które koncentrują się na elementach genetycznych biosensora w celu modulowania wydajności na poziomie promotora, obejmują inżynierię RBS, lokalizacji operatorskich oraz -35, -10 (sześciokąty) w celu dostrojenia czułości, zakresów operacyjnych i dynamicznych, i są przedmiotem metodologii opisanej w tym manuskrypcie (rysunek 1). Alternatywnie, modyfikacja selektywności i czułości biosensora poprzez analizę jego domeny wiązania efektora i mutacji reszt zaangażowanych w koordynację efektora (przy użyciu homologii sekwencji i / lub biologii strukturalnej) może modulować jego odpowiedź na pokrewny efektor ^18,19,20 lub całkowicie zmienić go w kierunku niepokrewnego efektora będącego przedmiotem zainteresowania 16,17,21. Takie wysiłki związane z dostrojeniem mogą następnie skierować bioczujniki do określonych zastosowań, przy czym zwykle są to kontrolery metaboliczne (pętle sprzężenia zwrotnego, obwody sterujące), podstawowe narzędzia przesiewowe (odkrywanie enzymów lub szczepów), wtórne narzędzia przesiewowe (badania przesiewowe wariantów enzymów, inżynieria metaboliczna) oraz bioprospekcja transporterów 22,23,24 . Jednym z takich przykładów jest zastosowanie reagującego na kwas mukonowy aTF, CatM, w połączeniu z zaprojektowaną sekwencją promotora w celu poprawy zakresu dynamicznego i operacyjnego. System ten został zintegrowany z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją w celu wyizolowania najskuteczniejszych szczepów wytwarzających kwas mukoniczny w oparciu o fluorescencję GFP po adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej²⁵.

Podczas gdy sukces opisanych powyżej strategii inżynieryjnych jest oczywisty, współzależności dźwigni dostępnych dla biologów syntetycznych do dostrajania bioczujników mogą skomplikować proces projektowania i wydłużyć okres poświęcony na rozwój bioczujników, co może zniechęcić niektórych badaczy do wdrażania bioczujników do własnych przepływów pracy. Jak pokazano na rysunku 1, próby dostrojenia bioczujnika do określonego wyniku poprzez modyfikację sześciokątów mogą nieumyślnie tłumić inne parametry, przy czym ta współzależność jest uznanym wyzwaniem w inżynierii biosensorów¹². Powszechne podejścia do dostrajania biosensorów polegają na racjonalnym projektowaniu i inżynierii ukierunkowanej ewolucji, przy czym te pierwsze opierają się na zrozumieniu a priori strukturalnych i mechanistycznych cech systemu, aby skoncentrować eksperymenty na komponentach o wysokim prawdopodobieństwie sukcesu; podczas gdy ta ostatnia opiera się na randomizowanej mutagenezie i naturalnej ewolucji w połączeniu z wysokoprzepustowym badaniem przesiewowym w celu wybrania wariantów wykazujących zoptymalizowane cechy 26,27,28,29,30. Obie techniki, choć skuteczne, mają również pewne wady: inżynieria ukierunkowana, na przykład poprzez skupienie się na określonych elementach strukturalnych lub funkcjonalnych, jest podatna na ograniczoną eksplorację pełnej przestrzeni eksperymentalnej i może ignorować efekty allosteryczne lub wtórne³⁰. Nieukierunkowane generowanie i selekcja bibliotek, choć idealne do optymalizacji projektów w sposób niekierowany, wymagające niewielkiej ilości wstępnych prac projektowych (tj. projektowania i generowania bibliotek), wymagają skłonności do użytecznych mutacji. Bez takiego odchylenia oczekuje się, że znacznie większy odsetek mutacji może być szkodliwy, wymagający większej liczby badań przesiewowych³¹. W związku z tym bardzo atrakcyjne są podejścia holistyczne, które uwzględniają nie tylko pierwotny wpływ części składowych biosensora (aTF, RBS, miejsca operatorskie i sześciokąty), ale także sposób, w jaki te elementy oddziałują ze sobą w celu wpływania na parametry bioczujnika.

Ustrukturyzowane metodologie wielowymiarowego eksperymentowania i modelowania statystycznego zostały szeroko przyjęte w procesach inżynierii procesowej w celu zbadania wielowymiarowej przestrzeni eksperymentalnej przy użyciu minimalnej możliwej liczby eksperymentów. To podejście, które łączy eksperymentowanie i modelowanie, zwane projektowaniem eksperymentów (DoE), co najważniejsze, pozwala badaczom optymalizować złożone procesy wielowymiarowe w kierunku określonych wyników, nie wymagając przy tym rozległej wiedzy a priori ^23,30. Chociaż zwykle stosuje się go do optymalizacji zmiennych ciągłych, dla których ustrukturyzowana eksploracja eksperymentalna jest łatwiejsza, DoE jest również stosowany w optymalizacji szlaków metabolicznych na poziomie genetycznym 31,32,33. Obejmuje to wstępny etap badania, w którym wybierane są czynniki uważane za najważniejsze dla pożądanego wyniku, a następnie etap optymalizacji, w którym wybrane czynniki są dostosowywane w celu uzyskania pożądanej wydajności, w tym przypadku w celu optymalizacji określonych parametrów biosensorów w celu zwiększenia ich zakresu zastosowania. Co najważniejsze, technikę tę można połączyć ze zautomatyzowanymi platformami do obsługi cieczy w celu zwiększenia przepustowości badań przesiewowych do średniej wielkości bibliotek 10³ - 10⁴ w celu globalnej optymalizacji wydajności bioczujników w oparciu o dane²³. Poniżej opisano protokół wdrożenia podejścia opartego na DoE do optymalizacji bioczujników, wspomaganego robotyką do obsługi cieczy w celu usprawnienia generowania bibliotek, badań przesiewowych i gromadzenia danych w celu globalnej optymalizacji czułości bioczujników.

Protocol

1. Projekt części RBS/promotora

1. Zidentyfikuj elementy regulacyjne specyficzne dla bioczujników, które można systematycznie dostrajać jako zmienne ciągłe w procesie DoE. Pogrupuj te elementy regulacyjne w odrębne moduły. Może to obejmować moduły regulujące transport efektorów, ekspresję czynników transkrypcyjnych i/lub ekspresję genów wyjściowych. Upewnij się, że każdy moduł jest regulowany na poziomie transkrypcji i/lub translacji przez promotor lub RBS (np. odpowiednio_{RBS trans}, P_reg, RBS_out i P_out).
2. Określ kluczowe lokalizacje funkcjonalne w wybranych regionach promotora i RBS, takie jak pola szesnastkowe, lokacje operatorów i sekwencje RBS.
   UWAGA: W literaturze istnieje wiele scharakteryzowanych promotorów i RBS-ów tworzących biblioteki z 34,35,36. Jednak w przypadku niescharakteryzowanych sekwencji promotorowych (zazwyczaj promotora P_reg) poniżej przedstawiono dalsze kroki w celu zlokalizowania dających się dostrajać elementów sekwencji genetycznej, jeśli nie są one dostępne w literaturze.
   1. Zlokalizuj inne operony zawierające interesujące sekwencje biosensorów za pomocą wyszukiwania BlastP aTF z żądanym wejściem czujnika. Wyodrębnij region międzygenowy aTF i jego regulowane geny, aby uzyskać sekwencje promotorowe.
      UWAGA: Lokalizacja i liczba sekwencji promotorów będzie się różnić w zależności od klasy użytego aTF.
3. Użyj wielu narzędzi do wyrównywania sekwencji i innego oprogramowania do tworzenia motywów, aby wyszukać domniemane promotory zachowanych motywów, takich jak heksboksy i strony operatorów. Na podstawie analizy sekwencji promotora wybierz sekwencje nukleotydowe do randomizacji ze zdegenerowanymi zasadami, np. N = cokolwiek, R = dowolna puryna, Y = dowolna pirymidyna itp.
   UWAGA: Czytelnicy są kierowani do publikacji źródłowej w celu uzyskania dalszych informacji na temat analizy promotorów i randomizacji bazy²³.

2. Montaż i walidacja biblioteki części

1. Zaprojektuj i uporządkuj startery, które specyficznie wzmocnią pożądany wektor ekspresji, aby umożliwić wstawienie wariantów sekwencji promotora/RBS przed markerem fluorescencyjnym (np. GFP). Rozcieńczyć liofilizowane startery po przybyciu do końcowego stężenia 100 μM w sterylnym dejonizowanym_H2O.
   1. Mieszaninę reakcyjną PCR zebrać na lodzie w probówkach do PCR zgodnie z parametrami określonej polimerazy. Upewnij się, że używana jest polimeraza o wysokiej wierności, aby zapobiec przenoszeniu mutacji do szkieletu wektora ekspresyjnego. Dostosuj temperaturę wyżarzania i czas wydłużania do potrzeb starterów i długości pożądanego produktu PCR.
   2. Przeanalizować produkt PCR za pomocą elektroforezy żelowej i oczyścić zlinearyzowany wektor za pomocą oczyszczania PCR lub zestawu do ekstrakcji żelu. Zmierzyć stężenie zlinearyzowanego DNA wektora i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Zamów zaprojektowane biblioteki wariantów (RBS lub promotory) do wstawienia do zlinearyzowanego wektora jako jednoniciowe zdegenerowane oligonukleotydy z ramionami homologii plazmidu 30 pz na końcach 5′ i 3′ w celu ukierunkowanej rekombinacji homologicznej do wektora ekspresji.
   1. Po przybyciu należy ponownie zawiesić liofilizowane oligonukleotydy do końcowego stężenia 100 ng/μl w sterylnym dejonizowanym_H2O.
3. Określ objętości dla równomolowych wielkości zlinearyzowanej biblioteki wektorów i wariantów za pomocą kalkulatorów online. Upewnij się, że końcowa objętość reakcji wyniesie 20 μl i że zastosowano stosunek molowy insertu do wektora 2:1.
   1. Rozmrozić podwielokrotność komercyjnej mieszanki głównej zespołu Gibsona (X2) na lodzie i zmontować reakcję w probówce PCR zgodnie z objętościami dostarczonymi przez wybrany kalkulator.
      UWAGA: Miks główny Gibson można również wykonać w laboratorium^37,38.
   2. Dodać 10 μl 2x głównej mieszanki Gibsona do fragmentów DNA i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 50 °C w termocyklerze lub podobnym urządzeniu.
   3. Nałożyć całe 20 μl produktu do ligacji na 200 μl właściwej E. coli w probówce do mikrowirówki. Inkubować na lodzie przez 30 minut, a następnie szok cieplny przez 45 s w temperaturze 42 °C.
   4. Umieścić komórki z powrotem w lodzie na 2 minuty, dodać 800 μl super optymalnego bulionu z pożywką do tłumienia katabolitu (SOC) do probówki i pozostawić komórki do regeneracji przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem.
   5. Rozprowadzić 50 μl przekształconych komórek na wielu 60-milimetrowych płytkach Petriego z agarem Luria-Bertani (LB) z odpowiednim doborem antybiotyków. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 18 godzin.
4. Sprawdź tabliczki pod kątem transformantów, oblicz liczbę kolonii, które reprezentują 3 razy teoretyczną różnorodność biblioteki, aby uchwycić wystarczającą reprezentację każdego wariantu. Zoptymalizuj montaż izotermiczny, jeśli liczba kolonii jest niska/zerowa.
   UWAGA: Nadpróbkowanie jest wymagane, gdy rozważa się idealną bibliotekę wygenerowaną z odczynników o wysokiej wierności lub syntezy. Jest to zazwyczaj 3 razy więcej niż całkowity rozmiar biblioteki. Na przykład 4 pozycje degeneracji (NNNN) = 4⁴ = 256 unikalnych sekwencji. Dlatego zeskrob ~768 kolonii.
   1. Zeskrobać wymaganą liczbę kolonii do jednej sterylnej kolby o pojemności 125 ml zawierającej 25 ml pożywki LB uzupełnionej odpowiednimi antybiotykami. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez 18 godzin w inkubatorze z wytrząsaniem (180 obr./min), upewniając się, że po upływie tego czasu kultura jest wyraźnie gęsta.
   2. Użyj zestawu do oczyszczania plazmidu midi-prep, aby oczyścić bibliotekę wariantów z przygotowanej kultury transformacyjnej. Określ stężenie DNA biblioteki plazmidów; 1-10 μg jest wymagane dla dalszych etapów. Upewnij się, że DNA biblioteki jest eluowane przy użyciu sterylnego dejonizowanego_H2O.
      UWAGA: Kroki wykraczające poza ten punkt skupią się na klonowaniu i walidacji bibliotek wariantów w hoście wyrażenia Pseudomonas putida (P. putida); Dostosowanie protokołu do innych gospodarzy może wymagać modyfikacji czasów inkubacji, temperatur inkubacji i metod transformacji.
5. Przygotować płytkę agarową LB z pożądanym żywicielem o ekspresji P. putida, wypuszczając smugi z wywaru glicerolowego i inkubując płytkę w temperaturze 30 °C przez 18 godzin.
   1. Pobrać pojedynczą kolonię P. putida z płytki agarowej LB, zaszczepić 10 ml pożywki LB i rosnąć w temperaturze 30 °C przez 18 godzin, przy 180 obr./min, wstrząsając.
   2. Przygotować komórki do elektrokompetencji poprzez odwirowanie wyhodowanej kultury w temperaturze 4000 x g w temperaturze 18 °C przez 2 minuty. Odlać sklarowany nad osadem, zawiesić ponownie w 1 ml sterylnego dejonizowanego_H2Oi przenieść zawieszone komórki do sterylnej probówki do mikrowirówki.
      UWAGA: Komórki P. putida powinny wydawać się różowawe po granulowaniu.
   3. Odwirować komórki przez 1 minutę przy 4 x g w mikrowirówce, odlać supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml sterylnego dejonizowanego_H2O. Powtórzyć etapy wirowania i ponownego zawieszania jeszcze 4 razy.
      UWAGA: Utrata komórek może wystąpić podczas wylewania supernatantu podczas mycia; Jest to normalne i nie powinno wpływać na plony.
   4. Przenieś 100 μl umytych komórek do kuwety do elektroporacji o średnicy 0,2 cm, dodaj 1-10 μg DNA z biblioteki plazmidów do kuwety i wymieszaj.
   5. Włączyć elektroporator, upewnić się, że napięcie jest ustawione na 2,5 kV dla kuwety 0,2 cm, włóż kuwetę do komory elektroporacyjnej i rozpocznij impuls.
   6. Dodaj 900 μl pożywki SOC do kuwety, wymieszaj i przenieś komórki do sterylnej probówki do mikrowirówki. Pozostawić komórki do regeneracji przez 2 godziny w temperaturze 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem.
6. Rozprowadzić 50 μl przekształconych komórek na dużych kwadratowych płytkach Petriego (230 mm) agaru LB uzupełnionego odpowiednim antybiotykiem i inkubować w temperaturze 30 °C przez 18 godzin.
   UWAGA: Zapewnij umiarkowaną gęstość kolonii na płytkach bibliotecznych (2-3 CFU/cm²). Będzie to zależeć od kompetencji bakteryjnych i objętości posiewu. Jeśli jest zbyt niska, optymalizacja transformacji lub kolejne rundy transformacji mogą być wykorzystane do zwiększenia liczby kolonii.
7. Wybierz od 25 do 50 kolonii ze wszystkich płytek transformacyjnych w celu walidacji sekwencji. Użyj starterów, które amplifikują się w zdegenerowanej sekwencji, amplifikują region przez PCR i wysyłaj go do sekwencjonowania Sangera w celu oceny różnorodności sekwencji, a także poliklonalności.
   UWAGA: Jeśli poliklonalność staje się problematyczna, rozłożenie transformacji na wiele partii kuwet z 1 μg DNA może pomóc w zmniejszeniu tego efektu.

3. Biblioteka części przesiewowe klonów - automatyzacja

1. Konfiguracja maszyny do obsługi cieczy
   1. Utwórz 7 programów na platformie do obsługi cieczy, aby zapewnić, że etapy intensywnie korzystające z pipetowania są trywializowane.
   2. Utwórz program "MTP Liquid Transfer", upewnij się, że urządzenie do obsługi cieczy jest skonfigurowane do pipetowania regulowanej objętości z przygotowanego zbiornika do pustych płytek do mikromiareczkowania (MTP) w swoim układzie.
   3. Utwórz program "Dodaj glicerol do MTP", upewnij się, że osoba obsługująca ciecz jest zaprogramowana do pipetowania 100 μl objętości 50% glicerolu do płytek, upewnij się, że prędkość dozowania i aspiracji wynosi 5-20 μL/s.
      UWAGA: Tworzony jest osobny program uwzględniający wyższą lepkość 50% glicerolu, co może prowadzić do tworzenia się pęcherzyków, niepełnej aspiracji lub zanieczyszczenia krzyżowego sąsiednich studni z powodu rozpryskiwania, jeśli nie jest kontrolowane.
   4. Utwórz program "DWB Liquid Transfer", skonfiguruj urządzenie do obsługi cieczy tak, aby pipetowało do bloków głębokich studzienek (DWB) z regulowanym ustawieniem objętości i upewnij się, że urządzenie do obsługi cieczy pipetuje z wstępnie napełnionego zbiornika.
   5. Utwórz program "Zaszczepij z rozmrożonego MTP", upewnij się, że osoba zajmująca się cieczą jest zaprogramowana do zasysania 5 μl z rozmrożonego MTP zawierającego wybrane kolonie i przenieś to na odpowiednie płytki DWB w układzie.
      UWAGA: Zwróć szczególną uwagę na układ MTP i DWB w układzie, zapewniając logiczną kolejność zdarzeń, aby uniknąć przypadkowego podwójnego zaszczepienia lub pominiętych płytek.
   6. Utwórz program "Transfer to Assay DWB", upewnij się, że osoba zajmująca się cieczą jest ustawiona na przenoszenie 5 μl komórek z jednej pozycji płytki DWB do innej pozycji płytki DWB. Program musi następnie powtórzyć tę czynność 4 razy przy każdym transferze, zaszczepiając inną pozycję płytki, tj. P1 -> P2, P1 -> P3 itd.
      UWAGA: Ten program zapewnia bezproblemową subkulturację 96 wariantów do różnych stężeń testowych.
   7. Utwórz program "Konfiguracja testu - ponowne zawieszenie PBS (DWB)", upewnij się, że osoba zajmująca się cieczami pipetuje każdy DWB w układzie z 500 μl PBS, program musi również zawierać etap mieszania, aby zapewnić prawidłowe zawieszenie granulek komórek.
   8. Utwórz program "Konfiguracja testu - Dodawanie komórek i PBS (MTP)", upewnij się, że ten program zawiera krok przenoszenia 200 μl ponownie zawieszonych komórek z jednej pozycji płytki DWB do pustej pozycji MTP.
      UWAGA: Dla wszystkich kroków 3.1 programowanie i układy obsługi płynów będą się różnić; Badacze powinni zapoznać się z instrukcjami obsługi konkretnych komercyjnych płynów, aby zmodyfikować powyższe programy tak, aby odpowiadały możliwościom i potrzebom eksperymentu.
2. Kultura biblioteki wariantów i kodowanie kreskowe
   1. Określ teoretyczny rozmiar biblioteki i oblicz liczbę poszczególnych wariantów, aby zapewnić pokrycie biblioteki > 95% (zalecany 3x rozmiar biblioteki) (patrz uwaga do kroku 2.5.).
   2. Obliczyć wymaganą objętość pożywki LB uzupełnionej antybiotykiem w zależności od liczby kolonii, które mają być przebadane (200 μl na kolonię + 10% więcej).
   3. Otwórz oprogramowanie do obsługi cieczy i kliknij Uruchom obok programu MTP Liquid Transfer (patrz Plik uzupełniający 1). Umieść przygotowane media w odpowiedniej pozycji zbiornika i napełnij pokład pustymi MTP zgodnie z układem. Ustaw program tak, aby dozować 200 μl pożywki. Kliknij przycisk OK , aby potwierdzić uruchomienie programu.
      UWAGA: Zawsze upewnij się, że zbiorniki i końcówki są odpowiednio zasilone do platformy obsługi cieczy przed potwierdzeniem rozpoczęcia programu, aby zapobiec zakłóceniom.
   4. Powtórz program tyle razy, ile jest to wymagane, uszczelnij napełnione MTP oddychającą membraną, aby zachować sterylność.
   5. Przenieś wypełnione płytki MTP na platformę zbieracza kolonii i rozszczelnij, a także przenieś kwadratowe płytki P. putida przekształcone z DNA biblioteki wariantów plazmidowych na platformę zbieracza kolonii. Użyj zbieracza kolonii, aby zaszczepić każdą z wstępnie napełnionych studzienek na płytki mikromiareczkowania pojedynczą kolonią z płytek biblioteki transformantów.
      UWAGA: Upewnij się, że minimalna głębokość agaru wynosi 25 ml, aby uniknąć uszkodzenia głowicy zbierającej kolonie.
   6. Ponownie zamknąć i przenieść zaszczepione płytki do inkubatora offline z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C (800 obr./min), upewniając się, że kontrola wilgotności jest włączona na poziomie 75%, aby uniknąć parowania kultur. Pozostaw je do wyrośnięcia na 16 godzin.
      UWAGA: Po inkubacji kultury będą widocznie gęste dla oka, jeśli tak nie jest, ponownie sprawdź pożywkę i wymagania dotyczące antybiotyków.
   7. Po 16 godzinach wzrostu należy umieścić wyrośnięte płytki z powrotem na platformie do obsługi cieczy i rozszczelnić. Kliknij Uruchom obok protokołu Dodaj glicerol do MTP (patrz Plik uzupełniający 1), upewnij się, że układ płytek na ekranie jest zgodny z układem dokującym do obsługi cieczy. Kliknij przycisk OK i zezwól na uruchomienie protokołu.
   8. Po zakończeniu ponownie zszczelnić płytki i krótko wymieszać w inkubatorze do wytrząsania offline (800 obr./min) przez 5 minut, a następnie zakodować kreskowo i przechowywać w temperaturze -80 °C.
   9. Powtórz kroki 3.2.7. oraz 3.2.8. do momentu, gdy wszystkie MTP zostaną dodane glicerol, zostaną wymieszane, oznaczone kodem kreskowym i przechowywane w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: W tym momencie protokół można wstrzymać, aby przygotować się do poniższych kroków charakterystyki. Co więcej, blokowanie płyt w różnych seriach doświadczalnych można zaplanować tak, aby odpowiadało pojemności używanej platformy do obsługi cieczy lub zmniejszyło obciążenie pracą za jednym posiedzeniem.
3. Selekcja bibliotek wariantów
   1. Obliczyć wymaganą objętość pożywki uzupełnionej antybiotykiem dla liczby DWB do napełnienia (~495 μL na studzienkę + 10% powyżej).
   2. Kliknij Uruchom obok programu DWB Liquid Transfer (patrz Plik uzupełniający 1), upewnij się, że nośnik został dodany do odpowiedniego zbiornika w układzie programu. Upewnij się, że puste DWB zostały dodane do odpowiednich pozycji układu i że dostępny jest odpowiedni zapas końcówek. Ustaw program tak, aby dozował 495 μl pożywki. Gdy wszystko będzie gotowe, kliknij przycisk OK , aby uruchomić program.
   3. Uszczelnić napełnione DWB oddychającą membraną i przenieść do tymczasowego przechowywania w temperaturze 4 °C, powtórzyć krok 3.3.2. dopóki wymagana liczba DWB nie zostanie wypełniona mediami.
   4. Kliknij Uruchom obok programu Incoculate from Thawed MTP (patrz Plik uzupełniający 1), upewnij się, że kriomateriały MTP i napełnione DWB są przenoszone na platformę obsługi cieczy zgodnie z układem. Upewnij się, że zapewniony jest wystarczający zapas końcówek. Kliknij przycisk OK , aby zainicjować program.
      UWAGA: Rozmrażaj talerze wyjściowe na lodzie przez 30 minut tylko wtedy, gdy przygotowane zostały wstępne programy i płytki zapewniające optymalną żywotność komórek.
   5. Po zakończeniu programu zaszczepione na noc DWB należy uszczelnić oddychającą membraną i przenieść do inkubatora z wytrząsarką płytkową offline z kontrolą wilgotności 75% i pozostawić do wzrostu przez noc przez 16 godzin w temperaturze 30 °C (800 obr./min).
   6. Ponownie zamknij, wymieszaj i włóż MTP cryostock do zamrażarki o temperaturze -80 °C zgodnie z krokiem 3.2.8.
   7. Powtórz kroki 3.3.4. zgodnie z ppkt 3.3.6. tyle razy jest wymagane, aż wymagana liczba nocnych DWB zostanie zaszczepiona i przeniesiona do inkubatora.
      UWAGA: Zaleca się rejestrowanie, kiedy każda partia płytek jest dodawana do inkubatora, aby uwzględnić opóźnienie czasowe między przebiegami podczas inokulacji i stosować tę samą kolejność dla dalszych etapów.
   8. Obliczyć wymaganą objętość pożywki uzupełnionej różnymi stężeniami efektora i antybiotyku w zależności od liczby nocnych DWB do przesiewu (495 μl na studzienkę + 10% powyżej). Każde stężenie efektora wymaga osobnego zbiornika w urządzeniu do obsługi cieczy.
      UWAGA: Do wstępnej charakterystyki, takiej jak badanie przesiewowe ON/OFF, wystarczą dwa stężenia efektorowe (np. 0 i 1000 μM stężenie końcowe). W celu wygenerowania danych dotyczących dawka-odpowiedź w celu dokładniejszej charakterystyki, zakres ten zwiększa się do minimum czterech stężeń (np. 0, 1, 25 i 1000 μM stężenie końcowe). Systemy represorowe nie wymagają dodawania efektora w celu zapewnienia funkcji, podczas gdy w przypadku aktywatorów, takich jak opisany system, wymagany jest efektor.
   9. Kliknij Uruchom obok programu DWB Liquid Transfer (patrz Plik uzupełniający 1). Upewnij się, że zbiorniki zawierające media uzupełnione efektorem znajdują się we właściwych pozycjach, zgodnie z układem. Dodaj puste DWB do platformy obsługi cieczy. Upewnij się, że na platformie dostępna jest wystarczająca liczba napiwków. Gdy wszystko będzie gotowe, kliknij przycisk OK , aby uruchomić protokół generowania testowych plików DWB.
   10. Po napełnieniu należy uszczelnić testowe DWB oddychającą membraną i przenieść do tymczasowego przechowywania w temperaturze 4 °C, a następnie ponownie napełnić platformę do obsługi cieczy większą liczbą pustych płytek.
   11. Powtórz kroki 3.3.9 i 3.3.10 tyle razy, ile to konieczne, aż zostanie wypełniona wymagana liczba DWB.
   12. Kliknij Uruchom obok programu Transfer to Assay DWB (patrz Plik uzupełniający 1). Upewnij się, że nieuszczelnione DWB do oznaczania zawierające pożywki uzupełnione efektorami są dodawane we właściwych miejscach w układzie obsługi cieczy.
   13. Przenieść i rozszczelnić nocne DWB zawierające wyhodowane P. putida zaszczepione w kroku 3.3.4. do platformy do obsługi cieczy, ponownie upewniając się, że układ jest ściśle przestrzegany. Upewnij się, że na platformie dostępna jest wystarczająca liczba napiwków. Gdy wszystko będzie gotowe, kliknij przycisk OK , aby uruchomić protokół.
       UWAGA: Przenoszenie i układanie subkultur na płytkach testowych zazwyczaj musi być wykonywane partiami, w zależności od wielkości platformy do obsługi cieczy.
   14. Po zakończeniu programu nałożyć plomby i przenieść płytki testowe do inkubatora offline w temperaturze 30 °C, przy wilgotności 75% przez 16 godzin (800 obr./min), końcowa objętość testu wyniesie na tym etapie 500 μl.
   15. Wyrzuć nocne DWB po inokulacji i powtórz kroki 3.3.12 do 3.3.14 zgodnie z wymaganiami, aż wszystkie wymagane testy DWB zostaną zaszczepione i zaczną rosnąć w inkubatorach offline.
   16. Wyjąć DWB z inkubatora, przenieść do wirówki i granulować komórki w temperaturze 4000 x g, 18°C przez 5 minut. Odlewać supernatant i umieszczać odwirowane DWB na platformie obsługi cieczy.
       UWAGA: Objętości granulek komórkowych mogą się różnić w zależności od stężenia efektora lub wariantu, dodatkowo niektóre granulki mogą wydawać się bardziej widoczne dla oka niż inne.
   17. Oblicz wymaganą objętość 1x PBS na podstawie liczby DWB do przesiewania (500 μL na studzienkę + 10% powyżej).
   18. Kliknij Uruchom obok programu Ustawienia testu - Ponowne zawieszenie PBS (DWB) (patrz Plik uzupełniający 1), ustaw objętość dozowania na 500 μL, upewnij się, że 1x PBS został dodany do odpowiedniego zbiornika, a następnie ułóż odwirowane płytki zgodnie z układem urządzenia do obsługi cieczy. Upewnij się, że dostępna jest wystarczająca liczba napiwków. Kliknij przycisk OK , aby uruchomić program.
       UWAGA: Mycie komórek przeprowadza się w celu usunięcia resztek pożywki wzrostowej, która może powodować autofluorescencję.
   19. Ponownie uszczelnij i wyjmij ponownie zawieszone płyty z uchwytu do cieczy. Upewnij się, że granulki są całkowicie zawieszone, sprawdzając spód płytki. Kontynuować przenoszenie granulowanych DWB do urządzenia zajmującego się cieczą i powtórzyć krok 3.3.18. , dopóki wszystkie płytki nie zostaną ponownie zawieszone.
   20. Kliknij Uruchom obok programu Ustawienia testu - Dodawanie komórek i PBS (MTP) (patrz Plik uzupełniający 1). Przenieś ponownie zawieszone DWB z kroku 3.3.18. do urządzenia do obsługi cieczy zgodnie z sugerowanym układem. Przenieś puste MTP do urządzenia do obsługi cieczy zgodnie z układem. Upewnij się, że objętość dozowania jest ustawiona na 200 μl i że dostępna jest wystarczająca ilość końcówek. Kliknij przycisk OK , aby uruchomić program.
   21. Przenieś wypełnione MTP (objętość testu końcowego 200 μL) do wielomodowego czytnika płytek offline, zmierz względną fluorescencję przy odpowiedniej długości fali emisji wzbudzenia (np. sfGFP lEx/lEm = 488/520) i OD₆₀₀ dla każdej studzienki w płytce.
       UWAGA: Ustawienia długości fali emisji wzbudzenia będą zależeć od wyboru genu fluorescencyjnego zakodowanego w wektorze ekspresji. Upewnij się, że ustawienia wzmocnienia w czytniku płytek są spójne przez cały czas i umożliwiają rozróżnienie między niskimi i wysokimi wariantami bez nasycania detektora.
   22. Powtórz kroki 3.3.20. oraz 3.3.21. dopóki wszystkie testowe DWP nie zostaną przeniesione do MTP i zmierzone.

4. Przetwarzanie/przekształcanie danych i klasyfikacja różnicowa

1. Przeprowadzić normalizację zebranych danych, dzieląc zarejestrowaną fluorescencję GFP (RFU) przez zarejestrowany pomiar OD₆₀₀ dla każdego wariantu dla każdego z ocenianych stężeń efektorowych (0 i 1000 μM).
   UWAGA: Większość czytników płytek można zaprogramować tak, aby automatycznie normalizowała fluorescencję za pomocą OD₆₀₀ podczas zbierania danych.
2. Oblicz ON/OFF, aby uzyskać zakres dynamiczny każdego wariantu, dzieląc RFU/OD₆₀₀ przy 1000 μM (ON) przez RFU/OD₆₀₀ przy 0 μM (OFF). Wykreśl wszystkie wartości ON/OFF wariantu jako wykres punktowy, używając ON/OFF podstawowej konstrukcji biosensora, aby określić warianty, które wykazują aktywność powyżej poziomu podstawowego.
   UWAGA: Włączanie/wyłączanie początkowej konstrukcji biosensora użytej w protokole zostało określone jako 3,6-krotne na podstawie wstępnej charakterystyki sekwencji²³ typu dzikiego.
3. W celu uzyskania szczegółowej charakterystyki należy dopasować dane dawka-odpowiedź za pomocą funkcji Hilla ze zmiennym nachyleniem, aby wyodrębnić wartości EC50 i/lub nachylenia Hilla za pomocą oprogramowania analitycznego.
   UWAGA: Aby oszacować czułość i EC₅₀, zbierz co najmniej cztery punkty danych obejmujące zakres, w którym odpowiedź przechodzi od niskiej do wysokiej aktywacji, zwykle najbardziej stroma część krzywej. Podczas gdy więcej punktów danych poprawia rozdzielczość i dokładność, cztery punkty wystarczą do oszacowania rankingu czułości.
4. Z pełnego zestawu wariantów wybierz podzbiór wariantów (np. N = 100), zapewniając zrównoważone pokrycie żądanych rankingów, w tym przypadku EC₅₀. W tym celu należy zidentyfikować warianty, które obejmują szeroki zakres w EC₅₀, upewniając się, że warianty o wysokiej i niskiej pozycji są proporcjonalnie reprezentowane. Usuń warianty, które są zbędne (np. te o podobnych rankingach i minimalnym wpływie na zasięg dystrybucji).
5. Po wybraniu ostatecznej biblioteki próbek wariantów (np. N = 100), przekształć dane przy użyciu następującego równania transformacji liniowo-logarytmicznej (lin-log) (Równanie 1).
   Równanie 1:
   
   gdzie
   
   
   
6. W przypadku wartości EC50 przypisz +1 do najwyższej (najmniej wrażliwej) i -1 do najniższej (najbardziej wrażliwej). Średnia geometryczna równa 0 odpowiada pośrednim poziomom wyrażeń.

5. Ostateczna generacja projektu przesiewania / DoE

1. Aby systematycznie badać przestrzeń projektowania bioczujników, należy użyć ostatecznego projektu przesiewowego (DSD). Ten projekt jest preferowany ze względu na jego zdolność do efektywnego eksplorowania przestrzeni projektowej przy jednoczesnym dostosowaniu badania do konkretnych potrzeb systemu.
2. Kliknij kategorię DOE , a następnie wybierz przycisk Ostateczny projekt rastrowania w oprogramowaniu statystycznym (patrz plik uzupełniający 2).
3. Zdefiniuj czynniki eksperymentalne (np. RBS_trans , P_reg , RBS_out i P_out) jako zmienne ciągłe, klikając przycisk Ciągły i nazywając je, upewniając się, że ustawiłeś wartości na +1 i -1 (patrz Plik uzupełniający 3).
4. Zdefiniuj żądane odpowiedzi (np. ON , OFF , ON/OFF , EC50 , Nachylenie), klikając przycisk Dodaj odpowiedź i dostosowując nazwę (patrz Plik uzupełniający 4).
   UWAGA: Ustaw cel odpowiedzi, klikając menu rozwijane celu, wybierz Brak lub Maksymalizuj w zależności od celu projektu (np. eksploracja a optymalizacja).
5. Po zdefiniowaniu czynników i odpowiedzi kliknij Kontynuuj , aby otworzyć kartę opcji projektu. Wybierz opcję Nie są wymagane żadne bloki, a następnie kliknij przycisk Utwórz projekt (patrz Plik uzupełniający 5).
   UWAGA: Można dodać bloki, aby odizolować projekt od czynników uciążliwych (czynników niebędących głównym zainteresowaniem). Może to zwiększyć złożoność eksperymentów. Jest on jednak używany według uznania badacza.
6. Oprogramowanie wygeneruje eksperymentalną tabelę projektową przedstawiającą konkretne kombinacje czynników, które mają być testowane. Części genetyczne z odpowiednich bibliotek przekształconych w lin-log zostaną użyte do wygenerowania odpowiednich 17 konstruktów. Zapisz i wyeksportuj tabelę obliczeniową, klikając przycisk Utwórz tabelę (patrz Plik uzupełniający 6).

6. Powtórz krok 2 - Projektowanie i montaż projektów genetycznych opartych na DoE

1. Rozpocznij konstruowanie plazmidów wielowymiarowych zgodnie z planem Definitive Screening Design (DSD).
   1. Zidentyfikuj zmienną początkową (np. promotor, RBS itp.). Zaprojektuj i uporządkuj startery w celu linearyzacji wektora wyrażenia, upewnij się, że startery otaczają docelowy obszar zmiennej, zapewniając usunięcie wszelkich istniejących wcześniej elementów sekwencji.
   2. Zaprojektuj i uporządkuj startery, które będą konkretnie wzmacniać sekwencje wariantów odpowiadające predefiniowanym poziomom biblioteki (np. -1, 0, +1) dla każdego węzła regulatorowego (P_{out P reg} RBS_{out RBS trans}). Upewnij się, że każdy starter zawiera ramiona homologii 30 pz, które są komplementarne do miejsca insercji wektora ekspresji.
   3. Oczyść plazmidowe DNA z odpowiedniej kultury kriogenicznej odpowiadającej poziomom biblioteki +1, 0 i -1 dla zidentyfikowanej zmiennej za pomocą miniprepu.
2. Ustawić reakcje PCR dla zlinearyzowanego wektora ekspresji i fragmentów biblioteki na lodzie i określić stężenie produktu zgodnie z opisem w krokach 2.1.1 i 2.1.2.
   1. Powtórz kroki od 2.3 do 2.4 protokołu, aby wykonać montaż Gibsona zlinearyzowanego wektora wyrażenia i fragmentów biblioteki. Upewnij się, że na tym etapie używane są szalki Petriego o standardowych rozmiarach.
   2. Przesiewaj kolonie za pomocą sekwencjonowania Sangera, aby potwierdzić poprawny montaż konstrukcji dla każdego z sugerowanych projektów DSD, a następnie przejdź do transformacji P. putida (kroki 2.5 - 2.6).
   3. Za pomocą PCR potwierdź obecność prawidłowego plazmidu w przekształconych koloniach. Wybrać potwierdzone transformanty i zaszczepić je w 10 ml LB uzupełnionego antybiotykiem do nocnego wzrostu w temperaturze 30 °C przez 18 godzin (180 obr./min). Utworzyć krio-papier (25% glicerolu w finale) i przechowywać w temperaturze -80 °C.

7. Selekcja i racjonalizacja danych

1. Z kriozapasów, smugi P. putida przekształcone za pomocą odpowiednich konstruktów projektowych DSD na agar LB uzupełniony antybiotykiem, inkubować w temperaturze 30 °C przez 18 godzin przez noc w celu wyhodowania kolonii.
   1. Wybrać trzy pojedyncze kolonie z każdej płytki odpowiadające sugerowanym schematom DSD i hodować je przez noc w 10 ml pożywki LB uzupełnionej antybiotykiem w temperaturze 30 °C przez 18 godzin.
   2. Następnego dnia załaduj DWB z gradientem stężenia efektora w zakresie od 0 mM do 1 mM (stężenie końcowe) na rząd do całkowitej objętości 50 μL na studzienkę. Rozcieńczyć kultury na noc w stosunku 1/100 do świeżego LB i dodać 450 μl kultury do DWB w poprzek gradientu stężeń.
   3. Ręcznie powtórz kroki 3.3.14 i 3.3.16, aby uzyskać wyrośnięte DWB, a następnie przejdź do kroków 3.3.18, 3.3.20 i wykonaj je ręcznie. oraz 3.3.21. , aby uzyskać dane RFU/OD dla każdego sugerowanego wariantu.
2. Dopasuj dane odpowiedzi na dawkę (RFU/OD) za pomocą funkcji Hill (ze zmiennym nachyleniem), wyodrębniając odpowiednie parametry (czynniki) do optymalizacji, takie jak EC₅₀, nachylenie wzniesienia, zakres dynamiki lub zakres operacyjny. Przekształć wynikowe dane do log10 i wprowadź wyodrębnione parametry do tabeli DSD dla każdego z testowanych projektów.
   1. Wykonaj dwupoziomową analizę przesiewową w celu zidentyfikowania istotnych czynników wpływających na działanie bioczujnika. Użyj współczynnika t Lentha i analizy wykresu półnormalnej^{23, 30} , aby określić, który czynnik odbiega od oczekiwanego rozkładu i zachować go w modelu. Utrzymuj efekt dziedziczności, upewniając się, że każdy czynnik istotny tylko w interakcji jest również uwzględniany indywidualnie.
   2. Przeprowadź standardowe modelowanie regresji najmniejszych kwadratów (SLSR)³⁰ dla każdej zmiennej odpowiedzi niezależnie, uwzględniając tylko zidentyfikowane istotne czynniki. Oceń diagnostykę modelu regresji, w tym wykresy resztkowe, testy braku dopasowania i wartości R², aby zapewnić prawidłowe dopasowanie danych.
   3. Użyj profilera odpowiedzi, aby określić optymalne ustawienia czynników w oparciu o pożądane cechy biosensora. Zdefiniuj funkcje celu dla każdej odpowiedzi (np. maksymalizując zakres dynamiki przy jednoczesnej minimalizacji EC₅₀), aby wygenerować ustawienia czynników, które zapewniają najlepszą równowagę we wszystkich reakcjach, biorąc pod uwagę ograniczenia systemowe i kompromisy.
3. Wróć do bibliotek wariantów i skonstruuj zoptymalizowany biosensor zgodnie z modułami sugerowanymi przez profiler odpowiedzi, wykonując kroki od 6.1 do 6.2 protokołu. Zweryfikuj wydajność zoptymalizowanego konstruktu za pomocą charakterystyki dawka-odpowiedź.

Results

Początkowo moduły, które mają wpływać na funkcję bioczujnika, muszą zostać wybrane do odmiany; może to obejmować regulację białek transportowych, które mogą wpływać na wewnątrzkomórkowe stężenie ligandów, a tym samym na wyjście biosensorów, ale obejmuje również względne poziomy transkrypcji i translacji samego aTF, a także fluorescencyjny reporter lub gen wyjściowy (ryc. 1). Rysunek 2 przedstawia typowy przepływ pracy wykorzystany podczas opracowywania eksperymentu opartego na DoE w celu optymalizacji bioczujników; począwszy od organizacji elementów regulatorowych w odrębne moduły podatne na manipulację za pomocą biologii syntetycznej poprzez zmiany na poziomie sekwencji, szczególnie w lokalizacjach operatorskich, sześciokątnych lub RBS (Rysunek 2A). W związku z tym kolejnym krokiem w przepływie pracy DoE jest randomizacja miejsc sekwencji w celu wygenerowania bibliotek wariantów (rysunek 2B). Stopień randomizacji musi być dokładnie przemyślany, ponieważ liczba przesiewanych kolonii powinna skalować się ze stopniem randomizacji 4^N, gdzie N jest równe liczbie losowych pozycji podstawowych. Traktowanie każdego unikalnego promotora lub sekwencji RBS jako unikalnej zmiennej jakościowej w DoE zwiększyłoby liczbę wymaganych konstrukcji do eksperymentalnie niewykonalnych poziomów, ponieważ taka konwersja na zmienne ciągłe poprzez charakterystykę bibliotek jest niezbędnym krokiem selekcji do oceny zakresu funkcji nabytej przez randomizację i zdefiniowania górnego, środkowego, i dolne granice funkcjonalności. Po raz pierwszy osiąga się to poprzez analizę wyników bibliotek jako miary siły wariantu RBS lub promotora za pomocą genu reporterowego (Figura 2C). Jak pokazano, transformacja lin-log jest wykonywana w celu rozdzielenia zmiennych ciągłych na poziomy, które mogą być wykorzystane przez DoE do zbadania różnych kombinacji i opracowania modelu opisującego skutki tych wariantów. Następnie wdrażany jest projekt przesiewowy przy użyciu 3 poziomów, które opisują zakres aktywności dla każdego czynnika w sposób kombinatoryczny (rysunek 2D). Poprzez montaż i testowanie zaproponowanych projektów, przestrzeń eksperymentalna jest efektywnie eksplorowana, a interakcje między czynnikami ujawniane. Analiza statystyczna uzyskanych danych służy do określenia, która kombinacja czynników ma największy wpływ na moc wyjściową bioczujnika, a SLSR służy do przewidywania zachowania systemu przy różnych kryteriach, ułatwiając optymalizację bioczujnika pod kątem określonych wyników, takich jak zwiększony zakres dynamiki lub czułość (rysunek 2D).

Rysunek 3 przedstawia montaż i selekcję biblioteki promotorów regulowanej przez aTF. Montaż izotermiczny przy użyciu zdegenerowanego oligonukleotydu przeprowadzono w celu stworzenia biblioteki kodowanej przez plazmid, w której każdy plazmid jest jednoznacznie losowany w określonych pozycjach. Stopień zróżnicowania bibliotek ostatecznie określi liczbę kolonii, które zostaną poddane badaniom przesiewowym, przy czym większe teoretyczne rozmiary bibliotek znacznie skorzystają na automatyzacji. Analiza sekwencji promotora operonów homologicznych do TphR dostarczyła mapy zachowania zasad, która została wykorzystana do poinformowania o lokalizacjach randomizacji, w szczególności zasad, które wykazywały pewien stopień zmienności, a zatem mogą modulować aktywność, nie będąc absolutnie niezbędnymi²³. Trzy zasady w każdym z pól szesnastkowych -35 i -10 zostały wybrane do pełnej randomizacji oprócz sześciu zasad w lokalizacji operatora (Rysunek 3A), co dało teoretyczną bibliotekę promotorów ~500 000. Biblioteka plazmidów została następnie wykorzystana do przekształcenia szczepu gospodarza. Na tym etapie dobra wydajność transformacji ma kluczowe znaczenie w celu uzyskania wystarczającego pokrycia biblioteki typowymi metodami rozwiązywania problemów pokazanymi na rysunku 3B. Optymalizacja stężeń DNA, metoda transformacji i projekt klonowania mogą znacznie poprawić wydajność transformatorów. Rysunek 3C przedstawia typowy przebieg pracy po otrzymaniu transformantów, poszczególne kolonie odpowiadające unikalnym wariantom muszą najpierw zostać wyhodowane w pożywce, zanim będzie można rozpocząć jakiekolwiek prace związane z charakteryzacją. Aby pokryć teoretyczny rozmiar biblioteki, trzeba będzie pobrać ogromną liczbę wariantów i ułożyć je w tablice. Wykorzystanie zautomatyzowanych systemów, takich jak urządzenia do obsługi płynów i zbieracze kolonii, może trywializować ten pracochłonny krok. Krok 1 na rysunku 3C ilustruje transfer pożywek wzrostowych do MTP, które zostały ręcznie załadowane do doku do obsługi cieczy, a następnie automatyczne zaszczepienie przez zbieracz kolonii. Niektóre etapy, takie jak zgrzewanie płytek i przenoszenie ich do inkubatorów offline, są ręczne, ale w razie potrzeby można je również zautomatyzować. Po wzroście kultur można również wykorzystać urządzenia do obsługi cieczy do wytwarzania kriozapasów poprzez dodanie glicerolu, jak pokazano na rysunku 3C. Na tym etapie kodowanie kreskowe płytek zapewni, że każdy wybrany wariant zostanie powiązany z określoną płytką i lokalizacją odwiertu, co umożliwi łatwe odniesienie do dalszej charakterystyki. Jedną z głównych zalet zautomatyzowanych podejść, poza redukcją nakładu pracy, jest zmniejszenie liczby błędów ludzkich, przy czym prawdopodobieństwo przeniesienia błędów na etapie przygotowania biblioteki jest mniejsze. Krok 2 na rysunku 3C ilustruje fazę automatycznej charakterystyki przygotowania biblioteki. Rozpoczyna się to od napełnienia DWB pożywką za pomocą platformy do obsługi cieczy, a następnie zaszczepienia za pomocą kriozapasów z kodami kreskowymi. Automatyzacja na tym etapie ponownie zapewnia zminimalizowanie błędów pipetowania i nakładu pracy. Płytki są następnie uszczelniane i ręcznie przenoszone do inkubatorów offline w celu wzrostu, w którym to momencie można zainicjować układanie związków efektorowych na świeżych płytkach głębinowych. Na potrzeby początkowego ekranu bibliotek części, prosty ekran ON/OFF może być pożądany, ponieważ może być używany do wstępnego przesiewania niefunkcjonalnych wariantów, które wykazują równą lub gorszą aktywność niż konstrukcja podstawowa, i wzbogacania puli wariantów dla tych, które wykazują zwiększoną aktywność. Ma to dodatkową zaletę w postaci zmniejszenia kosztów materiałowych końcówek i płytek, które mogą stać się zaporowe w protokołach przesiewowych dużych bibliotek. Jednak tam, gdzie wymagana jest optymalizacja bardziej złożonych wskaźników wydajności biosensorów (np. EC₅₀), wymagane będą dodatkowe stężenia efektorów. Po wzroście kultur płytki są zawracane do platformy do obsługi cieczy, która rozpoczyna inokulację płytek zawierających związki efektorowe, a następnie jest ręcznie zwracana do inkubatora na czas trwania testu. Rysunek 3D przedstawia ostatni etap automatyzacji przed zebraniem danych. Po upływie okresu, który upłynął na wzrost i aktywację biosensora, płytki są wyjmowane z inkubatora offline i zwracane do platformy do obsługi cieczy. Aby usunąć resztkowe pożywki wzrostowe, które mogą zakłócać zbieranie danych fluorescencyjnych, wymagane jest odwirowanie, usunięcie supernatantu i mycie komórek 1x PBS. Zastosowanie urządzeń do obsługi cieczy może ponownie trywializować ten proces, z automatycznym ponownym zawieszaniem kultur umożliwiającym szybkie przetwarzanie płytek, w tym transfer umytych komórek do 96-dołkowych MTP w celu przesiewu. Zbieranie danych może odbywać się w sposób ręczny lub zautomatyzowany, przy czym niektóre czytniki są wyposażone w stosy płyt, które mogą współpracować z urządzeniami do obsługi cieczy, aby jeszcze bardziej zautomatyzować proces zbierania danych. Porównując stosunek aktywacji biosensora w obecności efektora (ON) do jego braku (OFF), oceniono 5 000 wariantów przy użyciu stopnia aktywacji biosensora (zmiana fałdowania) w celu określenia funkcji biosensora; tylko warianty o aktywności wyższej niż konstrukt podstawowy (3,6-krotny) zostały uwzględnione w dalszej charakterystyce, jak wskazuje czerwono-różowy zacieniony obszar wykresu punktowego (Rysunek 3D). Na podstawie pozycji płytki i studzienek w wzbogaconej puli wariantów, można następnie przeprowadzić solidną charakterystykę przy użyciu kontrprób biologicznych lub różnych stężeń efektorów, odwołując się do oryginalnych płytek kriogenicznych z kodami kreskowymi wygenerowanych w kroku 1 przepływu pracy.

Rysunek 4 przedstawia przesiewowe warianty selekcji ze wstępnego badania przesiewowego w bibliotece, mające na celu opracowanie biblioteki promotorów do optymalizacji czułości. Korzystając z danych z 5000 wariantów przebadanych w poprzednim przepływie pracy, sklasyfikowana pula 226 wariantów z początkowego ekranu włączania/wyłączania, określonych jako bardziej aktywne niż sekwencja rodzicielska, została następnie scharakteryzowana i uszeregowana zgodnie z ich czułością, aby działać jako poziomy, wokół których można zaprojektować DSD. W pierwszym kroku zmienne jakościowe, w tym przypadku warianty P_out , muszą zostać przekształcone w zmienne ciągłe, które obejmują szeroki zakres czułości. Aby zapewnić czułość sita, wymagane są krzywe dawka-odpowiedź w celu uzyskania danych EC₅₀ z wykreślonej funkcji Hilla; Zwiększa to znacznie nakłady pracy związane z powlekaniem i dobrze nadaje się do automatyzacji przy użyciu urządzeń do obsługi cieczy, aby uprościć proces konfiguracji testu i badań przesiewowych, jak pokazano na rysunku 4A. Zgodnie z przepływem pracy ustalonym w kroku 2 na rysunku 3C, kody kreskowe płytek i pozycje studzienek odpowiadające wzbogaconej puli wariantów wykorzystano do inokulacji DWB wypełnionych pożywkami wzrostowymi i antybiotykami. Aby zwiększyć odporność doświadczalną, warianty poddano badaniom przesiewowym w potrójnym biologicznym triatle. Po przeniesieniu płytek do inkubatora offline w celu wzrostu, świeże DWB wypełniono pożywkami wzrostowymi uzupełnionymi efektorami 0, 1, 25 i 1000 μM przy użyciu płynnych manipulatorów w celu zmniejszenia nakładu pracy. Aby zmniejszyć liczbę płytek wymaganych do testu, wybrano zakres stężeń obejmujący dolną środkową i górną część krzywej, przy czym stężenia w punkcie środkowym ujawniają względną czułość każdego wariantu, jak pokazano na rysunku 4A. Po inokulacji pul wariantów przy każdym stężeniu efektora i analizie fluorescencji i OD₆₀₀, wykreślono krzywe dawka-odpowiedź, z analizą regresji nieliniowej wykorzystaną do wyznaczenia EC₅₀. Na tym etapie wygenerowano surową bibliotekę każdego wariantu z unikalną wartością EC₅₀ , przy czym 100 najbardziej niezawodnych wariantów zostało wykorzystanych, jak pokazano na rysunku 4B , w celu dalszego zmniejszenia rozmiaru biblioteki. Zanim jednak biblioteka ta będzie mogła być użyta w DoE, musi zostać wygenerowana konwersja unikalnych wariantów na bibliotekę rangowaną, reprezentującą zakres czułości w niej zawartej. Osiągnięto to poprzez przeprowadzenie transformacji danych w logu lin, która klasyfikuje i ponownie skaluje dane tak, aby każdy wariant był uszeregowany od najbardziej wrażliwego (-1) do najmniej wrażliwego (+1), a także zdefiniowanie wartości punktu środkowego (0), która reprezentuje średnią geometryczną zestawu danych Rysunek 4C. Transformacja surowych danych doprowadziła do powstania niebieskiego wykresu pokazanego na rysunku 4D, z którego dyskretne sekwencje P_out odpowiadające +1, 0 i -1 zostały przeniesione do ostatecznego projektu przesiewowego jako poziomy współczynnika P_out .

Rysunek 5 przedstawia pełny proces pracy po wygenerowaniu biblioteki, od generowania DSD do modelowania i globalnej optymalizacji biosensora w oparciu o uczenie wspomagane przez DoE. Rysunek 5A przedstawia podział typowego biosensora na 3 moduły z 1 (moduły transportowe i regulacyjne) lub 2 (moduł wyjściowy) węzłami regulacji. Podążając za przykładem przedstawionym na rysunku 4, zostaną opracowane biblioteki RBS lub promotorów, a poziomy w zakresie od +1, 0 i -1 zostaną wybrane tak, aby obejmowały największą zmienność każdego czynnika. Rozmiar ekranowanych bibliotek zazwyczaj określa liczbę eksperymentów wymaganych do pełnego zbadania przestrzeni projektowej, na przykład, jeśli każda biblioteka miałaby rozmiar 22, równałoby się to 22⁴ (234 256) kombinacji. DoE ma na celu uproszczenie obciążenia eksperymentalnego poprzez zmniejszenie liczby kombinacji poprzez ustrukturyzowane projekty badań przesiewowych. Chociaż możliwych jest wiele metodologii, DSD jest idealna do opracowywania bioczujników, ponieważ umożliwia identyfikację głównych czynników i interakcji dwuczynnikowych, unikając jednocześnie mylących efektów drugiego rzędu. Dodatkowo, ponieważ projekty DSD wykorzystują 3 poziomy, możliwe jest oszacowanie krzywizny (nieliniowości). Rysunek 5A przedstawia typowe wyjście DSD, w którym każdy z 4 modułów jest ustawiony na różne poziomy; ponieważ każdy poziom odpowiada określonemu promotorowi lub wariantowi RBS, montaż izotermiczny służy do generowania konstruktów genetycznych odpowiadających zalecanym projektom DSD. Po złożeniu i przekształceniu szczepu gospodarza za pomocą zalecanych konstruktów, krzywe odpowiedzi na dawkę są następnie uzyskiwane przy użyciu pełnego zakresu stężeń efektorowych, aby zapewnić większą pewność co do działania każdego z konstruktów Rysunek 5B. Ponieważ DSD radykalnie zmniejsza liczbę konstruktów, etap ten można często wykonać ręcznie lub przy użyciu automatycznych urządzeń do obsługi cieczy, jeśli jest to preferowane. Rysunek 5C przedstawia wynik profilu predykcyjnego uzyskany po skonstruowaniu i przetestowaniu sugerowanych kombinacji z ekranu DSD oraz zbudowaniu modeli predykcyjnych w oparciu o współczynnik Hilla (n_H) i wynik EC₅₀ każdej badanej kombinacji. Celem eksperymentu było opracowanie konstrukcji biosensora, która została globalnie zoptymalizowana zarówno pod kątem n_H , jak i EC₅₀ poprzez modulację ekspresji 4 węzłów regulacyjnych w celu maksymalizacji obu parametrów. Każdy czynnik regulacyjny jest pokazany w osobnej kolumnie ze stopniem wyrażenia wskazanym wzdłuż osi x odpowiadającej przekształconemu promotorowi lin-log i bibliotekom części RBS (od -1 do +1). Wpływ zmiany wyrażenia węzłów zarówno na EC₅₀ , jak i n_H jest wskazywany przez krzywe na podpowierzchniach. Wykresy profilu podkreślają często nieintuicyjny charakter optymalizacji bioczujników, w wyniku której dostrojenie jednego węzła regulacyjnego może mieć przeciwstawny wpływ na parametry wyjściowe. Na przykład wykazano, że_{RBS trans} nie ma silnej korelacji z n_H, _{jednak dodatnio koreluje z EC50} w sposób nieliniowy. Zakłada się również oddziaływania wyższego rzędu (nieliniowe), w przypadku RBS_wzrost siły spowoduje wzrost nachylenia (wyższe n_H) przy jednoczesnym wzroście czułości (niższy EC₅₀), co skutkuje krzywą o bardziej cyfrowym nachyleniu i ostrzejszą reakcją na rosnące stężenie efektora. Na podstawie tych modeli można wyraźniej odwzorować nieintuicyjne aspekty strojenia bioczujników, co umożliwia optymalizację węzłów regulacyjnych w kierunku globalnego optimum. Modele wykorzystano do przewidywania globalnych optimów zarówno dla EC₅₀ , jak i n_H , przy czym czerwone linie na wykresie wskazują optymalne poziomy każdego węzła regulacyjnego (rysunek 5C). Rysunek 5D przedstawia profil dawka-odpowiedź początkowej konstrukcji biosensora rodzicielskiego (niebieski) w porównaniu z najbardziej wydajnym konstrukcją DSD (zieloną) i globalnie zoptymalizowaną konstrukcją (lilak). Wykorzystując model do przewidywania idealnych wytrzymałości modułów w celu maksymalizacji EC₅₀ i n_H, zmontowano wariant odpowiadający mocnym stronom_{RBS trans} (-1), P_reg (-0,7), P_out (-0,3) i RBS_out (+1) i scharakteryzowano go za pomocą zoptymalizowanej konstrukcji wykazującej ulepszenia w EC₅₀ i n_H (rysunek 5D). Podczas gdy zarówno DSD, jak i globalnie zoptymalizowane biosensory wykazują podobny EC₅₀ (0,8 vs 0,7 μM),_{n H} został znacznie poprawiony bez uszczerbku dla już osiągniętych korzyści EC₅₀ . Wyniki wyraźnie pokazują zalety projektowania opartego na danych w porównaniu z podejściami opartymi na intuicji i służą do walidacji DoE jako sposobu na usprawnienie i uproszczenie procesu dostrajania bioczujników.

Rysunek 1: Dostrajanie genetycznie kodowanych parametrów biosensora. Układ modułów genetycznych genetycznie kodowanego biosensora, w tym aTF, miejsc operatorskich (OS), sześciokątnych (-35, -10) i komponentów RBS. Kolorowe pola odpowiadają interakcjom, które zwykle wpływają na parametry bioczujnika, takie jak: powinowactwo ligand-aTF (szary), operator aTF (różowy), RNAP-Hexbox (zielony) i RBS (pomarańczowy). Wpływ każdego parametru na charakterystykę dawka-odpowiedź jest przedstawiony na reprezentatywnych wykresach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przegląd typowego przepływu pracy optymalizacji biosensorów DoE. (A) Przegląd modularyzacji komponentów biosensorów pokazujący moduł transportowy kodujący białko transportowe w celu importu efektora docelowego, moduł regulatora odnoszący się do aTF oraz moduł wyjściowy, który koduje białko reporterowe, takie jak sfGFP. Pokazano również węzły regulacji, takie jak RBS_trans, P_reg, P_out i RBS_out, które odpowiadają węzłom genetycznym, które zostaną poddane randomizacji w celu zbadania parametrów biosensora. (B) Wybór elementów sekwencji podatnych na randomizację podstawową, w tym promotory i RBS'. Sekwencja rodzicielska promotora jest pokazana w górnej linii, a sfinalizowana zmutowana sekwencja pokazana poniżej, gwiazdy wskazują niezmienione zasady, podczas gdy K, M i N odnoszą się odpowiednio do guaniny / tyminy, adeniny / cytozyny lub dowolnego nukleotydu. Promotory oferują większy potencjał randomizacji poprzez kierowanie na heksboksy lub witryny operatorów, a także mogą obejmować duplikację lub modyfikację odstępów między sekwencjami. Biblioteki RBS oferują bardziej ograniczone opcje randomizacji, jednak są znacznie łatwiejsze do przesiewania ze względu na ich mniejszą maksymalną różnorodność. (C) Poziomy wyrażeń wariantów są charakteryzowane, a następnie przekształcane w uszeregowaną bibliotekę lin-log w celu przekształcenia czynników wariantów kategorycznych w 3 dyskretne poziomy, które są bardziej podatne na analizę za pomocą DoE. (D) Mapowanie przestrzeni eksperymentalnej odbywa się przy użyciu multipleksowanych kombinacji trzech poziomów każdego modułu w celu wygenerowania modelu, który można wykorzystać do informowania o wyborach projektowych w celu dostrojenia wydajności biosensora do pożądanych wyników, może to być w kierunku zakresu dynamiki lub czułości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Modularyzacja biosensorów, budowa biblioteki promotorów i zautomatyzowany przepływ pracy. (A) Przykład randomizacji określonych sekwencji w promotorze aTF i insercji do konstruktu biosensora poprzez montaż izotermiczny. Pogrubione litery wskazują pozycje, które zostały losowo przydzielone w miejscu operatora lub sześciokątnych zgodnie z dostarczonym kluczem podczas syntezy zdegenerowanych oligonukleotydów. (B) Panel opisujący transformację powstałej biblioteki wariantów biosensora w klonującego gospodarza, takiego jak E. coli, oraz dalsze kroki w zależności od wydajności transformantu. Niska wydajność transformacji może skutkować słabym pokryciem biblioteki teoretycznej i nieodpowiednią eksploracją przestrzeni projektowej. Rozwiązywanie problemów na tym etapie jest konieczne, aby upewnić się, że znaczna część wariantów jest dostępna do charakterystyki, z nakreśleniem typowych środków rozwiązywania problemów. (C) Przebieg pracy kroków 1 i 2 zgodnie z opisem w protokole, z symbolem czerwonej ręki wskazującym kroki ręczne i trybikiem wskazującym kroki automatyczne. Przepływ pracy w kroku 1 podkreśla kluczowe kroki w protokole, od wyboru kolonii do generowania kriomateriału. Przebieg pracy w kroku 2 demonstruje ożywienie i ponowne ułożenie kriozapasów do oznaczania według krzywej dawka-odpowiedź. (D) Zespół demonstrujący końcową procedurę przed badaniem przesiewowym, w tym mycie komórek i transfer na płytki testowe przed pomiarem fluorescencji i OD. W panelu pokazana jest przesiewana pula wariantów licząca 5000 wariantów, przy czym warianty wykazujące ON/OFF przekraczające sekwencję promotora rodzicielskiego (3,6-krotnie) są podświetlone w pomarańczowym polu. Można zaobserwować, że wiele wariantów skupia się wokół 1, co wskazuje na słabą wydajność i niską zmienność, prawdopodobnie z powodu randomizacji na poziomie sekwencji powodującej utratę funkcji. 226 wariantów pokazanych w ramkach na wykresie zostało wykorzystanych do solidnej charakterystyki. Dane zostały zaczerpnięte z oryginalnej publikacji Alvareza Gonzaleza i wsp.²³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Selekcja i dyskretyzacja górnych wariantów biblioteki promotorów za pomocą transformacji lin-log. (A) Zarys standardowej procedury generowania danych wyrażeń dla biblioteki RBS lub promotora. Korzystając z triażowanych wariantów, które reprezentują dobry zakres poziomów ekspresji, urządzenia do obsługi cieczy są używane do generowania płytek testowych wstępnie wypełnionych z góry określonym stężeniem efektora, z których można uzyskać krzywe odpowiedzi na dawkę dla sklasyfikowanych 226 wariantów. (B) Po określeniu EC₅₀ i dalszej redukcji scharakteryzowanej biblioteki do 100 wariantów, dane są przedstawiane jako wykres słupkowy przedstawiający mieszankę różnych wrażliwości generowanych w wyniku randomizacji promotora. orazDane EC₅₀ są przekształcane przy użyciu równania szybkości lin-log w celu przekształcenia ciągłego zestawu danych w zestaw kategoryczny, bardziej odpowiedni do faktoryzacji w DSD. (D) Przekształcone dane dotyczące wariantu EC₅₀ są teraz przedstawione zredukowane do uproszczonej skali i uszeregowane od wysokiej do niskiej aktywności EC₅₀. Z tego wybierane są 3 poziomy odpowiadające górnemu (+1) wariantowi średniej geometrycznej (0) i dolnemu (-1), które zostaną przeniesione do DSD w celu zbadania przestrzeni eksperymentalnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Eksperymentalne projektowanie, testowanie i efekty uczenia się oparte na modelach. (A) Schematyczny przebieg pracy przedstawiający generowanie tabeli obliczeniowej DSD na podstawie przekształconych bibliotek rangowych lin-log modułów_{RBS trans}, P_reg, P_{out i RBSout} . Tabela projektowa DSD sugeruje najmniejszą liczbę kombinacji, aby efektywnie odwzorować przestrzeń eksperymentalną. Podano przykładowe dane wyjściowe, w których +1, 0 i -1 odnoszą się do górnych, środkowych i dolnych wariantów wydajności dla każdego węzła regulacyjnego, zgodnie z opisem przekształceń lin-log. Są one konstruowane przez montaż izotermiczny i potwierdzane przez sekwencjonowanie przed przekształceniem w gospodarza wyrażenia w celu scharakteryzowania. (B) Po transformacji komórki są hodowane i testowane w szerokim zakresie stężeń efektorowych, a moc fluorescencyjna jest mierzona w celu wygenerowania krzywych dawka-odpowiedź. Różne parametry, takie jak nH i EC50, są wyodrębniane z krzywych dawka-odpowiedź i wprowadzane do DSD w celu wygenerowania modeli predykcyjnych dla każdego czynnika. (C) Korzystając z modeli, można przewidzieć wpływ modulacji jednego parametru biosensora poprzez zmianę poziomu ekspresji dowolnego modułu regulacyjnego. Co ważne, możliwe staje się globalne dostrojenie węzłów regulacyjnych, co umożliwia maksymalizację jednego lub więcej parametrów biosensora jednocześnie, oznaczonych przerywanymi czerwonymi liniami na każdym wykresie cząstkowym. (D) Optymalizacja modelu pod kątem maksymalnej czułości skutkuje globalnie zoptymalizowanym konstruktem (liliowym), którego krzywa odpowiedzi na dawkę jest wykreślana w stosunku do konstruktu DSD o najwyższej wydajności (zielony) i konstruktu biosensora rodzicielskiego (niebieski). Wyodrębnione parametry n_H i EC₅₀ przedstawiono poniżej wykresu, wykazując poprawę obu parametrów w stosunku do najbardziej wydajnego konstruktu DSD, potwierdzając skuteczność modeli predykcyjnych wygenerowanych na podstawie DSD. Dane zostały zaczerpnięte z oryginalnej publikacji Alvareza Gonzaleza i wsp.²³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Etapy protokołu zautomatyzowanej obsługi cieczy wykorzystywane do przygotowania biblioteki bioczujników i konfiguracji testu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2 do rysunku uzupełniającego 6: Generowanie krok po kroku ostatecznego projektu badania przesiewowego (DSD). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Biblioteki elementów genetycznych obejmujące szeroką zmienność genetyczną mają kluczowe znaczenie dla powodzenia metodologii opartej na DoE. Jak pokazano na rysunku 2A, liczba wariantów teoretycznych wzrasta wraz z liczbą pozycji, które mają być celem mutagenezy, a także stopniem randomizacji, przy czym ten stale rosnący rozmiar biblioteki tworzy znaczące wąskie gardła w badaniach przesiewowych. Zmniejszenie liczby docelowych pozycji lub stopnia randomizacji może zmniejszyć liczbę wariantów, które muszą zostać przebadane i jest atrakcyjnym podejściem, jeśli wymagane jest bardziej ukierunkowane podejście do dostrajania lub jeśli jako przewodnik istnieje znacząca wiedza a priori na temat systemu. Jednak w przypadku systemów takich jak biosensory, które mają wiele nakładających się na siebie cech lub mogą nie mieć dobrze scharakteryzowanych elementów genetycznych, trudno jest obejść wymóg rozmiaru biblioteki. Wykorzystanie zautomatyzowanych urządzeń do obsługi cieczy może trywializować pracę związaną z zbieraniem kolonii i wariantami hodowli, szczególnie gdy wymagane jest zwiększone gromadzenie punktów danych do wykreślania bardziej zaawansowanych funkcji, takich jak krzywe dawka-odpowiedź w porównaniu z dwoma komparatorami punktów danych, takimi jak ON/OFF. Chociaż trudno jest dokładnie określić ilościowo czas zaoszczędzony dzięki włączeniu zautomatyzowanych przepływów pracy, Główną korzyścią z jego wdrożenia jest czas, który można poświęcić na inne równoległe eksperymenty³⁸.

Mimo to, w wielu przypadkach, gdy rozmiary bibliotek przekraczają 10⁴, nawet metodologie wspomagane płynami stają się niepraktyczne³⁹. W takich przypadkach wstępne badanie przesiewowe wariantów za pomocą cytometrów przepływowych jest bardzo atrakcyjnym podejściem, ze znacznie większą zdolnością sortowania do 10⁷ komórek na godzinę⁴⁰. Stosowanie sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) z dwiema rundami selekcji pozytywnej i co najmniej jedną rundą selekcji negatywnej było rutynowo stosowane w klasyfikacji najbardziej wydajnych wariantów bioczujników przed bardziej obszerną charakterystyką 16,26,42. Opracowywanie i wykonywanie takich protokołów wykorzystujących FACS zostało szczegółowo omówione w innym miejscu³¹. Wstępne badania przesiewowe są możliwe przy użyciu testów z użyciem płytek do obsługi cieczy, jak opisano w powyższym protokole; porównując dane ON/OFF przy użyciu stężenia pojedynczego efektora, jak pokazano na rysunku 3D, do dalszej szczegółowej charakterystyki można wybrać tylko wariantowe bioczujniki o znaczącym wzmocnieniu funkcji (3,6-krotnym, jak podano w metodach), usprawniając rozwój biblioteki i czas trwania eksperymentów. Zarówno platformy FACS, jak i do obsługi cieczy wiążą się jednak ze znacznymi inwestycjami kapitałowymi dla laboratorium i często wymagają pewnego poziomu wiedzy technicznej do obsługi i konserwacji. Sita na płytkach agarowych zapewniają niższą techniczną i finansową barierę wejścia i były stosowane w połączeniu z gfp lub niebiesko-białymi badaniami przesiewowymi kolonii w celu selekcji wariantów biblioteki RBS, a także mutantów enzymatycznych na podstawie intensywności fluorescencji^43,44. Również one są jednak ograniczone pod względem liczby wariantów, które można skutecznie badać przesiewowo, ale wymagają również znacznej różnicy we fluorescencji, aby były wykrywalne⁴⁴. Jako kompromis między w pełni kombinatoryczną jednoczesną mutacją wielu elementów jednocześnie, metodologia "dziel i rządź" ma na celu podzielenie dużych bibliotek wariantów na łatwiejsze do opanowania bloki przesiewowe⁴¹. Chociaż podejście modularne może być pragmatyczne, nie bada skutecznie przestrzeni projektowania kombinatorycznego, ponieważ wiadomo, że wydajność komponentów biologicznych jest wysoce zależna od kontekstu, zwłaszcza u bakterii, gdzie dominuje sprzężenie transkrypcyjne i translacyjne. Ma to potencjał, aby doprowadzić do wyborów projektowych, które są ukierunkowane na lokalne maksima, a nie globalne optima.

Transport i rozpoznawanie specyficznych induktorów to kolejna ważna cecha rozwoju biosensorów, która zasługuje na wzmiankę, mimo że nie jest głównym celem przedstawionego protokołu. Brak odpowiedniego aTF dla cząsteczki docelowej stanowi poważne wyzwanie dla badaczy. Racjonalna selekcja istniejącego aTF, który wiąże strukturalny analog efektora docelowego, może zapewnić idealną matrycę, na której można zastosować randomizację kodonów w celu dostrojenia specyficzności aTF do pożądanego efektora¹⁷. Dostosowanie sekwencji docelowej do rozwiązanych struktur lub przewidywań Alphafold może umożliwić identyfikację miejsc wiązania efektora z podejrzanymi resztami aminokwasowymi poddanymi półracjonalnej randomizacji i rankingowi, dostosowanemu do protokołu¹⁷. Podobnie, wybór i modulacja transporterów odpowiedzialnych za import/eksport efektorów może znacząco zmienić charakterystykę dawka-odpowiedź biosensora. Stwierdzono, że ekspresja genu transportera jest znaczącym graczem w odpowiedzi biosensora, ze zróżnicowaną biblioteką promotorów P_tac i RBS kontrolujących ekspresję transportera MucK używanego do stabilizacji jego ekspresji w wielu rundach FACS, zwiększając odporność odpowiedzi biosensora¹⁷. Podobnie, badania przesiewowe różnych białek transportowych same w sobie mogą modulować specyficzność bioczujników, przy czym badanie przesiewowe przypuszczalnego zestawu transporterów PcaK przy użyciu bioczujnika reagującego na PCA prowadzi do identyfikacji dwóch transporterów wyjątkowo zdolnych do wychwytywania substratów 3,5-hydroksylowanych, rozszerzając zestaw związków wykrywalnych przez ten system²⁴.

Zautomatyzowane platformy mogą stać się jeszcze potężniejszymi narzędziami do charakteryzacji i eksploracji, gdy połączą zasady DoE z modelami głębokiego uczenia^46,47. Po wstępnym zbadaniu przestrzeni projektowej biosensora z platformą o wysokiej przepustowości, algorytmy uczenia maszynowego zostały wykorzystane do przewidywania funkcji niescharakteryzowanych sekwencji z dobrą dokładnością ⁴⁷. Metody przedstawione w tym protokole mogą być z łatwością zastosowane w testowaniu nowych modeli uczenia się języków do projektowania promotorów, podobnych do modeli, które zostały opracowane w oparciu o przewidywanie sekwencji między RBS⁴⁸. Co więcej, integracja takich modeli może wykorzystać dane dotyczące funkcji sekwencyjnych zawarte w projektach niefunkcjonalnych promotorów i zapewnić krytyczny wgląd w szerszą funkcjonalność bioczujnika jako całości. Mianowicie, miałoby to potencjał, aby rozwiązać kluczowe ograniczenie przepływu pracy DoE, polegające na tym, że wyniki fałszywie dodatnie, np. niefunkcjonalny promotor, niekoniecznie są równoznaczne z zmierzonym wynikiem zerowym, ze zjawiskami takimi jak fałszywa transkrypcja lub wprowadzenie elementu szumu do danych DoE, który jest trudny do zidentyfikowania i kontrolowania. Co istotne, aby objąć całą eksperymentalną przestrzeń projektową, wszelkie wygenerowane biblioteki muszą wykazywać szeroki zakres działań, ponieważ niewystarczający zakres działań spowoduje wypaczenie wyników projektu i stworzy niewiarygodność wszelkich modeli statystycznych wygenerowanych na podstawie zestawu danych³⁰. Jeśli problemem staje się niska zmienność biblioteki, można zaimplementować badanie innych elementów sekwencji lub zwiększyć stopień randomizacji, a różnice między bibliotekami można porównywać, aż do uzyskania odpowiedniej puli wariantów.

Kluczowym aspektem procesu DoE jest prawidłowe oszacowanie i wybór pierwotnych i wtórnych efektów uzyskanych z DSD, które następnie zostaną włączone do analizy statystycznej. DoE, jako podejście oparte na modelowaniu, jest bardzo podatne na nadmierne dopasowanie i stronniczość, co może szybko skomplikować proces optymalizacji poprzez kierowanie iteracyjnych wysiłków inżynieryjnych do nieoptymalnych sekcji przestrzeni projektowej⁴⁹. W związku z tym niezwykle ważne jest, aby zapewnić, że wszelkie projekty są solidnie odizolowane od takich efektów, zarówno na etapie koncepcji, jak i analizy danych. W początkowej fazie projektowania badań przesiewowych, wyśrodkowane przebiegi, w których wszystkie czynniki są ustawione na średnią geometryczną (tj. 0,0,0,0), mogą pomóc w zmniejszeniu błędu systematycznego modelu poprzez lepsze uwzględnienie interakcji nieliniowych, nie zwiększając jednocześnie znacznego obciążenia eksperymentalnego (1-3 dodatkowe serie)⁴⁹. Ponadto włączenie projektów randomizowanych może pomóc w uwzględnieniu zmiennych zewnętrznych, które nie są uwzględnione w projekcie eksperymentalnym, ale nadal mogą wpływać na mierzone zmienne odpowiedzi. W kontekście biologicznym randomizacja rozwiązuje takie kwestie, jak efekty czasoprzestrzenne, takie jak położenie płytki lub zmienność między partiami, zapobiegając znaczącemu wpływowi takich efektów na interpretację danych. Dbałość o takie szczegóły na tym wczesnym etapie może poprawić niezawodność modeli i prowadzić do bardziej wiarygodnych wniosków. Po przeprowadzeniu eksperymentów sugerowanych przez DSD wymagana jest analiza statystyczna danych w celu wyjaśnienia tych czynników, które miały istotny wpływ na parametry wyjściowe. Wykresy półnormalne oferują intuicyjną wizualną reprezentację wielkości efektów, przy czym efekty bez znaczenia zwykle spadają wzdłuż linii prostej, podczas gdy efekty o znaczącym wpływie będą odbiegać od tej linii, umożliwiając prosty wybór najważniejszych czynników w optymalizacji biosensorów. Mając to na uwadze, należy przyjąć konserwatywne podejście do selekcji efektów, tak jak w przypadku każdego modelowania, aby zmniejszyć ryzyko nadmiernego dopasowania modelu.

Możliwość szybkiego projektowania i optymalizacji biosensorów i innych obwodów genetycznych znacznie przyspieszy tempo badań w dziedzinie biotechnologii, np. w zakresie rozwoju szczepów i enzymów, ale także w diagnostyce w czasie rzeczywistym. Pojawienie się metodologii badań przesiewowych opartych na DoE w tej dziedzinie jest szczególnie obiecujące, ułatwiając efektywne wykorzystanie czasu i zasobów przy jednoczesnym badaniu maksymalnej możliwej przestrzeni projektowej, a także zostało już wykorzystane z dużym skutkiem w optymalizacji obwodów genetycznych dla szlaków metabolicznych i biosensorów 31,33,34,51. DoE szczególnie dobrze nadaje się do wieloczynnikowych problemów optymalizacyjnych, w których działa wiele interakcji pierwszego, drugiego, a nawet trzeciego rzędu, które w przeciwnym razie byłyby trudne do zbadania przy użyciu typowego eksperymentalnego podejścia do projektowania oparty na jednym czynniku na raz. Co więcej, wysiłki zmierzające do zaprojektowania jednego aspektu biosensora często nieumyślnie skutkują poświęceniem innego parametru, takiego jak poprawa czułości kosztem zakresu dynamiki⁵¹. Dzięki zdolności DoE do mapowania takich ukrytych interakcji, a także tworzenia modeli, które przewidują zachowanie bioczujników, cykl uczenia się testów kompilacji jest znacznie przyspieszony.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 &mikro; L CO-RE Końcówki, sterylne bez filtra	Hamilton	235939
2,2 ml 96 Płytka głębinowa, kwadratowe studzienki z dnem w kształcie litery V	Thermo	11594754
300 i mikro; Końcówki L CO-RE, ułożone w stos NTR, sterylne	Hamilton	235985
96-dołkowe przezroczyste dno, czarne płytki do mikromiareczkowania	Greiner	655097
Agaroza	Invitrogen	16500100
Złożone plazmidowe DNA	Dostarczony użytkownik	NIE
Czytnik mikropłytek ClarioStar Plus	BMG	NIE
Mieszanina roztworów deksynukloetydu (dNTP)	NEB	N0447L
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Fisher BioReaggents	Zobacz materiał BP231-100
Drabina DNA 100pz	NEB	N3231L
Drabina DNA 1KB	NEB	N3232L
Sekwencjonowanie DNA	Źródło: Bioscience	NIE
Synteza DNA	Identyfikator IDT	NIE
Escherichia coli DH5α Komórki kompotentne	NEB	Zobacz materiał C2987H
Barwnik w żelu, fioletowy X6 bez SDS	NEB	Zobacz materiał B7025S
Kuwety do elektroporacji z pulserem genowym/mikropulserem, odstęp 0,2 cm	Biorad	1652082
Graficzny pad Pryzmat 10	Podkładka graficzna	NIE
Płyn Hamilton Star	Hamilton	NIE
Inkubator z wytrząsarką płytkową HT multitron	Infors HT	NIE
Pakiet analiz statystycznych JMP	JMP	NIE
Rosół LB (młynarz)	Młynarz	L3522
LB Rosół (Miller) z agarem	Sigma	L3147
Elektroporator MicroPulser	Biorad	1652100
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621S
Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności	NEB	Zobacz materiał M0491S
Zestaw QIAprep Spin Midiprep	QIAGEN powiedział:	12143
Zestaw QIAprep Spin Miniprep	QIAGEN powiedział:	27104
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick	QIAGEN powiedział:	Zobacz materiał 28706X4 TGL
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR	QIAGEN powiedział:	28104
Zbieracz kolonii Qpix 420	Urządzenia molekularne w Wielkiej Brytanii	NIE
SOC Outgrowth Medium	NEB	Zobacz materiał B9020S
SYBR Bezpieczna barwnik żelowa DNA	Invitrogen	S33102 powiedział:
Bufor TAE (tris-acetat-EDTA, 50X)	Thermo Fisher	Zobacz materiał B49
UltraPureTM Woda destylowana bez dnazy/rnazy	Invitrogen	10977015